本发明属于新药设计与合成领域，具体涉及一类去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物的合成及其抗肿瘤应用。
背景技术：
斑蝥素(cantharidin,ca)是从芫菁科昆虫斑蝥体内提取的一种抗癌物质，对肝癌、卵巢癌、食道癌等有良好疗效，尤其对原发性肝癌有特殊的抑制作用。但由于斑蝥素的剧烈毒性，严重刺激人体泌尿系统和消化系统，在其临床应用方面有一定的局限性。人工合成的斑蝥素衍生物去甲斑蝥素(norcantharidin,nctd)，其构型与斑蝥素相同，但2，3位甲基被氢取代，毒副作用明显降低，不但能刺激骨髓而有升高白细胞的作用，同时具有保护肝细胞、增强免疫的作用，但是由于去甲斑蝥素在人体内滞留时间短，而稍过量即出现不良反应，剂量的限制很大程度上阻碍该药物发挥疗效。去甲斑蝥素酸钠是去甲斑蝥素在碱性条件下水解制得，化合物毒性明显降低，且药理作用明确，能够应用于临床。
因此，合成高效低毒的去甲斑蝥素衍生物，拓展斑蝥素类抗癌药物的种类意义重大，这已经成为现代中药的抗肿瘤研究热点。“氟”是一个十分神奇的原子，它具有小的原子半径(介于氢原子和氧原子之间)，最大的电负性，因此将氟原子或含氟基团选择性地引入到药物先导分子中可以使母体分子的物理性质、化学性质以及生物活性发生显著的变化。据药物学家统计，将氟引入到药物先导分子之中可以使其成药的几率提高十倍，目前30-40％的农药含氟，20％的上市药物含氟，因此高效的合成一些生物活性分子的含氟类似物是获取高活性药物先导分子的有效手段，是新药研发的重要途径之一。
目前，在斑蝥素中引入含氟基团的研究较少，同时为了寻找药效更好、毒性更小的抗肿瘤药物候选者，拓展斑蝥素类抗肿瘤药物的种类，我们设计将含氟基团引入到去甲斑蝥素中，合成了去甲斑蝥素含氟衍生物，为后续的抗癌活性筛选奠定基础。
技术实现要素：
一方面，本发明提供了一种去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物，其结构式如式i所示，
式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物具体结构包括：
另一方面，本发明提供了如上所述的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，包括以下步骤：1)侧链含氟苯甲醇5(化合物5)与去甲斑蝥素(化合物4)在有机溶剂中，一定温度条件下，通过有机碱作用，反应得到化合物6，即去甲斑蝥素羧酸含氟苄酯；2)化合物6与氢氧化物(naoh、mg(oh)2)发生中和反应，得到式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物，合成路线见以下：
在具体实施方案中，上述步骤1)所述的含氟苯甲醇(化合物5)分别为3-氟苯甲醇、3,5-二氟苯甲醇。
在一种优选的实施方式中，上述步骤1)所述的有机碱选自三乙胺、4-二甲氨基吡啶(缩写4-dmap)等，优选4-dmap。
在一种优选的实施方式中，上述步骤1)所述的溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷等，优选二氯甲烷(缩写dcm)，温度优选为60℃。
在具体实施方案中，上述步骤2)所述的氢氧化物分别为氢氧化钠和氢氧化镁。
在一种优选的实施方式中，上述步骤2)所述的溶剂选自二氯甲烷和醇溶液，优选甲醇。
在一种优选的实施方式中，上述步骤2)所述的氢氧化物为naoh时，温度优选室温；当氢氧化物为mg(oh)2时，温度优选回流温度。
再一方面，本发明还提供了合成式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物的底物4及其制备方法，包括步骤：a)以呋喃为原料，与顺丁烯二酸酐(化合物1)在有机溶剂中反应得到5-烯去甲斑蝥素(化合物2)；b)5-烯-去甲斑蝥素2在有机溶剂中与氢气加成反应得到底物去甲斑蝥素(化合物4)，合成路线见以下：
在一种优选的实施方式中，步骤a)采用的有机溶剂为醚类溶剂或卤代烃，例如：乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿。
在一种优选的实施方式中，步骤a)可在室温下进行，也可以适当加热；优选室温。
在一种优选的实施方式中，步骤b)反应所用的有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃或二氯甲烷；
在一种优选的实施方式中，步骤b)催化氢化反应所用的催化剂选自包括pd/c，及pd(oh)2/c在内的钯碳、铂碳；优选pd/c。
在上述合成及制备方法中，反应温度可依据反应类型适当选取。反应时间可通过薄层层析tlc、高效液相色谱法hplc或lc-ms液相质谱联用等监控手段追踪反应情况得出。
活性测试证明，本发明设计并合成得到的式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物具有很好的抗肿瘤效果，尤其是针对肝癌；对人肝癌体smmc-7721细胞的抑制活性测试中，化合物i-1作用24h时ic50＝19.89μm，48h时ic50＝16.52μm；化合物i-2作用24h时ic50＝11.51μm，48h时ic50＝10.97μm；化合物i-3作用24h时ic50＝22.66μm，48h时ic50＝14.38μm；化合物i-4作用24h时ic50＝8.67μm，48h时ic50＝8.34μm。
对人肝癌bel-7402细胞的活性测试显示，化合物i-1作用24h时ic50＝15.36μm，48h时ic50＝15.01μm；化合物i-2作用24h时ic50＝10.62μm，48h时ic50＝9.98μm；化合物i-3作用24h时ic50＝12.84μm，48h时ic50＝12.01μm；化合物i-4作用24h时ic50＝7.21μm，48h时ic50＝6.69μm。其活性明显强于阳性对照药物去甲斑蝥素和去甲斑蝥素酸钠；可望作为斑蝥素类抗肿瘤药物应用于临床。
因此，本发明的第四方面提供了式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途；优选地，用于制备抗肝癌药物的用途。
本发明的有益之处在于：本发明提供了式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物，是一类适合的抗肿瘤候选药物，尤其是作为抗肝癌的候选药物。相对于阳性对照药品去甲斑蝥素，本发明的化合物i分子结构引入了金属钠离子和镁离子，提高了水溶解性，稳定性；相较于去甲斑蝥素酸钠，本发明的化合物i分子结构引入含氟基团，可以使母体分子的物理性质、化学性质以及生物活性发生显著的变化，从而可增强药代动力学效力。此外，本发明的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物的合成方法，原料易得，非常易于操作实施。
具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可对权利要求的各参数或条件做出的改进或组合，这些改进或组合也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
本发明中使用的呋喃、顺丁烯二酸酐、3-氟苯甲醇、3,5-二氟苯甲醇、氢氧化钠、氢氧化镁来自萨恩化学技术(上海)有限公司；所用溶剂来自上海泰坦科技股份有限公司。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。
前述的本发明的先导化合物去甲斑蝥素4的合成方法，
具体包括以下步骤：
1)取顺丁烯二酸酐置于干燥的圆底烧瓶中，加入乙醚溶解，待完全溶解后滴加呋喃2，于室温下反应24h，抽滤，干燥后得白色固体中间体5-烯去甲斑蝥素3，备用；
2)将步骤1)得到的5-烯去甲斑蝥素3、10％钯碳依次加入100ml三颈瓶中，抽真空，通入氢气，加入乙酸乙酯30ml，室温下搅拌24h，反应结束后抽滤，减压浓缩得白色固体产物去甲斑蝥素4。上述反应中，可以用色谱法、液质连用谱来监控反应进程。色谱法中，可适用薄层色谱，还可用气相色谱法或液相色谱法如hplc代替等。
实施例1.5-烯去甲斑蝥素3的制备：
取一定量的顺丁烯二酸酐1(26mmol,2.6g)，置于圆底烧瓶中，向瓶中加入乙醚20ml完全溶解顺丁烯二酸酐，待完全溶解后，缓慢滴加呋喃22.9ml(39mmol)，于室温下反应24h，抽滤，干燥后得白色固体化合物3，即5-烯去甲斑蝥素，干燥称重为2.1g，收率48％。1hnmr(400hz,dmso-d6):δ6.58(s,2h),5.35(s,2h),3.31(d,j＝4.0hz,2h)。
上述实施例1的步骤1中用于溶解顺丁烯二酸酐的有机溶剂除了乙醚外，还可用二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃中的任一种代替。
实施例2.去甲斑蝥素4的制备：
室温下，取步骤(1)中的化合物3(10mmol,1.7g)，10％钯碳(0.16g,15mmol％)依次加入100ml三颈瓶中，加塞后抽真空，通入氢气，再加入乙酸乙酯30ml，室温下搅拌24h。待反应结束后抽滤，滤饼用乙酸乙酯冲洗2-3次，所得滤液减压浓缩后得到白色固体中间体4(1.6g)，即去甲斑蝥素，产率为97％。1hnmr(400hz,dmso-d6):4.86(s,2h),3.39(s,2h),1.65(s,4h)。
实施例3.去甲斑蝥素羧酸-3-氟苄酯(化合物6-1)的制备：
向25ml封管中分别加入去甲斑蝥素4(1.0mmol,168mg)，4-dmap(1.0mmol,244mg)，氩气置换三次后，再依次加dcm2.5ml，3-氟苯甲醇5-1(2.0mmol,217μl),在60℃条件下反应14h。反应结束后冷却至室温，分别用hcl(1mol/l)、饱和食盐水洗涤三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥后，快速柱层析得到白色固体产物6-1，产率为30.7％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.32(s,1h),7.41(q,j＝8.0hz,1h),7.21-7.13(m,3h),5.04(d,j＝13.2hz,1h),4.94(d,j＝13.2hz,1h),4.76-4.68(m,2h),3.07(dd,j＝14.8hz,9.6hz,2h),1.59-1.51(m,4h).19fnmr(376mhz,dmso-d6)δ-117.76—-117.88(m,1f).
实施例4.去甲斑蝥素羧酸-3,5-二氟苄酯(化合物6-2)的制备：
向25ml封管中分别加入去甲斑蝥素4(1.0mmol,168mg)，4-dmap(1.0mmol,244mg)，氩气置换三次后，再依次加dcm2.5ml，3,5-二氟苯甲醇5-2(2.0mmol,227μl),在60℃条件下反应14h。反应结束后冷却至室温，分别用hcl(1mol/l)、饱和食盐水洗涤三次，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥后，快速柱层析得到白色固体产物6-2，产率为44.8％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ12.34(s,1h),7.18(t,j＝9.6hz,1h),7.09(d,j＝6.4hz,2h),5.05(d,j＝13.6hz,1h),4.96(d,j＝13.6hz,1h),4.73(dd,j＝12.4hz,2.0hz,2h),3.09(dd,j＝16.0hz,9.6hz,2h),1.59-1.50(m,4h).19fnmr(376mhz,dmso-d6)δ-109.39(t,j＝7.5hz,2f).
实施例5.去甲斑蝥素-3-氟苄酯钠盐i-1的制备：
称取50mg(1.0equiv)实施例3得到的化合物6-1于圆底烧瓶中，加入15ml甲醇溶解，再向其中加入7.6mg(1.2equiv)naoh，室温下搅拌反应，tlc检测原料消失后停止反应。减压除去溶剂，经柱层析后得到白色固体产物，即目标产物去甲斑蝥素-3-氟苄酯钠盐，产率为67％。1hnmr(400mhz,d2o)δ7.39(q,j＝8.0hz,1h),7.19(q,j＝7.6hz,2h),7.089(t,j＝8.8hz,1h),5.09(d,j＝12.8hz,1h),5.00(d,j＝12.8hz,1h),4.87-4.86(m,2h),3.02(dd,j＝37.2hz,10.0hz,2h),1.71-1.67(m,2h),1.57-1.52(m,2h).
实施例6.去甲斑蝥素-3,5-二氟苄酯钠盐i-2的制备：
称取62.4mg(0.2mmol,1.0equiv)实施例4得到的化合物6-2于圆底烧瓶中，加入10ml甲醇溶解，再向其中加入8.0mg(0.2mmol,1.0equiv)naoh，室温下搅拌反应，tlc检测原料消失后停止反应。减压除去溶剂，经柱层析后得到白色固体产物，即目标产物去甲斑蝥素-3,5-二氟苄酯钠盐，产率为70％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.17(t,j＝8.4hz,1h),7.09(d,j＝7.2hz,2h),5.04(d,j＝13.2hz,1h),4.96(d,j＝13.2hz,1h),4.73(d,j＝11.6hz,2h),3.08(dd,j＝14.0hz,8.8hz,2h),1.55-1.49(m,4h)。
实施例7.去甲斑蝥素-3-氟苄酯镁盐i-3的制备：
称取50mg(1.0equiv)实施例3得到的化合物6-1于圆底烧瓶中，加入15ml甲醇溶解，再向其中加入9.9mg(1.2equiv)mg(oh)2，加热回流反应，tlc检测原料消失后停止反应。减压除去溶剂，经柱层析后得到白色固体产物，即目标产物去甲斑蝥素-3-氟苄酯镁盐，产率为38％。1hnmr(400mhz,d2o)δ7.45-7.33(m,1h),7.20-7.05(m,3h),5.05(dd,j＝27.6hz,12.0hz,2h),4.89-4.77(m,2h),3.14-3.07(m,2h),1.70(s,2h),1.57(s,2h)。
实施例8.去甲斑蝥素-3,5-二氟苄酯镁盐i-4的制备：
称取62.4mg(0.2mmol)实施例4得到的化合物6-2于圆底烧瓶中，加入10ml甲醇溶解，再向其中加入11.6mg(0.2mmol)mg(oh)2，加热回流反应，tlc检测原料消失后停止反应。减压除去溶剂，经柱层析后得到白色固体产物，即目标产物去甲斑蝥素-3,5-二氟苄酯镁盐，产率为36％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.18(t,j＝9.2hz,1h),7.07(d,j＝10.0hz,2h),5.04(d,j＝13.6hz,1h),4.96(d,j＝13.6hz,1h),4.73(d,j＝12.4hz,2h),3.09(dd,j＝15.2hz,10.0hz,2h),1.56-1.50(m,4h).
实施例9.去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物的活性测试
细胞株和溶剂
人肝癌smmc-7721细胞；
人肝癌bel-7402细胞；
细胞培养于含10％胎牛血清的rpmi1640中培养基；
溶剂：二甲亚砜(简称为dmso)。
cck-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案
选用待测肿瘤活细胞比例达90％以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用enogenecelltmcountingkit-8(简称为cck-8)细胞活力检测试剂盒。取对数生长期的人肝癌smmc-7721、bel-7402细胞，弃去培养液，pbs冲洗2遍，胰酶消化，离心，培养液重悬混匀细胞，8000个/孔，平行接种于96孔板。96孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养24小时后取出，每孔加入100μl含待测化合物的培养液，同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组(阳性对照分别选用去甲斑蝥素和去甲斑蝥素酸钠)。每组设3个重复，于37℃，5％co2培养箱中继续培养24或48h后，每孔加入10μlcck-8溶液，将培养板在培养箱内孵育后，用酶标仪测定在450nm处的吸光值(od值)，实验组与对照组均重复3次试验，计算各个化合物作用于人肝癌细胞smmc-7721、人肝细胞bel-7402的ic50。实验结果详见表1-2。
表1:对人肝癌smmc-7721细胞的ic50
表2:对人肝癌bel-7402细胞的ic50
表1-2实验结果表明，本发明化合物i具有很好体外抗肿瘤活性。去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物对人肝癌细胞smmc-7721和人肝癌细胞bel-7402的抑制活性明显强于去甲斑蝥素和去甲斑蝥素酸钠。
此外，相对于阳性对照品去甲斑蝥素，本发明的化合物i分子结构引入了金属钠离子和镁离子，提高了水溶解性，稳定性；相对于阳性对照品去甲斑蝥素和去甲斑蝥素酸钠，由于引入含氟基团，其生物活性发生显著变化。因此，化合物i是一种适合的抗肿瘤候选药物，尤其是作为抗肝癌的候选药物。
1.去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物，其结构式如式i所示：
式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物具体结构包括：
2.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，包括如下步骤：
步骤一：侧链含氟苯甲醇5即化合物5与去甲斑蝥素即化合物4在有机溶剂中，一定温度条件下，通过有机碱作用，反应得到化合物6，即去甲斑蝥素羧酸含氟苄酯；
步骤二：化合物6与氢氧化物即naoh、mg(oh)2发生中和反应，得到式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物；
其合成路线见以下：
3.根据权利要求2所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：所述化合物5为氟苯甲醇，氟苯甲醇分别为3-氟苯甲醇、3,5-二氟苯甲醇。
4.根据权利要求2所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：所述有机碱选自三乙胺或4-二甲氨基吡啶。
5.根据权利要求2所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、醇溶液或甲醇，其一定温度条件为60℃。
6.根据权利要求2所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：所述的氢氧化物分别为氢氧化钠和氢氧化镁。
7.根据权利要求2所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：所述合成式i所示的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物的化合物4的制备方法，包括如下步骤：
步骤a：以呋喃为原料，与顺丁烯二酸酐即化合物1在有机溶剂中反应得到5-烯去甲斑蝥素即化合物2；
步骤b：5-烯-去甲斑蝥素2在有机溶剂中与氢气加成反应得到去甲斑蝥素即化合物4，合成路线见以下：
8.根据权利要求7所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：步骤a)采用的有机溶剂为醚类溶剂或卤代烃，例如：乙醚、四氢呋喃、二氯甲烷或氯仿；所述步骤a)可在室温下进行，也可以适当加热。
9.根据权利要求7所述去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物i的合成方法，其特征在于：所述步骤b)反应所用的有机溶剂为乙酸乙酯、四氢呋喃或二氯甲烷；所述步骤b)催化氢化反应所用的催化剂选自包括pd/c，及pd(oh)2/c在内的钯碳、铂碳；优选pd/c。
10.根据权利要求1所述的去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物的应用，其特征在于：去甲斑蝥素含氟苄酯盐类衍生物用于肝癌。
技术总结