本发明涉及一种检测甲醇的荧光探针，特别涉及一种甲醇荧光探针的制备和其在甲醇快速检测中的应用。
背景技术：
甲醇对人体的毒性较大，国家卫生部2004年第５号公告中指出“摄入甲醇5-10ml可引起中毒，如果摄入30ml则可致人死亡”。甲醇在体内的代谢产物是甲醛和甲酸，其毒性更大于甲醇，所以人体摄入极少量的甲醇也能引起慢性中毒。甲醇作为一种无色有酒精气味的液体，常常被一些不法分子用于制造假酒，另外一些酿酒企业由于生产工艺控制不严等问题，也会导致酒中的甲醇超标。因此在打击假酒案件，对酒类商品进行质量检测，临床上对甲醇中毒的诊断等方面，都需要快速对样品中的甲醇进行定性，定量的检测。
关于酒中甲醇含量的检测，我国食品安全标准《gb5009.266-2016食品中甲醇的测定》中给出的检测方法为气相色谱法。目前文献报道的甲醇检测方法还有液相色谱法、分光光度法等。但是这些方法都需要大型实验仪器，测定过程复杂，耗时。因此亟待开发一种快速检测甲醇的方法。
荧光探针法是近年来发展起来的，在复杂环境下对物质进行检测的重要分析方法，具有快速、灵敏、成本低等的优点，广泛地应用于各种样品的检测。罗丹明是含有氧杂蒽结构的染料，具有很高的吸光系数、较长的激发和发射波长、较高的荧光量子产率和良好的光稳定性等优点，作为荧光探针的母体已大量的用于构建各种荧光探针（chem.rev.,2012,112,1910-1956）。
偶氮基团（-n=n-）是染料分子中常见的结构，具有顺式和反式两种构型，-n=n-键的超快速构型变化可使与之相联的荧光团发生荧光猝灭（org.lett.2014,16,15,3946-3949）。另据报道偶氮染料的-n=n-键在光照条件下可以被甲醇还原为氨基（journalofthesocietyofdyersandcolourists,1982,98,334-340）。本发明利用以上原理设计了一种罗丹明偶氮衍生物，该化合物的-n=n-键的超快速构型变化使与之相联的罗丹明基团发生荧光猝灭；当罗丹明偶氮衍生物在光照条件下遇到甲醇时，-n=n-键被甲醇还原断开，释放出的罗丹明分子呈现桃红色并发出强荧光。本发明利用上述罗丹明偶氮衍生物可实现在日光条件下对甲醇的快速检测。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测甲醇的荧光探针及其应用，该甲醇荧光探针可以实现对甲醇的荧光增强响应，抗干扰性强，灵敏度高，具有在现场快速检测甲醇样品的应用前景。
本发明采用的技术方案是：
一种检测甲醇的荧光探针的结构通式如（i）所示：
其中：r=no2、cl、br、cn
（i）。
所述的一种检测甲醇的荧光探针的制备方法如下：
将一定量的罗丹明化合物溶于2.5mol/l的稀盐酸溶液中，在室温下充分搅拌，将反应液降温至0℃，缓慢加入一定量的nano2，充分搅拌20min后，加入一定量的苯胺类化合物再反应20min，然后用1mol/l的naoh溶液调节ph至中性，反应液用有机溶剂萃取三次，合并有机相，用无水mgso4充分干燥，减压蒸除溶剂，硅胶层析过柱，真空干燥得产品。
上述方法中所述的罗丹明化合物、nano2和苯胺类化合物的摩尔比为30:35:32。
上述方法中所述的萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚中的一种。
上述方法中所述的硅胶层析洗脱液为石油醚：乙酸乙酯（v石油醚：v乙酸乙酯=20:1）。
本发明所述的一种检测甲醇的荧光探针可用于甲醇样品的快速检测。
本发明的有益效果是：本发明所述的一种检测甲醇的荧光探针，能选择性识别甲醇，并且具有抗干扰性强，灵敏度高的特点。由于其特殊的响应原理，这种探针对其他醇类化合物没有明显的响应，可以用于酒类中甲醇的测定。用该探针溶液浸泡过的滤纸，可以作为甲醇试纸对含甲醇样品进行定性检测。
附图说明
图1是实施例2制备的甲醇荧光探针1对常见溶剂的选择性荧光响应图谱。
图2是实施例2制备的甲醇荧光探针1（20μm）对不同浓度的甲醇/水溶液（2-220μm）的荧光光谱及线性范围（r2=0.9788）。
具体实施方式
实施例1罗丹明化合物的合成
称取3-二乙基氨基酚（1.65g，10.00mmol）于100ml烧瓶中，加入20ml经分子筛干燥过的甲苯，在60℃下缓慢搅拌至完全溶解。加入邻苯二甲酸酐（1.50g，约10.13mmol），在n2保护下，混合物回流反应12h。用稀盐酸溶液（ω=20％）调节至ph≤4，得到紫红色沉淀。将产物抽滤，用蒸馏水充分洗涤，干燥得4-二乙氨基酮酸粗品0.70g，收率42.50％。
称取4-二乙氨基酮酸粗品1g（3.2mmol）于100ml烧瓶中，加入10ml甲烷磺酸，在50℃下搅拌至充分溶解，加入间氨基苯酚0.4g（3.80mmol），在n2保护下加热至120℃持续反应10h。反应完毕后冷却至室温，用0.1mna2co3溶液调节至ph≤5，再用乙酸乙酯（3×20ml）充分萃取，合并有机相，用mgso4干燥抽滤，减压蒸除溶剂，硅胶层析过柱（v二氯甲烷：v甲醇=1:1），得红色固体0.40g，收率40.35%。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.03(d,j=7.1hz,1h),7.57(dtd,j=19.6,7.3,1.1hz,2h),7.14(d,j=7.2hz,1h),6.66(d,j=9.0hz,1h),6.57(d,j=8.6hz,1h),6.50(d,j=2.2hz,1h),6.45(d,j=2.5hz,1h),6.39(dd,j=9.1,2.5hz,1h),6.33(dd,j=8.6,2.2hz,1h),3.36(q,j=7.1hz,4h),1.16(t,j=7.1hz,6h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.64,153.87,150.95,150.48,133.51,129.58,129.38,129.21,125.99,125.10,112.47,110.18,109.05,107.12,100.53,97.15,44.60,12.44。
实施例2探针1的合成
称取实施例1制得的罗丹明化合物0.150g（0.30mmol）于50ml的烧瓶中，加入10ml2.5mol/l的稀盐酸溶液，在室温下充分搅拌。将烧瓶放置在加有氯化钠固体冰水混合物中，搅拌5min。称取nano2固体0.024g（0.35mmol）缓慢加入到反应液中，充分搅拌20min后，加入对硝基苯胺0.044g（0.32mmol）反应20min，最后用1mol/l的naoh溶液调节ph至中性。反应液再用乙酸乙酯（3×30ml）充分萃取，合并有机相，用无水mgso4充分干燥，减压蒸除溶剂，硅胶层析过柱（v石油醚：v乙酸乙酯=20:1），真空干燥得探针10.038g，收率23.50%。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.26(d,j=8.4hz,2h),8.07(d,j=7.4hz,1h),7.68(dd,j=13.2,7.2hz,2h),7.46(d,j=8.4hz,2h),7.41(s,1h),7.24(d,j=7.6hz,1h),7.13(d,j=8.4hz,1h),6.83(d,j=8.4hz,1h),6.62(d,j=8.6hz,1h),6.47(s,1h),6.41(d,j=8.7hz,1h),3.39(dd,j=13.8,6.9hz,4h),1.21(t,j=6.9hz,6h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.56,153.04,152.54,142.34,134.93,132.57,129.70,129.20,127.95,125.57,124.99,124.06,117.95,116.37,115.91,108.42,100.97,100.00,99.90,97.80,44.57,41.61,37.12,32.77,29.70,24.80,21.06,18.05,14.12,12.50,11.34.ms(esi):[m h ]anal.calcdfor:c30h25n5o5:536.1928;found:536.1907。
实施例3探针2的合成
按照实施例2的方法合成得探针20.056g，收率43.33%。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.05(d,j=7.4hz,1h),7.66(dt,j=23.3,7.4hz,2h),7.45(d,j=8.6hz,2h),7.38(d,j=8.7hz,2h),7.30(s,1h),7.24(d,j=7.4hz,1h),6.94(d,j=8.5hz,1h),6.77(d,j=8.5hz,1h),6.60(d,j=8.9hz,1h),6.49(s,1h),6.39(d,j=9.1hz,1h),3.39(q,j=7.0hz,4h),1.20(t,j=7.0hz,6h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.71,153.11,152.90,152.73,149.65,145.18,144.83,134.86,131.92,129.56,129.35,128.93,127.24,124.96,124.06,120.72,115.32,112.04,108.47,104.97,103.91,97.55,84.24,44.52,37.12,31.95,29.73,22.72,14.16,12.53.ms(esi):[m h ]anal.calcdfor:c30h25cln4o3:525.1687;found:525.1692。
实施例4探针3的合成
按照实施例2的方法合成得探针30.081g，收率54.26%。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.06(d,j=7.6hz,1h),7.66(dt,j=22.5,7.3hz,2h),7.52(d,j=8.2hz,2h),7.37(d,j=8.0hz,2h),7.30(s,1h),7.24(d,j=7.5hz,1h),6.95(d,j=8.5hz,1h),6.77(d,j=8.4hz,1h),6.61(d,j=8.9hz,1h),6.49(s,1h),6.39(d,j=9.0hz,1h),3.39(q,j=6.9hz,4h),1.20(t,j=6.9hz,6h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.71,153.09,152.91,152.72,149.68,145.42,145.07,134.84,132.29,129.55,129.30,128.91,127.25,124.96,124.06,120.88,119.65,115.49,112.26,108.52,105.52,104.14,97.61,44.52,31.94,29.71,29.37,22.71,14.14,12.53.ms(esi):[m h ]anal.calcdfor:c30h25brn4o3:569.1128;found:569.1187。
实施例5探针4的合成
按照实施例2的方法合成得探针40.070g，收率46.67%。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.05(d,j=7.5hz,1h),7.66(dt,j=23.1,7.4hz,2h),7.41(d,j=7.8hz,2h),7.30(s,1h),7.23(t,j=7.9hz,3h),6.94(d,j=8.5hz,1h),6.76(d,j=8.5hz,1h),6.61(d,j=8.9hz,1h),6.50(s,1h),6.39(d,j=8.9hz,1h),3.39(q,j=6.9hz,4h),2.38(d,j=10.3hz,3h),1.20(t,j=7.0hz,6h).13cnmr(101mhz,cdcl3)δ169.70,153.19,152.94,152.73,149.64,145.30,144.20,136.60,134.79,129.84,129.49,129.26,128.91,127.27,124.92,124.07,119.40,114.89,111.97,108.44,105.12,103.72,97.63,84.29,44.52,31.94,29.71,22.71,21.11,14.14,12.53.ms(esi):[m h ]anal.calcdfor:c31h28n4o3:505.2234;found:505.2217。
实施例6探针性能测试
选取实施例2制备的探针1为例进行性能测试。
1）实施例2制备的探针1在不同溶剂中的荧光光谱测定。将一定量的探针1储备液（1mm）分别加入不同溶剂中，使探针1的最终浓度为20μm。对所得的样品进行荧光光谱测定，结果如图1所示（激发光波长480nm）。由图1可以看出，探针1对甲醇具有良好的荧光响应，对乙醇有微弱的荧光响应，对于其他常见的溶剂没有荧光响应。
2）探针1对不同浓度的甲醇水溶液的荧光响应。将一定量的探针1储备液（1mm）分别加入不同甲醇浓度的水溶液中（2-220μm），使探针1的最终浓度为20μm。对所得的样品进行荧光光谱测定，结果如图2所示（激发光波长480nm）。由图2可以看出，随着甲醇浓度的增加，探针的荧光强度逐渐增加。在2-220μm的范围内荧光强度与甲醇浓度呈线性关系（r2=0.9788），所以该探针可以定量的检测甲醇。
3）探针1试纸对甲醇的检测。将滤纸条浸入探针1储备液（1mm）10秒，然后将滤纸条自然晾干即可得到甲醇试纸。将甲醇含量为0.1%的乙醇溶液滴加到试纸上放置1min后试纸呈现桃红色。将纯乙醇滴到该试纸上无明显现象。以上实验说明该试纸可以方便地检测乙醇中的微量甲醇。
1.一种检测甲醇的荧光探针，为结构通式（i）：
其中：r=no2、cl、br、cn
（i）。
2.权利要求1所述的一种检测甲醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将一定量的罗丹明化合物溶于2.5mol/l的稀盐酸溶液中，在室温下充分搅拌，将反应液降温至0℃，缓慢加入一定量的nano2，充分搅拌20min后，加入一定量的苯胺类化合物再反应20min，然后用1mol/l的naoh溶液调节ph至中性，反应液用有机溶剂萃取三次，合并有机相，用无水mgso4充分干燥，减压蒸除溶剂，硅胶层析过柱，真空干燥得产品。
3.根据权利要求2所述的一种检测甲醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的罗丹明化合物、nano2和苯胺类化合物的摩尔比为30:35:32。
4.根据权利要求2所述的一种检测甲醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚中的一种。
5.根据权利要求2所述的一种检测甲醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的硅胶层析洗脱液为石油醚：乙酸乙酯，其v石油醚：v乙酸乙酯=20:1。
6.权利要求1所述的一种检测甲醇的荧光探针用于甲醇样品的快速检测。
技术总结