本发明涉及药物技术领域，尤其涉及具有nav1.5钠离子通道抑制活性的新型化合物hypulatonea和hypulatoneb及其制备方法，以及其在治疗心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭药物中的应用。
背景技术：
金丝桃属(hypericum)是藤黄科(guttiferae)的一个大属，全世界约400种。我国约有55种8亚种，全国均有分布，主产于在西南地区。该属植物在国内外民间被广泛作为药用植物，具有悠久的历史。例如我国金丝桃属植物有25种在民间作为药物用，具有抗抑郁、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等多种药理活性。到目为止，从金丝桃属植物中已经发现了多种类型的活性成分，其中异戊烯基化的酰基间苯三酚是其特征性的化学成分，因具有复杂的结构和多样的生物活性而受到广泛的关注。
金丝梅(hypericumpatulum)别名土连翘，芒种花。生于海拔2700m的山坡、草地、林下、灌丛中或空旷处，具有清热利湿解毒，疏肝通络，祛瘀止痛等功效。文献报道该植物的化学成分主要有黄酮，口山酮类化学成分。然而迄今为止现有的技术中未见有去芳化异戊烯基酰化间苯三酚杂萜hypulatonea和hypulatoneb及其活性的报道。
nav1.5是心脏组织中特定表达的电压门控钠离子通道，参与心肌动作电位的产生与传导。在心肌细胞动作电位进程中，钠电流由峰钠电流和晚钠电流组成，峰钠电流是指动作电位上升支形成时钠离子通道大量开放所产生的电流，晚钠电流是指动作电位平台期少量钠通道开放所产生的电流。从2013年到2018年被证实超过400个nav1.5的突变体与长qt综合征、心力衰竭、心律不齐、布鲁加达(brugada)综合征等疾病相关。例如，nav1.5的1505-1507δkpq的突变可引起遗传性长qt综合征(lqt3)，该突变体可延长心肌动作电位的qt间期，其电生理特征为晚钠电流增加。由于晚钠电流的增加与一系列心脏系统的疾病相关，所以它们成为了心脑血管疾病药物研发的热门靶点。雷诺嗪等一系列晚钠电流的抑制剂也逐步被应用到临床，用于治疗治疗心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭等疾病。然而这些分子几乎都存在选择性差、药效不足及副作用大等问题，市场上仍然急需新型的晚钠电流抑制活性分子。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供从金丝梅(h.patulum)中分离得到的去芳化异戊烯基酰化间苯三酚杂萜hypulatonea和hypulatoneb，其制备方法，以其为活性成分的药物组合物，其在药物中特别是在治疗心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭等疾病的药物中的应用。本发明提供的新化合物hypulatonea和hypulatoneb具有显著nav1.5钠离子通道抑制活性，可以用于制备预防和/或治疗心脏系统疾病的药物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了下述结构所示的去芳化异戊烯基酰化间苯三酚杂萜化合物hypulatonea和hypulatoneb或其药用盐：
其中化合物hypulatonea和hypulatoneb是具有复杂所示结构的倍半萜与去芳化异戊烯基酰化间苯三酚的杂萜化合物。
如所述的有去芳化异戊烯基间苯三酚杂萜类合物hypulatonea和hypulatoneb或其药用盐，其中所述的药用盐是指药学上可接受的盐，包括与有机酸和无机酸形成的盐，所述的有机酸为酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、草酸、马来酸、琥珀酸、乙二酸、藻酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、烟酸、2-萘磺酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫代氰酸、对-甲苯磺酸盐和十一烷酸盐，所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸。
本发明提供了上述技术方案所述化合物hypulatonea和hypulatoneb的制备方法，包括以下步骤：用甲醇对干燥金丝梅全草进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分再用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过mci柱，依次收集得到5个组分a～e，将b组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为a1～a5组分；a2组分经过hplc分离纯化得到化合物hypulatonea和hypulatoneb。
本发明提供了一种具有选择性的nav1.5钠离子通道抑制活性的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为上述技术方案所述化合物hypulatonea和hypulatoneb或上述技术方案所述制备方法制备得到的化合物hypulatonea和hypulatoneb。
一种新型的选择性的nav1.5钠离子通道抑制剂，其以有去芳化异戊烯基酰化间苯三酚杂萜化合物hypulatonea和hypulatoneb为活性成分。
优选地，所述药学上可接受的辅料包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。
本发明提供了上述技术方案所述化合物或药物组合物在制备预防和/或治疗心脏系统疾病药物中的应用。
优选地，所述心脏系统疾病包括心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭等。
优选地，所述预防和/或治疗心脏系统疾病的药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。
本发明提供的化合物hypulatonea和hypulatoneb对nav1.5钠离子通道抑制活性，以所述化合物为有效成分的药物组合物可用于制备预防和/或治疗心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭等疾病药物，具有潜在临床应用价值。
本发明提供的化合物hypulatonea和hypulatoneb的制备方法，金丝梅经甲醇提取后利用mci柱分离、正相和反相柱层析以及高效液相色谱分离技术，能够得到具有选择性的强效nav1.5钠离子通道抑制活性的目标化合物，操作方便。
附图说明
图1为化合物hypulatonea的氢谱(600mhz,cdcl3)；
图2为化合物hypulatonea碳谱(150mhz,cdcl3)；
图3为化合物hypulatonea的高分辨质谱图；
图4为化合物hypulatonea的x-射线的衍射图；
图5为化合物hypulatonea的手性拆分液相分图；
图6为化合物(±)-hypulatonea的实验ecd和计算ecd对比图；
图7为化合物hypulatoneb的氢谱(600mhz,cdcl3)；
图8为化合物hypulatoneb的碳谱(150mhz,cdcl3)；
图9为化合物hypulatoneb的高分辨质谱图；
图10为化合物hypulatoneb的x-射线的衍射图；
图11化合物hypulatonea和hypulatoneb对不同离子通道的作用。a：hypulatoneb作用于晚钠电流的剂量效应关系，其ic50为0.20μm；b：hypulatoneb作用于不同通道的活性，左起依次是30μm雷诺嗪、10μmhypulatoneb、1μmhypulatoneb作用于晚钠电流、10μmhypulatoneb分别作用于cav3.1、kv1.5、herg；c：hypulatonea作用于不同通道的活性，左起依次是30μm雷诺嗪、10μmhypulatonea、1μmhypulatonea作用于晚钠电流、10μmhypulatonea分别作用于cav3.1、kv1.5、herg。
图12为化合物hypulatonea和hypulatoneb的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供了去芳化异戊烯酰化基间苯三酚类化合物hypulatonea和hypulatoneb结构式如图12所示。
本发明提供了上述技术方案所述化合物hypulatonea和hypulatoneb的制备方法，包括以下步骤：用甲醇对干燥金丝梅全草(12kg)进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分在用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过mci柱，依次收集得到5个组分a～e，将a(16.4g)组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为a1～a5组分；a2组分经过hplc分离纯化得到化合物hypulatonea和hypulatoneb。
在本发明中，上述硅胶柱层析以及mci柱分离的过程中，所用洗脱剂的体积没有特殊限定，根据实际需要进行选择即可。
在本发明中，上述进行硅胶柱层析和过mci柱分离的过程中，优选采用薄层色谱法检视分段收集得到多个相应组分(即a～e组分、a1～a5组分)。
本发明提供了一种具有nav1.5钠离子通道抑制活性的药物组合物，由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为上述技术方案所述化合物hypulatonea和hypulatoneb或上述技术方案所述制备方法得到的化合物中的至少一种。
本发明对于所述药学上可接受的辅料没有特殊的限定，具体的，所述药学上可接受的辅料优选包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。本发明对于上述辅料中的具体种类没有特殊的限定，根据实际需要选择即可。
本发明提供了上述技术方案所述药物组合物在制备预防和/或治疗心脏系统疾病药物中的应用。
本发明对于所述预防和/或治疗心脏系统疾病药物没有特殊的限定，根据实际需要选择即可，具体可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、口服液制剂、注射剂或冻干粉针剂。本发明对于不同剂型药物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
在本发明中，所述预防和/或治疗心脏系统疾病的药物所给予的剂量将随着所使用的化合物、给予方式、所希望的治疗和所指示的障碍而变化。例如，口服给药，所述化合物hypulatonea和hypulatoneb或其药学上可接受的盐的每日剂量可以在0.01微克/千克体重(μg/kg)至100毫克/千克体重(mg/kg)的范围内。
下面将结合附图，用本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
化合物hypulatonea和hypulatoneb的制备方法，包括以下步骤：
本发明提供了上述技术方案所述化合物hypulatonea和hypulatoneb的制备方法，包括以下步骤：用甲醇对干燥金丝梅全草(12kg)进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，将所述浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分在用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过mci柱，依次收集得到5个组分a～e，将a(16.4g)组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分，记为a1～a5组分；a2组分经过hplc分离纯化得到化合物hypulatonea和hypulatoneb。
化合物hypulatonea的结构解析(表征图如图1～3所示)具体如下：
化合物hypulatonea，无色晶体。hresims表明其分子式为c48h64o5，计算其不饱和度为17。1hnmr表明该化合物存在1个单取代的苯环，10个甲基，11个亚甲基，12个次甲基和15个季碳。尤其是一个孤立的羰基(δc206.7ppm,c-4)，一个共轭的羰基(δc192.0ppm,c-7)，1个1,3-二酮(δc113.7ppm,c-1；176.8ppm,c-6；196.2ppm,c-2)，两个化学位移为62.7ppm(c-3)和59.8ppm(c-5)的季碳表面了去芳化异戊烯基酰化间苯三酚母核的存在。另外，h-24和c-4,c-5,c-6以及h-14/h-19和c-2,c-3,c-4的hmbc相关表明化合物1是去芳化异戊烯基酰基酰化间苯三酚母核在c-3和c-5位分别被两个异戊烯基和一个香叶基取代。除了以上提到的15个碳信号以外，分析剩下的15个碳信号，其可能是一个倍半萜单元。此倍半萜的单元的结构最终通过h-9/h-10/h-11，h-5/h-6/h-7和h-2/h-3的1h-1hcosy相关以及me-15与c-7,c-8和c-9；me-13/me-14与c-3,c-4和c-5；h-12与c-1,c-2和c-11的hmbc相关确定。去芳化异戊烯基酰化间苯三酚与倍半萜的连接通过h-12与c-4,c-5和c-6的hmbc相关确定确定。最终，c-6(δc176.8ppm)和c-1(δc90.9ppm)的低场的化学位移结合化合物的不饱和度确定了其氧杂螺环结构的存在。
通过上述波谱数据的分析，化合物hypulatonea的平面结构得到确定。最后通过x-射线的单晶衍射分析，进一步证实了其平面结构并确定了其相对构型，也确定了其是一对外消旋体(图4)，并且成功对其进行了手性拆分，通过ecd计算分别确定了其绝对构型(图5，图6)。
表1.化合物hypulatonea的1h-nmr和13c-nmr数据(cdcl3)
化合物hypulatoneb，无色晶体。hresims表明其分子式也为c48h64o5，并且仔细对比化合物hypulatonea和hypulatoneb的1hnmr和13cnmr谱图，表明这两个化合物有高度的相似性，仔细分析该化合物的hsqc、hmbc，1h-1hcosy谱以及x-ray的单晶衍射，最终确定了化合物2的平面结构和相对构型。
表2.化合物hypulatoneb的1h-nmr和13cnmr数据(cdcl3)
化合物hypulatonea的理化性质及结构数据：
无色晶体；colorelesscrystals；
化合物hypulatoneb的理化性质及结构数据：
无色晶体；
实施例2
本发明去芳化异戊烯基酰化间苯三酚类衍生物hypulatonea和hypulatoneb对nav1.5晚钠电流抑制活性实验方法和结果如下：
1、细胞制备与表达
以添加10％小牛血清(gibco)和青霉素(100单位/毫升)、链霉素(0.1毫克/毫升)(biologicalindustries)双抗的dmem(hyclone)培养基培养人胚胎肾(hek)293细胞。将处于对数生长期的293细胞用lipod293tm(signagenlaboratories)转染试剂将人源pcdna3.1-nav1.5、pcdna3.1-herg、pcdna3.1-kv1.5、pcdna3.1-cav3.1和pcdna3.1-egfp质粒转染入细胞。转染的人胚胎肾(hek)293细胞需在48小时内使用。
2、电生理学实验
所有实验均在室温(22-25℃)下进行。利用微电极拉制仪(p-1000,sutterinstrument)和加热抛光将硼硅酸盐玻璃制备移液管(worldprecisioninstruments)制备为阻抗在2～4mω的玻璃电极并用于全细胞电流记录。电流通过axopatch200b进行放大，然后digidata1440a(moleculardevices)进行数据转化。电流以2khz通过低能滤波器，然后在10khz进行采样。pclamp10(moleculardevices)被用来进行数据采集和分析。记录nav1.5电流细胞外溶液中包含(inmm)25nacl、122teacl、1mgcl2·6h2o、2cacl2、10glucose、10hepes(ph＝7.4,用naoh来调节)；细胞内溶液中包含(inmm)140cscl、10nacl、2na-atp、20hepes(ph＝7.4用csoh来调节)；电流记录程序为：将细胞膜钳制在-110mv电位，用100ms的-30mv(峰钠电流)、用400ms的-30mv(晚钠电流)去极化电压刺激细胞，每次刺激间隔为4s，研究晚钠电流时先灌流100μm藜芦定激发晚钠电流，然后在灌流待研究化合物看其作用。记录cav3.1电流细胞外溶液中包含(inmm)142cscl,1mgcl2,2cacl2,10glucose和10hepes(ph＝7.4，用csoh来调节)；细胞内溶液中包含(inmm)142cscl,2mgcl2,2na2atp,10hepes和11egta(ph＝7.4，用csoh来调节)；电流记录程序为：将细胞膜钳制在-100mv电位，用150ms的-30mv去极化电压刺激细胞，每次刺激间隔为4s。记录kv1.5电流细胞外溶液中包含(inmm)140nacl、4kcl、1mgcl2·6h2o、2cacl2、10glucose、10hepes(ph＝7.4,用naoh来调节)；细胞内溶液中包含(inmm)130kcl、1mgcl2·6h2o、5egta、5na-atp、10hepes(ph＝7.4，用koh来调节)；电流记录程序为:将细胞膜钳制在-80mv电位，先用1250ms的 50mv去极化电压激活通道，然后用800ms的-30mv电压诱发并记录尾电流，每次刺激间隔为4s。记录herg电流细胞外溶液中包含(inmm)140nacl、4kcl、1mgcl2·6h2o、2cacl2、10glucose、10hepes(ph＝7.4,用naoh来调节)；细胞内溶液中包含(inmm)130kcl、1mgcl2·6h2o、5egta、5na-atp、10hepes(ph＝7.4,用koh来调节)；电流记录程序为:将细胞膜钳制在-80mv电位，先用2000ms的 20mv去极化电压激活通道，然后用200ms的-50mv电压诱发并记录尾电流，每次刺激间隔为8s。
3、数据分析与统计
数据的收集和统计分析均采用graphpad8.0.1(graphpadsoftware,sandiego,causa)。ic50值和希尔系数通过希尔方程y＝imin (imax-icmin)/[1 10(logec50-c)×hillslope]用收集得到的数据计算得出。两组间显著性分析用t-检验，多组间比较用单因素方差分析，p>0.5,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。所有数据均为平均值±标准差。
4、化合物雷诺嗪、hypulatonea和hypulatoneb对通道的抑制活性，如表-3所示。
表3.hypulatonea和hypulatoneb作用于nav1.5、cav3.1、kv1.5、herg
实验结果表明，在本发明实验条件下，雷诺嗪(临床上第一个用于抑制晚钠电流的化合物)对晚钠电流具有抑制活性，30μm抑制晚钠电流79.9±6.3％，而本发明的化合物hypulatonea和hypulatoneb同样表现出了显著的晚钠电流抑制活性，1μm抑制率分别为62.2±1.6％和77.5±1.3％。生物活性研究表明，hypulatoneb的活性强于阳性对照30倍，其ic50为0.20μm，是目前发现的活性最强的晚钠电流天然抑制剂，并且对cav3.1、kv1.5、herg表现出较好的选择性，见图11。上述2个分子可能成为治疗与晚钠电流相关疾病的先导化合物，如lqt3、心力衰竭、心律不齐等疾病。
实施例3
片剂的制备：
按实施例1的方法先制得化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠橡酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液制剂的制备：
按实施例1的方法先制得化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠橡酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂、颗粒剂或冲剂的制备：
按实施例1的方法先制得化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠橡酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.下述结构式所示的酰基间苯三酚杂萜类化合物hypulatonea和hypulatoneb或其药用盐，
2.如权利要求1所述的酰化间苯三酚杂萜类化合物hypulatonea和hypulatoneb或其药用盐，其中化合物hypulatonea和hypulatoneb是具有复杂所示结构的倍半萜与去芳化异戊烯基酰化间苯三酚的杂萜化合物。
3.如权利要求1所述的酰化间苯三酚杂萜类化合物hypulatonea和hypulatoneb或其药用盐，其中所述的药用盐是指药学上可接受的盐，包括与有机酸和无机酸形成的盐，所述的有机酸为酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、草酸、马来酸、琥珀酸、乙二酸、藻酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊烷丙酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、半硫酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、烟酸、2-萘磺酸、扑酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫代氰酸、对-甲苯磺酸盐和十一烷酸盐，所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸。
4.权利要求1或2所述化合物hypulatonea和hypulatoneb的制备方法，采用甲醇对干燥金丝梅全草进行提取3次，每次2天，所得提取液经减压蒸馏得到浸膏，浸膏用100–200目硅胶拌样，进行硅胶柱层析，所用洗脱剂为氯仿，得到氯仿段，之后将所得氯仿部分再用聚酰胺拌样，以70％–100％的甲醇–水作为流动相过mci柱，依次收集得到5个组分a～e，将a组分在梯度洗脱条件下进行硅胶柱层析，以石油醚/丙酮为洗脱剂依次收集得到5个组分a1～a5组分；a2组分经过hplc分离纯化得到化合物hypulatonea和hypulatoneb。
5.一种药物组合物，其特征在于，其由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为权利要求1或2所述化合物hypulatonea和/或hypulatoneb或权利要求4所述制备方法制备得到的化合物hypulatonea和/或hypulatoneb。
6.一种用于预防和治疗心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭病的药物组合物，其特征在于，其由活性成分和药学上可接受的辅料组成，所述活性成分为权利要求1或2所述化合物hypulatonea和/或hypulatoneb或权利要求4所述制备方法制备得到的化合物hypulatonea和/或hypulatoneb。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括药物载体、表面活性剂、缓冲物质、崩解剂、粘合剂、填充剂、润滑剂、赋形剂、增溶剂、香味剂和着色剂中的一种或几种。
8.权利要求1所述的酰化间苯三酚杂萜hypulatonea和hypulatoneb或权利要求5或6任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗心脏系统疾病的药物中的应用。
9.权利要求1所述的酰化间苯三酚杂萜hypulatonea和hypulatoneb或权利要求5或6任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血、心绞痛、心率失常及心力衰竭病的药物中的应用。
10.一种选择性的nav1.5钠离子通道抑制剂，其以权利要求1或2所示的酰基间苯三酚杂萜hypulatonea和/或hypulatoneb为活性成分。
技术总结