本发明涉及荧光检测试剂，具体属于一种香豆素衍生物mito-cys及其制备方法，以及该衍生物mito-cys在细胞线粒体半胱氨酸检测中的应用。
背景技术：
生物硫醇是细胞内主要的还原性物质之一，而作为细胞中硫代谢的中心，半胱氨酸(cys)在谷胱甘肽、神经递质牛磺酸、气体信号分子硫化氢及各种蛋白质的合成中扮演着系列关键的角色。cys作为细胞中的一线抗氧化物质，其浓度的异常与氧化应激存在密切的联系。细胞内线粒体是细胞的能量工厂，其有氧代谢过程是细胞中活性氧的主要来源。而细胞中氧化还原水平的失衡是导致氧化应激的直接因素。对细胞线粒体内氧化还原过程的深入认识将推动氧化应激诱发的系列重大疾病研究的突破性进展。因此，对细胞线粒体内cys的浓度检测具有重要的现实意义。
本发明提供了一种香豆素衍生物mito-cys及其制备方法，并基于该衍生物mito-cys实现了对细胞线粒体cys的特异性检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种香豆素衍生物及其制备方法，以及该衍生物可作为检测试剂用于cys的荧光检测；在检测cys时选择性高，灵敏度高；该衍生物可用于细胞线粒体内cys的半定量检测。
本发明提供的一种香豆素衍生物，中文名称为(e)-(3-(4-(3-(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-苯并吡喃-3-基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)-2-甲氧基苯氧基)-3-氧丙基)三苯基季膦盐，英文名称为(e)-(3-(4-(3-(7-(diethylamino)-2-oxo-2h-chromen-3-yl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3-oxopropyl)triphenylphosphonium，缩写为mito-cys。结构式为：
香豆素衍生物在磷酸缓冲溶液(ph8.0)中对cys显示了优良的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏。
mito-cys的制备：
1)将3-乙酰基-7-n，n-二乙胺基香豆素、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛按摩尔比为1：1.2溶于乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，然后柱色谱分离(洗脱剂按体积比乙酸乙酯：石油醚＝1：3)得到(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮；
2)将步骤1)所得(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮和2-羧乙基(三苯基季膦盐)按摩尔比为1：1溶于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1当量)和4-二甲氨基吡啶(0.2当量)，室温搅拌至反应完全；体系减压蒸干后柱色谱分离(洗脱剂按体积比甲醇：二氯甲烷＝1：20)得到目标化合物mito-cys。
本发明香豆素衍生物mito-cys的用途：该衍生物可以在ph8.0体系中对水环境和细胞线粒体中半胱氨酸特异性检测；所述的检测包含荧光检测和细胞成像检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、所述香豆素衍生物mito-cys合成简单，成本低廉，易于大规模生产；
2、所述检测方法能够实现cys的特异性检测，其它氨基酸不与mito-cys反应；
3、所述检测方法实现了细胞线粒体内cys特异性半定量检测；
4、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪和激光共聚焦显微镜即可实现。
附图说明：
图1香豆素衍生物mito-cys氢谱表征。
图2香豆素衍生物mito-cys碳谱表征。
图3香豆素衍生物mito-cys质谱表征。
图4实施例2mito-cys与cys作用的随时间荧光发射强度图。
图5实施例3mito-cys与各种分析物作用的荧光发射强度对比图。其中，1.gly；2.glu；3.met；4.ser；5.asp；6.tyr；7.his；8.lys；9.trp；10.asn；11.hcy；12.gsh；13.cys。
图6实施例4mito-cys对hela细胞内源cys进行特异性半定量检测。其中，1.pbs；2.100μmcys；3.200μmcys；4.2mmgsh；5.2mmgshee分别孵育后细胞在498nm处的荧光强度。
图7实施例5mito-cys对细胞内源cys成像图与商业化染料线粒体红的共定位成像图。其中a)绿色通道(mito-cys)成像；b)红色通道(线粒体红)成像；c)绿色、红色和明场的三通道叠加；d)红色通道和绿色通道荧光信号的相关性。
具体实施方式：
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护范围不受下述实施例的限制。
实施例1
mito-cys的制备及表征：
将3-乙酰基-7-n，n-二乙胺基香豆素(2mmol，0.52g)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(2.4mmol，0.36g)溶于乙醇中，加入3～5滴哌啶，回流20h至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，然后柱色谱分离(洗脱剂按体积比乙酸乙酯：石油醚＝1：3)得到(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮；
取(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮(1mmol，0.39g)和2-羧乙基(三苯基季膦盐)(1mmol，0.41g)溶于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1mmol，0.19g)和4-二甲氨基吡啶(0.2mmol，0.024g)，室温搅拌20h至反应完全；体系减压蒸干后柱色谱分离(洗脱剂按体积比甲醇：二氯甲烷＝1：20)得到目标化合物mito-cys。
1hnmr(600mhz，dmso)δ8.60(s，1h)，7.94–7.79(m，16h)，7.68(t，j＝13.6hz，2h)，7.48(s，1h)，7.36(d，j＝8.1hz，1h)，7.14(d，j＝7.9hz，1h)，6.82(d，j＝8.8hz，1h)，6.61(s，1h)，4.06–3.91(m，2h)，3.80(s，3h)，3.51(dd，j＝13.3，6.8hz，4h)，2.99(dd，j＝15.5，8.8hz，2h)，1.15(t，j＝6.5hz，6h)(图1)。13cnmr(151mhz，dmso)δ186.1，160.4，158.7，153.5，151.4，148.9，141.7，140.8，135.6，134.7，134.3，134.3，132.9，130.8，130.7，126.1，123.7，121.0，118.6，118.0，115.9，113.5，110.8，108.4，96.4，56.4，44.9，27.0，12.8(图2)。hr-ms[probe] :m/z理论值710.2666，实验得710.2692(图3)。
实施例2
配制ph＝8.0的磷酸缓冲溶液，配制2mmmito-cys的dmso溶液，配制20mmcys的水溶液；取2ml的磷酸缓冲溶液(ph8.0)、10μlmito-cys的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，加入20μlcys的水溶液，随时间在荧光分光光度仪上检测(414nm激发)。0-7min内，498nm的荧光强度逐渐增强，荧光发射图见图4。
实施例3
配制ph＝8.0的磷酸缓冲溶液，配制2mmmito-cys的dmso溶液，分别配制20mmcys，hcy，asn，asp，glu，gly，his，lys，met，ser，trp，tyr，和100mmgsh的水溶液；在13个荧光比色皿中，各加入2ml的磷酸缓冲溶液(ph8.0)和10μlmito-cys的dmso溶液，再分别加入20μlcys、hcy、asn、asp、glu、gly、his、lys、met、ser、trp、tyr和gsh的水溶液。10min后在荧光分光光度仪上检测各自的荧光强度(414nm激发)(见图5)。cys使得检测体系在498nm处荧光强度明显升高，其它的分析物没有引起检测体系明显的荧光强度变化。经实验证明，其它分析物不干扰体系对cys的检测。
实施例4
配置2mmmito-cys的dmso溶液，分别配制20mmcys、200mmgsh和200mmgshee的水溶液，将育有hela细胞的96孔酶标板(5×6)进行编号，分别加入1.pbs；2.100μmcys；3.200μmcys；4.2mmgsh；5.2mmgshee(终浓度)的溶液于37℃孵育1h。经pbs充分洗涤后，分别加入终浓度为5μmmito-cys的pbs溶液孵育20min后，在酶标仪中测试各孔中细胞在498nm处的荧光强度(414nm激发)(见图6)。分别预孵育100μmcys和200μmcys组细胞的荧光强度明显升高且与孵育cys的浓度呈正相关，而细胞预孵育2mmgshee(细胞膜通透的gsh供体)组与对照组的荧光强度接近。此实验证明mito-cys可以在细胞水平对cys进行特异性半定量检测。
实施例5
配置2mmmito-cys的dmso溶液，配制0.2μm商业化的线粒体红色染料-线粒体红的pbs溶液；取育有hela细胞的培养皿依次孵育终浓度为5μmmito-cys的pbs(10min)、终浓度为0.2μm的商业化线粒体红色染料-线粒体红的pbs(15min)后用激光共聚焦显微镜成像(见图7)。分别用405nm和561nm作为绿色通道(480-520nm)和红色通道(580-620nm)的激发光，绿色通道和红色通道均有强的荧光发射且荧光信号的相关性较高，皮尔森系数为0.82。此实验证明mito-cys可以检测线粒体中的cys。
1.一种香豆素衍生物mito-cys，其特征在于，结构式为：
2.如权利要求1所述的一种香豆素衍生物mito-cys的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将3-乙酰基-7-n，n-二乙胺基香豆素、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛溶于乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，然后柱色谱分离得到(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮；
2)将步骤1)所得(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮和2-羧乙基(三苯基季膦盐)溶于二氯甲烷中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，室温搅拌至反应完全；体系减压蒸干后柱色谱分离得到目标化合物mito-cys。
3.如权利要求2所述的香豆素衍生物mito-cys的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中3-乙酰基-7-n，n-二乙胺基香豆素和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛的摩尔比为1：1.2。
4.如权利要求2所述的香豆素衍生物mito-cys的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中柱色谱的洗脱剂配比为乙酸乙酯：石油醚＝1：3。
5.如权利要求2所述的香豆素衍生物mito-cys的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中(e)-7-(二乙氨基)-3-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-2h-苯并吡喃-2-酮、2-羧乙基(三苯基季膦盐)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1：1：0.2。
6.如权利要求2所述的香豆素衍生物mito-cys的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中柱色谱的洗脱剂配比为甲醇：二氯甲烷＝1：20。
7.如权利要求1所述的香豆素衍生物mito-cys在ph8.0的水环境中半胱氨酸检测中的应用。
8.如权利要求1所述的香豆素衍生物mito-cys在制备动物细胞线粒体半胱氨酸检测试剂中的应用。
技术总结