本发明属于药物化学领域，具体涉及一种核苷类似物的氘代物及其制备方法和用途。
背景技术：
：冠状病毒(coronavirus,cov)是一类对人具有严重危害的病原微生物。迄今为止，人类共发现了7种能感染人类的冠状病毒，分别为sars-cov、mers-cov、sars-cov-2(新型冠状病毒，也作2019-ncov)、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63及hcov-hku1。其中后四种冠状病毒仅可引起轻微感冒或腹泻症状。而无论是2003年的sars、2012年的mers还是2019年爆发一直持续到2020年的covid-19(新型冠状病毒引起的疾病)，都在全世界范围内对人们的生命健康造成了严重的威胁和影响。重症急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome，sars)为一种由sars冠状病毒(sars-cov)引起的急性呼吸道传染病，主要临床表现为：潜伏期1～16天，常见为3～5天。起病急，传染性强，以发热为首发症状，可有畏寒，体温常超过38℃，呈不规则热或弛张热，稽留热等，热程多为1～2周；伴有头痛、肌肉酸痛、全身乏力和腹泻。起病3～7天后出现干咳、少痰，偶有血丝痰，肺部体征不明显。病情于10～14天达到高峰，发热、乏力等感染中毒症状加重，并出现频繁咳嗽，气促和呼吸困难，略有活动则气喘、心悸，被迫卧床休息。这个时期易发生呼吸道的继发感染。病程进入2～3周后，发热渐退，其他症状与体征减轻乃至消失。肺部炎症改变的吸收和恢复则较为缓慢，体温正常后仍需2周左右才能完全吸收恢复正常。轻型患者临床症状轻。重症患者病情重，易出现呼吸窘迫综合征。儿童患者的病情似较成人轻。有少数患者不以发热为首发症状，尤其是有近期手术史或有基础疾病的患者。2003年，世卫组织公布的数据显示，全球因sars死亡人数919人，病死率近11％。中东呼吸综合症(middleeastrespiratorysyndrome,mers)是由mers-cov引起的严重呼吸系统疾病，主要症状包括发热、咳嗽、呼吸困难等，还可能出现腹泻、恶心和呕吐等消化系统症状，可能导致肺炎和肾功能衰竭等严重并发症。自2012年至今，mers-cov已导致全球超过2468人感染，超过851人死亡，根据世界卫生组织(who)的统计，mers患者死亡率在38％左右(431/1139)。根据世界卫生组织(who)的统计，mers患者死亡率在38％左右(431/1139)。新型冠状病毒引起疾病(covid-19)是由新型冠状病毒(sars-cov-2)感染所致。sars-cov-2感染的一般症状有：发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难；部分患者起病症状轻微，甚至可无明显发热。严重症状有：急性呼吸窘迫综合征、脓毒性休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍。sars-cov-2感染患者在鼻咽拭子、痰、呼吸道分泌物、血液、粪便等可检出sars-cov-2病毒阳性，患者胸部影像学显示，早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，胸腔积液少见。根据新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)，目前在临床上治疗新型冠状病毒感染者尚无特异性抗病毒药物，对感染患者，一般采用隔离和支持治疗，但可试用α-干扰素雾化吸入及洛匹那韦/利托那韦。正在进行的针对2019-ncov的临床试验药物包括中成药(如双黄连)或者抗其它病毒药物(如瑞德西韦(remdisivir)、阿比朵尔、达芦那韦等)，其在体外细胞试验对2019-ncov有抑制作用。其中瑞德西韦(remdisivir)结构如下所示，已在美国1例新型冠状病毒感染患者中显示较好的疗效(firstcaseof2019novelcoronavirusintheunitedstates，michelle，holshue，chaseetal.,newengland,2020january31doi:10.1056/nejmoa2001191))。在2020年2月正式引入中国，目前正在进行新型冠状病毒感染的iii期临床试验。瑞德西韦(remdisivir)是一种新型的腺苷类似物单磷酸酰胺前药，在细胞内可转变成药理学活性形式三磷酸核苷(ntp)，抑制病毒的rna聚合酶，抑制病毒核酸合成。目前正在进行埃博拉病毒(ebolavirus)感染治疗的iii期临床研究阶段。同时也发现其具有广谱抗病毒活性，在体外对呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)、鸠宁病毒(juninvirus)、拉沙热病毒(lassafevervirus)、mers-cov、sars以及尼帕病毒(nipahvirus)等多种rna病毒具有抗病毒活性。瑞德西韦化合物在中国专利cn103052631a(2016.2.24)中公开，后续公开了用途专利cn105899216a(2016.08.24)、cn107073005a(2017.08.18)、cn107074902a(2017.08.18)、cn108348526a(2018.07.31)，晶型专利cn110636884a(2019.12.31)。将药物活性分子基团中的氢替换成同位素氘，因其无毒无放射性，又比碳氢键稳定约6～9倍，可以封闭代谢位点而延长药物的半衰期，从而降低治疗剂量，同时又不影响药物的药理活性，而被认为是一种优良的修饰方法。目前还未有瑞德西韦化合物的氘代产物研究报道，鉴于其在控制新型冠状病毒疫情中具有重要作用，因此研究它的氘代物，进一步提高瑞德西韦的体内代谢并扩大治疗窗范围，具有重要的临床意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种核苷类似物的氘代物及其制备方法和用途，具体为瑞德西韦的氘代物及其制备方法和用途。本发明提供式i所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，其中，r1～r35各自独立地选自氢或氘，且r1～r35中至少有一个选自氘。进一步地，化合物如式ii所示，其中，r1～r22各自独立地选自氢或氘，且r1～r22中至少有一个选自氘。进一步地，化合物如式iii所示，其中，r13～r21各自独立地选自氢或氘，且r13～r21中至少有一个选自氘。进一步地，式iii中，r13～r17全部为氘，r18～r21各自独立地选自氢或氘；或r19～r21全部为氘，r13～r18各自独立地选自氢或氘；或r18选自氘，r13～r17和r19～r21各自独立地选自氢或氘。进一步地，化合物选自如下结构：进一步地，化合物合成路线如下：，其中，合成路线包括以下步骤：(1)化合物a与化合物b酯化反应得化合物c；(2)化合物c与化合物d进行n-磷酰化反应；然后加入化合物e进行亲核取代反应，得化合物f；(3)化合物f与化合物g在催化剂和缚酸剂作用下发生反应，生成化合物h；(4)化合物h脱保护获得目标产物式iii化合物；其中，r13～r21的定义如权利要求3所述，r36选自氢或氘。进一步地，在步骤(1)中，所述的酯化反应所用催化剂为二氯亚砜，二氯亚砜与化合物a的摩尔比为1.0～2.0，反应温度20-80℃，反应时间4～8h；在步骤(2)中，所用有机溶剂为二氯甲烷；在-78℃先后滴加化合物d和三乙胺，0～25℃保温反应3～6h，hplc监控化合物c完成转化，其中，hplc条件为：流动相为10％乙腈(含0.05％三乙胺)：90％水(含0.05％三乙胺)，时间为10min，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，柱子为welchultimateaq-c18，5um，4.6x200mm，然后0～10℃加入4-硝基苯酚和三乙胺，10～20℃下保温搅拌2～4h，反应液在20～25℃下减压浓缩除去有机溶剂，浓缩物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝8:1)分离纯化获得化合物f的消旋体粗品，该粗品用二异丙醚打浆、过滤，其中，二异丙醚的使用体积为粗品重量的2～6倍体积，优选为4倍体积，滤饼40～50℃真空干燥4h得光学纯的化合物f；在步骤(3)中，所用有机溶剂可选乙腈，四氢呋喃和甲苯，优选乙腈，所用催化剂可选氯化镁、氯化锌、氯化锡、氯化亚锡，优选氯化镁，缚酸剂可选三乙胺、吡啶、n,n-二异丙基乙胺，优选n,n-二异丙基乙胺，反应温度50～80℃，反应时间0.5～2h，反应液经减压浓缩除去有机溶剂，向浓缩物加入乙酸乙酯，所得溶液先后用5％柠檬酸钠、饱和氯化铵溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，浓缩有机相后经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)纯化得化合物h；在步骤(4)中，所用有机溶剂可选乙腈、四氢呋喃和丙酮，所用试剂为盐酸，盐酸与化合物h摩尔比1.0～1.5，反应温度0～15℃，反应时间1～3h。反应结束后，在0～5℃下滴加饱和碳酸氢钠水溶液调ph至7～8，反应液用乙酸乙酯萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后减压浓缩得产品粗品，经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离纯化得目标化合物式iii化合物。本发明提供化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药在制备抗冠状病毒药物中的用途，所述冠状病毒选自mers-cov、sars-cov、sars-cov-2，更优选地，所述病毒为sars-cov-2。本发明提供化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药在制备预防和/或治疗冠状病毒感染疾病的药物中的用途，所述冠状病毒感染疾病选自mers、sars、covid-19，优选为covid-19。本发明提供一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物所述化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。本发明化合物在保留对sars-cov-2有效性的基础上，较为显著地延长了半衰期，对剂量的需求降低，减小副作用，同时扩大治疗窗范围，因此，本发明用于制作治疗冠状病毒感染相关疾病的药物具有非常好的前景本发明所述氘为氢(h)的同位素，也被称为重氢，元素符号一般为d或2h，氘原子核中有一个质子和一个中子，其相对原子量为2。本发明所述“氘代物”是指分子中至少一个氢被氘取代的产物。本发明所述“药学上可接受的盐”是指利用该化合物的游离碱与无机或有机酸直接成盐反应得到的产物。其中，无机或有机酸可选自盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸、苦味酸、柠檬酸、马来酸、甲烷磺酸、三氟甲烷磺酸、乙烷磺酸、对甲苯磺酸等。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。实施例1本发明化合物1的制备合成路线为：具体制备方法包括：向反应瓶中加入l-丙氨酸-3,3,3-d3(a-1,1.00g,0.011mol)和2-乙基丁醇(b,10ml)，反应体系在0℃下搅拌5min，缓慢滴加二氯亚砜(1.44g，0.012mol)，加热至60℃搅拌并保温搅拌6h，减少浓缩除去大部分溶剂，待浓缩物降温至室温后加入30ml乙酸乙酯并搅拌60min，抽滤得类白色固体即化合物c-1(2.11g，收率90.2％，质谱检测丰度99.3atom％d)。取化合物c-1(1.50g，0.007mol)和二氯甲烷30ml，体系搅拌降温至-78℃，加入苄氧二氯磷酸酯(d,1.48g，0.007mol)，然后缓慢滴加三乙胺(0.71g，0.007mol)。体系升温至20℃并保温搅拌5h,hplc监控反应完全(10％乙腈(含0.05％tfa)：90％水(含0.05％tfa)，10min，1.0ml/min，30℃，welchultimateaq-c18，5um，4.6x200mm)。体系降温至0℃并加入4-硝基苯酚(e,0.88g，0.006mol)，然后缓慢滴加三乙胺(0.71g，0.007mol)，反应升温至20℃并搅拌3h。反应结束，20～25℃减压浓缩除去溶剂，浓缩物经硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯＝8:1)分离得无色半固体(2.27g，71.5％)。将所得半固体用10ml二异丙醚搅拌24h后抽滤，滤饼为化合物f-1，40℃真空干燥4h得0.86g，收率38.0％。1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ8.37-8.29(m,2h),7.55-7.49(m,2h),7.48-7.40(m,2h),7.29-7.21(m,3h),6.71(m,1h),4.12-4.07(m,1h),4.01(d,j＝5.7hz,2h),1.43(m,1h),1.31-1.21(m,4h),0.80(t,j＝7.4hz,6h)；lcmsm/z454.2[m h].取化合物f-1(0.65g，0.001mol)和化合物g(0.33g，0.001mol)，氯化镁(0.10g，0.001mol)和10ml乙腈，50℃搅拌10min，然后加入n,n-二异丙基乙胺(0.39g，0.003mol)，搅拌20min后降温至20℃，30～40℃减压浓缩除去乙腈，然后加入100ml乙酸乙酯，反应液先后用5％柠檬酸水溶液(20ml)，饱和氯化铵水溶液(20ml)，5％碳酸氢钠水溶液(20ml)，和饱和食盐水(20ml)洗涤，有机相减压浓缩后经柱色谱分离纯化(石油醚-乙酸乙酯＝4:1)得类白色固体即化合物h-1(0.47g，73.0％)。1h-nmr(400mhz,methanol-d4):δ7.89(s,1h),7.28–7.23(m,2h),7.09–7.05(m,3h),6.83(m,2h),5.30(d,j＝6.6hz,1h),4.91(m,1h),4.57-4.51(m,1h),4.35-4.22(m,2h),4.00(m,1h),3.89(m,1h),3.80(m,1h),1.60(s,3h),1.49-1.43(m,1h),1.40(s,3h),1.36-1.23(m,4h),0.86(t,j＝7.4hz,6h)；lcmsm/z646.1[m h].取化合物h-1(0.40g，0.0006mol)和10mlthf，体系搅拌降温至5℃后滴加浓盐酸(0.07g，0.0007mol)，保温5℃搅拌2h，加入5ml水，用饱和碳酸氢钠溶液调ph至7～8，体系用乙酸乙酯萃取(10ml*2)，经饱和食盐水(5ml)洗涤后减压浓缩的类白色固体即化合物1粗品，经柱色谱分离(石油醚-乙酸乙酯＝2:1)纯化得0.27g，收率75.0％。1hnmr(400mhz,cd3od):7.81(s，1h)，7.31-7.25(m，2h)，7.20-7.07(m，3h)，6.91-6.80(m,2h)，1.49-1.38(m，1h)，1.32-1.21(m,4h),0.84(m,6h).lcmsm/z606.1[m h].实施例2～7化合物2～7的制备化合物2～7的制备选取不同的底物a系列和d系列，采用化合物1的合成路线和操作步骤制得，具体见表1。表1化合物2～7的制备通过以下实验例证明本发明化合物的有益效果。实验例1本发明化合物对hae细胞体系中sars-cov-2的有效率1、实验方法将hae细胞铺于384孔板上，并培养24小时。将sars-cov-2接种于培养板上，再将细胞于37℃培养72小时。利用本发明化合物1-7以及remdisivir分别给药。24小时候，检测病毒因子。并计算半数有效浓度ec50。2、实验结果见表2表2本发明化合物对sars-cov-2的有效率化合物ec50(um)remdisivir0.050化合物10.061化合物20.051化合物30.073化合物40.066化合物50.053化合物60.064化合物70.070通过以上结果，可以看出，在本发明化合物1-7，即在remdisivir特定结构的氘取代物，对sars-cov-2的体外有效率与remdisivir相当，其中化合物2和化合物5对sars-cov-2的体外有效率几乎没有变化，保留了remdisivir的有效性。实施例2本发明化合物在动物体内半衰期的研究取sd大鼠10只，采用尾静脉注射进行本发明化合物1-7以及remdisivir的给药，每只动物分别在8个时间点采血，绘制血药浓度曲线，根据结果计算药物半衰期。试验结果见表3。表3本发明化合物动物体内半衰期结果通过半衰期试验结果，可以看到，本发明化合物1和化合物2通过特定位置的氘取代，实现了对remdisivir半衰期延长的效果，其延长效果分别为化合物1延长了13.2％，化合物2延长了26.7％。化合物3～5半衰期基本与remdisivir相当，化合物3和化合物5稍长，化合物6-7半衰期比remdisivir稍短。综上所述，本发明化合物1和2在保留对sars-cov-2有效性的基础上，较为显著地延长了半衰期，对剂量的需求降低，减小副作用，同时扩大治疗窗范围，因此，本发明用于制作治疗冠状病毒感染相关疾病的药物具有非常好的前景。当前第1页1 2 3
技术特征：1.式i所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，其中，
r1～r35各自独立地选自氢或氘，且r1～r35中至少有一个选自氘。
2.根据权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，其特征在于，化合物如式ii所示，
其中，r1～r22各自独立地选自氢或氘，且r1～r22中至少有一个选自氘。
3.根据权利要求2所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，其特征在于，化合物如式iii所示，
其中，r13～r21各自独立地选自氢或氘，且r13～r21中至少有一个选自氘。
4.根据权利要求3所述的化合物，或其药学上可接受的盐、或其前药，其特征在于，式iii中，
r13～r17全部为氘，r18～r21各自独立地选自氢或氘；
或r19～r21全部为氘，r13～r18各自独立地选自氢或氘；
或r18选自氘，r13～r17和r19～r21各自独立地选自氢或氘。
5.根据权利要求4所述的化合物，或其药学上可接受的盐、或其前药，其特征在于，其中，化合物选自如下结构：
6.制备权利要求3～5任意一项所述化合物的方法，其特征在于，合成路线如下：
，
其中，合成路线包括以下步骤：
(1)化合物a与化合物b酯化反应得化合物c；
(2)化合物c与化合物d进行n-磷酰化反应；然后加入化合物e进行亲核取代反应，得化合物f；
(3)化合物f与化合物g在催化剂和缚酸剂作用下发生反应，生成化合物h；
(4)化合物h脱保护获得目标产物式iii化合物；
其中，r13～r21的定义如权利要求3所述，r36选自氢或氘。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
在步骤(1)中，所述的酯化反应所用催化剂为二氯亚砜，二氯亚砜与化合物a的摩尔比为1.0～2.0，反应温度20～80℃，反应时间4～8h；
在步骤(2)中，所用有机溶剂为二氯甲烷；在-78℃先后滴加化合物d)和三乙胺，0～25℃保温反应3～6h，hplc监控化合物c完成转化，其中，hplc条件为：流动相为10％乙腈(含0.05％三乙胺)：90％水(含0.05％三乙胺)，时间为10min，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，柱子为welchultimateaq-c18，5um，4.6x200mm，然后0～10℃加入4-硝基苯酚和三乙胺，10～20℃下保温搅拌2～4h，反应液在20～25℃下减压浓缩除去有机溶剂，浓缩物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝8:1)分离纯化获得化合物f的消旋体粗品，该粗品用二异丙醚打浆、过滤，其中，二异丙醚的使用体积为粗品重量的2～6倍体积，优选为4倍体积，滤饼40～50℃真空干燥4h得光学纯的化合物f；
在步骤(3)中，所用有机溶剂可选乙腈，四氢呋喃和甲苯，优选乙腈，所用催化剂可选氯化镁、氯化锌、氯化锡、氯化亚锡，优选为氯化镁，缚酸剂可选三乙胺、吡啶、n,n-二异丙基乙胺，优选为n,n-二异丙基乙胺，反应温度50～80℃，反应时间0.5～2h，反应液经减压浓缩除去有机溶剂，向浓缩物加入乙酸乙酯，所得溶液先后用5％柠檬酸钠、饱和氯化铵溶液、5％碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤，浓缩有机相后经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)纯化得化合物h；
在步骤(4)中，所用有机溶剂可选乙腈、四氢呋喃和丙酮，所用试剂为盐酸，盐酸与化合物h摩尔比1.0～1.5，反应温度0～15℃，反应时间1～3h。反应结束后，在0～5℃下滴加饱和碳酸氢钠水溶液调ph至7～8，反应液用乙酸乙酯萃取，有机相经饱和食盐水洗涤后减压浓缩得产品粗品，经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离纯化得目标化合物式iii化合物。
8.权利要求1～6任意一项所述化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药在制备抗冠状病毒的药物中的用途，所述冠状病毒选自mers-cov、sars-cov、sars-cov-2，更优选地，所述冠状病毒为sars-cov-2。
9.权利要求1～6任意一项所述化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药在制备预防和/或治疗冠状病毒感染疾病的药物中的用途，所述冠状病毒感染疾病选自mers、sars、covid-19，优选为covid-19。
10.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是以权利要求1～6任意一项所述化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。
技术总结本发明提供了式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药，其中，R1～R35各自独立地选自氢或氘，且R1～R35中至少有一个选自氘。本发明还进一步提供了该化合物的制备方法和用途。实验证明，该化合物对于SARS‑CoV‑2有显著的抑制作用，且较瑞德西韦半衰期长，本发明在制备治疗和/或预防本SARS‑CoV‑2引起的疾病的药物上具有非常好的应用前景。
技术研发人员：温万东;陈齐;石万棋;邓聪;史焱;唐伟;陈科;吴瑕;代明星;唐跃军
受保护的技术使用者：成都阿奇生物医药科技有限公司
技术研发日：2020.02.28
技术公布日：2020.06.05
