本发明涉及鼠李糖脂钙制备方法及在洗护用品、化妆品中的用途。
背景技术：
鼠李糖脂是一种阴离子生物表面活性剂，主要是通过假单胞菌或伯克氏菌类发酵得到。鼠李糖脂被发现有58种化学结构，可主要分为四大类：单鼠李糖单脂质同系物、单鼠李糖双脂质同系物、双鼠李糖脂单脂质同系物、双鼠李糖双脂质同系物。发酵得到的鼠李糖脂是多种同系物的混合物，可溶于水，一般以混合物的膏状存在。由于鼠李糖脂具有良好的抗菌、洗涤、润湿、渗透和乳化等表面活性作用，因而在医疗、环境、石油、食品等领域具有广大的潜在市场。且鼠李糖脂具有抗菌、抗皱、抗衰老等生物活性、低毒性和低皮肤刺激性，这些特性使其在化妆品行业中也具有巨大的竞争力。
鼠李糖脂的纯化分离非常困难。含鼠李糖脂的发酵液中具有十分复杂的成分，除鼠李糖脂外还含有菌体、蛋白质、多糖、色素、甘油酯及脂肪酸等多种杂质，因而分离比较困难且成本较高。目前已报道的鼠李糖脂的分离提纯方法，主要有酸沉法、膜分离法、溶剂萃取法、柱层析法和相转移法等。一般地，先使用酸调节ph至4.0左右，使鼠李糖脂发生沉淀后进行粗提纯，再利用有机溶剂如甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、己烷等进行萃取，此方法消耗大量有机溶剂、能耗高，且所得到的产品纯度差，呈深棕色膏状，使用便利性差。随后，m.heyd等人利用甲醇和ph调节鼠李糖脂胶束尺寸，结合聚砜膜的超滤膜法，进行两步法分离鼠李糖脂：第一步超滤膜截住大尺寸的鼠李糖脂胶束和大分子蛋白质，而透过小分子杂质；第二步，加甲醇减小鼠李糖脂胶束尺寸，而截住大分子蛋白。此方法有效去除了小分子杂质和蛋白质等杂质，使纯度比较高，但是需要特殊、高价的超滤膜装置，膜污染问题严重，且有机溶剂作用下的膜容易发生变形。柱层析法通过甲醇、氯仿的混合溶液进行梯度洗脱，所需时间长及有机溶剂消耗量大，成本极高。德国赢创(2013)采用相转移法，即根据不同ph下鼠李糖脂在有机溶剂相中和氢氧化钾溶液中分配系数不同(各自溶解度不同造成)，先转移至溶剂相，后转移到碱溶液中，除去亲水性和疏水性杂质，此操作法繁琐，分离收率低。
而且，上述方法得到的最终产品形式不是膏体就是水溶液，不易运输、保存，使用不方便，且颜色深，另外还存在分离成本高、纯度与收率差的缺陷。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鼠李糖脂钙及其制备方法。
本发明利用含钙离子与鼠李糖脂发生络合反应，生成不溶于水的鼠李糖脂钙。然后，利用醇类和酯类有机溶剂易溶解鼠李糖脂钙而无法溶解其它杂质如多糖、蛋白质和长链脂肪酸等的物化性质，使鼠李糖脂钙得到很好的分离，本方法所得的鼠李糖脂钙产品纯度高，不涉及有害有毒的有机溶剂，不仅适合于普通工农业，也适合于日化行业。具体地，本发明的有益之处，详述如下。
本发明的目的在于针对现有鼠李糖脂产品不易保存和运输的不足，提供一种将鼠李糖脂转变为鼠李糖脂钙及其分离纯化方法，包括下列步骤：
(1)将鼠李糖脂发酵液或含鼠李糖脂溶液在搅拌下滴加含钙离子的溶液，经过离心获得粗鼠李糖脂钙沉淀。
(2)将步骤(1)中收集的粗鼠李糖脂钙沉淀溶解在有机溶剂中，离心除去不能溶于有机溶剂的杂质。
(3)将步骤(2)中收集的鼠李糖脂钙的有机溶液经蒸发后，得到鼠李糖脂钙粉末。
进一步地，所述步骤(1)中的鼠李糖脂发酵液或含鼠李糖脂的溶液先通过离心去除固体杂质。
所述步骤(1)中的搅拌方式采用机械搅拌。
进一步地，所述步骤(1)中，离心的条件为：在转速为1000-5000rmp下离心10-30分钟。
进一步地，所述步骤(1)中，鼠李糖脂和钙离子的摩尔比例为1:1-1：5，优选地，采用1:1.2-1：3。
进一步地，所述步骤(1)中，滴加含钙离子的溶液后反应0.1～4h。反应温度为10℃～60℃，优选地，采用20℃～50℃。
进一步地，所述步骤(2)中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯等，优选地，采用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇作为有机溶剂。
进一步地，所述步骤(3)中蒸发步骤采用减压或常压蒸馏。
本发明还提供了一种上述鼠李糖脂钙在洗护用品、化妆品中的用途。
本发明的鼠李糖脂钙具有同鼠李糖脂类似的主体结构，只是鼠李糖脂的氢根离子被钙离子所取代(见图1和图2的核磁与分析结构鉴定)。本发明得到的鼠李糖脂钙不是作为膏体和溶液，鼠李糖脂钙不溶于中性的纯水，呈粉末状，但溶于醇类有机溶剂的，色泽浅、易运输和保存。使用时在其它物质(如氢根离子)存在时可被解除络合的钙离子，成为鼠李糖脂。鼠李糖脂钙与鼠李糖脂具有相似的结构好性质，可替代鼠李糖脂应用在各个领域。本发明同时提供高效、方便和快速的鼠李糖脂钙的制备方法，该方法使用较少的溶剂，且使用的溶剂是绿色的，皆可使用可持续资源或直接微生物发酵得到的。同时温度要求不高，无需太多能耗涉及的设备简单，技术难度低。
附图说明
图1为1h-nmr分析谱图，其中，a为鼠李糖脂钙，b为鼠李糖脂；
图2为红外图谱，其中，a为鼠李糖脂钙，b为鼠李糖脂。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中，鼠李糖脂发酵液由铜绿假单胞菌发酵获得，作为一种方式，可通过如下方式发酵，但不限于此：
发酵菌种为铜绿假单胞菌zju-211(pseudomonasaeruginosazju-211，菌种保藏号：cctccno:m209237)，将菌种接种于60ml的种子培养基，温度为38℃，摇床转速200rpm，培养48h得到摇瓶菌种。种子培养基组成如下：一级大豆油，40g/l：nano3，4g/l；nacl，1.5g/l；kcl，1.5g/l；cacl2·2h2o，0.2g/l；kh2po4，4g/l；na2hpo4·12h2o，4g/l；mgso4，0.3g/l；微量元素，2.5ml/l。所述微量元素组成如下:fecl3·6h2o0.08g/l，znso4·7h2o0.75g/l，cuso4·5h2o0.075g/l，mnso4·h2o0.75g/l，h3bo3，0.15g/l。
将摇瓶菌种接种到3吨发酵培养基中，接种量2％(v/v)，发酵过程温度控制在38℃，通气量为1.0vvm，搅拌转速300rpm，发酵周期4天。发酵培养基组成如下：一级大豆油，70g/l；nano3，8g/l；nacl，1.5g/l；kcl，1.5g/l；cacl2·2h2o，0.2g/l；kh2po4，4g/l；na2hpo4·12h2o，4g/l；mgso4，0.3g/l；微量元素，2.5ml/l。所述微量元素组成如下:fecl3·6h2o0.08g/l，znso4·7h2o0.75g/l，cuso4·5h2o0.075g/l，mnso4·h2o0.75g/l，h3bo3，0.15g/l。
发酵结束后，得到鼠李糖脂50g/l发酵液约1.6吨。
实施例1以鼠李糖脂发酵液为初始原料制备脂肪酸钙：
将500ml50g/l鼠李糖脂发酵液经高温灭菌后，发酵液颜色呈深棕色。在1000rmp下离心10min，弃去沉淀后，置于1000ml圆底烧瓶中。在室温下，在磁力搅拌下缓慢加入cacl2水溶液，使得鼠李糖脂：cacl2≈1:0.5(摩尔比)，反应0.1h后停止。在转速为1000rmp下离心10min，收集底部鼠李糖脂钙沉淀物。进一步采用甲醇进行充分溶解鼠李糖脂钙沉淀物，于转速为1000rmp下离心10min，得到鼠李糖脂的有机溶液。将鼠李糖脂钙的有机溶液蒸发后，得到19.2g鼠李糖脂钙粉末,且该粉末颜色呈浅黄色，经高效液相色谱分析，其鼠李糖脂含量为91％，收率约80％。
将制备得到的鼠李糖脂钙和鼠李糖脂同时送样进行1h-nmr鉴定，溶剂为氘代甲醇。鼠李糖脂钙的核磁谱图见图1a。分析结果如下：1hnmr(500mhz,methanol-d4)δ5.25(p,j＝6.4hz,1h),4.05(p,j＝6.0hz,1h),3.77–3.58(m,3h),3.37(dt,j＝16.3,9.4hz,1h),2.63–2.51(m,3h),2.49(dd,j＝15.2,5.8hz,1h),1.63(q,j＝7.3,6.6hz,2h),1.55(q,j＝7.2,6.8hz,2h),1.38–1.21(m,25h),0.90(t,j＝6.7hz,6h)，共10个主要峰；鼠李糖脂的核磁谱图见图1b。分析结果如下：1hnmr(500mhz,methanol-d4)δ5.33(dd,j＝8.7,4.8hz,1h),4.11(dq,j＝8.9,5.0hz,1h),3.84–3.62(m,3h),3.36(dq,j＝19.0,9.5hz,1h),2.47(dddd,j＝32.0,27.6,15.0,6.4hz,3h),1.63–1.50(m,4h),1.34–1.27(m,19h),1.24(t,j＝5.3hz,3h),0.90(td,j＝7.0,2.2hz,5h)，共9个主要峰。对比现有的核磁结果，羧基(-cooh)的氢都没有在这两种物质中被检测出来，可能是羧基在这两种物质中含量较少，所以检测信号弱，都符合文献(monteiro,chemistry&physicsoflipids，2007)的核磁分析谱图。该结果说明鼠李糖脂钙的主体结构与鼠李糖脂类似。
图2a为鼠李糖脂钙的红外图谱，图2b为鼠李糖脂的红外。对比两张红外光谱图，可以发现，两种物质具有相似的峰形：1165、1123cm-1是c-o-c伸缩振动产生的羧酸酯基团吸收峰，1379cm-1处的c-h或o-h变形振动引起吸收峰；1730cm-1是c＝o伸缩振动产生的典型吸收峰；3347cm-1处的吸收峰是分子中oh伸缩振动所致；2924、2855cm-1是亲油的碳氢链中甲基和亚甲基c-h伸缩振动产生的吸收峰。两者显著不同的峰为：图2a中1560～1570cm-1和1380～1460cm-1期间出现的两个较强的吸收峰，是羧酸根负离子的反对称伸缩振动峰，因为糖脂钙是二价金属盐，同时羧酸根负离子中两个c-o键完全平均化，其伸缩振动发生强烈偶合，所以导致其吸收带向低频方向移动。
根据红外谱图分析，李糖脂钙为两分子鼠李糖脂的羧酸基团中各自氢离子被钙离子取代所产生的化合物，但因为鼠李糖脂中单/双鼠李糖和单/双脂肪酸可能变化，产生多种组成结构的鼠李糖脂钙。以下列出三种单、双鼠李糖脂钙的结构式：
其中，n、m、x、y均为正整数，z、l为0或正整数。制备得到的大多数为两条脂肪酸的鼠李糖脂钙，即z、l等于1时。
本发明的鼠李糖脂钙的主体结构与鼠李糖脂类似，因而其性质、用途也与鼠李糖脂相似。但鼠李糖脂钙不溶于中性的纯水，呈粉末状，相比于鼠李糖脂其色泽浅、易运输和保存。
实施例2以鼠李糖脂膏体为制备脂肪酸钙：
将25g鼠李糖脂(纯度80％，由发酵液酸沉后有机溶剂萃取得到)溶于100ml稀碱水溶液中，在5000rmp下离心10min，弃去不容物质后放入250ml圆底烧瓶中。烧瓶置于50℃恒温水浴锅中，在机械搅拌下缓慢加入ca(oh)2溶液，使得鼠李糖脂：ca(oh)2≈1:5(摩尔比)，反应4h后停止。在转速为5000rmp下离心10min，得到粗鼠李糖脂钙沉淀。在转速为5000rmp下离心10min，获得鼠李糖脂沉淀。将鼠李糖脂沉淀烘干后，采用异丙醇进行多次洗涤，于转速为5000rmp下离心10min，得到鼠李糖脂的有机溶液。将鼠李糖脂钙的有机溶液进行减压蒸馏后，得17g鼠李糖脂钙粉末，纯度91.5％。
实施例3以鼠李糖脂溶液为原料制备鼠李糖脂钙：
将30wt％鼠李糖脂溶液500ml置于1000ml圆底烧瓶中，于95℃油浴锅中，在搅拌下缓慢加入饱和cacl2溶液，使得鼠李糖脂：cacl2≈1:5(摩尔比)，反应4h后停止。在转速为5000rmp下离心30min，得到粗鼠李糖脂钙沉淀。将鼠李糖脂沉淀烘干后，加入有机溶剂乙酸乙酯500ml进行多次溶解，于转速为5000rmp下离心30min，得到鼠李糖脂的有机溶液。将鼠李糖脂钙的有机溶液减压蒸馏后，得135g鼠李糖脂钙粉末,颜色为奶白色。
实施例4鼠李糖脂钙粉末的保存特性：
将上述实施例5得到的135g鼠李糖脂钙粉末,放入250ml广口瓶中，并保存在室温下(20-30度)两个月后，称重为125.5g,颜色仍呈奶白色。
实施例5鼠李糖脂钙粉末作为洗护用品的使用：
取鼠李糖脂钙粉末200g与滑石粉10、小苏打5g均匀混合，制备可久存、无需添加防腐剂的洗颜粉。2g洗颜粉溶于100ml自来水中，可观察溶液起泡性较强，可直接用于皮肤清洗，洗后肤感好。这样直接将粉末可用作个人护理、家居等各种清洗产品，而且无需添加防腐剂、抗菌剂。
实施例6鼠李糖脂钙粉末作为生物农药的使用：
鼠李糖脂钙粉末代替表面活性剂与三环唑、凹突棒混合制备25％三环唑可湿性粉,使用效果好。
实施例7鼠李糖脂钙粉末作为化妆品乳化剂的使用：
用上述实施例3得到的鼠李糖脂钙粉末制备一种护肤型面霜，由以下原料(重量百分比)制成：
1,3-丁二醇5％-10％；
甘油3％-8％
鼠李糖脂钙10％-15％
鼠李糖1.0％-3.0％
异十六烷1％-4％
角鲨烷1％-4％
木糖醇0.5％-1.0％
食用乙醇1.5％-3.5％
卡波姆0.5％-0.8％
三乙醇胺0.3％-0.5％
高分子透明质酸钠0.05％-0.2％
防腐剂0.2％-0.5％；
去离子水：余量
按照以上配方制备的面霜不黏腻、涂展性好、滋润效果良好，有不错的使用体验。
应当说明的是，虽然本发明以较佳实施例揭露如上，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，然其并非用以限定本发明，在不脱离本发明的精神和范围内，所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.鼠李糖脂钙，所述鼠李糖脂钙由鼠李糖脂与钙离子络合得到，其结构式为：
其中，n、m、x、y均为正整数，z、l为0或正整数。
2.一种权利要求1所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将鼠李糖脂发酵液或含鼠李糖脂的溶液在搅拌下滴加含钙离子的溶液，经过离心获得粗鼠李糖脂钙沉淀。
(2)将步骤(1)中收集的粗鼠李糖脂钙沉淀溶解在有机溶剂中，离心除去不能溶于有机溶剂的杂质。
(3)将步骤(2)中收集的鼠李糖脂钙的有机溶液经蒸发后，得到鼠李糖脂钙粉末。
3.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的鼠李糖脂发酵液或含鼠李糖脂的溶液先通过离心去除固体杂质。
4.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的搅拌方式采用机械搅拌。
5.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，离心的条件为：在转速为1000-5000rmp下离心10-30分钟。
6.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，鼠李糖脂和钙离子的摩尔比例为1:1-1：5，优选地，采用1:1.2-1：3。
7.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，滴加含钙离子的溶液后反应0.1～4h。反应温度为10℃～60℃，优选地，采用20℃～50℃。
8.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯等，优选地，采用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇作为有机溶剂。
9.根据权利要求2所述鼠李糖脂钙的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中蒸发步骤采用减压或常压蒸馏。
10.一种权利要求1所述鼠李糖脂钙在洗护用品、化妆品、表面活性剂中的用途。
技术总结