本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体、其合成方法及应用。
背景技术：
目前人们多通过对天然核苷酸进行结构改性，设计并合成化学结构修饰的人工核酸，并以其为基础开展核酸化学、开发新型核酸药物以及设计新型核酸探针的研究(chemistry&biology,2012,19,1360.)。目前构建人工核苷的方法主要有修改碱基结构(acc.chem.res.2002,35,936.)、核糖的结构(science,2012,336,341.)和构型(acc.chem.res.,1999,32,301)以及磷酸二酯键的改进(j.biol.chem.,2001,276,38536.)来设计新型人工核酸。
非天然寡聚核苷酸在基因治疗、生物探针以及生物材料等领域有着极其重要的应用(org.biomol.chem.,2007,5,3260.)，为了调节核酸的化学和生物稳定性以及各种相关的物理化学性质，人们对核苷中的糖环、碱基以及磷酸二酯键进行不同程度的化学修饰。其中基于磷酸二酯键的化学修饰对于改善核酸的化学和生物学稳定性、调节核酸二级结构以及物理化学性质具有重要意义。
现有非天然寡聚核苷酸存在的问题：1.碱基的修改相对简单，但对于核酸药物的疗效改进作用有限；2.糖环的修饰对于改善非天然核苷与天然核苷的结合能力，增强双链稳定性具有较好的效果，但是对糖环的修改需要繁复的合成工作；3.基于替换磷酸二酯键的化学修饰对于调节非天然核酸的化学稳定性、抗酶解活性、以及对特定蛋白的识别能力均有重要的意义，目前在dna或者rna中将磷酸二酯键部分替换为酰胺键均被证实具有改善酶解和识别能力的性质。但是目前引入的酰胺单元均为单酰胺结构，双酰胺结构对于特定结构的蛋白及抗体具有特异性的识别能力。
技术实现要素：
本发明以dna中的磷酸二酯键作为改造位点，通过简单的醚化、酰胺化、还原和酯化等标准的有机单元反应，将带有负电荷的磷酸二酯键替换为不带电荷的丁二酰胺键，得到了一种非天然寡聚核苷酸，极大拓展了人工核酸的种类，为设计新型非天然寡聚核苷酸提供了新的模块。具体技术方案如下：
一种含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体，化学结构如下：
上述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体，由齐多夫定经一系列有机反应制备而成；所述有机反应包括醚化、酰胺化、还原以及酯化反应。具体步骤如下：
(1)以齐多夫定为起始原料，将其5’羟基进行保护后再将其3’的叠氮还原为氨基，所得的产物再与丁二酸酐进行开环反应得到含有羧基的脱氧胸苷单元；
(2)将步骤1)中得到的含有羧基的脱氧胸苷单元与5’氨基修饰的脱氧胸苷在缩合试剂作用下进行选择性酰胺化反应；
(3)将步骤2)所得产物与2-o-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下得到5’端有4,4-二甲氧基三苯甲基醚和3’端含有2-o-氰乙基-n,n-二异丙基亚磷酰胺的脱氧胸苷-脱氧胸苷单体。
在上述方案的基础上，所述步骤1)中齐多夫定5’羟基的保护反应，是由4,4-二甲氧基三苯基氯甲烷介导，并与齐多夫定进行反应；优选的，反应溶剂为吡啶，反应温度为室温。
在上述方案的基础上，所述步骤1)中3’叠氮还原为氨基的反应，是在惰性气体保护下由三乙胺介导，并与齐多夫定5’羟基保护后的产物进行反应；优选的，反应溶剂为四氢呋喃-水，反应温度为85℃。
在上述方案的基础上，所述惰性气体为氮气或氩气。
在上述方案的基础上，所述步骤1)中与丁二酸酐进行的开环反应，反应溶剂为二氯甲烷，反应温度为室温。
在上述方案的基础上，所述步骤2)中5’氨基修饰的脱氧胸苷为5'-氨基-β-胸苷；优选的，所述缩合试剂为二环己基碳二酰亚胺，反应温度为室温。
在上述方案的基础上，所述步骤3)的反应是在四氢呋喃中进行，优选的，所述有机碱为三乙胺。
在上述方案的基础上，所述步骤3)的反应中2-o-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺是在冰浴搅拌下滴加入反应体系，滴加完成后，继续在冰浴下搅拌1小时后再于室温下继续搅拌2小时。
上述方法制备的含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体在dna合成过程中的应用。
本发明技术方案的优点
本发明设计并合成了一种含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的核苷类试剂，对核苷酸中脱氧胸苷(dt)-脱氧胸苷(dt)中的磷酸二酯键替换为丁二酰胺键，本发明通过核磁和质谱对合成过程中的有机中间体及最终产物进行了结构和纯度的表征，并采用凝胶电泳色谱和基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱等手段确认了酰胺键取代磷酸二酯键人工核酸的基本物理化学性质。本发明的单体表现出良好的化学稳定性和反应活性。可直接用于核酸自动合成仪上，通过标准操作实现在核酸序列中任意位点的修饰，具有极高的便利性，极大拓展了人工核酸的种类，为设计新型非天然寡聚核苷酸提供了新的模块。
本发明含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成步骤简洁明了，操作便捷，中间体及产物的纯化方式简单，可以实现高效大量制备目标产物，为核酸的结构修饰提供了一种成本可控，简单高效的结构修饰试剂及合成方法。
附图说明
图1为化合物1的1h-nmr谱图，横坐标为化学位移(chemicalshift)，量纲为ppm，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图2为化合物1的esi质谱谱图，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图3为化合物2的1h-nmr谱图，横坐标为化学位移(chemicalshift)，量纲为ppm，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图4为化合物2的esi质谱谱图，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图5为化合物3的1h-nmr谱图，横坐标为化学位移(chemicalshift)，量纲为ppm，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图6为化合物3的esi质谱谱图，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图7为空白序列dna的保留时间，横坐标是样品在色谱柱上的保留时间，量纲是分钟(min)，mau是毫吸光度单位(mabsorbanceunit)；
图8为含有丁二酰胺结构dna的保留时间，横坐标是样品在色谱柱上的保留时间，量纲是分钟(min)，mau是毫吸光度单位(mabsorbanceunit)；
图9为空白序列dna的分子量，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图10为3’端含有丁二酰胺结构dna的分子量，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图11为3’端含有丁二酰胺结构dna的分子量，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图12为3’和5’端均含有丁二酰胺结构dna的分子量，横坐标为质荷比(masschargeratio)，量纲为a.u.，纵坐标为信号强度，无实际量纲；
图13不同序列在s1核酸酶降解下的凝胶电泳色谱，其中1.空白序列；2.空白序列 s1核酸酶；3.序列1；4.序列1 s1核酸酶；5.序列2；6.序列2 s1核酸酶；7.序列3；8.序列3 s1核酸酶；9.dnamarker；
图14含有丁二酰胺单元的人工dna与空白dna的熔点数据，横坐标为熔解温度(℃)，纵坐标为dna解离程度，无实际量纲；
图15为图14中a部分的局部放大图；
图16为含有丁二酰胺结构dna对错配碱基的识别中的焓变，横坐标为错配序列的分类，纵坐标为dna解离过程的焓变，量纲是千焦每摩尔(kj/mol)；
图17为探针dna与错配dna形成双链的熔点(tm)曲线；横坐标为dna融解温度，量纲为摄氏度(℃)；纵坐标为归一化之后的dna样品的紫外吸光度；
图18为图17中b部分的局部放大图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明中仪器型号及缓冲液配比，如下：
紫外-可见光谱仪型号为variancary100。
pbs缓冲液的配制方法为：称取8.0gnacl，0.2gkcl，1.42gna2hpo4，0.27gkh2po4于1000ml容量瓶中，加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将ph调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1000ml，高温高压条件下灭菌处理，室温下保存备用。
本发明中，有机分子的结构和纯度均由核磁共振氢谱(1h-nmr)和电喷雾电离(esi-ms)来确定，dna的结构信息由基质辅助激光电离解析-飞行时间质谱(maldi-tof)来确定。
核磁型号为brukeramx400spectrometer(400mhz)，所用溶剂为氘代氯仿(cdcl3)和氘代二甲亚砜(d6-dmso)，带tms内标；esi质谱型号为agilent6510q-tof，检测模式为阴离子模式；maldi-tof质谱型号为shimadazubiotechaximaperformance,检测模式为阴离子模式；高效液相色谱型号为waters2695，检测柱型号为xbriageoligonucleotidesbehc18(2.1mm×50mm；column
表1
实施例1
本发明获得了一种非天然寡聚核苷酸的修饰试剂，即含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体，化学结构如下：
该单体的合成路线如下：
具体步骤：
(a)10mmol齐夫多定溶于50ml无水吡啶中，室温下加入10-20mmol4,4-二甲氧基三苯基氯甲烷的10ml吡啶溶液，室温下搅拌1-12h；反应液浓缩除去溶剂后加入50ml四氢呋喃，1ml水和1ml三乙胺，氮气保护下85℃反应1-8h，浓缩除去有机溶剂；油状产物溶于100ml乙酸乙酯中，用100ml饱和氯化铵和100ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥；粗产品可直接用于下一步；
将上述制备的产物5-(4,4-甲氧基三苯基甲醚)-3-氨基-β-胸苷10mmol溶于40ml二氯甲烷中，冰浴搅拌下加入10-18mmol丁二酸酐，室温下搅拌1-12h；所得产物以异丙醚重结晶即可得到白色粉末状固体，为化合物1；收率87％。
化合物1的核磁共振氢谱数据如下：
1h-nmr(cdcl3,400mhz):1.51(s,5-me,3h),2.17-2.36(m,2’h,2h),3.30-3.50(m,5’h,2h),3.70-3.74(m,3’h,1h),3.75-3.78(m,meo-,6h),5.29(m,4’h,1h)，6.23-6.25(m,1’h,1h),6.82-6.84(m,arh,4h),7.23-7.31(m,arh,9h),7.41-7.58(m,6h,1h)。
化合物1的esi质谱数据如下：
formulac35h37n3o9,calc643.21，found666.25(m na )。
(b)10mmol化合物1，5-20mmol5'-氨基-β-胸苷，和5-20mmol二环己基碳二酰亚胺，室温下继续搅拌1-24h；加入100ml饱和碳酸氢钠洗涤，有机相无水硫酸钠干燥；产品柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷/乙酸乙酯＝50:1-1:1(体积比)；产品为淡黄色固体粉末，5.18g，即化合物2；收率60％。
化合物2的核磁共振氢谱数据如下：
1h-nmr(d6-dmso,400mhz):1.36(s,5-me,3h),2.30-2.51(m,coch2ch2co,4h),2.61-2.77(m,2’h,2h),3.40-3.44(m,5’h,2h),3.76-3.79(m,meo-,6h),4.00(s,3’h,1h),4.70-4.74(m,4’h,1h)，6.30--6.35(m,1’h,1h),6.80-7.40(m,arh,14h),9.94(s,-cooh,1h)。
化合物2的esi质谱数据如下：
formulac45h50n6o12,calc866.35,found889.35(m na )。
(c)3mmol化合物2和1-3g无水三乙胺溶于30ml无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加3-6mmol2-o-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺；反应于冰浴下搅拌1h后再于室温下继续搅拌2h，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸钠溶液洗涤；有机相无水硫酸钠干燥过夜；浓缩溶剂得到5'端含有4,4-二甲氧基三苯甲基醚和3'端含有2-o-氰乙基-n,n-二异丙基亚磷酰胺的脱氧胸苷(dt)-脱氧胸苷(dt)2.0g(化合物3)，收率65％。
化合物3的核磁共振氢谱数据如下：
1h-nmr(d6-dmso,400mhz):1.40(s,5-me,3h),1.76(s,5-me,3h)1.96-2.11(m,2’h,4h),2.28-2.32(m,coch2ch2co,4h),3.13-3.24(m,3’h,2h),3.25-3.28(m,4’h,2h),3.67-3.83(m,meo-,6h),3.84-4.43(m,5’h,4h),6.08-6.10(m,1’h,1h)，6.17-6.20(m,1’h,1h),6.83-7.51(m,arh,14h),8.00-8.27(m,6h,2h),11.27-11.31(m,conh,1h)。
化合物3的esi质谱数据如下：
formulac54h67n8o13p,calc1066.44，found1065.44(m-h )，1066.44(m )。
实施例2
将含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体用于dna合成过程
合成路线如下：
具体步骤：
(d)800mg双胸苷试剂(含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体)溶于3ml无水乙腈中，氮气保护下转移至abi394核酸合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入核酸序列：5’-ttccacttaccagattgatt-3’，执行1μmol量级的合成；
(e)合成完毕后将固相载体取出，分散在1ml5-32％甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热1-4h，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物；目标产物通过高效液相色谱分离，并通过maldi-tof进行结构信息表征。dna序列、分子量及hplc保留时间如表2所示：
表2
注：斜体部分含有丁二酰胺结构脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体
实施例3
含有丁二酰胺结构的双胸苷试剂在构建抗酶切人工核酸中的应用
1、含有丁二酰胺结构的双胸苷试剂修饰在人工核酸5’端的合成方法
2、含有丁二酰胺结构的双胸苷试剂修饰在人工核酸3’端的合成方法
抗酶切人工核酸的合成方法，具体步骤为：
步骤a：800毫克试剂溶于3毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至abi394核酸合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入核酸序列：5’-ttccacttaccagattgatt-3’，执行1μmol量级的合成。
步骤b：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升5-32％甲氨水溶液中，55-75℃下密闭加热1-4小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到粗产物。目标产物通过高效液相色谱分离，并通过maldi-tof进行结构信息表征。
表3.dna序列和分子量
注：斜体部分含有丁二酰胺结构脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体
3、含有丁二酰胺单元双胸苷结构dna对外切酶的酶解实验
选用了s1核酸酶，该酶是单链特异性的核酸内切酶，它可以将dna或者rna降解成为酸可溶性5’-p核苷酸，最终核酸的90％以上会被降解，其酶切顺序为从3’端或者5’端依次进行酶切。
表4s1核酸酶的使用方法
将样品(表3中的核酸序列)分别与s1核酸酶按照上述表格的体积混合均匀，置于恒温下振荡(30℃，500rpm)，振荡反应30min，然后在75℃下灭活10min，降至室温，加入15μl甲酰胺溶液，采用聚丙烯酰胺变性胶进行表征，结果如图13所示。
实验证实，空白序列以及只在序列的一端引入丁二酰胺键的dna(序列1和2)在加入s1核酸酶之后可以完全被切割成单核苷，由于酶切后的序列太短，在300v的凝胶电泳条件下，通道2、4、6的核酸条带完全迁移到了凝胶最底部，因此在凝胶中无法观察到dna条带，而在序列的两端同时引入丁二酰胺键后(序列3)，其dna的凝胶条带与未加s1核酸酶的序列一致。该酶切实验结果表明，丁二酰胺键的引入可以提高传统dna对某些核酸酶的抗性。
4、含有丁二酰胺单元双胸苷结构dna与互补序列的热稳定性实验
将2oddna样品用高速离心机离心处理3min，然后加入50μl的超纯水，涡旋混匀后离心，取1μl样品加入150-200μl超纯水，混合均匀后利用紫外-可见光谱进行浓度标定。测试的波长范围是220-320nm，记录260nm处的紫外吸收值，根据朗伯比尔定律a＝εbc即可计算出dna溶液的浓度。将8μmol/l的dna样品与探针序列按照等摩尔比在1×pbs缓冲液中进行组装，浓度为4μmol/l，总体积为800μl，组装温度为95℃，组装时间为5min，自然冷却恢复至室温即可认为dna双链结构组装完成，将组装完成的dna溶液置于4℃冰箱中保存备用。
通过紫外可见光谱仪进行dna组装体熔点的表征，如图14所示。仪器参数设置如下：波长为260nm，温度范围为10-80℃，温度变化速度为1℃/min，每个样品循环测试2次，测试结束后温度恢复至25℃。
表5.含有丁二酰胺结构dna的熔点
实施例4
本发明提供一种含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸(dna)，该人工dna为引入丁二酰胺结构来替代磷酸二酯键的人工dna检测序列，对于t-c类碱基错配具有很强的特异性识别。天然dna结构(a)以及含有丁二酰胺结构dna结构(b)，如下所示：
本发明所提供的含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸，识别错配碱基的方法是，将含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸作为探针序列，来识别靶标序列中碱基错配。其检测方法为，通过变温紫外-可见光谱测量探针序列和靶标序列形成dna双链的熔点温度(meltingtemperature,tm)和熔解过程中的焓变(δh)来检测探针序列对错配碱基的识别，可以20kj/mol的熔解焓变来识别t-c碱基错配。含有丁二酰胺单元dna对错配碱基的识别中的焓变。
含有丁二酰胺结构的人工脱氧核糖核酸识别错配碱基
1、样品配置测定方法
将2oddna样品用高速离心机离心处理3min，然后加入50μl的超纯水，涡旋混匀后离心，取1μl样品加入150-200μl超纯水，混合均匀后利用紫外-可见光谱进行浓度标定。测试的波长范围是220-320nm，记录260nm处的紫外吸收值，根据朗伯比尔定律a＝εbc即可计算出dna溶液的浓度。将8μmol/l的dna样品与探针序列按照等摩尔比在1×pbs缓冲液中进行组装，浓度为4μmol/l，总体积为800μl，组装温度为95℃，组装时间为5min，自然冷却恢复至室温即可认为dna双链结构组装完成，将组装完成的dna溶液置于4℃冰箱中保存备用。探针序列、互补序列以及含有错配碱基的序列如表6所示：
表6
注：m代表含有错配碱基的序列，tt代表含有丁二酰胺结构的位点，下划线代表错配位点。
2、熔点测定方法及熔点数据
通过紫外可见光谱仪进行dna组装体熔点的表征。仪器参数设置如下：波长为260nm，温度范围为10-80℃，温度变化速度为1℃/min，每个样品循环测试2次，测试结束后温度恢复至25℃。探针dna与错配dna形成双链的熔点(tm)和焓变(δh)，如表7所示。
表7
图17显示了探针dna与错配dna形成双链的熔点(tm)曲线，可以看出，对于错配的t碱基或者g碱基，其每条错配dna序列的焓变值基本相同，证明该类结构修饰对于t-t和t-g错配碱基的识别无法精准确定错配碱基的数量；但是对于错配的c碱基，每引入一个t-c碱基错配，其解离焓变较t-g和t-t错配降低约为20kj/mol，继续引入t-c碱基错配可在原有基础上进一步降低约20kj/mol的解离焓。综合熔点变化和焓变值的数据分析，可以得出如下实验结论：在检测序列中以丁二酰胺单元取代磷酸二酯键单元，对取代位点处的t-c碱基具有特异性的识别能力。
目前对于t类错配碱基识别中，单个t-g错配的焓变降低一般在3-34kj/mol之间，单个t-t错配的焓变降低一般在30kj/mol左右，而单个t-c错配的焓变降低一般在8-12kj/mol，但是在使用本发明方法对t-g和t-t碱基错配检测时可以观察到约40kj/mol的焓降，而对t-c碱基错配进行检测时，单个错配的焓降约为60kj/mol，而且第二个t-c错配碱基的识别可在原有基础上继续降低20kj/mol。由此可见，丁二酰胺结构的引入对于特异性识别t-c碱基错配具有重要价值，当检测到双链的熔点降低≥15℃，或者解离焓降低≥50kj/mol时，即可认证为待检测序列中存在t-c碱基错配。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
1.一种含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体，其特征在于，化学结构如下：
2.权利要求1所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，以齐多夫定为原料经醚化、酰胺化、还原、酯化反应制备而成。
3.根据权利要求2所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)以齐多夫定为起始原料，将其5’羟基进行保护后再将其3’的叠氮还原为氨基，所得的产物再与丁二酸酐进行开环反应得到含有羧基的脱氧胸苷单元；
(2)将步骤1)中得到的含有羧基的脱氧胸苷单元与5’氨基修饰的脱氧胸苷在缩合试剂作用下进行选择性酰胺化反应；
(3)将步骤2)所得产物与2-o-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺在有机碱的作用下得到5’端有4,4-二甲氧基三苯甲基醚和3’端含有2-o-氰乙基-n,n-二异丙基亚磷酰胺的脱氧胸苷-脱氧胸苷单体。
4.根据权利要求3所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，所述步骤1)中齐多夫定5’羟基的保护反应，是由4,4-二甲氧基三苯基氯甲烷介导，并与齐多夫定进行反应，反应溶剂为吡啶。
5.根据权利要求3所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，所述步骤1)中3’叠氮还原为氨基的反应，是在惰性气体保护下由三乙胺介导，并与齐多夫定5’羟基保护后的产物进行反应。
6.根据权利要求3所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，所述步骤1)中3’叠氮还原为氨基的反应的反应溶剂为四氢呋喃-水。
7.根据权利要求3所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，所述步骤1)中与丁二酸酐进行的开环反应的反应溶剂为二氯甲烷。
8.根据权利要求3所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，所述步骤2)中5’氨基修饰的脱氧胸苷为5'-氨基-β-胸苷。
9.根据权利要求3所述含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体的合成方法，其特征在于，所述步骤2)中的缩合试剂为二环己基碳二酰亚胺。
10.权利要求2～9任一项所述方法制备的含有丁二酰胺结构的脱氧胸苷-脱氧胸苷亚膦酰胺单体在dna合成过程中的应用。
技术总结