本发明涉及治疗食管癌的活性单体及其组合物和应用，具体涉及从猪牙皂、土贝母两种中药中分别提取的活性单体，以及组成的治疗食管癌的组合物，属于中医药技术领域。
背景技术：
食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。全世界每年约有20万人死于食管癌，我国是食管癌高发区，因食管癌死亡者仅次于胃癌，居第二位，男性多于女性，发病年龄多在40岁以上，但近年来40岁以下发病者有增长趋势。食管癌的发生与亚硝胺慢性刺激、炎症与创伤、遗传因素以及饮水、食物和蔬菜中的微量元素含量有关，但确切原因还不明确。手术治疗是西医治疗食道癌的首选方法，手术治疗5年的生存率为25％左右，但是，食道癌手术后产生的一些并发症，例如：腹泻、咳嗽等严重影响患者的生存治疗，往往引起营养不良、贫血、低蛋白血症，严重者丧失劳动能力，甚至危及患者生命。另外，由于食道癌患者就诊时往往已属中、晚期，癌细胞扩散、转移，手术治疗效果不能令人满意。与手术治疗相比，放疗或化疗5年的生存率仅仅10％左右，效果不太理想，且食道癌的组织类型以鳞癌为多，对化疗不敏感。放疗虽然有一定疗效，但患者的生存率没有明显提高，放疗后局部未得到控制或复发者达88.9％。放疗后还易导致骨髓抑制，外周血白细胞下降，免疫功能受到抑制等副反应，大大影响治疗计划的顺利完成，使患者生存质量下降，生存期缩短。
中药能够激活和增强人体免疫细胞，免疫分子，提高机体免疫功能，增强机体抗病能力，从而发挥抗肿瘤效应，对缓解临床症状，增强体质，延长生存期都有显著疗效，采用传统中医药治疗癌症正在不断探索和发展中。文献和古方曾涉及到猪牙皂或土贝母具有抗癌作用，但关于抗食管癌的报道很少，二者合用可治疗瘰疬但在治疗食管癌药方中还未见报道，没有针对抗食管癌的猪牙皂和土贝母中最强活性单体的报道，更没有出现活性单体组方的比例关系，药物对食管癌细胞作用机制的研究也不系统。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种从以猪牙皂和土贝母为原料，提取的活性单体及其组合物，以及其在治疗食管癌中的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是提供治疗食管癌的活性单体，由以下两种方式制备而成：
(a)第一种方式：
(1)醇提：称取猪牙皂，用95％(v/v)乙醇溶液常温浸泡后，抽滤，弃滤渣，浓缩，干燥得棕黄色固体；
(2)萃取：将棕黄色固体溶于超纯水中，然后正丁醇萃取，将萃取液旋蒸，干燥得正丁醇部位固体；
(3)大孔树脂层析分离：正丁醇部位固体溶于超纯水中，通过大孔树脂层析柱，采用h2o-etoh体系洗脱，留取50％h2o-50％etoh部位洗脱液，干燥得50％h2o-50％etoh部位固体；
(4)ods层析柱分离：将50％h2o-50％etoh部位固体溶于超纯水中，通过ods层析柱，采用h2o-meoh体系洗脱，留取30％h2o-70％meoh部位洗脱液，干燥，得到淡黄色固体；
(5)硅胶层析柱分离：使用ch2cl2溶解淡黄色固体，湿法上样，采用etoac-meoh-h2o体系洗脱，留取洗脱液，干燥；
(6)纯化：使用葡聚糖凝胶分子筛、重结晶及高效液相纯化，得到猪牙皂活性单体；
(b)第二种方式：
(1)醇提：称取土贝母，用95％(v/v)乙醇溶液常温浸泡后，抽滤，弃滤渣，浓缩，干燥得棕黄色固体；
(2)萃取：将棕黄色固体溶于超纯水中，然后正丁醇萃取，将萃取液旋蒸，干燥得正丁醇部位固体；
(3)大孔树脂层析分离：正丁醇部位固体溶于超纯水中，通过大孔树脂层析柱，采用h2o-etoh体系洗脱，留取30％h2o-70％etoh部位洗脱液，干燥得30％h2o-70％etoh部位固体；
(4)ods层析柱分离：将30％h2o-70％etoh部位固体溶于超纯水中，通过ods层析柱，采用h2o-meoh体系洗脱，留取20％h2o-80％meoh部位洗脱液，干燥，得到淡黄色固体；
(5)硅胶层析柱分离：使用ch2cl2溶解淡黄色固体，湿法上样，采用etoac-meoh-h2o体系洗脱，留取洗脱液，干燥；
(6)纯化：使用葡聚糖凝胶分子筛、重结晶及高效液相纯化，得到土贝母活性单体。
猪牙皂和95％乙醇溶液的质量体积比为1g：7ml；土贝母和95％乙醇溶液的质量体积比为1g：7ml。
步骤(a)-(2)和(b)-(2)中固体和超纯水的质量体积比为1g：50ml。
步骤(a)-(3)和(b)-(3)中h2o-etoh体系为100％h2o、70％h2o-30％etoh、50％h2o-50％etoh、30％h2o-70％etoh、100％etoh，洗脱液体积为3倍柱体积。
步骤(a)-(4)和(b)-(4)中h2o-meoh体系为70％h2o-30％meoh、60％h2o-40％meoh、50％h2o-50％meoh、40％h2o-60％meoh、30％h2o-70％meoh、20％h2o-80％meoh、100％meoh，洗脱液体积为3倍柱体积。
步骤(a)-(5)中etoac-meoh-h2o体系中etoac、meoh、h2o的体积比为8：2：0.5；步骤(b)-(5)中etoac-meoh-h2o体系中etoac、meoh、h2o的体积比为7：5：0.5；步骤(a)-(5)、(b)-(5)中洗脱液体积为3倍柱体积；步骤(a)-(6)中高效液相纯化的条件为vmeoh:vh2o＝78:22，紫外吸收波长206nm，流速2ml/min；步骤(b)-(6)中高效液相纯化的条件为vmeoh:vh2o＝75:25，紫外吸收波长265nm，流速2ml/min。
本发明的技术方案之一是提供一种治疗食管癌的组合物，包括上述猪牙皂活性单体和土贝母活性单体。
其中，猪牙皂活性单体和土贝母活性单体的质量比为4:6-2:8。
优选的，猪牙皂活性单体和土贝母活性单体的质量比为3:7。
组合物可以为丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、口服液或注射剂。
本发明的技术方案之一是提供一种上述活性单体或组合物在制备治疗食管癌药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明使用细胞模型，以活性追踪为导向，采用醇提、层析色谱及高效液相色谱等现代提取分离技术，从具有抗癌活性的猪牙皂、土贝母两种中药中分别提取活性单体，并使用化学谱图手段推测分子组成并确定各单体分子结构，以基线等比增减法确定单体用量比例，组合成治疗食管癌的组合物，然后将活性单体及组合物作用于多种食管癌细胞，研究其对食管癌的作用机制。本发明提供的两种活性单体及其组合物，均来源于天然药物的提取，属纯中药制剂，具有预防和治疗食管癌的作用，具有很大的市场潜力和广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为猪牙皂活性单体的质谱图。
图2为猪牙皂活性单体的红外光谱图。
图3为土贝母活性单体的质谱图。
图4为土贝母活性单体的红外光谱图。
图5为猪牙皂活性单体对四种食管癌细胞的实时作用。
图6为土贝母活性单体对四种食管癌细胞的实时作用。
图7为组合物对四种食管癌细胞的实时作用。
图8为活性单体和组合物对四种食管癌细胞的迁移的实时作用。图中，control表示空白，zyz表示猪牙皂，tbm表示土贝母，com-hua表示组合物。
图9为活性单体和组合物作用于ec9706细胞对细胞周期的影响。
图10为活性单体和组合物作用于eca109细胞对细胞周期的影响。
图11为活性单体和组合物作用于te-1细胞对细胞周期的影响。
图12为活性单体和组合物作用于ec-1细胞对细胞周期的影响。
图13为活性单体和组合物对四种食管癌蛋白表达的影响。图中，con表示空白，zyz表示猪牙皂，tbm表示土贝母，com-hua表示组合物。
图14为猪牙皂活性单体浓度的增加对has内源性荧光强度的影响(a：300k，b：310k)。
图15为土贝母活性单体浓度的增加对has内源性荧光强度的影响(a：300k，b：310k)。
图16为组合物浓度的增加对has内源性荧光强度的影响(a：300k，b：310k)。
图17为δλ＝15nm时，hsa同步荧光光谱随猪牙皂活性单体浓度增加的变化(a：300k，b：310k)。
图18为δλ＝15nm时，hsa同步荧光光谱随土贝母活性单体浓度增加的变化(a：300k，b：310k)。
图19为δλ＝15nm时，hsa同步荧光光谱随组合物浓度增加的变化(a：300k，b：310k)。
图20为δλ＝60nm时，hsa同步荧光光谱随猪牙皂活性单体浓度增加的变化(a：300k，b：310k)。
图21为δλ＝60nm时，hsa同步荧光光谱随土贝母活性单体浓度增加的变化(a：300k，b：310k)。
图22为δλ＝60nm时，hsa同步荧光光谱随组合物浓度增加的变化(a：300k，b：310k)。图17-22中箭头表示随着加入药物浓度的增加同步荧光强度逐渐增加。
图23为hsa溶液随猪牙皂活性单体溶液浓度增加对hsa的荧光猝灭的stern-volmer曲线(a：300k，b：310k)。
图24为hsa溶液随土贝母活性单体溶液浓度增加对hsa的荧光猝灭的stern-volmer曲线(a：300k，b：310k)。
图25为hsa溶液随组合物溶液浓度增加对hsa的荧光猝灭的stern-volmer曲线(a：300k，b：310k)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法为本领域的常规技术手段。
实施例1：猪牙皂活性单体的制备
1.1提取方法
(1)醇提：称取猪牙皂，用95％(v/v)乙醇溶液(质量体积比为1g：7ml)常温浸泡6天后，抽滤，弃滤渣，浓缩，真空-80℃冻干得棕黄色固体；
(2)萃取：将棕黄色固体溶于超纯水中(质量体积比为1g：50ml)，在分液漏斗中依次使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等不同极性溶剂萃取，将四部位萃取液(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水)旋蒸，真空-80℃冻干得固体，分别使用mtt法测试活性，结果显示猪牙皂的正丁醇部位活性最强；
(3)大孔树脂层析分离：正丁醇部位固体溶于超纯水中，通过大孔树脂层析柱hp20，采用水-乙醇(etoh)体系(100％h2o、70％h2o-30％etoh、50％h2o-50％etoh、30％h2o-70％etoh、100％etoh，v/v)洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为1ml/min，将五部位洗脱液旋蒸，真空-80℃冻干得固体，分别使用mtt法测试活性，结果显示猪牙皂50％h2o-50％etoh部位活性最强；
(4)ods层析柱分离：将50％h2o-50％etoh部位固体溶于超纯水中，通过ods层析柱(daisogelsp-120-50-ods-b)，采用水-甲醇(meoh)体系(70％h2o-30％meoh、60％h2o-40％meoh、50％h2o-50％meoh、40％h2o-60％meoh、30％h2o-70％meoh、20％h2o-80％meoh、100％meoh，v/v)洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为1ml/min，将七部位洗脱液旋蒸，真空-80℃冻干得淡黄色固体，分别使用mtt法测试活性，结果显示30％h2o-70％meoh部位活性最强；
(5)硅胶层析柱分离：使用ch2cl2溶解30％h2o-70％meoh部位淡黄色固体，湿法上样，采用etoac(乙酸乙酯)-meoh-h2o体系(etoac、meoh、h2o的体积比为8：2：0.5)洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为1ml/min，留取洗脱液，真空-80℃冻干得固体；
(6)纯化：依次使用葡聚糖凝胶分子筛、重结晶及高效液相纯化，得到猪牙皂活性单体；其中，葡聚糖凝胶分子筛：用甲醇溶解步骤(5)所得固体，加载到静置后的葡聚糖凝胶层析柱sephadexlh-20，采用30％h2o-70％meoh(v/v)流动相洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为0.5ml/min，真空-80℃冻干得固体；重结晶：甲醇溶解所得固体，4.0μm滤头过滤后加入过量乙醚，静置析出固体，过滤留固体，再重复两次上述操作；高效液相纯化的条件为vmeoh:vh2o＝78:22，紫外吸收波长206nm，流速2ml/min。
1.2猪牙皂活性单体的化学结构鉴定
该物质为白色无定型粉末；mp：309～311℃；易溶于水，甲醇，乙醇等溶剂；元素分析显示此化合物仅含c、h、o三种元素，实测值：c，59.6％，h，8.2％，o，32.2％；计算值：c，59.86％，h，8.24％，o，31.9％，质谱结果如图1，阳离子tof-msm/s:1004[m h] 提示分子量为1003；推测分子式c50h82o20；红外光谱如图2，3600～3200cm-1区域出现一宽峰，归属为糖羟基。主要取代基的特征谱，1100～1010cm-1区域出现两个峰，表明分子中有呋喃糖苷，1719cm-1为羰基伸缩振动，2930cm-1为c-h非对称振动。
核磁1h、13c谱，1h-nmr(500mhz,cd3od)在高场出现了δ0.8～1.5之间有七个甲基信号。δ5.4是呋喃糖构型特征。12.5,16.2,17.1,17.9,18.3,19.5,24.4,24.6,26.4,27.9,28.5,31.6,33.3,33.5,37.9,40.3,40.7,40.8,41.8,43.0,57.0,64.3,66.8,67.2,67.3,68.6,69.7,70.9,71.1,71.8,71.9,73.2,73.6,75.1,75.7,75.9,76.8,77.5,77.7,78.1,81.5,87.9,103.5,105.8,106.6,106.7,112.5,112.6，13c-nmr(125mhz，cd3od)谱给出四个糖端基碳信号δ103.0，105，106，106，分别为呋喃糖、葡萄糖和木糖，δ78.1说明骨架为齐墩果酸。
推测活性单体结构式为：
实施例2：土贝母活性单体的制备
2.1提取方法
(1)醇提：称取土贝母，用95％(v/v)乙醇溶液(质量体积比为1g：7ml)常温浸泡6天，抽滤，弃滤渣，浓缩，真空-80℃冻干得棕黄色固体；
(2)萃取：将棕黄色固体溶于超纯水中(质量体积比为1g：50ml)，在分液漏斗中依次使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等不同极性溶剂萃取，将四部位萃取液(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水)旋蒸，真空-80℃冻干得固体，分别使用mtt法测试活性，结果显示土贝母的正丁醇部位活性最强；
(3)大孔树脂层析分离：正丁醇部位固体溶于超纯水中，通过大孔树脂层析柱hp20，采用水-乙醇体系(100％h2o、70％h2o-30％etoh、50％h2o-50％etoh、30％h2o-70％etoh、100％etoh，v/v)洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为1ml/min，将五部位洗脱液旋蒸，真空-80℃冻干得固体，分别使用mtt法测试活性，结果显示土贝母30％h2o-70％etoh部位活性最强；
(4)ods层析柱分离：将30％h2o-70％etoh部位固体溶于超纯水中，通过ods层析柱(daisogelsp-120-50-ods-b)，采用水-甲醇体系(70％h2o-30％meoh、60％h2o-40％meoh、50％h2o-50％meoh、40％h2o-60％meoh、30％h2o-70％meoh、20％h2o-80％meoh、100％meoh，v/v)洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为1ml/min，将七部位洗脱液旋蒸，真空-80℃冻干得淡黄色固体，分别使用mtt法测试活性，结果显示土贝母20％h2o-80％meoh部位活性最强；
(5)硅胶层析柱分离：使用ch2cl2溶解20％h2o-80％meoh部位淡黄色固体，湿法上样，采用etoac-meoh-h2o体系(etoac、meoh、h2o的体积比为7：5：0.5)洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为1ml/min，留取洗脱液，真空-80℃冻干得固体；
(6)纯化：依次使用葡聚糖凝胶分子筛、重结晶及高效液相纯化，得到土贝母活性单体；其中，葡聚糖凝胶分子筛：用甲醇溶解步骤(5)所得固体，加载到静置后的葡聚糖凝胶层析柱sephadexlh-20，采用20％h2o-80％meoh(v/v)流动相洗脱，洗脱液体积为3倍柱体积，流速为0.5ml/min，真空-80℃冻干得固体；重结晶：甲醇溶解所得固体，4.0μm滤头过滤后，逐滴滴加水至刚出现浑浊止，保鲜膜密封瓶口，使用5ml注射器针头在保鲜膜扎3×3共9个孔，静置观察固体出现，过滤留固体，再重复两次上述操作；高效液相纯化的条件为vmeoh:vh2o＝75:25，紫外吸收波长265nm，流速2ml/min。
2.2土贝母活性单体的化学结构鉴定
该物质为无定型白色粉末；mp：261～263℃；微溶于水，易溶于甲醇、乙醇。元素分析，实测值：c，56.5％，h，7.3％，o，36.2％；计算值：c，56.3％，h，7.3％，o，36.4％，表明此化合物仅含c、h、o三种元素。质谱结果如图3，阳离子tof-msm/s:1388.5[m na] 提示分子量为1365.3；推测分子式c64h100o31。
红外光谱如图4，3600～3200cm-1区域出现一宽峰，归属为糖羟基。主要取代基的特征谱，1039、1131cm-1区域出现两个峰，表明分子中有c-o键的伸缩振动，3385cm-1为羟基的伸缩振动，1653cm-1为羰基伸缩振动，2934cm-1为c-h非对称伸缩振动。
核磁1h、13c谱结果，1h-nmr(500mhz,cd3od)在高场出现了δ0.77(3h，t，j＝6.5hz，ch3-27)，0.79(3h，s，ch3-18)，0.96(3h，d，j＝3.5hz，ch3-21)，1.22(3h，s，ch3-19)四个甲基信号，烯氢信号δ5.37(1h，h-6)。碳谱15.2,17.6,17.9,18.0,19.2,24.6,26.1,27.3,31.3,32.6,33.4,34.2,36.6,37.1,37.6,40.9,41.6,42.7,42.8,46.1,46.4,47.7,48.2,48.4,49.9,62.2,64.4,64.8,67.0,68.0,68.6,70.4,70.6,70.7,70.9,70.9,72.9,73.6,74.0,74.8,75.8,76.4,76.7,77.3,77.4,77.5,78.3,84.0,84.7,95.1,102.1,103.5,105.7,106.2,123.5,145.1,172.3,172.5,176.8，
13c-nmr(125mhz，cd3od)谱给出三个糖端基碳信号δ103.0，102.3，100.4以及δ110.5的c-22季碳信号。因此，碳谱上45个碳信号中18个归属为糖部分，27个归属于皂苷元部分，烯碳信号δ145.1，123.5说明苷元c-5，6含有双键。
推测活性单体结构式为：
实施例3：治疗食管癌的组合物
利用mtt法检测猪牙皂活性单体和土贝母活性单体对常见食管癌细胞(eca109、ec9706、te-1、ec-1)的作用，具体方法为：
1)将对数生长期细胞进行消化、离心、重悬、计数，接种于96孔板中，3个复孔，1.0×104cells/孔，200μl/孔，eca109、te-1、ec-1细胞使用rpmi1640培养基培养，ec9706使用dmem培养基培养，培养基中含10％fbs，本发明细胞所用培养基遵循此规则；
2)培养箱孵育，5％co2、37℃、饱和湿度，24h后取出，弃上层培养液，设置空白组和加药组，空白组更换含10％fbs培养基，加药组更换含工作浓度药物的10％fbs培养基，工作浓度设置8个浓度梯度，100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.563μg/ml，0.781μg/ml，200μl/孔；
3)培养箱孵育，5％co2、37℃、饱和湿度，48h后取出，弃上清，加mtt工作液100μl/孔，培养箱内孵育4h，弃上清，加入dmso150μl/孔，轻叩96孔板周边，摇床摇15min；
4)酶标仪570nm、630nm双波长测定od(吸光度)值；
5)计算抑制率。抑制率(％)＝(1-加药组od值/空白组od值)×100％；
6)使用spssstatistics17.0软件分析系统对实验结果进行数据分析，得ic50值。
结果显示，两种活性单体对四种食管癌细胞均有明显的生长抑制作用，猪牙皂活性单体对eca109、ec9706、te-1、ec-1四种食管癌细胞作用的ic50值分别为2.42±0.09μg/ml、5.94±0.45μg/ml、35.58±0.58μg/ml、3.56±0.28μg/ml；土贝母活性单体对eca109、ec9706、te-1、ec-1四种食管癌细胞作用的ic50值分别为1.93±0.09μg/ml、1.97±0.09μg/ml、7.90±0.41μg/ml、1.23±0.02μg/ml。
使用基线等比增减设计法来确定组合物中两种活性单体的比例关系。基线等比增减设计法是针对a、b两种药物总量恒定的前提下，以一定的配比为基线，a药含量以10％～30％递减，b药含量以10％～30％递增，或反之，向两侧扩增，直至扩大到极点，两侧极点分别为单纯a药和单纯b药，基线等比增减试验设计法试验适合两种药物的组合配比设计，这种方法正适合两种活性单体的组方设计。本发明以质量比5:5为基线，两侧以10％递变，a:b分别为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10等，分别作用于四种食管癌细胞，同时设置对照组，通过mtt法检测抑制率，得到最佳配比，结果表明，当mzj:mtbm＝3:7时组合物对四种食管癌细胞的增殖抑制能力最强，故选取3:7作为组合物中猪牙皂活性单体和土贝母活性单体的最佳质量比，后续试验采用该配比的组合物(表1)。
表1猪牙皂与土贝母活性单体二元作用对四种食管癌细胞的抑制率(n＝3，x±s)
注：表中zj和tbm分别表示猪牙皂活性单体和土贝母活性单体，p<0.05。
实施例4：活性单体及组合物对四种食管癌细胞的作用
4.1rtca实验测试细胞增殖
试验具体操作方法参照xcelligencertcadp系统基本实验操作protocol。rtca操作有专用架子，为避免静电及各接触点的磨损或污染对电极板的损害所有操作应在架子上进行。
1)将对数生长期细胞进行消化，离心，重悬，计数，以含10％fbs培养基制成105cells/ml的细胞悬液，e-plate16孔板所需细胞悬液总量100μl/孔×16孔＝1.6ml，考虑损耗，需配2ml细胞悬液；
2)开启rtca电脑及软件，layout设置各孔参数，包括细胞类型、细胞数、药物浓度及单位、控制组及加药组；
3)把e-plate16孔板加入50μl含10％fbs培养基，置于rtca-station上，此时软件面板message界面应提示“connectionok”，若不出现此提示应检查连接装置是否良好，schedule→addstep，检测基线，所有孔cellindex均应低于0.063。注：若有多个板，则需点击其对应的板号，分别设置layout，分别检测基线；
4)取出板，加100μl细胞悬液，此时104cells/孔，此步操作直接将100μl含10％fbs细胞悬液加入到对应孔即可，不可将细胞与孔中原有的50μl含10％fbs培养基混匀，若在孔中再次吹打混匀将会破坏细胞层，导致其阻抗发生变化，影响其数据质量；
5)超净台静置30min，在放置到培养箱中的rtca-station上，系统自动扫描scan板后开始step2；
6)step2设置：schedule→addstep，设置sweep289，interval15min，则显示总时间72h→apply；
7)点击start，出现文件保存路径，即开始采集。若有多个板则应分别设置和点击start按钮；
8)加药。24h后，点击pause，取出加药，加药时不需吸取原孔中各培养基，只需直接加入对应的药量，加药后，点击continue继续采集数据。注：加药时点击暂停按钮，该时间段所采集数据空白，导致采集曲线结合点下调，待半小时后数据值回升基本正常。
采用上述方法，将eca109、ec9706、ec-1、te-1四种食管癌细胞分别种植于e-plate16孔板，种板24h后加药，加药作用48h停止实验，实验设置空白组(不加药)和加药组，加药组设置7个浓度梯度，将3000μg/ml药物母液(活性单体和组合物)倍比稀释共7个浓度，分别为3000μg/ml、1500μg/ml、750μg/ml、375μg/ml、187.5μg/ml、93.75μg/ml、46.875μg/ml，加药时取5μl加入对应孔，此时终浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.5625μg/ml，以此浓度的含药血清培养基作用于细胞，测定细胞指数cellindex，即ci，通过细胞指数的大小体现药物对细胞的作用影响。以时间为横轴，ci为纵轴，各药物作用不同细胞结果如图5-7。
图5为猪牙皂活性单体对四种食管癌细胞的实时作用，与空白组(control)相比，7种浓度梯度的猪牙皂活性单体均能降低四种细胞的ci值，且呈浓度梯度的依赖关系。猪牙皂活性单体对于不同的细胞其药物作用的敏感程度存在差异，其中eca109最敏感，te-1较其它三种细胞不敏感。
图6为土贝母活性单体对四种食管癌细胞的实时作用，与空白组(control)相比，7种浓度梯度的土贝母活性单体均能降低四种细胞的ci值，且呈浓度梯度的依赖关系。四种食管癌细胞中，te-1弱于其它三种细胞对土贝母活性单体的敏感性。
图7为组合物对四种食管癌细胞的实时作用，与空白组(control)相比，组合物的7种浓度梯度均能降低四种细胞的ci值，且呈浓度梯度的依赖关系。组合物对于不同细胞的药物作用敏感程度存在差异，其中eca109最敏感，te-1较其它三种细胞不敏感。
4.2rtca实验测试细胞迁移
1)细胞悬液、药物配制步骤与4.1rtca实验同；
2)迁移板分上室和下室。超净台中取出16孔板，上室于plate上，蓝色标志点位于夹具的左上方，下室加工作液。空白组165μl/孔，含10％fbs培养基，加药组165μl/孔，含10％fbs、ic50值药物浓度的培养基，3个复孔。操作过程避免产生气泡，操作后下室液面呈向上凸出弧形。将上下室标志点对准按压扣上，30μl/孔向上室里加不含血清培养基，培养箱中平衡1h。
3)将平衡后的迁移板置于培养箱中的rtca-station上，检测连接状态，设置相关参数，具体步骤与rtca细胞增殖类似。
4)平衡1h后，上室加入细胞悬液，100μl/孔，加药组额外加入ic50浓度的药物悬液，5μl/孔。迁移板放置超净台内静置30min，待细胞沉降后，放置到培养箱中的rtca-station上，设定检测时间48h，采集、储存实验数据。
图8为二活性单体和组合物分别作用于四种食管癌细胞后的迁移。由图可知，与空白组相比加药组ci值明显降低，表明二活性单体及组合物均能降低四细胞的迁移能力，且对于同种细胞，活性单体和组合物对其迁移能力的降低水平存在差异，组合物较单一单体对四种细胞的影响更为显著。
4.3细胞克隆
4.3.1主要试剂的配制
琼脂糖底层琼脂和上层琼脂，其质量浓度分别为1.2％，0.7％，配制方法类似，称取1.2g，0.7g琼脂糖粉分别溶于100ml生理盐水中，高压灭菌，4℃冰箱储存备用。
4.3.2软琼脂克隆操作步骤
1)将1.2％的软琼脂和2×完全培养基(含20％fbs)各30ml等体积混合，制成0.6％底层琼脂，铺于24孔板中，0.8ml/孔，19.2ml/板，室温静置凝固。
2)将对数生长期食管癌细胞eca109、ec9706、ec-1、te-1进行消化、重悬、计数，分别制成细胞悬液。
3)将0.7％的软琼脂和2×完全培养基(含20％fbs)各30ml等体积混合，制成0.35％上层琼脂，分别加入细胞悬液至细胞浓度为250cells/ml，设置空白组(不加药)和加药组，加药组加入药物至药物浓度为ic50值，混匀，0.8ml/孔，19.2ml/板，每孔细胞数200个，超净台室温静置凝固，置培养箱中孵育，22天后观察、计数。
4)设置3个复孔，实验重复3次，取均值。
4.3.3细胞集落形成率
细胞集落形成率＝平均细胞集落数/每孔接种细胞数×100％
4.3.4统计学分析
使用spssstatistics17.0软件分析系统对实验结果进行数据分析，以均数±标准差
4.3.5实验结果
空白组和加药组对4种食管癌细胞处理后，22天后观察与空白组相比，加药组克隆细胞群落变小，形态不规则，结果如表2所示：
表2.活性单体及组合物对4种细胞作用后克隆形成的集落数(n＝3，
表2可知，对于4种食管癌细胞，与空白组比较，两活性单体及组合物均能抑制细胞集落的形成，细胞集落形成数量出现明显下降，不同的单体对于不同的细胞存在明显差异，对于eca109细胞加药组的集落形成较空白组减少1/2左右，其他三种细胞加药组较空白组细胞集落数目减少1/3～1/2之间。就细胞集落形成率而言，空白组ec9706、eca109、te-1、ec-1细胞大约在21.7％～34.3％之间，加药组大约在7.9％～24.4％之间，其中ec-1和te-1细胞活性单体加药组集落形成率下降了10个百分点左右；ec9706细胞活性单体加药组集落形成率下降了14个百分点左右；eca109细胞集落加药组形成率下降了14个百分点左右。组合物对ec9706、te-1、ec-1细胞较单体更为显著，集落数约是活性单体的1/2左右。
4.4细胞周期
将对数生长期食管癌细胞eca109、ec9706、ec-1、te-1进行消化，离心，重悬，计数，接种于100mm培养皿中，106cells/皿，10ml/皿，培养箱内培养24h，吸取上清，空白组加含10％fbs培养基，加药组加猪牙皂活性单体、土贝母活性单体和组合物ic50值药物浓度的含10％fbs培养基，10ml/皿，每组3皿，继续培养48h。观察细胞形态，拍照。各皿弃上清，预冷pbs洗涤2次，0.125％不含edta消化胰酶消化，倒置显微镜观察细胞收缩，变圆，部分脱壁，0.5mlfbs终止消化，1500rpm离心7min，弃上清，预冷pbs洗涤2次，计数，取106cells于流式管中，1500rpm离心7min，弃上清，加入预冷无水乙醇，调整乙醇终浓度为70％，乙醇固定24h，1500rpm离心7min，弃上清，预冷pbs洗涤2次，1ml/次，使用蛋白周期测定试剂盒，分别加入pi(碘化丙啶)/rnaase500μl，4℃避光30min，300目尼龙过滤，流式细胞仪上样测试，开启cellquestpro软件，设置激发波长488nm，采集细胞荧光信号20000events，采集结束modfit软件分析各期分布，结果见图9-12。
图9为活性单体和组合物作用于ec9706细胞对细胞周期的影响。与空白组相比，两活性单体及组合物对食管癌ec9706细胞周期均有明显改变，药物作用ec9706后，细胞g0/g1期细胞比率增加，s期及g2/m期细胞比率降低，说明药物把细胞分裂阻滞在dna合成前期，且组合物对ec9706细胞周期的影响较活性单体显著。
图10为活性单体和组合物作用于eca109细胞对细胞周期的影响。与空白组相比，两活性单体及组合物对食管癌eca109作用后，g0/g1期细胞比率均显著增加，s期及g2/m期细胞比率降低。
图11为活性单体和组合物作用于te-1细胞对细胞周期的影响。与空白组相比，两活性单体和组合物对食管癌te-1细胞周期影响存在较大差异，猪牙皂活性单体作用te-1后，g0/g1期细胞比率减少，而g2/m期细胞比率增加。土贝母活性单体和组合物作用te-1细胞后g0/g1期细胞比率增加，而细胞s期细胞比率降低。
图12为活性单体和组合物作用于ec-1细胞对细胞周期的影响。与空白组相比，两活性单体和组合物均对食管癌ec-1细胞周期产生显著影响，g0/g1期细胞比率增加，g2/m期细胞比率降低。
由上可知，与空白组比较，活性单体及组合物对四种细胞的周期均有明显的影响作用。猪牙皂和土贝母两活性单体及组合物分别作用于四种食管癌细胞后，整体的规律趋势为g0/g1期细胞比率增加，s期及g2/m期细胞比率降低，说明药物把细胞分裂阻滞在dna合成前期，且组合物对细胞周期的影响较活性单体显著。
4.5westernbloting
4.5.1主要试剂的配制
40％丙烯酰胺：76.0g丙烯酰胺，4.0gn,n’-亚甲双丙烯酰胺，180ml水，转子搅拌溶解，滤纸过滤，室温，备用。
1.5mtris-hcl：90.8gtris-base，450ml水，转子搅拌溶解，调节ph至8.8，定容500ml，室温，备用。
0.5mtris-hcl：30.3gtris-base，450ml水，转子搅拌溶解，调节ph至6.8，定容500ml，室温，备用。
10％sds：10.0gsds(十二烷基硫酸钠)，溶于水，定容100ml，室温，备用。
10％aps：0.1gaps(过硫酸铵)，溶于1ml水，4℃，备用。
5×sb(上样缓冲液)：2.5ml0.5mtris-hcl(ph6.8)，0.39gdtt(二硫苏糖醇)，0.5gsds，0.0025g溴酚蓝，2.5ml丙三醇，10ml水，转子搅拌混匀，4℃，备用。
10×eb(电泳缓冲液)：30.0gtris-base，144.0gglycine(甘氨酸)，10gsds，调节ph至8.3，水定容至1000ml，用时稀释10倍至1×。
转移缓冲液：5.8gtris-base，2.9gglycine，0.37gsds，600ml水，转子搅拌充分溶解，200mlmeoh(甲醇)，超纯水定容1000ml，室温，备用。
封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mltbst缓冲液，室温，备用。
10×丽春红染液：2.0g丽春红s，30.0g三氯乙酸，30.0g磺基水杨酸，80ml水，用时稀释10倍。
一抗：egfr单克隆抗体(rbmabtoegfr)，plcγ1单克隆抗体(momabplcγ1)，pkcα单克隆抗体(rbmabtopkcalpha)，βactin单克隆抗体(rbpabtobetaactin)，使用时1：2000稀释。
二抗：抗兔抗体hrbcoatanti-rabbitigg，抗鼠抗体hrbgoatanti-mouseigg，使用时1：1500稀释。
4.5.2操作步骤
1)细胞接种与处理：将对数生长期食管癌细胞eca109、ec9706、ec-1、te-1进行消化、离心、重悬、计数，以106cells/皿密度接种于100mm培养皿，10ml/皿，设空白组与加药组，3皿/组，培养箱24h后，弃上清，空白组加含10％fbs培养基，加药组加ic50值浓度含10％fbs培养基，10ml/皿，48h，终止培养。
2)蛋白提取：药物作用48h后，弃上清，预冷pbs洗2次，加3ml预冷pbs，冰上操作，细胞刮刀收集细胞，重复3次，离心，去上清，1ml预冷pbs吹打细胞，转移到1.5mlep管，低温离心机4℃，2000rpm离心15min，弃上清，加入400μlripa细胞裂解液，10μl1mmna3vo4，10μl100mmpmsf蛋白酶抑制剂，涡旋振荡1min，400w超声破碎3s，3次，冰上裂解1h，其间每5min振荡1次。低温离心机4℃，15000rpm离心30min，-20℃保存，备用。
3)蛋白定量：在3ml考马斯亮蓝g250中分别加入1μg/μl标准蛋白bsa1、5、10、15、20、25、30μl，振荡混匀，紫外分光光度计595nm做标准蛋白浓度曲线，在3ml考马斯亮蓝g250中分别加入待测样品10μl，测量吸光度，代入标准曲线，计算出待测样品浓度。
4)8％sds-page分离胶：50ml锥形瓶依次加入2ml40％丙烯酰胺，2.5ml1.5mtris-hcl，100μl10％sds，5.4mlh2o，25μl10％aps，5μltemed(四甲基乙二胺)，摇匀3min，缓慢灌入以固定好的玻璃板中，待胶面离玻璃上沿1cm左右停止，加水液封，约40min后，交界面出现清晰折线表明胶已凝固。
5)4％分离胶：将分离胶上液封水倒掉，并用吸水纸吸干。50ml锥形瓶依次加入1ml40％丙烯酰胺，2.5ml0.5mtris-hcl，100μl10％sds，6.4mlh2o，50μl10％aps，10μltemed，摇匀3min，缓慢灌入分离胶上层，直至与玻璃板短板平齐，水平插入梳子，待基层胶凝固后，小心拔出梳子，水冲洗浓缩胶，置电泳槽中，加入电泳液。
6)电泳：上样液由上样蛋白，5×sb，eb三种物质组成，每孔上样量20μg，上样体积15μl，上样前95℃，蛋白变性5min，第一泳道为marker10μl。开启电源，初始电压40v，当蓝色标志到达分离胶时调节电压80v，直到蓝色标志距离胶底部约1cm，关闭电源。
7)转膜：将胶从玻璃板中取出，切除多余部分，按黑胶白膜，黑板-胶-滤纸-海绵-白板的“三明治”顺序叠放胶和膜，注意排除胶和膜之间的气泡，然后合并夹子，放入转膜槽，黑黑(负)白红(正)，加入转移缓冲液，恒电压30v，4℃冰箱内转膜。
8)封闭：转膜结束，丽春红染液染色5min，圆珠笔标志各marker位置，清水洗除丽春红，封闭液室温1h或4℃过夜，封闭。
9)杂交：封闭结束，将膜按目标蛋白切割，转移到杂交袋中，分别加入一抗200μl将膜完全浸润，室温，杂交袋内杂交4h，tbst缓冲液洗涤50min，每10min换tbst缓冲液一次，共5次，再在杂交袋中加入二抗200μl将膜完全浸润，杂交袋内杂交2h，tbst缓冲液洗涤1h，每10min换tbst缓冲液一次，共6次。
10)显影：将膜转移到杂交袋，按蛋白分子量顺序排列，加入ecl发光剂，在x射线暗盒中固定。暗室中，x光片压片，曝光，显影剂显影至条带明显，定影剂定影，至胶片透明，清水中洗去残留定影剂，晾干，扫描条带。
4.5.3实验结果
以ic50药物浓度，将两活性单体和组合物分别作用于四种食管癌细胞，提取蛋白、定量、8％sdspage胶分离、湿转、一抗孵育、二抗孵育然后化学发光、暗室显影得四种细胞的egfr、plc-γ1和pkcα蛋白表达(见图13)。如图13所示，对蛋白表达各条带进行分析，经药物作用后，较空白组，四种食管癌细胞的egfr、plc-γ1和pkcα三种蛋白表达均降低，土贝母活性单体较猪牙皂活性单体对plc-γ1和pkcα蛋白影响强，组合物对各蛋白的影响强度强于各活性单体。以上结果表明，不同活性单体不同程度抑制四种食管癌细胞的三种目标蛋白的表达，但各活性单体对不同细胞中不同蛋白表达的影响存在较大的差异性。
实施例5：活性单体和组合物与人血清白蛋白(hsa)的相互作用
5.1溶液的配制
tris-hcl缓冲溶液的配制：分别称取tris-base3.0292g、nacl7.3102g于250ml容量瓶中，双蒸水溶解后定容，浓hcl调ph至7.32，4℃保存备用。
hsa溶液配制：以双蒸水为溶剂，配成浓度为5×10-5mol/l的hsa溶液，过夜，4℃保存备用。
两活性单体及组合物样品溶液的配制：分别称取猪牙皂活性单体6.01mg、土贝母活性单体8.18mg，组合物5.65mg，以甲醇为溶剂，制备10-3mol/l样品溶液，4℃保存备用。
5.2荧光光谱测定
实验组为10mlhsa(1×10-6mol/l)溶液，由9.80mltris-hcl缓冲溶液和0.20mlhsa(5×10-5mol/l)溶液配制，空白组为纯tris-hcl溶液。实验时依次加入不同体积的活性单体和组合物样品溶液，改变样品溶液浓度，研究不同活性单体和组合物浓度对has内源性荧光强度的影响。实验参数设置：λex＝280nm，exslit＝5nm，emslit＝5nm，扫描范围285nm-450nm。设δλ＝60nm或δλ＝15nm，扫描同步荧光光谱。实验温度300k、310k。
所用荧光分光光度计为日本hitachi公司的f-7000荧光分光光度计。
5.3实验结果
5.3.1与hsa的相互作用的发射光谱
活性单体和组合物对has内源性荧光强度的影响见图14-16。由图可知，在300k和310k，ph＝7.32，tris-hcl缓冲溶液，hsa(1×10-6mol/l)溶液，激发波长(λex)为280nm条件下，随活性单体和组合物样品溶液浓度的增加，hsa中的内源性荧光强度均逐渐减弱，这表明样品溶液可以猝灭hsa的内源性荧光，但其最大发射峰的形状及位置基本不变，样品溶液与hsa之间发生了较强的相互作用，推测形成荧光较弱的复合物造成hsa内源性荧光猝灭。
5.3.2与has相互作用的同步荧光光谱
δλ＝15nm时，hsa同步荧光光谱随活性单体和组合物浓度增加的变化见图17-19。由图可知，温度为300k和310k，ph＝7.32，tris-hcl缓冲溶液，δλ＝15nm，hsa(1×10-6mol/l)，猪牙皂活性单体、土贝母活性单体和组合物随着药物浓度的增加，hsa酪氨酸残基最大吸收峰的强度逐渐升高，但其峰位基本不变，表明样品溶液对蛋白质分子构象的改变不大。
δλ＝60nm时，hsa同步荧光光谱随活性单体和组合物浓度增加的变化见图20-22。由图可知，在温度为300k和310k时，ph＝7.32，tris-hcl缓冲溶液，δλ＝60nm，随药物浓度增加，hsa色氨酸残基的同步荧光最大吸收峰强度逐渐下降，表明药物与hsa形成了荧光较弱或无荧光的复合物。色氨酸残基的特征荧光光谱峰均能被药物猝灭，但hsa色氨酸荧光峰的位置变化不明显，表明药物对蛋白质分子构象的改变不大。而组合物(300k)，随药物浓度的增加，hsa的同步荧光最大吸收峰强度逐渐上升，表明此温度下组合物可以增强同步荧光最大吸收峰强度，但hsa色氨酸残基的特征荧光光谱的峰位基本不变，表明组合物对蛋白质分子构象的改变不大。
5.3.3与has相互作用猝灭类型的确定
hsa的荧光猝灭机制包括静态猝灭和动态猝灭，猝灭机制一般由stern-volmer方程确定：
f0/f＝1 kqτ0[q]＝1 ksv[q](1)
kq＝ksv/τ0(2)
式中：f0为无药物时，hsa的荧光发射强度，f为加入不同体积样品溶液后hsa的荧光强度，ksv为动态猝灭常数，kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为没有猝灭剂存在下生物大分子平均寿命(约为10-8s)，[q]为样品溶液的浓度。
hsa溶液随活性单体和组合物溶液浓度增加对hsa的荧光猝灭的stern-volmer曲线见图23-25。
以f0/f对样品溶液浓度作图，得到样品溶液与hsa相互作用的stern-volmer曲线，求得速率常数及猝灭常数，结果见表3。
表3温度为300k和310k时样品溶液与hsa的kq、ksv
猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速度常数一般是2.0×1010l/(mols)。根据表3由stern-volmer曲线求出的猝灭速度常数，在300k、310k时，样品溶液和hsa相互作用的猝灭常数kq的绝对值，均远大于2.0×1010l/(mols)，则可以判断此猝灭过程均为形成无荧光复合物静态猝灭过程。
药物分子进入生物体后，在体内进行着吸收、代谢、确定靶器官和受体等重要的生理过程，而这些都是以大分子蛋白与小分子之间相互作用为桥梁进行的，所以蛋白与药物分子之间相互作用的研究为揭示药物在生物体内的作用机制具有重要作用。该研究可以为未来发现抗食管癌活性单体和组合物提供实验和理论基础，以及为通过合理设计血清白蛋白载体开发抗食管癌药物的靶向性治疗提供依据。
1.治疗食管癌的活性单体，其特征在于，由以下两种方式制备而成：
(a)第一种方式：
(1)醇提：称取猪牙皂，用95％(v/v)乙醇溶液常温浸泡后，抽滤，弃滤渣，浓缩，干燥得棕黄色固体；
(2)萃取：将棕黄色固体溶于超纯水中，然后正丁醇萃取，将萃取液旋蒸，干燥得正丁醇部位固体；
(3)大孔树脂层析分离：正丁醇部位固体溶于超纯水中，通过大孔树脂层析柱，采用h2o-etoh体系洗脱，留取50％h2o-50％etoh部位洗脱液，干燥得50％h2o-50％etoh部位固体；
(4)ods层析柱分离：将50％h2o-50％etoh部位固体溶于超纯水中，通过ods层析柱，采用h2o-meoh体系洗脱，留取30％h2o-70％meoh部位洗脱液，干燥，得到淡黄色固体；
(5)硅胶层析柱分离：使用ch2cl2溶解淡黄色固体，湿法上样，采用etoac-meoh-h2o体系洗脱，留取洗脱液，干燥；
(6)纯化：使用葡聚糖凝胶分子筛、重结晶及高效液相纯化，得到猪牙皂活性单体；
(b)第二种方式：
(1)醇提：称取土贝母，用95％(v/v)乙醇溶液常温浸泡后，抽滤，弃滤渣，浓缩，干燥得棕黄色固体；
(2)萃取：将棕黄色固体溶于超纯水中，然后正丁醇萃取，将萃取液旋蒸，干燥得正丁醇部位固体；
(3)大孔树脂层析分离：正丁醇部位固体溶于超纯水中，通过大孔树脂层析柱，采用h2o-etoh体系洗脱，留取30％h2o-70％etoh部位洗脱液，干燥得30％h2o-70％etoh部位固体；
(4)ods层析柱分离：将30％h2o-70％etoh部位固体溶于超纯水中，通过ods层析柱，采用h2o-meoh体系洗脱，留取20％h2o-80％meoh部位洗脱液，干燥，得到淡黄色固体；
(5)硅胶层析柱分离：使用ch2cl2溶解淡黄色固体，湿法上样，采用etoac-meoh-h2o体系洗脱，留取洗脱液，干燥；
(6)纯化：使用葡聚糖凝胶分子筛、重结晶及高效液相纯化，得到土贝母活性单体。
2.根据权利要求1所述的治疗食管癌的活性单体，其特征在于，猪牙皂和95％乙醇溶液的质量体积比为1g：7ml；土贝母和95％乙醇溶液的质量体积比为1g：7ml。
3.根据权利要求1所述的治疗食管癌的活性单体，其特征在于，步骤(a)-(2)和(b)-(2)中固体和超纯水的质量体积比为1g：50ml。
4.根据权利要求1所述的治疗食管癌的活性单体，其特征在于，步骤(a)-(3)和(b)-(3)中h2o-etoh体系为100％h2o、70％h2o-30％etoh、50％h2o-50％etoh、30％h2o-70％etoh、100％etoh，洗脱液体积为3倍柱体积。
5.根据权利要求1所述的治疗食管癌的活性单体，其特征在于，步骤(a)-(4)和(b)-(4)中h2o-meoh体系为70％h2o-30％meoh、60％h2o-40％meoh、50％h2o-50％meoh、40％h2o-60％meoh、30％h2o-70％meoh、20％h2o-80％meoh、100％meoh，洗脱液体积为3倍柱体积。
6.根据权利要求1所述的治疗食管癌的活性单体，其特征在于，步骤(a)-(5)中etoac-meoh-h2o体系中etoac、meoh、h2o的体积比为8：2：0.5；步骤(b)-(5)中etoac-meoh-h2o体系中etoac、meoh、h2o的体积比为7：5：0.5；步骤(a)-(5)、(b)-(5)中洗脱液体积为3倍柱体积；步骤(a)-(6)中高效液相纯化的条件为vmeoh:vh2o＝78:22，紫外吸收波长206nm，流速2ml/min；步骤(b)-(6)中高效液相纯化的条件为vmeoh:vh2o＝75:25，紫外吸收波长265nm，流速2ml/min。
7.一种治疗食管癌的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的猪牙皂活性单体和土贝母活性单体。
8.根据权利要求7所述的组合物，猪牙皂活性单体和土贝母活性单体的质量比为4:6-2:8。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，优选的，猪牙皂活性单体和土贝母活性单体的质量比为3:7；所述组合物为丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、口服液或注射剂。
10.一种权利要求1所述活性单体或权利要求7所述组合物在制备治疗食管癌药物中的应用。
技术总结