本发明属于抗肿瘤技术领域，特别涉及一种肿瘤靶向多肽及其在制备多肽药物偶联物中的应用。
背景技术：
肿瘤病人的治疗除了手术切除、放疗外，药物干预是一个重要的手段。目前常用的药物治疗方法是化疗和靶向疗法。化疗的毒副作用众所周知；靶向疗法目前临床上采用的小分子化合物如伊马替尼(imatinib)靶向抑制bcr–abl酪氨酸激酶inchronicmyelogenicleukemia，埃罗替尼(erlotinib)抑制egfr酪氨酸激酶活性，硼替佐米(bortezomib)能抑制蛋白酶体和nf-κb通路等，但这些药物的半衰期较短且容易导致肿瘤抗药性；最近几年上市的抗体药物主要靶向肿瘤细胞表面的膜受体如egfr、her2/neu、vegfr等，但单独使用时疗效常常不尽人意，也容易引起肿瘤的抗药性等。而为了避免肿瘤耐药性并有效地清除癌细胞，靶向配体药物偶联物(targetingligand–drugconjugates，tldc)的研发日益受到重视。目前这些靶头--靶向肿瘤的配体可以是蛋白质、小分子多肽、糖肽、模拟肽、小分子化合物、核酸寡核苷酸适配子等。研究者将靶头与化疗药物二者进行结合到一起，通过靶头的靶向作用特异性地识别到肿瘤细胞表面分子，然后利用细胞本身具备的内吞作用使化疗药物进入肿瘤细胞体内发生作用，从而达到杀死肿瘤细胞的目的，大大弥补了前者疗效偏低后者毒副作用大等方面缺陷。
tldc最具代表性的就是目前的研发热点--抗体药物偶联物(antibodydrugconjugate，adc)。2013年，首个adc药物，罗氏公司的kadcyla获得美国fda批准，用于治疗her2阳性同时对曲妥珠单抗和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌患者。目前已知有超过100种的adc在进行研发，有30多种adc进入不同阶段的临床试验，而我国的很多制药企业也正在关注和开展相关研发。
但adc药物的研发也存在难点：(1)抗体与效应分子的偶联有一定的难度。抗体分子量大，暴露的化学键也较多，而效应分子往往是一些小分子量的化合物，形象比喻就相当于在篮球上挂上几个乒乓球，因此偶联时如何控制一定的比例和确定偶联的部位就非常重要；(2)化学偶联很有可能会使抗体发生不可逆的变性，最常见的就是不好溶解或者失活，尤其是有较多二硫键链接的抗体，在修饰的时候更加需要小心；(3)抗体的糖基化对其活性和亲和性有很大的影响，偶联可能会对糖基化位点造成影响；(4)对固体肿瘤而言，adc必须具备良好的渗透性，才能达到肿瘤组织与目标抗原结合，而血管壁、组织屏障和血脑屏障的穿透性都与抗体的分子大小相关，进而决定了偶联的效应分子是否能顺利进入靶标细胞发挥作用等等；但由于抗体的分子量较大，所以据统计，只有1％的药物能到达靶部位顺利释放。因此，提供一种分子量小、穿透性好，且具备多靶向性的药物偶联物具有重要现实意义。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种肿瘤靶向的多肽。
本发明的另一目的在于提供所述肿瘤靶向多肽在制备多肽药物偶联物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种肿瘤靶向的多肽，其氨基酸序列为：(hyp)-(d-asn)-(d-leu)-(d-lys)-(cit)-(acpc)-(d-asp)-(aad)-(nva)；其中hyp表示羟脯氨酸，asn表示天冬酰胺，leu表示亮氨酸，lys表示赖氨酸，cit表示瓜氨酸，acpc表示环丙氨酸，asp表示天冬氨酸，aad表示2-氨基已二酸，nva表示正缬氨酸，大写d表示为后面的氨基酸为右旋氨基酸。
所述的肿瘤靶向的多肽在制备多肽药物偶联物中的应用。
一种多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物(llc2b-ss-dm1)，其结构式如i所示：
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，包括如下步骤：
(1)向酰胺树脂(c30h26no5r)中加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液进行反应，待反应结束后抽干溶剂，清洗，得到中间产物s1；
(2)向步骤(1)中得到的中间产物s1中加入含有fmoc-lys(dde)-oh，diea(n,n-二异丙基乙基胺)和hctu(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)的n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)溶液进行反应，待反应结束后抽干溶剂，得到中间产物s2；
(3)向步骤(2)中得到的中间产物s2中加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液进行反应，得到中间产物s3；
(4)重复步骤(2)～(3)中的操作，依次连接的氨基酸fmoc-aeea(即将fmoc-aeea替换步骤(2)中的fmoc-lys(dde)-oh，以此类推)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aeea-oh，fmoc-aeea-oh，fmoc-nva-oh，fmoc-aad(otbu)-oh，fmoc-d-asp(otbu)-oh，fmoc-acpc-oh，fmoc-cit-oh，fmoc-d-lys(boc)-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-d-asn(trt)-oh，boc-hyp-oh，得到llc2b-lys(dde)树脂球；
(5)向步骤(4)中得到的llc2b-lys(dde)树脂球中加入含有水合肼的dmf溶液进行反应，清洗，得到中间产物s4；
(6)向步骤(5)中得到的中间产物s4中加入含有3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的dmf溶液进行偶联反应，待反应结束后清洗，得到llc2b-k(ss)树脂球；
(7)向步骤(6)中得到的llc2b-k(ss)树脂球中加入三氟乙酸混合液进行切割处理，再加入冷乙醚使产物沉淀，清洗，真空抽干，得到llc2b-k(ss)干粉；
(8)将步骤(7)中得到的llc2b-k(ss)干粉溶于乙腈水溶液中，调节ph至7.0，再加入美登素(dm1)，室温搅拌，得到多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物(llc2b-ss-dm1)。
步骤(1)中所述的酰胺树脂的取代度为0.503mmol/g。
步骤(1)中所述的酰胺树脂为经过预处理的酰胺树脂，其通过如下方法实现：向酰胺树脂中加入dmf，浸泡2～3小时，然后弃去溶液，得到预处理后的酰胺树脂。
步骤(1)和(3)中所述的含有4-甲基哌啶的dmf溶液的浓度为质量百分比20％。
步骤(1)中所述的含有4-甲基哌啶的dmf溶液的用量为按每克酰胺树脂配比8～16毫升含有4-甲基哌啶的dmf溶液计算。
步骤(1)中所述的反应的时间优选为5～20分钟；优选为20分钟。
步骤(1)中所述的加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液优选为分成两次加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液；具体为：向酰胺树脂中加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液反应5分钟，然后去掉溶液，再次加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液反应15分钟。
步骤(1)中所述的清洗为依次采用dmf、甲醇和dmf进行清洗；优选为依次用dmf清洗三次、甲醇清洗三次和dmf清洗三次。
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，还包括将步骤(1)中得到的中间产物s1进行平衡的步骤；具体为：向中间产物s1中加入dmf平衡2～5分钟，然后抽干溶剂，得到平衡后的中间产物s1。
步骤(2)中所述的中间产物s1，fmoc-lys(dde)-oh，diea和hctu的摩尔比为1:5:10:5。
步骤(2)中所述的中间产物s1和含有fmoc-lys(dde)-oh，diea和hctu的n-甲基-2-吡咯烷酮溶液的体积比为1:2。
步骤(2)中所述的反应的时间为至少2小时；优选为2～4小时。
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，还包括将步骤(2)中得到的中间产物s2进行检测的步骤；具体为：将中间产物s2进行清洗，然后加入茚三酮溶液，kcn溶液和苯酚溶液各一滴，并在100℃～110℃加热5min，若变黄色，说明偶联充分，则进行下一步反应；若为蓝色，说明偶联不充分，则需要延长步骤(2)中的反应时间。
所述的茚三酮溶液通过如下方法配置得到：将5g茚三酮溶于100ml乙醇中，得到茚三酮溶液。
所述的kcn溶液通过如下方法配置得到：将2ml0.001m氰化钾和98ml重蒸吡啶混合均匀，得到kcn溶液。
所述的苯酚溶液通过如下方法配置得到：将80g苯酚溶于20ml乙醇中，得到苯酚溶液。
所述的清洗为依次采用dmf和乙醇进行清洗；优选为依次用dmf清洗三次和乙醇清洗一次。
步骤(3)中所述的中间产物s2与含有4-甲基哌啶的dmf溶液的体积比为1：2～4。
步骤(3)中所述的反应的时间优选为5～20分钟；优选为20分钟。
步骤(3)中所述的加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液优选为分成两次加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液；具体为：向中间产物s2中加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液反应5分钟，然后去掉溶液，再次加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液反应15分钟。
步骤(5)中所述的含有水合肼的dmf溶液的浓度为体积百分比2％。
步骤(5)中所述的llc2b-lys(dde)树脂球与含有水合肼的的dmf溶液的体积比为1：2～4。
步骤(5)中所述的反应的时间优选为5～15分钟；优选为15分钟。
步骤(5)中所述的清洗为依次采用dmf、甲醇和dmf进行清洗；优选为依次用dmf清洗三次、甲醇清洗三次和dmf清洗三次。
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，还包括将步骤(5)中得到的中间产物s4进行平衡的步骤；具体为：向中间产物s4中加入dmf平衡2～5分钟，然后抽干溶剂，得到平衡后的中间产物s4。
步骤(6)中所述的中间产物s4与3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的摩尔比为1：5。
步骤(6)中所述的中间产物s4与含有3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的dmf溶液的体积比为1:2。
步骤(6)中所述的偶联反应的时间优选为2小时。
步骤(6)中所述的清洗为依次采用dmf、甲醇和二氯甲烷进行清洗；优选为依次用dmf清洗三次、甲醇清洗三次和二氯甲烷清洗三次。
步骤(7)中所述的三氟乙酸混合液的组成成分为：82.5％(v/v)的三氟乙酸，5％(v/v)的苯甲硫醚，5％(v/v)的硫代茴香醚，2.5％(v/v)的三异丙基硅烷和5％(v/v)的水。
步骤(7)中所述的三氟乙酸混合液的用量为按每克llc2b-k(ss)树脂球配比10ml三氟乙酸混合液计算。
步骤(7)中所述的切割处理的时间为3小时。
步骤(7)中所述的清洗为采用冷乙醚进行清洗；优选为用冷乙醚清洗两次。
步骤(8)中所述的乙腈水溶液为乙腈与水按体积比1:1配比得到的溶液。
步骤(8)中所述的llc2b-k(ss)干粉与美登素(dm1)的质量比为15：4。
步骤(8)中所述的调节ph为采用含有10mmedta(乙二胺四乙酸)的pbs缓冲液(ph7.2)进行调节。
步骤(8)中所述llc2b-k(ss)干粉的用量为按其在体系终浓度为0.03～0.06mm计算；优选为按其在体系终浓度为0.03mm计算。
步骤(8)中所述的搅拌的时间为1小时以上。
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，还包括将步骤(8)中得到的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物进一步纯化的步骤。
所述的纯化为采用反相色谱hplc进行纯化。
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤包括乳腺癌等。
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的用量为0.5～2.0mg/kg。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明中采用能靶向包括fgfr2和her2在内的多个酪氨酸酶受体家族成员的小分子多肽作为靶头，选择目前adc药物研发中常用的效应分子和接头分子进行组合并偶联，形成一种新的多肽药物偶联物(peptidedrugconjugate，pdc)。与adc相比，本发明提供的pdc分子量相对小，穿透性较好，而且具备多靶向性，能针对包括her2和fgfr2在内的多个酪氨酸激酶受体高表达的肿瘤来发挥作用，而且克服了adc化学偶联过程可能出现的缺点，活性相对稳定。
(2)本发明还公开了该llc2b-ss-dm1的细胞水平和在体动物水平的实验结果，该结果说明pdc能靶向肿瘤细胞发挥作用，即llc2b-ss-dm1可以作为一种新的肿瘤治疗途径。
附图说明
图1是llc2b-ss-dm1的结构图。
图2是llc2b-ss-dm1偶联的过程图。
图3是llc2b-cyanine5.5偶联的过程图。
图4是s-llc2b-cyanine5.5的结构图。
图5是靶头多肽llc2b与fgfr2和her2蛋白的亲和性检测结果图；其中，图a为多肽llc2b与fgfr2蛋白的亲和性检测结果；图b为多肽llc2b与her2蛋白的亲和性检测结果。
图6是llc2b-ss-dm1的细胞克隆形成实验结果图。
图7是llc2b-ss-cy5.5的靶向肿瘤的活体小动物成像检测结果图。
图8是llc2b-ss-cy5.5的靶向肿瘤的活体小动物组织解剖成像检测结果图。
图9是llc2b-ss-dm1抗肿瘤的在体肿瘤体积检测检测结果统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。
本发明实施例中涉及的fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-aeea-oh，fmoc-nva-oh，fmoc-aad(otbu)-oh，fmoc-d-asp(otbu)-oh，fmoc-acpc-oh，fmoc-cit-oh，fmoc-d-lys(boc)-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-d-asn(trt)-oh，boc-hyp-oh和fmoc-aeea([2-[2-(fmoc-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸)连接分子购自美国chempep公司；酰胺树脂(rinkamideresin；c30h26no5r)购自美国p3biosystems公司(取代度为0.503mmol/g)；hctu[6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯，o-(1h-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate]、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸(3-sseimidopropionicacid)购自美国matrixscientific公司；6-氯-1-羟基苯并三氮唑(6-clhobt)、天然和非天然氨基酸均购自美国chem-impex公司；含荧光素基团的cyanine5.5-nhs(菁染料cy5.5琥珀酰亚胺，简称cy5.5-nhs)购自lumiprobe公司；4-甲基哌啶(4-methylpiperidine)购自美国alfaaesar公司；diea(n,n-二异丙基乙基胺，n,n-diisopropylethylamine)，三氟乙酸，苯甲醚，茴香醚，dic(n,n'-二异丙基碳二亚胺)和其他有机溶剂(如甲醇、乙醚等)均购自美国sigma-aldrich公司；dm1(maytansine，美登素)购自博瑞生物医药(苏州)股份有限公司。
实施例1、llc2b的合成
序列(hyp)-(d-asn)-(d-leu)-d-lys)-(cit)-(acpc)-(d-asp)-(aad)-(nva)即llc2b的合成与常规多肽合成的方法类似，具体如下：
(1)称取含fmoc保护基团的非天然氨基酸，按如下公式来称取：酰胺树脂克数×酰胺树脂取代度×4倍摩尔浓度×某个fmoc-氨基酸分子量。6-clhobt和dic同样按如下公式称取：酰胺树脂克数×酰胺树脂取代度×4倍摩尔浓度×分子量。称取6-clhobt和dic后，加入分析级dmf溶液，即1ml溶液中含hobt的质量＝0.05×0.31×4×169.7＝10.52mg；dic的体积＝0.05×0.31×4×126.2/0.815＝96μl，之后加入称好的含fmoc保护基团的非天然氨基酸(操作上可以10倍的量配制称去后分成10支管，再溶解不同氨基酸粉末)。按照此方法，分别配置9个氨基酸溶液。
(2)取酰胺树脂，加入2倍体积dmf，孵育2小时，之后真空泵抽干溶液，再加入含20％(w/w)4-甲基哌啶的dmf溶液分别反应5分钟和15分钟各一次，每次均抽干，再用dmf洗3次，甲醇洗3次，再dmf3洗次，每次均为20分钟。
(3)按序列顺序依次从c端往n端合成偶联，具体为在步骤(2)中加入步骤(1)配制的第一个4倍摩尔浓度的氨基酸溶液，振荡2～4h。2小时后挑取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮(100ml乙醇含5g茚三酮)，kcn(2ml0.001m氰化钾 98ml重蒸吡啶)和苯酚(20ml乙醇含80g苯酚)的溶液各一滴(约40ul)，105℃～110℃加热5min，变淡黄色为偶联充分，如有蓝色则继续反应。待反应完全后，抽干溶液，再加入dmf洗3次，甲醇洗3次，再dmf洗3次，每次均为20分钟。
(4)脱去偶联的氨基酸的保护基团，即再加入含20％(w/w)4-甲基哌啶的dmf溶液分别反应5分钟和15分钟各一次，每次均抽干，再加入dmf洗3次，甲醇洗3次，再dmf洗3次，每次均为20分钟。
(5)加入步骤(1)准备的第二个氨基酸溶液，重复步骤(3)和(4)，将llc2b的9个氨基酸都偶联到酰胺树脂上。
(6)采用tfa(三氟乙酸)混合液(tfa82.5％ 苯甲硫醚5％ 硫代茴香醚(thioanisole)5％ 三异丙基硅烷(triisopropylsilane)2.5％ 水5％；(v/v)，)，按每克树脂加入10ml溶液来切割llc2b，处理3小时。收集溶液用并用冷乙醚沉淀。之后沉淀再用冷乙醚洗两次，最后真空抽干，得到llc2b干粉。
实施例2：llc2b与rtk家族成员的亲和性检测结果
(1)准备好灭菌过滤后的超纯水作为样品的溶剂，小分子多肽(llc2b)和蛋白(fgfr2蛋白和her2蛋白)溶解之后进行分装，于-80℃冰箱储存；其中，fgfr2蛋白和her2蛋白均购买自北京义翘神州生物技术有限公司；
(2)配置预先设定好的小分子浓度和蛋白浓度，小分子多肽与蛋白浓度比在80～150倍(此浓度比是μm级别的浓度比)；
(3)样品配制好之后进行过滤，室温放置30min进行上机(使用的仪器为等温滴定量热仪itc200)操作
(4)手动清洗样品池和参比池7～8次，接着机器清洗样品池和滴定针，待仪器清洗之后，参比池和样品池加入超声过滤的超纯水(反复抽吸排除池中的气泡)；
(5)设定好实验参数，一般转速设为750rpm，温度25℃，每滴2μl，19-20滴微量滴定，滴定针执行上样，进行水滴水实验；
(6)水滴水实验证明仪器干净后，可以进行样品的滴定，一般样品的滴定包括样品滴水，样品滴buffer，以及样品滴蛋白，3次滴定结果进行整合分析；本实施例中由于样品使用超纯水溶解，因此只需要样品滴水和样品滴蛋白两次滴定。
(7)滴定结束后，如发现放热或吸热值没有什么变化，或者没有达到滴定饱和值，需要根据数据分析调整浓度比例进行二次实验；
(8)数据处理，用origin分析软件对放热曲线进行模拟拟合运算出n(反应的化学计量比)、ka(亲和常数)、△h(反应引起的焓变)、△s(反应引起的熵变)等参数，其中ka值为结合常数，kd＝1/ka。
(9)结果表示llc2b与fgfr2和her2蛋白亲和力kd值分别是0.96nm和1.49nm(图5)。
实施例3：llc2b-ss-dm1的合成
llc2b-ss-dm1的结构如图1所示，偶联过程如图2所示：
(1)称取1.0g酰胺树脂，然后将酰胺树脂放入反应管中，加入2倍体积dmf(n,n-二甲基甲酰胺)浸泡2～3小时；抽吸弃去溶液，加入含有20％(w/w)4-甲基哌啶的dmf溶液(8毫升)，反应5分钟，去掉溶液后再加含有20％(w/w)4-甲基哌啶的dmf溶液(8毫升)，反应15分钟；通过抽滤装置抽干溶剂，之后采用dmf三次、甲醇三次和dmf三次清洗，再加入分析级dmf平衡2～5分钟。
(2)通过抽滤装置抽干溶剂，加入2倍体积的含5倍摩尔浓度的fmoc(即芴甲氧羰基)基团保护的化合物fmoc-lys(dde)-oh和5倍摩尔浓度hctu的nmp(n-methyl-2-pyrrolidone，n-甲基-2-吡咯烷酮)溶液，再加入10倍摩尔浓度的diea，振荡旋转反应至少2～4小时。
(3)检测：取少量(1毫克左右)步骤(2)中获得的树脂，用dmf洗三次和乙醇洗一次，加入茚三酮(100ml乙醇含5g茚三酮)，kcn(2ml0.001m氰化钾 98ml重蒸吡啶)和苯酚(20ml乙醇含80g苯酚)的溶液各一滴(约40ul)，100℃～110℃加热5min，变黄色为阴性反应，说明偶联充分，则进行下一步反应；如为蓝色，说明偶联不充分，仍需延长反应时间；
(4)脱保护：抽吸弃去溶液，加入2倍体积含有20％(w/w)4-甲基哌啶的dmf溶液，反应5分钟，过滤去除溶液，再加2倍体积20％(w/w)4-甲基哌啶的dmf溶液反应15分钟；
(5)重复步骤(2)至(4)中的操作，依次连接的氨基酸fmoc-aeea(即将fmoc-aeea替换步骤(2)中的fmoc-lys(dde)-oh，以此类推)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aeea-oh，fmoc-aeea-oh，fmoc-nva-oh，fmoc-aad(otbu)-oh，fmoc-d-asp(otbu)-oh，fmoc-acpc-oh，fmoc-cit-oh，fmoc-d-lys(boc)-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-d-asn(trt)-oh，boc-hyp-oh，获得保护修饰的llc2b-lys(dde)树脂球(protected-llc2b-k(dde)珠子)。
(6)向步骤(5)中得到的llc2b-lys(dde)树脂球加入2倍体积的含2％(v/v)水合肼的dmf溶液分别反应5分钟和10分钟各一次并抽干，再采用dmf三次、甲醇三次和dmf三次清洗，再加入分析级dmf平衡2～5分钟。
(7)充分洗涤平衡后抽干溶剂，然后加入2倍体积含有3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的dmf溶液；其中，3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的加入量相当于树脂球5倍分子数。使其与树脂球上的c-末端赖氨酸侧链偶联，室温条件下偶联反应2小时，获得有保护基团的llc2b-k(ss)树脂球，抽干，再采用dmf三次、甲醇三次和二氯甲烷(dcm)三次清洗，再真空抽干。
(8)采用tfa(三氟乙酸)混合液(tfa82.5％ 苯甲硫醚5％ 硫代茴香醚5％ 三异丙基硅烷2.5％ 水5％；(v/v))处理树脂球3小时用以切割llc2b-k(ss)，其用量为按每克树脂加入10mltfa混合液。收集溶液用并用冷乙醚沉淀。之后沉淀再用冷乙醚洗两次，最后真空抽干，得到llc2b-k(ss)干粉。
(9)称量步骤(8)中得到的llc2b-k(ss)干粉(150mg)，再将其溶解于乙腈(acn):水＝1:1(体积比)的溶液中，使其终浓度为0.06mm，之后加入含有10mmedta(乙二胺四乙酸)的pbs缓冲液(ph7.2)将溶液的ph调整到7.0。
(10)溶于乙腈的dm1(美登素40mg，0.054mmol)1公升溶液慢慢加入上述llc2b-k(ss)溶液1公升中，并室温搅拌1小时，直到埃尔曼试验结果阴性，即二硫键还原成巯基后检测，无显色反应说明无游离的二硫键。
(11)上述反应液直接采用反相色谱hplc进行纯化，层析柱信号为vydacc18column(22×250mm)，流速5ml/min。用溶剂a(在h2o中含有0.1％(v/v)的tfa)和溶剂b(acn中含有0.1％(v/v)tfa)进行hplc梯度洗脱(0～70％b，40分钟内)，214nm波长进行检测。洗脱液经冻干后得到白色粉末，即llc2b-ss-dm1，纯度＞95％，其分子量为：3152.9752。
实施例4：llc2b-cy5.5(llc2b-cyanine5.5)的合成
取部分(约50毫克)实施例3步骤(5)中制备的有保护基团的llc2b-lys(dde)树脂球，置于1.5毫升聚丙烯柱中。脱除dde并彻底洗涤后，在无水dmf(0.7ml)中加入cy5.5-nhs(38mg，0.05mmol)和diea(17.5l，0.1mmol)，在室温下(用箔包柱)旋转混匀2小时。抽干，再采用dmf三次、甲醇三次和二氯甲烷(dcm，dichloromethane)三次清洗，再真空抽干。产物再用如实施例3步骤(8)中所述的tfa混合液从树脂球切割化合物(时间为3小时)，收集溶液用并用冷乙醚沉淀；之后沉淀再用冷乙醚洗两次，最后真空抽干。hplc(方法参考实施例3步骤(11))纯化得到llc2b-cy5.5(图3)，深蓝色粉末(纯度＞95％)。其分子量预测为：3111.67。ssdi-tof质谱分析实际检测为：3112.21。
实施例5：s-llc2b-cy5.5(scrambledllc2b-cy5.5，打乱序列的对llc2b-cy5.5)的合成
打乱序列的对照llc2b标识为s-llc2b，其序列为(hyp)-(d-leu)-(cit)-(d-asp)-(d-asn)-(d-lys)-(acpc)-(nva)-(aad)。合成方法与上述实施例4类似，即先合成s-llc2b-lys(dde)树脂球，然后再合成s-llc2b-cy5.5(图4)。s-llc2b-cy5.5的分子量预测同样为3111.67。ssdi-tof质谱分析实际检测为:3112.47。
实施例6：llc2b-ss-cy5.5靶向在体肿瘤的活体检测
(1)balb/c-nu裸小鼠购自广东省医学实验动物中心，4～6周龄，18～20g，雌性，分成3组。
(2)裸鼠皮下注射mcf-7细胞，肿瘤长至50～100mm3后分别尾静脉注射40nmol的pbs缓冲液，llc2b-ss-cy5.5，或s-llc2b-ss-cy5.5；其中，llc2b-ss-cy5.5和s-llc2b-ss-cy5.5的制备方法参考实施例2和3，不同之处在于，llc2b-ss-cy5.5为llc2b-ss-dm1将dm1部分改为荧光标记cy5.5(用于观察体内靶向性)；s-llc2b-ss-cy5.5为将llc2b短肽的序列打乱(作为对照)。24h后活体成像观察靶向性。之后解剖分离内脏器官以及肿瘤等观察荧光分布。
结果如图7和图8所示，通过附图可以看出llc2b-ss-cy5.5可以很好的靶向到肿瘤部分，而对照组pbs组不可见荧光，s-llc2b-ss-cy5.5的靶向性不如llc2b-ss-cy5.5组。说明llc2b具有靶向肿瘤的作用。
实施例7：llc2b-ss-dm1的抗肿瘤细胞增殖的检测
(1)取对数生长期的mcf-7细胞(mcf-7细胞购于中科院细胞所)，0.25％胰酶消化细胞，显微镜细胞计数，每孔含细胞600个铺在六孔板中；
(2)待细胞长到8～16个克隆团后，开始加入多肽药物dm1和llc2b-ss-dm1，于37℃，5％(v/v)co2培养箱中培养；
(3)培养4～5天后，细胞长到50～100个克隆团左右，终止培养；
(4)吸除培养基，pbs缓冲液润洗2～3次，4％(w/v)多聚甲醛固定10-15min；
(5)吸走4％(w/v)多聚甲醛，风干过夜(一定要全干)；
(6)每孔加入0.2％(w/v)的结晶紫水溶液500μl，染色10min，回收结晶紫；
(7)超纯水轻洗3～5遍，至6孔板中基本无背景色；
(8)风干六孔板，拍照。结果如图6所示，与阳性对照dm1相比，ll2b-ss-dm1可通过llc2b对fgfr2和her2的靶向作用，再通过dm1的毒性作用抑制癌细胞的生长。
实施例8：llc2b-ss-dm1的在体抗肿瘤活性结果
(1)balb/c-nu裸小鼠购自广东省医学实验动物中心，4～6周龄，18～20g，雌性。
(2)现有小鼠25只，总共分成5组，每组5只小鼠。
(3)小鼠单侧种瘤，每侧细胞1×107个mcf-7细胞，肿瘤长至30～50mm3开始给药(大约一周)。
(4)采用尾静脉注射给药，每周给药1次，一共给药3周。药物为llc2b-ss-dm1，药物浓度分别为0.5，1.0和2.0mgdm1equiv./kg。对照组dm1组药物浓度为0.5mg/kg。治疗过程中，每2天测量一次小鼠肿瘤体积和体重变化，给药结束后再测量1周。
(5)用游标卡尺测量肿瘤的长径(l)和短径(w)大小，根据体积公式：v＝0.5×l×w2，计算肿瘤体积。
(6)治疗结束后，将小鼠安乐死，解剖剥下肿瘤拍照。结果如图9所示，可以看出llc2b-ss-dm1可以抑制肿瘤体积。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种肿瘤靶向的多肽，其特征在于，所述的肿瘤靶向的多肽的氨基酸序列为：(hyp)-(d-asn)-(d-leu)-(d-lys)-(cit)-(acpc)-(d-asp)-(aad)-(nva)。
2.权利要求1所述的肿瘤靶向的多肽在制备多肽药物偶联物中的应用。
3.一种多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物，其特征在于，其结构式如i所示：
4.权利要求3所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向酰胺树脂中加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液进行反应，待反应结束后抽干溶剂，清洗，得到中间产物s1；
(2)向步骤(1)中得到的中间产物s1中加入含有fmoc-lys(dde)-oh，diea和hctu的n-甲基-2-吡咯烷酮溶液进行反应，待反应结束后抽干溶剂，得到中间产物s2；
(3)向步骤(2)中得到的中间产物s2中加入含有4-甲基哌啶的dmf溶液进行反应，得到中间产物s3；
(4)重复步骤(2)～(3)中的操作，依次连接的氨基酸fmoc-aeea，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(boc)，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-aeea-oh，fmoc-aeea-oh，fmoc-nva-oh，fmoc-aad(otbu)-oh，fmoc-d-asp(otbu)-oh，fmoc-acpc-oh，fmoc-cit-oh，fmoc-d-lys(boc)-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-d-asn(trt)-oh，boc-hyp-oh，得到llc2b-lys(dde)树脂球；
(5)向步骤(4)中得到的llc2b-lys(dde)树脂球中加入含有水合肼的dmf溶液进行反应，清洗，得到中间产物s4；
(6)向步骤(5)中得到的中间产物s4中加入含有3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的dmf溶液进行偶联反应，待反应结束后清洗，得到llc2b-k(ss)树脂球；
(7)向步骤(6)中得到的llc2b-k(ss)树脂球中加入三氟乙酸混合液进行切割处理，再加入冷乙醚使产物沉淀，清洗，真空抽干，得到llc2b-k(ss)干粉；
(8)将步骤(7)中得到的llc2b-k(ss)干粉溶于乙腈水溶液中，调节ph至7.0，再加入美登素，室温搅拌，得到多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物。
5.根据权利要求4所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)和(3)中所述的含有4-甲基哌啶的dmf溶液的浓度为质量百分比20％；
步骤(1)中所述的含有4-甲基哌啶的dmf溶液的用量为按每克酰胺树脂配比8～16毫升含有4-甲基哌啶的dmf溶液计算；
步骤(2)中所述的中间产物s1，fmoc-lys(dde)-oh，diea和hctu的摩尔比为1:5:10:5；
步骤(3)中所述的中间产物s2与含有4-甲基哌啶的dmf溶液的体积比为1：2～4；
步骤(5)中所述的含有水合肼的dmf溶液的浓度为体积百分比2％；
步骤(5)中所述的llc2b-lys(dde)树脂球与含有水合肼的的dmf溶液的体积比为1：2～4；
步骤(6)中所述的中间产物s4与3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸的摩尔比为1：5；
步骤(7)中所述的三氟乙酸混合液的组成成分为：82.5％(v/v)的三氟乙酸，5％(v/v)的苯甲硫醚，5％(v/v)的硫代茴香醚，2.5％(v/v)的三异丙基硅烷和5％(v/v)的水；
步骤(7)中所述的三氟乙酸混合液的用量为按每克llc2b-k(ss)树脂球配比10ml三氟乙酸混合液计算；
步骤(8)中所述的llc2b-k(ss)干粉与美登素的质量比为15：4；
步骤(8)中所述llc2b-k(ss)干粉的用量为按其在体系终浓度为0.03～0.06mm计算。
6.根据权利要求4所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，其特征在于，还包括将步骤(2)中得到的中间产物s2进行检测的步骤；具体为：
将中间产物s2进行清洗，然后加入茚三酮溶液，kcn溶液和苯酚溶液各一滴，并在100℃～110℃加热5min，若变黄色，说明偶联充分，则进行下一步反应；若为蓝色，说明偶联不充分，则需要延长步骤(2)中的反应时间；
所述的清洗为依次采用dmf和乙醇进行清洗。
7.根据权利要求4所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的酰胺树脂为经过预处理的酰胺树脂，其通过如下方法实现：向酰胺树脂中加入dmf，浸泡2～3小时，然后弃去溶液，得到预处理后的酰胺树脂；
步骤(1)中所述的反应的时间为5～20分钟；
步骤(1)中所述的清洗为依次采用dmf、甲醇和dmf进行清洗；
步骤(2)中所述的反应的时间为至少2小时；
步骤(3)中所述的反应的时间为5～20分钟；
步骤(5)中所述的反应的时间为5～15分钟；
步骤(5)中所述的清洗为依次采用dmf、甲醇和dmf进行清洗；
步骤(6)中所述的偶联反应的时间为2小时；
步骤(6)中所述的清洗为依次采用dmf、甲醇和二氯甲烷进行清洗；
步骤(7)中所述的切割处理的时间为3小时；
步骤(7)中所述的清洗为采用冷乙醚进行清洗；
步骤(8)中所述的乙腈水溶液为乙腈与水按体积比1:1配比得到的溶液；
步骤(8)中所述的调节ph为采用含有10mm乙二胺四乙酸的pbs缓冲液进行调节；
步骤(8)中所述的搅拌的时间为1小时以上。
8.根据权利要求4所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的制备方法，其特征在于：还包括将步骤(8)中得到的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物进一步纯化的步骤；
所述的纯化为采用反相色谱hplc进行纯化。
9.权利要求3所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：
所述的肿瘤为乳腺癌；
所述的多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物的用量为0.5～2.0mg/kg。
技术总结