本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种抑制破骨细胞分化的订书肽及其制备方法和应用。
背景技术：
骨质疏松症是以骨量降低、骨组织显微结构发生改变，以骨脆性增加、骨强度下降、易骨折为特征的一种骨病，其病理生理学基础是骨吸收与骨形成的失衡，该平衡由促骨形成的成骨细胞和促骨吸收的破骨细胞进行调控。目前临床使用最广泛的抗骨质疏松药物主要包括抑制破骨细胞分化的双膦酸盐和促进骨形成的特立帕肽等小分子药物。为提高治疗药物的选择性，减少副作用，当前，通过外源性分子来调控成骨细胞和破骨细胞分化相关的重要信号通路已成为骨质疏松研究的热点方向之一。
本申请发明人在现有技术披露的众多信息中注意到，有研究表明糖原合成酶激酶3β(gsk3β)能够促进破骨细胞关键因子nfatc1从细胞核向细胞质的转移，从而抑制破骨细胞的分化；还有文献报道frattide与磷酸化的gsk3β能形成稳定的复合物晶体结构；而gsk3β与磷酸化gsk3β之间存在相互转化的关系，因此，本申请发明人推测特异性地靶向磷酸化gsk3β进而抑制磷酸化gsk3β可在一定程度上抑制gsk3β的表达，从而达到对破骨细胞的负向调控。
生物体内蛋白质之间的相互作用在生命过程中起着至关重要的作用。通过人工合成分子来调控蛋白-蛋白相互作用界面是一种有效的策略，其已经广泛地应用于药物化学中以进行疾病干预，其中人工合成多肽即为调控蛋白间相互作用的一种重要手段。但因存在稳定性低，透膜性差等问题，当前，多肽类药物在临床上的应用受到了较大的限制。应用全碳骨架形成侧链环合结构改造多肽来稳定α-螺旋肽的活性构象，即订书肽(stapledpeptide)，成为克服这一缺陷的最直接最有效方法。
目前现有技术公开了一些具有抑制破骨细胞分化的活性的多肽。例如专利文献cn109111506a，公开了一种用于治疗骨质疏松的多肽，其氨基酸序列为：asp-ser-ser)6-(d-tyr)-asn-(d-trp)-asn-ser-phe-(azagly)-leu-arg(me)-phe-nh2((aspserser)6-kp-10，并证明了(aspserser)6-kp-10具有较好的骨靶向作用，可以有效地抑制破骨细胞分化，治疗由于卵巢切除导致的骨质疏松。又如专利文献cn109251242a，公开了一种多肽，该多肽不仅与天然的白细胞介素-3功能相同或类似，并且皮肤渗透度非常优秀，可以通过抑制核因子κb受体活化因子配体-核因子κb受体活化因子信号路径，抑制核因子κb的活化及核转录，并抑制由核因子κb受体活化因子配体及炎性细胞因子诱导的抗酒石酸盐酸性磷酸酶、组织蛋白酶k或1型或2型肿瘤坏死因子受体的表达，从而以浓度依赖性的方式抑制破骨细胞的分化。但目前未见frattide或其订书肽对破骨细胞分化的作用的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种抑制破骨细胞分化的订书肽。
本发明的再一的目的是，提供所述订书肽的用途。
本发明的另一的目的是，提供所述订书肽的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种订书肽，所述订书肽选自下列中的一种：
a)以ac-dphrllqqlvls-nh2为肽链模板，其中7q和11l被s5替换并环合；
b)以ac-dphrllqqlvls-nh2为肽链模板，其中3h和7q被s5替换并环合；
c)以ac-dphrllqqlvls-nh2为肽链模板，其中5l和9l被s5替换并环合；
d)以ac-gnlikeavrrlhsr-nh2为肽链模板，其中5k和9r被s5替换并环合；
e)以ac-gnlikeavrrlhsr-nh2为肽链模板，其中7a和11l被s5替换并环合；
f)以ac-gnlikeavrrlhsr-nh2为肽链模板，其中8v和12h被s5替换并环合。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述订书肽在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
所述订书肽在制备抑制破骨细胞分化的试剂中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的订书肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)在缩合剂的作用下分别使c端首个氨基酸与固相载体偶联；
(2)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下连接下一个氨基酸；
(4)重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以s5分别替代i和i 4位氨基酸；
(5)最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；
(6)在环合剂作用下使i和i 4位s5氨基酸发生烯烃复分解反应，环合肽链；
(7)使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
作为本发明的一个优选例，采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：ymc-packods-aq柱；流动相：流动相a为0.1％tfa/水，流动相b为0.1％tfa/乙腈；梯度洗脱程序：25％b洗脱0～5min，25％b～45％b、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
作为本发明的另一优选例，步骤(1)中采用的缩合剂为dic-oxyme缩合体系，活化剂为dic，以nmp为溶剂。
更优选地，步骤(1)中氨基酸、oxyme、dic的比例为1:1:1:6(mol/mol/mol/ml)或1:0.9:0.9:6(mol/mol/mol/ml)。
作为本发明的另一优选例，步骤(1)中固相合成时，树脂的载样量为0.3mmol/g。
作为本发明的另一优选例，步骤(1)中偶联反应的温度为50～60℃，更优选为55℃；偶联反应的时间为20-30min，更优选为20min。
作为本发明的另一优选例，步骤(2)中，所述脱保护试剂为oxyme、哌啶及dmf的混合溶液，比例为71:2:4(m/v/v)。
作为本发明的另一优选例，步骤(2)中，脱fmoc保护是采用保护试剂作用5min后，再次作用5min；脱除fmoc基团的反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
作为本发明的另一优选例，s5后所接的第一个氨基酸反应时间为1h并按相同条件重复反应一次再进行下一步操作。
作为本发明的另一优选例，步骤(5)中，使用的乙酰化试剂为吡啶与醋酸酐的混合液，投料比为1:1(v/v)。
作为本发明的另一优选例，步骤(5)所述乙酰化是采用树脂在乙酰化试剂中反应20min；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合剂为grubbsⅰ试剂的二氯乙烷的溶液，投料比为树脂载样量:grubbsⅰ试剂:二氯乙烷＝0.3:58:6(mmol/mg/ml)。
作为本发明的另一优选例，步骤(6)中所述环合是树脂在环合试剂中震荡两次，每次2h；反应温度为20～30℃，更优选为25℃。
作为本发明的另一优选例，步骤(7)中，所述切割试剂为tips、h2o和tfa的混合溶液，体积比为2.5:2.5:95；所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10ml/mg。
作为本发明的另一优选例，步骤(7)中，切割的温度为20～30℃，更优选为25℃；切割的时间为4h。
本发明优点在于：
1、本申请发明人基于丰富的研究经验，认识到frattide可能具有抑制破骨细胞分化的作用，进一步设计并合成了订书肽，实验证实了其可显著抑制破骨细胞分化，在骨质疏松症等相关疾病治疗中具有潜在的应用价值。
2、本发明以氨基树脂树脂为载体，按照模板frattide：ac-dphrllqqlvlsgnlikeavrrlhsr-nh2氨基酸序列在dic-oxime缩合体系中，通过fmoc固相合成法，合成得到肽链，其间在保留关键氨基酸残基的基础上，于特定位置以s5代替原有氨基酸，连接在树脂上直链肽在grubbsⅰ试剂的二氯乙烷溶液中进行烯烃复分解反应环合后从树脂上切下得到目标订书肽，所得化合物经纯化后，采用hplc及ms等光谱进行表征分析。该方法简便易行，所得订书肽纯度大于98％，产率高。
附图说明
图1为本发明订书肽示意图。
图2为本发明订书肽的合成路线图。
图3-12为纯化后的目标化合物高效液相色谱图(图3-4)和质谱图(图5-12)。
图13-14为破骨细胞分化抑制实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明按照模板frattide：ac-dphrllqqlvlsgnlikeavrrlhsr-nh2(seqidno:1)氨基酸序列设计并合成6条订书肽。其中，frn-1，frn-2和frn-3选取肽段ac-dphrllqqlvls-nh2(seqidno:2)为肽链模板；frc-1，frc-2和frc-3选取肽段ac-gnlikeavrrlhsr-nh2(seqidno:3)为肽链模板。各订书肽具体如图1所示。
以下实施例，涉及的缩略词解释如下：
fmoc：芴甲氧羰基
dcm：二氯甲烷
dce：二氯乙烷
dmf：n,n-二甲基甲酰胺
oxyme：ethylcyanoglyoxylate-2-oxime
dic：n,n-二异丙基碳二亚胺
nmp：n-甲基吡咯烷酮
s5：2-amino-2-methylhept-6-enoicacid
tfa：三氟乙酸
tips：三异丙基硅烷
grubbsⅰ：苯基亚甲基双(三环已基磷)二氯化钌
涉及的实验材料来源如下：
氨基酸、氨基树脂购自上海吉尔生化有限公司；n-甲基吡咯烷酮(nmp)、n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)、ethylcyanoglyoxylate-2-oxime、三氟乙酸(tfa)、乙腈(色谱纯)购自北京百灵威科技有限公司；n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、无水乙醚、二氯甲烷(dcm)、二氯乙烷(dce)、哌啶、苯酚均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。
实施例1本发明抑制破骨细胞分化的订书肽的制备
1、订书肽的合成
如图2所示：
(1)化合物1的制备
取氨基树脂500mg(载样量为0.30mmol·g-1)加入到固相合成反应管中，用dcm浸泡20min使树脂充分溶胀，抽干待用。
加20％哌啶-dmf溶液(0.1moxyme)至树脂完全淹没，25℃下振荡5min×2脱去树脂上的fmoc，依次用dcm、dmf洗涤树脂各3次。
(2)化合物2的制备
将序列中首个氨基酸(1mmol)、oxyme(142mg，1mmol)和dic(155.0μl，1mmol)混溶于6mlnmp中，加入到树脂中60℃下振荡20min(s5后的一个氨基酸反应1h，重复反应1次)，依次用dcm、dmf洗涤树脂各3次。
(3)化合物3的制备
重复(1)、(2)步骤的做法，根据多肽序列依次将fmoc氨基酸(1mmol)、oxyme(142mg)和dic(155μl)混溶于6mlnmp，加入到树脂中，于60℃下振荡20min，重复脱保护→缩合→脱保护，直至所有氨基酸连接完成。最后一个氨基酸脱保护后，加入吡啶:乙酸酐(1:1)混合液6ml在25℃下震荡20min，依次用dcm、dmf、无水乙醚洗涤树脂各3次后，抽真空干燥树脂。
(4)化合物4的制备
待树脂完全干燥后，加入grubbsⅰ(58mg)试剂的二氯乙烷溶液(6ml)，25℃下震荡反应两次，每次2h，反应完成后依次用dcm、dmf、无水乙醚洗涤树脂各3次，抽真空干燥树脂。
(5)目标化合物的制备
将树脂洗净抽干，加入tips:h2o:tfa＝2.5:2.5:95(v/v/v)15ml，常温下振荡4h，过滤，用少许tfa洗涤树脂，收集滤液。氩气鼓泡吹走多余tfa，倒入冰乙醚沉淀离心后，弃掉上清液，继续用冰乙醚反复洗涤离心三次，氩气吹干得订书肽粗品。
2、目标订书肽的纯化
将粗肽用乙腈和水溶解，通过制备型rp-hplc纯化。分离条件如下：
仪器：pre-hplcsd-1varian高效液相色谱仪；
色谱柱：ymc-packods-aq(250×20mml.d，s-5μm，12nm)；
流动相：流动相a为体积分数为0.1％tfa的水溶液，流动相b为体积分数为0.1％tfa的乙腈溶液；
步骤与参数：25％b洗脱0～5min，25％b～45％b、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
实施例2产物的鉴别与结构分析
将实施例1的步骤2所得产物通过hplc进行鉴别以及hr-q-tof-ms(高分辨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)进行结构分析，色谱流动相为乙腈和水。流动相a为体积分数为0.1％tfa的水溶液，流动相b为体积分数为0.1％tfa的乙腈溶液，梯度洗脱(0～5min，流动相b：5％；5-30min，流动相b：5％～90％)；流速15.0ml·min-1；检测波长214nm和254nm，进样量20μl。经测定与粗品主峰出峰时间一致，且本法所制备订书肽纯度>98％(图3-4)。通过hr-esi-ms质谱仪分析结果如图5-12所示。
实施例3抑制破骨细胞分化实验
trap染色试验：破骨细胞的形成通过trap阳性细胞定量检测。bmms以每孔8000个细胞的密度接种到96孔板中。孵化24h后，bmms加入浓度为30ng/ml的m-csf，50ng/ml的rankl和不同浓度的肽(0，20和40μm)进行孵化。每2天更换一次新鲜培养基。破骨诱导5天后，pbs洗涤2次，在4％多聚甲醛(ph7.4)中室温固定10min，trap染色试剂盒染色。光学显微镜下阳性多核破骨细胞计数，使用imagej软件测量每孔破骨细胞百分比。
结果见图13-14，本发明的订书肽可以抑制破骨细胞的分化，其中frn-2、frc-1、frc-2和frc-3效果最为突出，frc-2效果最优。
以上实施例表明，本发明成功制备得到基于frattide的订书肽，且证明了该订书肽可以显著抑制破骨细胞的分化，具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
sequencelisting
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>一种抑制破骨细胞分化的订书肽及其制备方法和应用
<130>/
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
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<212>prt
<213>人工序列
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aspprohisargleuleuglnglnleuvalleuserglyasnleuile
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2025
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<213>人工序列
<400>2
aspprohisargleuleuglnglnleuvalleuser
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<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<400>3
glyasnleuilelysglualavalargargleuhisserarg
1510
1.一种订书肽，其特征在于，所述订书肽选自下列中的一种：
a)以ac-dphrllqqlvls-nh2为肽链模板，其中7q和11l被s5替换并环合；
b)以ac-dphrllqqlvls-nh2为肽链模板，其中3h和7q被s5替换并环合；
c)以ac-dphrllqqlvls-nh2为肽链模板，其中5l和9l被s5替换并环合；
d)以ac-gnlikeavrrlhsr-nh2为肽链模板，其中5k和9r被s5替换并环合；
e)以ac-gnlikeavrrlhsr-nh2为肽链模板，其中7a和11l被s5替换并环合；
f)以ac-gnlikeavrrlhsr-nh2为肽链模板，其中8v和12h被s5替换并环合。
2.权利要求1所述的订书肽在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
3.权利要求1所述的订书肽在制备抑制破骨细胞分化的试剂中的应用。
4.权利要求1所述的订书肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在缩合剂的作用下分别使c端首个氨基酸与固相载体偶联；
(2)使用脱保护试剂脱去氨基酸上的fmoc保护基；
(3)在缩合剂作用下连接下一个氨基酸；
(4)重复进行脱保护-耦合操作，依照氨基酸序列合成肽链；其中，环合位点以s5分别替代i和i 4位氨基酸；
(5)最后一个氨基酸脱保护后乙酰化；
(6)在环合剂作用下使i和i 4位s5氨基酸发生烯烃复分解反应，环合肽链；
(7)使用切割试剂将肽链从载体上切下，纯化后得相应订书肽。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)采用的纯化方法为反向高效液相色谱法，条件如下：色谱柱：ymc-packods-aq柱；流动相：流动相a为0.1％tfa/水，流动相b为0.1％tfa/乙腈；梯度洗脱程序：25％b洗脱0～5min，25％b～45％b、5～60min；流速为15ml/min，进样量为5ml，检测波长214nm。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用的缩合剂为dic-oxyme缩合体系，活化剂为dic，以nmp为溶剂。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述脱保护试剂为oxyme、哌啶及dmf的混合溶液，比例为71:2:4(m/v/v)。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，乙酰化试剂为吡啶与醋酸酐的混合液，投料比为1:1(v/v)。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述环合剂为grubbsⅰ试剂的二氯乙烷的溶液，投料比为树脂载样量:grubbsⅰ试剂:二氯乙烷＝0.3:58:6(mmol/mg/ml)。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述切割试剂为tips、h2o和tfa的混合溶液，体积比为2.5:2.5:95，所述切割试剂与直链肽的体积质量比为1:10ml/mg。
技术总结