本发明属于药物载体领域，更具体的，本发明涉及一种双子型两亲性短肽及其作为疏水性药物载体的应用。
背景技术：
：目前临床上许多的小分子药物本身为疏水性，水溶性差，在制剂中通常需要采用载体将其分散、溶解在水溶液或水性溶液中，才能通过注射给药。目前在临床上广泛使用的疏水药物的载体主要有脂质等材料。以最常用的抗癌药物紫杉醇为例，上市药物紫杉醇注射液taxol中含有约527mg/ml的聚氧乙烯蓖麻油以及49.7％的无水乙醇作为溶媒；最常用的全身麻醉药物如丙泊酚，是以天然大豆油、蛋黄卵磷脂等脂质分子为载体的脂肪乳制剂；血管舒张药前列地尔采用了大豆油、卵磷脂、油酸等脂质分子为载体的脂肪乳注射液；高血压药物氯维地平也含有注射用油和磷脂成分。但是，脂质成分在临床上的应用存在一些问题，例如稳定性较差(anesthanalg2003，97：769-771)、引起注射痛(actaanaesthesiolscand2001，45：839-841)、诱发高血脂(lancet2001，357：606-607)以及容易引起细菌快速生长而诱发感染等(anesth.analg.1999，88：209-212)。紫杉醇注射液taxol在临床使用过程中出现了较多不良反应如急性超敏反应(allergyasthmaimmunolres2016，8：174-177)，神经毒性(nanomedicine2015，11：1925-1938)等；丙泊酚脂肪乳注射液存在丙泊酚输注综合征(propofolinfusionsyndrome，pris)的问题(critcare2015，19：398)；氯维地平注射液限制了严重脂质代谢紊乱的患者的使用(见氯维地平注射液说明书)，等等。上述问题基本都与脂质成分相关。因此开发新型的不含脂质成分的疏水药物的载体材料的方向极具前景。目前有一些其他的非脂质材料已应用在临床上，如人血白蛋白包载紫杉醇的制剂abraxane已于2005年在美国上市，其副作用小，给药时间短，不良反应降低(intjnanomedicine2009，4：99-105)。但是，该剂型受限于白蛋白载体的人血来源及相应的微生物和病毒污染风险，价格昂贵。采用聚合物mpeg-plla材料载紫杉醇制剂cynviloq已于2007年在韩国上市(advdrugdeliverrev2017，122：20-30)，但是聚合物材料价格较高，合成工艺较复杂，同时聚合物纳米毒性还需要继续关注。在生物安全性方面，人工合成的短肽具有其独特的优势，也是一种很有潜力的药物载体材料。中国发明专利(zl专利号00105625.5，授权公告号cn1148227c，题为“治疗化合物及其应用”)公开了一种基于短肽载体的治疗化合物及其应用。该发明专利是将紫杉醇与谷氨酸、天冬氨酸通过化学结合的方式形成治疗化合物，而非利用短肽自组装形成的纳米球对药物直接进行装载。人工设计的自组装短肽作为近年来国际上新兴的一类材料受到越来越多的重视(nanotoday2016，11：41-60)。其中有一类模拟传统表面活性剂结构设计的，具有典型的亲水性头部和疏水性尾部的两亲性短肽，是国内外许多课题组关注的重点(accchemres2017，50：2440-2448)。由于这是一类人工合成的，主要由天然氨基酸组成的材料，因此在品质和纯度的可控性、生物相容性和可降解性等方面具有天然的优势。两亲性短肽能够在疏水作用的驱动下自组装形成管腔或囊泡、杆状或球状胶束、单分子或双分子层膜等多种纳米结构，是一种理想的药物载体材料。此外，一些两亲性短肽能够通过其疏水性尾部与膜蛋白疏水区的结合对膜蛋白形成包裹，从而提高膜蛋白在水溶液中的稳定性，也被用于膜蛋白的研究(plosone2011，6：e25067)，这也从另一个侧面证实了两亲性短肽包裹疏水性分子的潜力。然而，目前报道的两亲性短肽载药量较低，制剂稳定性较差，载药能力显著不如大多数的天然脂质分子，这些问题是目前两亲性短肽类载体尚未普及的原因。有文献报道了一种“双子型两亲性短肽”，区别于只含有一个疏水性尾部和一个亲水性头部的传统两亲性短肽，它含有两个疏水性尾部和两个亲水性头部的两亲性短肽；该短肽依赖特定条件下两个半胱氨酸(cys)之间形成二硫键来实现双子型结构，相比传统两亲性短肽载药量有所提高，但其依赖cys形成二硫键，在设计上有一定局限性，且稳定性较差(colloidsurfacea2015，469：263-270)。技术实现要素：本发明目的是提供一种新的载药效果可与脂质载体相比拟，且不依赖二硫键的双子型两亲性短肽，其技术方案如下：一种双子型两亲性短肽，它具有如下通式：(y)n-pro-x-x-pro-(y)n，其中x为亲水性氨基酸，y为疏水性氨基酸，n表示疏水性氨基酸的个数，取值范围4-8。亲水性氨基酸和疏水性氨基酸按照亲水指数(jmolbiol1982，157：105-132)高低来定义，亲水指数≥-0.4的为疏水性氨基酸，亲水指数≤-0.7的为亲水性氨基酸，氨基酸亲水指数如下表所示：氨基酸缩写亲水指数氨基酸缩写亲水指数r-4.5s-0.8k-3.9t-0.7n-3.5g-0.4d-3.5a1.8q-3.5m1.9e-3.5c2.5h-3.2f2.8p-1.6l3.8y-1.3v4.2w-0.9i4.5如前述的短肽，所述短肽的n端和/或c端带有化学修饰；n端化学修饰择一地选自：烷酰基化(如：乙酰化，甲酰化等)，生物素标记，脂肪酸修饰(如：palm，myr，lauryl等修饰)，苯甲酰化，2-氨基苯甲酰化，马来酰亚胺，卤代烷酰基化(如：三氟乙酰化，氯乙酰化、溴乙酰化等)，琥珀酰化，联肼尼克酰胺，荧光基团标记(如：fam，fitc，tamra等荧光基团标记)。c端化学修饰择一地选自：酰胺化，酯化，醛基化，醇基化，琥珀酰化，荧光基团标记(如：amc，cmk，fmk等荧光标记)。如前述的短肽，(y)n为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸中的任意一种或几种按任意顺序的组合。如前述的短肽，y为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸中的任意一种或几种按任意顺序的组合。如前述的短肽，y为丙氨酸。如前述的短肽，n为5～6。如前述的短肽，x-x为丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的任意一种或两种按任意顺序的组合。如前述的短肽，x选自谷氨酸或赖氨酸。如前述的短肽，x为赖氨酸。如前述的短肽，所述短肽的氨基酸序列如seqidno.1、3、4、5或6所示；优选地，如seqidno.1所示。如前述的短肽，所述n端化学修饰为乙酰化；和/或，c端化学修饰为酰胺化(酰胺基中的c原子可以是短肽c段自带的c原子)。前述的短肽在制备疏水药物的载体中的用途。如前述的用途，所述载体是由所述短肽经自组装形成的胶束；优选地，所述胶束为球状胶束。如前述的用途，所述疏水药物包括但不限于紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、甲基泼尼松、米诺环素、顺铂、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素b、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素a、维生素d、维生素e、维生素k、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素等中的任意一种或几种的混合物；优选地，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、依托咪酯或丙泊酚。一种疏水药物载体，所述载体是前述短肽自组装形成的胶束；优选地，所述胶束为球状胶束。一种纳米载体制剂，所述制剂以疏水药物为活性成分，以前述短肽自组装形成的胶束为载体。如前述的纳米载体制剂，短肽与活性成分的含量比为5μmol：1～100mg。如前述的纳米载体制剂，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、甲基泼尼松、米诺环素、顺铂、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素b、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素a、维生素d、维生素e、维生素k、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素等中的任意一种或几种的混合物；优选地，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、依托咪酯或丙泊酚。本发明的双子型两亲性短肽，是在传统的单个疏水性尾部两亲性短肽的基础上，通过两个pro形成转角结构，得到在任何条件下都具有2个疏水性尾部的双子型两亲性短肽，是一种全新的设计。本发明的双子型两亲性短肽，载药能力相比目前的短肽载体有明显提升；将本发明的短肽用作疏水性药物的载体制备成制剂，能够使药效达到接近现有脂质载体药物制剂的水平。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为双子型两亲性短肽apk、ape、apke、gavpk和avlfpk，以及单个疏水尾的两亲性短肽a6k的结构示意图。图2为双子型两亲性短肽自组装及其装载疏水药物的机制示意图。图3为apk自组装纳米膜结构及其装载模式疏水药物分子芘形成均匀纳米球的电镜图，以及用传统的单个疏水尾的两亲性短肽a6k装载芘形成不规则纳米球的对比电镜图。图4为apk装载的紫杉醇(apk-ptx)抑制卵巢癌细胞skov3的增殖效果图。图5为apk装载的阿霉素(apk-dox)抑制卵巢癌细胞skov3的增殖效果图。图6为apk对卵巢癌细胞skov3的作用效果图。图7为apk装载紫杉醇的电镜图。图8为apk装载阿霉素的电镜图。图9为apk装载依托咪酯的电镜图。图10为apk装载丙泊酚的电镜图。图11为双子型两亲性短肽apk、ape、apke、gavpk和avlfpk的圆二色光谱，显示它们具有相似的无规则二级结构。图12为双子型两亲性短肽apk、ape、apke、gavpk和avlfpk与tht结合的荧光光谱，显示它们具有相似的自组装行为。图13为双子型两亲性短肽ape、apke、gavpk和avlfpk装载模式疏水药物芘形成纳米球的电镜图。具体实施方式实施例1：短肽对模式疏水药物芘的装载本发明材料：(ala)6-pro-lys-lys-pro-(ala)6，即ac-ala-ala-ala-ala-ala-ala-pro-lys-lys-pro-ala-ala-ala-ala-ala-ala-nh2，缩写为apk，ac表示乙酰基；apk在氨基酸序列表中为seqidno.1；(ala)6-lys，即ac-ala-ala-ala-ala-ala-ala-lys-cooh，缩写为a6k，在氨基酸序列表中为seqidno.2，结构如图1所示，委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成。芘和dmso购置于sigma-aldrich公司。短肽母液配置：将apk按照0.5mm溶解于水中，超声5min。芘母液配置：将芘粉末按照10mm溶解于dmso中。将短肽母液10ml置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将100μl芘母液用移液器逐滴加入短肽母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。10μl的样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干。再加入10μl2％的磷钨酸染色3min。最终染色溶液用滤纸吸干并晾干。再采用透射电镜成像。从图3可以看出apk可独立自组装形成纳米膜结构，而apk装载芘后可形成粒径小于50nm，大小均匀、形状规则的纳米球。相比之下，单个疏水尾的a6k装载芘只能形成粒径超过200nm，形状、大小都不规则的纳米粒。实施例1的结果表明：apk能够对疏水性药物进行有效装载。实施例2：短肽对紫杉醇的装载材料：apk委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；紫杉醇购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：将apk按照0.5mm溶解于水中，超声5min。紫杉醇母液配置：将紫杉醇粉末按照10mg/ml溶解于无水乙醇中。将短肽母液10ml置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将100μl紫杉醇母液用移液器逐滴加入短肽母液中(apk与紫杉醇用量比为5μmol：1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。实施例3：短肽对紫杉醇的装载apk委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；紫杉醇购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：将apk按照1mm溶解于水中，超声5min。紫杉醇母液配置：将紫杉醇粉末按照20mg/ml溶解于无水乙醇中。将紫杉醇母液1ml置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将100ml短肽母液用移液器逐滴加入紫杉醇母液中(apk与紫杉醇用量比为5μmol：1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。实施例4：短肽对紫杉醇的装载apk委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；紫杉醇购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：将apk按照1mm溶解于水中，超声5min。紫杉醇母液配置：将紫杉醇粉末按照20mg/ml溶解于无水乙醇中。将apk按照0.5mm和紫杉醇粉末10mg/ml共溶于2mldmso中(apk与紫杉醇用量比为5μmol：100mg)，超声5min；采用真空干燥器将有机溶剂去除，用10ml水复溶，再超声10min，置于4℃保存实施例5：紫杉醇-短肽制剂对卵巢癌细胞的抑制作用将人卵巢癌细胞skov3以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时。移除上清，加入不同浓度的紫杉醇-短肽制剂(按实施例2的方法制备)，以及相应浓度的泰素(市售紫杉醇药物制剂)作为对照，孵育48h后，用cck-8试剂法测定细胞活率。反映细胞活率的od值采用微板荧光测定仪在490nm波长进行测定。通过实验组和对照组的比较可以看出紫杉醇-短肽制剂(apk-ptx)对肿瘤细胞有显著的抑制作用，与对照组药物泰素相当(图4)。实施例6：短肽对阿霉素的装载试剂：盐酸阿霉素购置于大连美仑生物技术有限公司，三乙胺购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：将apk按照0.5mm溶解于水中，超声5min。盐酸阿霉素脱盐：将盐酸阿霉素粉末10mg溶于10ml甲醇中，加入10μl三乙胺，磁力搅拌过夜，在真空装置下蒸干有机溶剂，获得阿霉素粉末。阿霉素母液配置：将阿霉素粉末按照10mg/ml溶解于无水乙醇中。将短肽母液10ml置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将100μl阿霉素母液用移液器逐滴加入短肽母液中(apk与阿霉素用量比为5μmol：1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。实施例7：短肽对阿霉素的装载试剂：盐酸阿霉素购置于大连美仑生物技术有限公司，三乙胺购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：将apk按照0.5mm溶解于水中，超声5min。盐酸阿霉素脱盐：将盐酸阿霉素粉末10mg溶于10ml甲醇中，加入10μl三乙胺，磁力搅拌过夜，在真空装置下蒸干有机溶剂，获得阿霉素粉末。阿霉素母液配置：将阿霉素粉末按照10mg/ml溶解于无水乙醇中。将阿霉素母液1ml置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将100ml短肽母液用移液器逐滴加入阿霉素母液中(apk与阿霉素用量比为5μmol：1mg)，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。实施例8：短肽对阿霉素的装载试剂：盐酸阿霉素购置于大连美仑生物技术有限公司，三乙胺购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：将apk按照0.5mm溶解于水中，超声5min。盐酸阿霉素脱盐：将盐酸阿霉素粉末10mg溶于10ml甲醇中，加入10μl三乙胺，磁力搅拌过夜，在真空装置下蒸干有机溶剂，获得阿霉素粉末。阿霉素母液配置：将阿霉素粉末按照10mg/ml溶解于无水乙醇中。将apk按照0.5mm和阿霉素粉末10mg/ml(即apk与阿霉素用量比为5μmol：100mg)共溶于2mldmso中，超声5min；采用真空干燥器将有机溶剂去除，用10ml水复溶，再超声10min，置于4℃保存。实施例9：阿霉素-短肽制剂对卵巢癌细胞的抑制作用将人卵巢癌细胞skov3以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时。移除上清，加入不同浓度的阿霉素-短肽制剂(使用实施例6的方法制备)，以及相应浓度的盐酸阿霉素作为对照，孵育48h后，采用cck-8试剂法测定细胞活率。反映细胞活率的od值采用微板荧光测定仪在490nm波长进行测定。通过实验组和对照组的比较可以看出阿霉素-短肽制剂(apk-dox)对肿瘤细胞有显著的抑制作用，与对照组药物盐酸阿霉素相当(图5)。实施例10：短肽对依托咪酯的装载材料：(ala)6-pro-lys-lys-pro-(ala)6，缩写为apk，委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；依托咪酯购置于大连美仑生物技术有限公司；无水乙醇购置于成都市科龙化工试剂厂。短肽母液配置：apk按照0.5mm溶解于0.9％生理盐水中，涡旋后超声10min。称取20mg依托咪酯，加入10ml短肽母液(apk与依托咪酯用量之比为5μmol：20mg)中，涡旋后超声20min，再置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，搅拌40min，室温保存。实施例11：大鼠尾静脉单次注射依托咪酯-短肽制剂的麻醉效果使用健康成年雄性sd大鼠(体重：295±14g)。将大鼠放置于固定器，露出尾巴，找到侧边的尾静脉，酒精擦拭后留置针置管给药(依托咪酯-短肽制剂使用实施例10的方法制备)。按照0.1ml/s给药速度匀速给予0.6ml药物，给药完毕后，推0.05ml空气以保证药物完全进入尾静脉后拔出留置针，棉签按压止血。快速取出大鼠并将其放置于空笼位中，观察大鼠反应进行镇静评分并记录不良反应(cfda“药物单词给药毒性指导原则”(征求意见稿2013-05-26))。镇静评分(psychopharmacology1996，125：105-112)：四肢肌张力正常，能保持自主活动且反应灵敏0分；明显的趋触性运动(大鼠趋向于停留在靠近笼子边缘的位置)1分；后退平衡失调2分；前肢直立不到60度，共济失调3分；俯卧，不能站立，只能靠腹部支撑4分；翻正反射消失5分。翻正反射消失的观察(anesthesiology2000,93(3)：837-843)：翻正反射消失且持续超过30秒记为“ ”，否则记为“-”。从1mg/kg剂量开始进行爬坡实验，分别找出一个“ ”和“-”的剂量，作为ed50(半数有效量，能引起50％最大反应强度的药量)实验的给药参考范围。序贯法测定ed50，从低剂量开始给药，观察大鼠镇静效果，若为“-”，则下一只给药剂量减小(r＝1.5，等比)，若为“ ”则下一只给药剂量等比加大；从“-”到“ ”或“ ”到“-”为一个交叉，出现5次同向交叉实验终止。采用dixon-mood法(ed50＝lg-1(∑c/∑t))计算出药物在大鼠体内的ed50。并算出95％可信区间95％ci＝lg-1(1ged50±1.96slged50)，slged50＝{[∑m-(∑c)2/∑t]/(∑t·(∑t-1)}1/2。根据测得的ed50，按照上述给药方法对大鼠进行单次尾静脉注射2ed50药物，观察大鼠的镇静效果。通过与临床使用的依托咪酯脂肪乳制剂(福尔利)对比，可以看出依托咪酯-短肽制剂与依托咪酯市售制剂(福尔利)的麻醉效果相当，且无明显不良反应发生(表1)。表1依托咪酯-短肽制剂与福尔利麻醉效果对比实施例12：短肽对丙泊酚的装载材料：(ala)6-pro-lys-lys-pro-(ala)6，缩写为apk，委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；丙泊酚购置于sigma-aldrich公司。短肽母液配置：apk按照1mm溶解于0.9％生理盐水中，涡旋后超声10min。将丙泊酚取0.1ml，滴加至9.9ml短肽母液中，涡旋后超声20min，再置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，搅拌40min，室温保存。实施例13：大鼠尾静脉单次注射丙泊酚-短肽制剂的麻醉效果使用健康成年雄性sd大鼠(体重：295±14g)。将大鼠放置于固定器，露出尾巴，找到侧边的尾静脉，酒精擦拭后留置针置管给药(丙泊酚-短肽制剂使用实施例11的方法制备)。按照0.1ml/s给药速度匀速给予0.6ml药物，给药完毕后，推0.05ml空气以保证药物完全进入尾静脉后拔出留置针，棉签按压止血。快速取出大鼠并将其放置于空笼位中，观察大鼠反应进行镇静评分并记录不良反应(cfda“药物单词给药毒性指导原则”(征求意见稿2013-05-26))。镇静评分(psychopharmacology1996，125：105-112)：四肢肌张力正常，能保持自主活动且反应灵敏0分；明显的趋触性运动(大鼠趋向于停留在靠近笼子边缘的位置)1分；后退平衡失调2分；前肢直立不到60度，共济失调3分；俯卧，不能站立，只能靠腹部支撑4分；翻正反射消失5分。翻正反射消失的观察(anesthesiology2000,93(3)：837-843)：翻正反射消失且持续超过30秒记为“ ”，否则记为“-”。从1mg/kg剂量开始进行爬坡实验，分别找出一个“ ”和“-”的剂量，作为ed50实验的给药参考范围。序贯法测定ed50，从低剂量开始给药，观察大鼠镇静效果，若为“-”，则下一只给药剂量减小(r＝1.5，等比)，若为“ ”则下一只给药剂量等比加大；从“-”到“ ”或“ ”到“-”为一个交叉，出现5次同向交叉实验终止。采用dixon-mood法(ed50＝lg-1(∑c/∑t))计算出药物在大鼠体内的ed50。并算出95％可信区间95％ci＝lg-1(lged50±1.96slged50)，slged50＝{[∑m-(∑c)2/∑t]/(∑t·(∑t-1)}1/2。通过与临床使用的丙泊酚脂肪乳制剂(得普利麻)对比ed50，可以看出丙泊酚-短肽制剂与临床丙泊酚市售制剂(得普利麻)的麻醉效果相当(表2)。表2丙泊酚-短肽制剂与丙泊酚(得普利麻)的ed50对比实施例5、9、11、13的结果表明，本发明的短肽apk可以装载各种疏水性药物，使药物发挥与等剂量市售(脂肪乳)制剂相当的药效。实施例14：apk短肽对卵巢癌细胞的作用将人卵巢癌细胞skov3以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中，孵育24小时。移除上清，加入不同浓度的短肽，孵育48h后，采用cck-8试剂法测定细胞活率。反映细胞活率的od值采用微板荧光测定仪在490nm波长进行测定。通过结果可以看出apk短肽对肿瘤细胞没有显著的抑制，证明其没有明显的细胞毒性(图6)。实施例15：纳米结构表征通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。10μl的样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干。再加入10μl2％的磷钨酸染色3min。最终染色溶液用滤纸吸干并晾干。再采用透射电镜成像。从图7～图10可以看出短肽包载药物成为纳米级球状胶束。在传统的单个疏水性尾部两亲性短肽的研究中，已有大量文献表明，用不同的疏水性氨基酸作为疏水性尾部，和/或用不同的亲水性氨基酸作为亲水性头部，得到的两亲性短肽都能够形成相似的纳米载体(procnatlacadsciusa2002，99：5355-5360；langmuir2003，19：4332.)；疏水性尾部的长度，即疏水性氨基酸的数目，也可以在4-8中任意取值，不会从本质上改变短肽自组装形成纳米载体的能力(nanolett2002，2：687；jpeptsci2018，24：e3062.)。可以合理推测，将具有2个疏水性尾部的apk的亲水性头部氨基酸glu替换成其它亲水性氨基酸，和/或，将apk的疏水性尾部氨基酸ala替换成其它疏水性氨基酸，和/或，改变疏水性尾部的长度(单侧尾部在4-8个氨基酸中任意取值)，不会从本质上改变本发明短肽自组装形成纳米载体的能力。以下将对此举例说明：实施例16：不同短肽双子型二级结构的表征apk、ape、apke、gavpk和avlfpk，前述短肽均委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成。ape、apke、gavpk、avlfpk序列如表3所示。表3ape、apke、gavpk、avlfpk序列注：ac表示乙酰基。用圆二色光谱仪测定各短肽的圆二色光谱，从而判断它们具有相似的二级结构。将各短肽溶于水配成0.1mm的溶液，取800μl放置于光程长度为2mm的石英比色杯中，在25℃条件下测定其在185～260nm范围内的圆二色光谱。如图11所示，所有短肽均在195nm附近出现一个负峰，表明所有设计的短肽都具有与apk相似的无规则自由伸展的二级结构，因此判断它们和apk一样，能够借助pro形成的转角，呈典型的双子型结构。实施例17：不同短肽自组装能力的表征apk、ape、apke、gavpk和avlfpk短肽委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成。将各短肽配成0.5mm的水溶液，在每500μl短肽溶液中加入终浓度为10μm的硫磺素t(thioflavint，tht，购自sigma-aldrich公司)，用荧光分光光度计测定其460～600nm范围内的荧光光谱(激发波长设定为450nm)，从而判断其是否存在与apk相似的自组装行为。如图12所示，所有短肽均在490nm附近出现典型的tht荧光峰，表明所有设计的短肽都与apk一样具有相似的自组装行为。实施例18：不同短肽装载模式疏水药物芘形成纳米球的表征apk、ape、apke、gavpk和avlfpk短肽委托上海波泰生物科技有限公司进行化学合成；芘购自sigma-aldrich公司。短肽母液配置：将各短肽按照0.5mm溶解于水中，超声5min。芘母液配置：将芘粉末按照10mm溶解于dmso中。将短肽母液10ml置于室温磁力搅拌2000rpm/min条件下，将100μl芘母液用移液器逐滴加入短肽母液中，加完后继续磁力搅拌30min，再超声10min，置于4℃保存。通过高分辨率透射电子显微镜观察形态特征。10μl的样品溶液加在400目的铜网上5min，然后用一片滤纸吸干。再加入10μl2％的磷钨酸染色3min。最终染色溶液用滤纸吸干并晾干。再采用透射电镜成像。从图13可以看出各短肽均能包载芘形成大小均匀的纳米球结构。实施例16～18的结果表明，具有本发明通式(y)n-pro-x-x-pro-(y)n(其中y为疏水性氨基酸，x为亲水性氨基酸，n的数量为4～8)所述结构的各种短肽能够借助pro形成的转角，呈典型的双子型结构，且具有相似的自组装行为，可包裹疏水性药物形成纳米球结构。因此可以合理推断：具有本发明通式具有通式(y)n-pro-x-x-pro-(y)n所述结构的短肽包裹疏水性药物形成的复合物，均能产生与apk包裹疏水性药物所形成复合物类似的药效。综上，本发明的短肽可以有效包裹疏水性药物，形成纳米球，能够起到和市售脂肪乳制剂相当的药效。sequencelisting<110>四川大学华西医院<120>一种双子型两亲性短肽及其作为疏水性药物载体的应用<130>gykh1533-2019p018601cc<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>16<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<400>1alaalaalaalaalaalaprolyslysproalaalaalaalaalaala151015<210>2<211>7<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<400>2alaalaalaalaalaalalys15<210>3<211>16<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<400>3alaalaalaalaalaalaproglugluproalaalaalaalaalaala151015<210>4<211>16<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<400>4alaalaalaalaalaalaprolysgluproalaalaalaalaalaala151015<210>5<211>16<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<400>5glyvalvalalaalaalaprolyslysprovalglyglyalavalval151015<210>6<211>14<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<400>6leuvalphephealaprolyslysproalaphephevalleu1510当前第1页1 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技术特征：1.一种双子型两亲性短肽，其特征在于，它具有如下通式：(y)n-pro-x-x-pro-(y)n，其中x为亲水性氨基酸，y为疏水性氨基酸，n表示疏水性氨基酸的个数，取值范围4-8。
2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：所述短肽的n端和/或c端带有化学修饰；
n端化学修饰择一地选自：烷酰基化，生物素标记，脂肪酸修饰，苯甲酰化，2-氨基苯甲酰化，马来酰亚胺，卤代烷酰基化，琥珀酰化，联肼尼克酰胺，荧光基团标记(如fam、fitc、tamra等荧光基团标记)；
c端化学修饰择一地选自：酰胺化，酯化，醛基化，醇基化，琥珀酰化，荧光基团标记(如amc，cmk，fmk等荧光标记)。
3.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：(y)n为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸中的任意一种或几种按任意顺序的组合。
4.根据权利要求3所述的短肽，其特征在于：(y)n为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸中的任意一种或几种按任意顺序的组合；优选地，y为丙氨酸。
5.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：n为5～6。
6.根据权利要求1-5所述的短肽，其特征在于：x-x为丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的任意一种或两种按任意顺序的组合。
7.根据权利要求6所述的短肽，其特征在于：x选自谷氨酸或赖氨酸；优选地，x为赖氨酸。
8.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于：所述短肽的氨基酸序列如seqidno.1、3、4、5或6所示；优选地，如seqidno.1所示。
9.根据权利要求2-8任一所述的短肽，其特征在于：所述n端化学修饰为乙酰化；
和/或，c端化学修饰为酰胺化。
10.权利要求1-9任一所述的短肽在制备疏水药物的载体中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述载体是由所述短肽经自组装形成的胶束；优选地，所述胶束为球状胶束。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其特征在于：所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、甲基泼尼松、米诺环素、顺铂、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素b、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素a、维生素d、维生素e、维生素k、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素等中的任意一种或几种的混合物；
优选地，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、依托咪酯或丙泊酚。
13.一种疏水药物载体，其特征在于：所述载体是权利要求1-9任一所述短肽自组装形成的胶束；优选地，所述胶束为球状胶束。
14.一种纳米载体制剂，其特征在于：所述制剂以疏水药物为活性成分，以权利要求1-9任一所述短肽自组装形成的胶束为载体。
15.根据权利要求14所述的纳米载体制剂，其特征在于：短肽与活性成分的含量比为5μmol：1～100mg。
16.根据权利要求14或15所述的纳米载体制剂，其特征在于：所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、姜黄素、多西他赛、多柔比星、长春新碱、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、维甲酸、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、替尼泊苷、柔红霉素、阿克拉霉素、索拉非尼、甲基泼尼松、米诺环素、顺铂、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、胺碘酮、卡马西平、卡维地洛、氯丙嗪、西沙必利、氯苯砜、阿奇霉素、新霉素、两性霉素b、灰黄霉素、塞来昔布、雷洛昔芬、氯比洛芬、吲哚美辛、布洛芬、他莫昔芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、拉替拉韦、依非韦伦、奈非那韦、阿扎那韦、利托那韦、西罗莫司、安体舒通、他克莫司、他林洛尔、特非那定、雌二醇、维生素a、维生素d、维生素e、维生素k、丙泊酚、依托咪酯、全氟碳、地西泮、前列地尔、复合脂溶性维生素、地塞米松、氟比洛芬酯、氯维地平、鸦胆子油、环孢素、胰岛素等中的任意一种或几种的混合物；
优选地，所述疏水药物为紫杉醇、阿霉素、依托咪酯或丙泊酚。
技术总结本发明涉及一种短肽及其作为疏水药物的载体的应用。所涉及的短肽氨基酸序列为(Y)n‑Pro‑X‑X‑Pro‑(Y)n。本发明的短肽，能够通过分子自组装的机制装载多种疏水药物，与疏水药物形成粒径均匀的纳米球状胶束，从而能够有效地转运药物进入细胞或组织发挥其药效，安全无明显细胞毒性，制剂工艺简单，是一种极具开发前景的疏水药物的载体。
技术研发人员：邱峰;彭飞;张文胜
受保护的技术使用者：四川大学华西医院
技术研发日：2020.02.19
技术公布日：2020.06.05
