本发明属于生产过程中蛋白纯化
技术领域：
，涉及猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺。
背景技术：
：亚单位疫苗(subumitvaccine)是将编码病原微生物的保护性抗原基因导入受体如细菌、酵母或动物细胞，使其高效表达。保护性抗原分离纯化后，与佐剂联合制成的一种能诱发机体产生抗体和免疫保护、安全性高、稳定性好、无需灭活、不含有核酸的一类疫苗。尽管很多不同种类的蛋白通过基因工程技术在体外成功表达，然而在亚单位疫苗生产下游工作中的蛋白纯化技术还不够成熟，据有人统计，亚单位疫苗分离纯化成本约占到其全部成本的60％-80％。目前，食品安全要求越来越高，国家政策法规越来越严格，产业面临整合重组，市场品质竞争力需要提高，精准免疫的要求，上游发展迅猛，这些因素说明兽用疫苗纯化越来越重要。亚单位疫苗生产下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术将成为目前亚单位疫苗开发的瓶颈，也是未来最具有潜力的突破方向，更是亚单位疫苗广泛商业化必须攻克的难题。内毒素是由革兰氏阴性细菌在自溶裂解和生长繁殖过程中释放,能引起人或动物发热、弥漫性血管内凝血、内毒素血症以及休克等毒性效应甚至死亡。因此内毒素的去除对于优化生产环节并提高生物制品的安全性非常重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：(1)取猪圆环病毒cap蛋白发酵液，高速离心获得菌体，将菌体重悬后用高压均质仪破碎菌体，获得猪圆环病毒cap蛋白破碎液；(2)将猪圆环病毒cap蛋白破碎液利用中空纤维柱澄清过滤，得到猪圆环病毒cap蛋白上样液；(3)将猪圆环病毒cap蛋白上样液利用阳离子交换柱进行纯化，随后洗脱，得到高纯度猪圆环病毒cap蛋白洗脱液；(4)将高纯度猪圆环病毒cap蛋白洗脱液除菌过滤后，即得高纯度且内毒素达到使用浓度的猪圆环病毒cap蛋白液；(5)将高纯度且内毒素达到使用浓度的猪圆环病毒cap蛋白液测定浓度、效价及内毒素含量，计算回收率及纯度。进一步，重悬中重悬液的加入量为与猪圆环病毒cap蛋白培养液离心所得菌体质量比例为10ml:1g。进一步，中空纤维柱孔径为0.65μm；中空纤维柱型号为apsea0045hsf20sp；所述过滤用过滤器型号为液体5芯2英寸316l。进一步，步骤(2)待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作过程为：先透过70％-80％待澄清蛋白液，然后补加体积与剩余待澄清蛋白液体积相同的生理盐水，继续透过，待透过的体积等于加入的生理盐水体积后，再补加体积与剩余蛋白液体积相同的生理盐水，如此洗滤多次后，直至不能透过，澄清过滤过程结束。进一步，步骤(3)离子交换柱的填料为spbestaroseff；离子交换柱的型号为ec0200-gi0500h、ec0300-gi0500h；生产及层析系统为ap100s(d)。进一步，步骤(3)猪圆环病毒cap蛋白澄清液利用离子交换柱进行蛋白纯化的过程为：用无菌的0.1mol/lnaoh溶液对离子交换柱冲洗3个柱体积，再用无菌水冲洗直至ph为8.0，随后用0.2mpb溶液平衡离子交换柱至柱前柱后电导率一致(柱前和柱后的电导率都在6.5-6.6ms/cm)，ph稳定在8.0，紫外检测uv280基线平稳；然后将步骤(2)所得猪圆环病毒cap蛋白上样液上样，上样结束后，用0.2mpb溶液洗去未结合的杂蛋白，待uv280值下降至低于0.100au，再用高盐溶液洗脱猪圆环病毒cap蛋白，紫外检测uv280值增加时开始收集洗脱液，待uv280值下降至低于0.100au时停止收集。进一步，步骤(3)利用离子交换柱进行离子交换时，猪圆环病毒cap蛋白澄清液的上样线性流速为38.20cm/h，压力控制小于3.00bar，上样量控制在70-80mg/mlbsa；洗脱采用的洗脱液为1.0mol/lnacl，洗脱流速为38.20cm/h。本发明的有益效果：(1)本发明解决了猪圆环病毒cap蛋白纯化过程复杂且内毒素难以去除的技术问题。通过阳离子交换实现了一步法纯化猪圆环病毒cap蛋白且去除内毒素的目的。猪圆环病毒cap蛋白回收率达到88.10％，杂蛋白去除率达到97.5％，内毒素含量控制在10000eu/ml以下。(2)在本发明中用到了中空纤维澄清过滤、阳离子交换层析技术，采用特定0.65μm孔径的中空纤维澄清过滤预处理，通过sp6ff离子交换柱一步纯化，获得高纯度且低内毒素的猪圆环病毒cap蛋白。(3)本发明操作简单，将原先需要14天得到蛋白量缩短至2天，大大简化了蛋白纯化时间。提到了猪圆环病毒cap蛋白纯化效率，节约了人力及成本，并将内毒素含量降低到疫苗使用标准以下。本发明推广前景良好。(4)本发明所述猪圆环病毒cap蛋白纯化工艺，纯度高，去除内毒素效率高，大大提高了杂蛋白及内毒素对于接种猪的副反应，提高了亚单位疫苗的安全性。附图说明图1猪圆环病毒cap蛋白纯化峰；图2猪圆环病毒cap蛋白纯化结果sds-page检测；图3纯化猪圆环病毒cap蛋白效价检测。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例中，所用仪器如下：中空纤维柱澄清过滤过程中中空纤维柱型号为：apsea0045hsf20sp。中空纤维柱澄清过滤中空纤维柱设备型号为液体5芯2)英寸316l。中空纤维柱及设备购自杭州科百特过滤器材有限公司。离子交换柱填料为：spbestaroseff。填料购自博格隆上海生物技术有限公司。离子交换柱型号为：ec0200-gi0500h、ec0300-gi0500h。层析系统型号为：ap100s(d)。离子交换柱及层析系统购自湖南科众源创科技有限公司。实施例1猪圆环病毒cap蛋白纯化工艺1上样液制备1.1取猪圆环病毒cap蛋白发酵液，10000rpm高速离心30min，获得菌体，备用。1.2取1kg菌体，按1:10(w/v)加生理盐水重悬，高压均质仪破碎菌体，获得猪圆环病毒cap蛋白破碎液。1.3将0.65μm中空纤维柱分别安装到中空纤维柱控制设备中，接通相应的管道，组装完毕后用无菌注射用水循环浸润中空纤维柱10min。破碎液液利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作过程为：先透过70％-80％待澄清蛋白液，然后补加体积与剩余待澄清蛋白液体积相同的生理盐水，继续透过，待透过的体积等于加入的生理盐水体积后，再补加体积与剩余蛋白液体积相同的生理盐水，如此洗滤多次后，直至不能透过，澄清过滤过程结束。获得上样液。2阳离子交换柱纯化工艺2.1系统预处理2.1.1缓冲液：0.5mol/lnaoh；平衡缓冲液(buffera)：0.2mpbbuffer；洗脱缓冲液(bufferc)：0.2mpbbuffer 1mnacl。2.1.2将阳离子交换填料spbestaroseff捣匀装入ec0200-gi0500h柱中，离子交换柱组装完毕后测柱效。2.1.3用无菌0.5mol/lnaoh处理分子筛凝胶层析柱2个柱体积(cv)，再用无菌注射水清洗至ph7.5，然后用buffera平衡离子交换柱至电导率柱前后一致(柱前和柱后电导率在6.5-6.6ms/cm)，ph稳定在8.0，紫外uv280基线平稳。2.2纯化过程将上样液上样，设定上样线性流速为0.2ml/min，压力控制小于3.00bar，上样量控制在70-80mg/mlbsa(填料的最大挂载量为95mg/mlbsa)。待一个柱体积上样液6.28l经离子交换柱上样完成后，用buffera洗未结合的杂蛋白。待uv280值下降至低于0.100au，用高盐溶液bufferc洗脱猪圆环病毒cap蛋白。待紫外uv280值增加时开始收集洗脱后样品，待uv280值下降至低于0.100au时停止收集蛋白，继续洗脱至抗原液全部流出柱体。收集的洗脱样品即为猪圆环病毒cap蛋白纯化洗脱液1个柱体积左右。表1为cap蛋白纯化回收率及纯度计算。表2为纯化cap蛋白效价检测。表3为内毒素含量检测。表1表2样品效价上样液≧1:64穿透液≧1:32洗杂液≧1:2纯化cap蛋白≧1:32表3图1为猪圆环病毒cap蛋白纯化峰。图2为猪圆环病毒cap蛋白纯化结果sds-page检测。m：蛋白marker。上：上样液。穿：穿透液。杂：洗杂液。1-2：洗脱液。图3为纯化猪圆环病毒cap蛋白效价检测。1：上样液；2：洗杂液；3：穿透液；4：纯化cap蛋白。结果显示，经过一步纯化后得到的猪圆环病毒cap蛋白，回收率达到88.1％，蛋白纯度达到97.5％，效价在1:32以上，内毒素含量在2.5万eu/ml以下，达到生产使用标准，该纯化工艺稳定，适合在生产中推广使用。以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)取猪圆环病毒cap蛋白发酵液，高速离心获得菌体，将菌体重悬后用高压均质仪破碎菌体，获得猪圆环病毒cap蛋白破碎液；
(2)将猪圆环病毒cap蛋白破碎液利用中空纤维柱澄清过滤，得到猪圆环病毒cap蛋白上样液；
(3)将猪圆环病毒cap蛋白上样液利用阳离子交换柱进行纯化，随后洗脱，得到高纯度猪圆环病毒cap蛋白洗脱液；
(4)将高纯度猪圆环病毒cap蛋白洗脱液除菌过滤后，即得高纯度且内毒素达到使用浓度的猪圆环病毒cap蛋白液；
(5)将高纯度且内毒素达到使用浓度的猪圆环病毒cap蛋白液测定浓度、效价及内毒素含量，计算回收率及纯度。
2.按照权利要求1所述猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于：所述重悬中重悬液的加入量为与猪圆环病毒cap蛋白培养液离心所得菌体质量比例为10ml:1g。
3.按照权利要求1所述猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于：所述中空纤维柱孔径为0.65μm；中空纤维柱型号为apsea0045hsf20sp；所述过滤用过滤器型号为液体5芯2英寸316l。
4.按照权利要求1所述猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于：所述步骤(2)待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作过程为：先透过70％-80％待澄清蛋白液，然后补加体积与剩余待澄清蛋白液体积相同的生理盐水，继续透过，待透过的体积等于加入的生理盐水体积后，再补加体积与剩余蛋白液体积相同的生理盐水，如此洗滤多次后，直至不能透过，澄清过滤过程结束。
5.按照权利要求1所述猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于：所述步骤(3)离子交换柱的填料为spbestaroseff；离子交换柱的型号为ec0200-gi0500h、ec0300-gi0500h；生产及层析系统为ap100s(d)。
6.按照权利要求1所述猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于：所述步骤(3)猪圆环病毒cap蛋白澄清液利用离子交换柱进行蛋白纯化的过程为：用无菌的0.1mol/lnaoh溶液对离子交换柱冲洗3个柱体积，再用无菌水冲洗直至ph为8.0，随后用0.2mpb溶液平衡离子交换柱至柱前柱后电导率一致(柱前和柱后的电导率都在6.5～6.6ms/cm)，ph稳定在8.0，紫外检测uv280基线平稳；然后将步骤(2)所得猪圆环病毒cap蛋白上样液上样，上样结束后，用0.2mpb溶液洗去未结合的杂蛋白，待uv280值下降至低于0.100au，再用高盐溶液洗脱猪圆环病毒cap蛋白，紫外检测uv280值增加时开始收集洗脱液，待uv280值下降至低于0.100au时停止收集。
7.按照权利要求1所述猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，其特征在于：所述步骤(3)利用离子交换柱进行离子交换时，猪圆环病毒cap蛋白澄清液的上样线性流速为38.20cm/h，压力控制小于3.00bar，上样量控制在70-80mg/mlbsa；洗脱采用的洗脱液为1.0mol/lnacl，洗脱流速为38.20cm/h。
技术总结本发明公开了猪圆环病毒CAP蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺，取猪圆环病毒CAP蛋白发酵液，高速离心获得菌体，将菌体重悬后用高压均质仪破碎菌体，利用中空纤维柱澄清过滤，利用阳离子交换柱进行纯化，随后洗脱，除菌过滤后，即得高纯度且内毒素达到使用浓度的猪圆环病毒CAP蛋白液。猪圆环病毒CAP蛋白回收率达到88.10％，杂蛋白去除率达到97.5％,内毒素含量控制在10000EU/mL以下。
技术研发人员：郭广君;吕素芳;沈志强;韩强;曲光刚;吴信明;程立坤
受保护的技术使用者：郭广君
技术研发日：2020.02.26
技术公布日：2020.06.05
