本发明涉及一种茄子钾离子通道蛋白smakt1及其编码基因和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
钾是植物生长发育所必需的三大营养元素(氮、磷、钾)之一，钾离子广泛分布于植物体内各个组织中，是植物体内含量最丰富的阳离子，参与了植物体内的多种生理过程，对植物正常的生长和发育起着至关重要的作用。
我国作为农业大国，但是由于人类不合理的施肥、灌溉、轮作等栽培管理模式，使得土壤中的矿物质离子平衡被打破，大部分耕地土壤呈现缺钾和盐渍化状态。而盐胁迫条件下，由于植物根系细胞吸收过量的na 而抑制了对k 的吸收，从而导致植物细胞产生k 匮乏现象。植物根系从土壤中吸收k 主要是通过k 转运蛋白和通道蛋白，包括kt/hak/kup家族转运体和shaker家族钾离子通道蛋白。拟南芥中的akt1是第一个通过功能互补酵母k 吸收缺陷型获得的内向k 通道蛋白。之后一系列的研究表明拟南芥atakt1的功能缺失会导致植物k 吸收的减少，从而使其对低钾胁迫的敏感性增强。
茄子作为一种典型的设施蔬菜，在全世界均有种植。但茄子在应对低钾或盐胁迫方面的研究相对滞后，目前与茄子smakt1基因及其编码蛋白的相关文献未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于填补茄子smakt1基因的克隆、表达模式分析以及其应用方面的空白。本发明提供了一种茄子钾离子通道蛋白smakt1及其编码基因和应用，具体为茄子smakt1的cdna以及氨基酸序列；进一步地，本发明提供了茄子smakt1基因在不同组织器官及低钾和盐胁迫条件下的表达模式。本发明还提供了smakt1可提高植物对低钾和盐胁迫环境的耐逆性的证据。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种茄子smakt1蛋白，所述smakt1蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。
第二方面，本发明提供了一种编码smakt1蛋白的基因的核苷酸序列，所述基因的核苷酸序列包括：
(1)如seqidno.1所示第1～2655位所示的碱基序列；或
(2)与seqidno.1所示第1～2655位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列。
第三方面，本发明提供了一种用于扩增前述编码smakt1蛋白的基因的引物对，所述引物对的碱基序列如seqidno.3、seqidno.4所示。
第四方面，本发明提供了一种用于前述编码茄子smakt1蛋白的基因的荧光定量pcr分析的引物对，所述引物对的碱基序列如seqidno.5、seqidno.6所示。
第五方面，本发明提供了一种茄子smakt1蛋白的应用，所述应用包括如下中的至少一种：
(c1)在调控植物的钾离子吸收中的应用；
(c2)在调控植物对低钾环境或盐胁迫环境的耐逆性中的应用。
优选地，所述应用具体为如下中的至少一种：
(c1)在促进植物的钾离子吸收中的应用；
(c2)在增加植物对低钾环境或盐胁迫环境的耐逆性中的应用。
优选地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
第六方面，本发明提供了一种前述smakt1蛋白的基因功能验证的方法，包括将编码smakt1蛋白的基因导入目的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体中，得到相应的互补酵母菌株或者拟南芥株系；所述互补酵母菌株或者拟南芥株系满足如下表现：
(d1)对低钾环境的耐逆性高于相对应的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体；或
(d2)对盐胁迫环境的耐逆性高于相对应的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体。
第七方面，本发明提供了一种smakt1蛋白在育种中的应用，具体包括在培育钾离子吸收能力强的植物和/或在低钾环境和/或盐胁迫环境下具有高耐逆性的植物中的应用。
本发明的茄子smakt1相关核苷酸全长序列通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。
当获得了有关序列后，就可以用同源重组的方法来将其克隆入目的表达载体，再通过热激法转入大肠杆菌细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离获得足够的表达载体质粒用于后续实验，包括peg法转化酵母菌株和热激法转化农杆菌菌株。最后利用农杆菌介导法转化到植物细胞或组织中。
所述目的缺陷型酵母菌株为钾营养缺陷型酵母菌种r5421(gaberetal.,1988，trk1encodesaplasmamembraneproteinrequiredforhigh-affinitypotassiumtransportinsaccharomycescerevisiae.molcellbiol8:2848-2859)，所述拟南芥突变体为拟南芥akt1突变体(xuetal.,2006，aproteinkinase,interactingwithtwocalcineurinb-likeproteins,regulatesk transporterakt1inarabidopsis.cell125:1347-1360)。
本发明所述的育种目的为培育钾离子吸收能力高和/或对低钾环境的耐逆性高的植物和/或对盐胁迫环境的耐逆性高的植物。
以上任一所述低钾环境的条件具体可为钾浓度为100μm，盐胁迫环境的条件为200mmnacl。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明通过试验证实了smakt1在根、茎、叶、花、果实、萼片中均有表达，根系中的表达量显著高于其他组织。低钾和盐胁迫处理下，其在叶片和根系中的表达量均表现出先升高后下降的趋势。将所述的smakt1基因导入目的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体中表达后，可以增强缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体对低钾和盐胁迫环境的耐受能力。本发明在作物分子改良中具有较大应用价值，对于培育耐受低钾和盐胁迫的茄子具有重要的理论意义和实践意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的茄子smakt1蛋白与拟南芥atakt1蛋白的氨基酸序列同源比较(fasta)结果；
图2为本发明的茄子smakt1基因在茄子不同组织的表达情况；图中的相对表达量以0h根系为基准1；
图3为本发明的茄子smakt1基因在低钾和盐胁迫处理条件下的表达变化情况；其中，图3a为低钾处理，图3b为盐胁迫处理；图中的相对表达量以0h叶片为基准1；
图4为本发明的茄子smakt1基因提高钾吸收缺陷型酵母菌株对低钾环境的耐逆性的结果；
图5为本发明的茄子smakt1基因提高钾吸收缺陷型酵母菌株对盐胁迫环境的耐逆性的结果；
图6为smakt1基因在拟南芥转基因植株中表达量的检测结果；
图7为本发明的茄子smakt1基因提高拟南芥akt1突变体对低钾环境的耐逆性的结果；
图8为本发明的茄子smakt1基因提高拟南芥akt1突变体对盐胁迫环境的耐逆性的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、茄子smakt1基因的克隆
1.植物材料的获得
本实验所用的植物材料为茄子。茄子种植于上海市闵行区航天育种基地。
2.rna的提取
本实验中使用的所有去核糖核酸酶(ribonuclease,rnase)的离心管和枪头均购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用的研钵和研棒均进行高温灭菌。总rna的提取使用takaraminibestuniversalrnaextractionkit试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)。rna质量检测采用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000分光光度计检测。
3.rna反转录为cdna
反转录试剂盒使用primescripttmii1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)。
4.目的基因的克隆
利用引物
f1(seqidno.3)：5′-atgggggaaaatagaggacttgg-3′
r1(seqidno.4)：5′-ttacaattctggtgatttatcttcatgg-3′
进行pcr，扩增得到预期长度后回收并连接到pmd-19t(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌dh5α，利用α互补及菌落pcr筛选阳性克隆，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得cdna序列seqidno.1。
实施例2、茄子smakt1基因的序列信息与同源性分析
本发明新的茄子smakt1基因全长cds开放读框序列为2655bp，详细序列见seqidno.1。根据cds开放读码框序列推导出茄子smakt1的氨基酸序列，共884个氨基酸残基，详细序列见seqidno.2所示序列。
将茄子smakt1的cds开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用blast程序在拟南芥基因组数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥atakt1基因(at2g26650.1)在核苷酸水平上具有67.15％一致性；在氨基酸水平上，它们两者之间具有70.03％的一致性，如图1所示。
实施例3、smakt1基因在茄子不同组织中的表达差异及其在低钾和盐胁迫下的表达模式
1.植物材料的获得
根、茎、叶、花、果实、萼片分别取自4个月苗龄的茄子植株。将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。每个样品取3株，设置三次重复实验。
选取人工气候培养室中同期播种且长势一致的茄子幼苗，待其长至四叶一心时分别进行低钾和盐胁迫处理，在0h、6h、12h、24h、48h和7天时取处理材料的叶片和根系。每个时间点的样品取3株，每组实验设置三次重复。
营养液的配制：每升去离子水中大量元素含有1650mgnh4no3，370mgmgso4·7h2o，170mgkh2po4，440mgcacl2·2h2o；微量元素含有22.3mgmnso4·4h2o，0.83mgki，0.025mgcuso4·5h2o，6.25mgh3bo3，0.025mgcocl·6h2o，8.65mgznso4·7h2o，0.25mgna2moo4·2h2o；铁盐含有：27.8mgfeso4·7h2o，37.3mgna2-edta。
低钾溶液的配制：每升去离子水中大量元素含有2300mgnh4no3，370mgmgso4·7h2o，144mgnh4h4po4，440mgcacl2·2h2o；微量元素和铁盐同上述营养液。
盐胁迫溶液的配制：在上述营养液中加入200mm的nacl。
2.rna的提取
本实验中使用的所有去核糖核酸酶(ribonuclease,rnase)的离心管和枪头均购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用的研钵和研棒均进行高温灭菌。总rna的提取使用takaraminibestuniversalrnaextractionkit试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)。rna质量检测采用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000分光光度计检测。
3.cdna的获得
以500ng的总rna为模板，反转录试剂盒使用primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)。
4.设计特异性引物以进行实时荧光定量pcr分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子smakt1基因序列，利用引物设计软件设计用于real-timepcr中smakt1基因定量分析的特异性引物，
smakt1-f(seqidno.5)：5′-atgctagctcgcggtagaatgg-3′
smakt1-r(seqidno.6)：5′-tcaagaccgcgcttcaaca-3′
内参基因为actin(gu984779.1)，其引物为actin-f(seqidno.7)：5′-gtcggaatgggacagaaggatg-3′
actin-r(seqidno.8)：5′-gtgcctcagtcaggagaacagggt-3′
5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用easydilution(试剂盒提供)将标准品cdna溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cdna溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行real-timepcr扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的pcr扩增产物。通过标准曲线确定模板cdna的合适稀释倍数。
6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cdna第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，real-timepcr反应在ftc-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μl。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。
7.采用2-δδct法作相对定量分析。结果表明smakt1基因在茄子的根、茎、叶、花、果实、萼片中都有表达，其中在根中的表达量最高，说明smakt1基因的表达具有明显的空间差异性(图2)。
8.观察低钾或盐胁迫处理后smakt1基因在茄子的根和叶片中的表达变化，低钾胁迫下茄子根系和叶片中smakt1表达量在短时间内呈现上调表达趋势。当处理时间达到24h时，叶片中smakt1的表达量回复到初始水平，根系中smakt1的表达量也逐渐降低(图3a)。在盐胁迫处理下叶片和根系中smakt1的表达变化趋势与低钾胁迫处理下的变化趋势相似(图3b)。这说明外界高盐胁迫会影响植物对k 的吸收，从而导致植物产生低钾反应。
实施例4、茄子smakt1基因转入钾吸收缺陷型酵母的功能验证
所用转化载体为pyes2.0，酵母菌株为钾吸收缺陷型酵母r5421。
1.r5421的活化：将保存的r5421菌种从-80℃超低温冰箱取出，于冰上融化。将接种环灼烧灭菌，冷却后沾取融化的菌液于ypda固体培养基上划线，30℃培养3天左右。挑取单菌落于灭菌的锥形瓶中(50ml)，加入5mlypda液体培养基，30℃，250r/min摇菌培养至od600为1.6左右。将所有菌液转接于100ml灭菌锥形瓶中，并加入50mlypda液体培养基，30℃，250r/min摇菌培养至od600为0.6～0.8。得活化的酵母菌液。
2.peg法转化酵母：将活化的酵母菌液转移至50ml离心管中，3,000r/min离心5min收集菌体；用1/2体积的灭菌ddh2o洗涤菌体，再3,000r/min离心5min，弃上清，加入适当灭菌ddh2o重悬酵母；在1.5ml无菌离心管中依次加入60μl酵母菌液、240μl50％peg、35μlliac、10μl5mg/mlssdna和质粒dna(0.1～10μg)5μl，漩涡震荡混匀。30℃恢复培养30min后，42℃热激25min，冰上冷却5min；7200r/min离心1min集菌，弃尽上清，加灭菌ddh2o重悬菌体，涂布于相应氨基酸缺陷型培养基上，30℃培养2～3天。得含有不同质粒dna的三种r5421酵母菌株。
其中三种r5421酵母菌株所含质粒dna分别为：pyes2.0，pyes2.0-smakt1和pyes2.0-atakt1。
3.阳性酵母克隆梯度稀释点斑
1)将含有不同质粒的菌株置于50ml离心管中，加入5mlypda培养液，30℃，250r/min摇菌培养至od600为1.6左右。
2)7,200r/min离心1min集菌，弃尽上清，加灭菌ddh2o重悬菌体，7,200r/min离心1min集菌，弃尽上清，用灭菌ddh2o洗涤菌体，重复两次。
3)加入适量灭菌ddh2o重悬酵母菌，调整od600值为0.8左右。
4)将每种酵母菌液梯度稀释10倍，即在新的无菌管内加入100μl无菌ddh2o，吸出10μl，补入10μl调整好od600值的菌液，此为稀释10倍，再从该菌液里吸出10μl加入到90μl无菌ddh2o里，此为稀释100倍，同法再准备好稀释1,000倍和10,000的菌液；
5)将各种菌液及其梯度稀释的菌液分别点5μl于ap培养基上(lietal.,2014，theos-akt1channeliscriticalfork uptakeinricerootsandismodulatedbythericecbl1-cipk23complex.plantcell26:3387-3402.)，在超净台内吹干平皿，于30℃培养5天后拍照。结果如图4所示。
4.smakt1基因在钾吸收缺陷型酵母中的功能验证
配置含不同浓度kcl的ap培养基，将上述三种菌株点斑到培养基上并观察各自生长情况。如图4所示，转入空载体的钾营养吸收缺陷型酵母菌株r5421(图4中的 vetor)在低于5mmk 浓度的培养基中不能生长，而转入smakt1和atakt1的r5421酵母菌株则可以生长。但是随着培养基中k 浓度的降低，转入smakt1和atakt1的r5421酵母菌株生长情况逐渐产生差别。转入smakt1的r5421酵母菌株生长情况要稍弱于转入atakt1的r5421酵母菌株，说明smakt1和atakt1一样能够恢复钾营养吸收缺陷型酵母的生长，但是smakt1对k 的吸收能力要低于atakt1。
另外将上述获得的含有pyes2.0空载体、atakt1和smakt1的r5421酵母菌株转移到含有100mm、200mm和300mmnacl及1mm、5mm和10mmkcl不同组合的ap培养基上并观察其生长情况。如图5所示，在含有1mm、5mm和10mmkcl的培养基上，随着nacl浓度的不断增加，转入smakt1和atakt1的r5421酵母菌株生长逐渐受到抑制。在含有10mmkcl的培养基上，转入空载体的r5421酵母菌株随着nacl浓度的不断增加生长逐渐被抑制，但转入smakt1和atakt1的r5421酵母菌株生长受抑制程度较轻。以上结果说明，smakt1和atakt1不仅可以增加钾营养吸收缺陷型酵母的k 吸收能力，还可以增强其耐盐能力。
实施例5、茄子smakt1基因转入拟南芥突变体的功能验证
所用转化载体为phb，拟南芥材料为拟南芥野生型col和akt1突变体。
将采用常规方法获得的含有phb-smakt1的农杆菌培养至od0.8～2.0，6000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用ms液重悬，调整od600为0.8～1.2，侵染拟南芥花序10～60sec，暗培养12h后正常培养，收集成熟的种子。
1.t1代转基因苗筛选：将t1代种子按照以上描述的方法铺于筛选1/2ms培养基(含50mg/l潮霉素)上。4℃黑暗环境春化3天后，移入光照培养箱中培养。7-10天后挑选能够正常萌发并且根部生长不受抑制的转化植株，移入正常的1/2ms培养基中恢复培养2-3天后移入营养土中生长，单株收获t2代种子。
2.t2代单拷贝株系筛选：同样采用以上描述的方法将t2代种子播种于筛选1/2ms培养基(含50mg/l潮霉素)上，生长一周左右后进行萌发分离比的统计，在筛选培养基上能够生长的种子与不能生长的种子经卡方检验符合3:1比例的株系即为单拷贝插入株系，选取一定数量的t2代单拷贝插入的株系进行繁种，单株收获t3代种子。
3.t3代纯合株系筛选：取一定量的t3代种子(50-100粒)播种于筛选培养基(含50mg/l潮霉素)上，生长一周左右后所有种子都能生长的株系即为单拷贝插入的纯合株系，继代幼苗具有抗性的株系为纯合插入的转化植株，对这些株系进行繁种，收获的种子可以用于进一步的实验。
4.培养基的配制
ms培养基使用phytotechnologylaboratories生产的m524。每升去离子水中加入4.33gm524粉末，30g蔗糖。完全溶解后用1m的naoh溶液调ph至5.8。配置固体培养基需要加入8g的琼脂粉。
低钾(lk)培养基的配置：使用phytotechnologylaboratories生产的m407微量元素培养基，每升去离子水中加入0.61gm407粉末，再补入2.3gnh4no3和0.144gnh4h4po4粉末。蔗糖和琼脂的量保持不变，ph为5.8。
5.smakt1基因在拟南芥突变体中的功能验证
将构建好的smakt1过表达载体转入拟南芥akt1突变体植株，从中筛选出两个转基因株系与野生型一起进行低钾处理检测试验。通过qrt-pcr检测确定smakt1转入到了akt1突变体植株内(图6)。在ms培养基上生长4天后，挑选生长一致的拟南芥幼苗转到ms和lk培养基上，生长7天后进行观察拍照。如图7所示，在ms培养基上四种拟南芥材料的生长没有区别。但在lk培养基上，四种拟南芥材料的叶片均有发黄，其中akt1突变体的叶片黄化最为严重，而转入smakt1的拟南芥株系叶片黄化程度与野生型相似。以上结果说明smakt1参与介导拟南芥根部细胞对k 的吸收。
我们将上述四种拟南芥材料转入蛭石中进行耐盐实验。待拟南芥在蛭石中生长一周后，每两天浇灌一次含200mmnacl的营养液并每天观察其生长情况。结果发现，在盐胁迫处理第7天时，与野生型相比，akt1突变体生长受到明显抑制，但smakt1的两个转基因株系可部分恢复到野生型水平(图8)。这一结果说明smakt1可提高拟南芥akt1突变体的耐盐能力。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
sequencelisting
<110>上海交通大学
<120>茄子钾离子通道蛋白smakt1及其编码基因和应用
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1.一种茄子smakt1蛋白，其特征在于，所述smakt1蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。
2.一种编码权利要求1所述smakt1蛋白的基因的核苷酸序列，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括：
(1)如seqidno.1所示第1～2655位所示的碱基序列；或
(2)与seqidno.1所示第1～2655位所示的碱基序列具有至少70％的同源性的碱基序列。
3.一种用于扩增权利要求2所述编码smakt1蛋白的基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如seqidno.3、seqidno.4所示。
4.一种用于权利要求2所述编码茄子smakt1蛋白的基因的荧光定量pcr分析的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如seqidno.5、seqidno.6所示。
5.一种根据权利要求1所述茄子smakt1蛋白的应用，其特征在于，所述应用包括如下中的至少一种：
(c1)在调控植物的钾离子吸收中的应用；
(c2)在调控植物对低钾环境或盐胁迫环境的耐逆性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用具体为如下中的至少一种：
(c1)在促进植物的钾离子吸收中的应用；
(c2)在增加植物对低钾环境或盐胁迫环境的耐逆性中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.一种根据权利要求1所述smakt1蛋白的基因功能验证的方法，其特征在于，包括将编码smakt1蛋白的基因导入目的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体中，得到相应的互补酵母菌株或者拟南芥株系；所述互补酵母菌株或者拟南芥株系满足如下表现：
(d1)对低钾环境的耐逆性高于相对应的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体；或
(d2)对盐胁迫环境的耐逆性高于相对应的缺陷型酵母菌株或者拟南芥突变体。
9.一种根据权利要求1所述smakt1蛋白在育种中的应用，其特征在于，具体包括在培育钾离子吸收能力强的植物和/或在低钾环境和/或盐胁迫环境下具有高耐逆性的植物中的应用。
技术总结