本发明属于基因工程领域，涉及一种含水稻重金属转运蛋白oshma6及其编码的基因在降低铜毒害方面的应用。
背景技术：
铜(cu)是一种必需的微量营养素，在光合作用、氧化应激、氮和碳代谢、激素感受和细胞壁合成等许多植物过程中起着关键作用(pilonetal,2006；hanschandmendel,2009)。铜缺乏会导致植物生长迟缓、幼叶变黄和发育缺陷(klaumannetal,2011)。铜缺乏还会损害花粉育性，降低生长速度、结实率和产量(huangetal,2016)。铜在人类健康方面也发挥着重要作用，铜缺乏导致贫血和免疫缺陷(collinsandklevay,2011；gulecandcollins,2014)。目前，全世界有20多亿人患有微量营养素缺乏症，如铜、铁和锌(whiteandbroadley,2009)。
同样，过量的铜对植物是有毒的(abdel-ghanyetal,2005；andrés-colásetal,2006)，并引起植物根系生长抑制，生物量减少和植物坏死(navari-izzoetal,2006；lequeuxetal,2010；huangetal,2016)。铜毒也降低了植物对铁的吸收(alaoui-sosséetal,2004)。叶绿体中类囊体膜也是铜毒性的主要靶点(bernaletal,2004)。铜毒害可导致黄叶和降低植物光合速率(alaoui-sosséetal,2004；bernaletal,2006)。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种能改良植物对铜毒害或铜累积的水稻重金属转运蛋白oshma6及其编码基因oshma6。
本发明的技术方案为：氨基酸序列如seqidno.2所示的水稻重金属转运蛋白oshma6在提高转基因植物对重金属铜的耐受和/或降低转基因植物对重金属铜的累积中的应用。
oshma6基因在提高转基因植物对重金属铜的耐受和/或降低转基因植物对重金属铜的累积中的应用，所述oshma6基因的cds为seqidno.1所示的核苷酸序列，或为与seqidno.1互为配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如seqidno.2所示的水稻核苷酸序列。
上述所述的应用中，所述植物为水稻。
插入oshma6基因的酿酒酵母重组表达载体，所述oshma6基因的cds为seqidno.1所示的核苷酸序列，或为与seqidno.1互为配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如seqidno.2所示的水稻核苷酸序列。
上述所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属铜的耐受性中的应用。
上述所述的酿酒酵母重组表达载体在降低工程菌株酿酒酵母对重金属铜的积累中的应用。
本发明的有益效果如下：
在本发明中，我们对oshma6基因的应用进行探索，发现该基因以下应用方式：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对重金属铜的耐受性；(2)在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母细胞对重金属铜的累积，促进酵母体内铜的外排。
本发明也可推广至农业生物技术领域，通过改变oshma6基因在农作物中的表达，调控农作物对重金属铜的耐受性和富集。
附图说明
图1：构建完成的酿酒酵母重组表载体oshma6-pyes2示意图。
图2：水稻oshma6基因应答不同浓度cu2 处理的qrt-pcr检测。
图3：转化oshma6-pyes2的转基因酵母对铜胁迫的耐受性提高、
图4：转化oshma6-pyes2的转基因酵母在含铜培养基中生长曲线和铜累积降低。(a)在不添加铜的培养基中，转化oshma6-pyes2的转基因酵母和转化pyes2的转基因酵母的生长曲线。(b)在含3mmcu2 的培养基中，转化oshma6-pyes2的转基因酵母和转化pyes2的转基因酵母的生长曲线。(c)在含6mmcu2 的培养基中，转化oshma6-pyes2的转基因酵母和转化pyes2的转基因酵母的生长曲线。(d)转化oshma6-pyes2的转基因酵母和转化pyes2的转基因酵母在含3mmcu2 和6mmcu2 的培养基中生长30小时后酵母的cu2 浓度。
具体实施方式
一、水稻基因oshma6序列的克隆
1)总rna的提取
水稻(武运粳7号)幼苗长至3叶期，用0.2mm硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1mltrizol试剂(购自invitrogen,usa)，充分摇匀振荡后，抽提总rna。
2)oshma6基因cds全长的克隆
通过水稻数据库(riceannotationprojectdatabase,https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)的基因数据库中检索到水稻的oshma6(os02g0172600)基因的cds序列，用软件primer5.0设计引物序列(如下)，从组织cdna库中钓出oshma6的cds全长序列。
p1:5’-atggcccatctccagctcacgccgc-3’(seqidno.3)
p2:5’-tcactctacagttatttgtaacagg-3’(seqidno.4)
以步骤1)获得的总rna为模板，经反转录合成cdna第一链后，用高保真酶(primestarhsdnapolymerase购自takara公司)进行pcr扩增，pcr程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pmd-18载体(购自takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因oshma6的全长序列(seqidno.1)。
二、转化oshma6-pyes2的转基因酵母的获得
1)酿酒酵母重组表载体oshma6-pyes2的构建
根据步骤一中获得的水稻基因oshma6的全长序列，见seqidno.1的序列，用软件primer5.0设计引物序列(如下)：
p5:5’-ttcggatccgatggcccatctccagctcacgccgc-3’(bamhi)(seqidno.5)
p6:5’-gcctctagagtcactctacagttatttgtaacagg-3’(xbai)(seqidno.6)
以步骤一中获得的克隆oshma6的cds序列的pmd-18载体为模板，用高保真酶(primestarhsdnapolymerase购自takara公司)进行pcr扩增，pcr程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回获得f端和r端分别添加酶切位点bamhi和xbai的oshma6的cds序列的pcr产物。将回收产物用限制性内切酶bamhi和xbai进行双酶切，同时用bamhi和xbai双酶切酿酒酵母表载体pyes2，然后分别回收酶切过的pcr片段和载体。回收后通过t4连接酶将线性化的载体与酶切过的pcr片段在4℃下连接过夜，转化到大肠杆菌dh5a感受态细胞中，涂在含有氨苄青霉素100μgml-1的lb固体培养基上生长12h后，挑取阳性菌落,提取质粒经bamhi和xbai双酶切验证片段大小无误后，将该菌液进行dna测序，将含有测序正确克隆命名为oshma6-pyes2。即为酿酒酵母重组表载体，载体示意图见图1。
1)酿酒酵母菌株的转化
培养酿酒酵母菌株cm52，用pyes2质粒和重组的oshma6-pyes2质粒对上述酵母进行转化。酵母转化采用醋酸锂转化法，具体步骤如下：
(1)接种待转化的酵母菌株cm52的单菌落与5mlypda液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)，培养过夜，od600值约0.8。(2)西区100μl上述菌液转移到20ml的ypda液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)继续培养，摇5-8h至菌液od600值达0.5-0.8。(3)培养液在室温条件下4000g离心3min，收集细胞。细胞用10ml无菌超纯水重悬，再于室温4000g离心3min，沉淀细胞。(4)沉淀的细胞用2ml锂盐溶液(10×te缓冲液,ph7.5,200μl；10×乙酸锂储液，200μl；无菌水，1.6ml)重悬，将待转化质粒和10μl变性鲑鱼精一起加入1.5ml离心管中混匀。(5)往每个离心管中加入200μl用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1ml新鲜配制的peg溶液(50％peg，800μl；10×te缓冲液,ph7.5,100μl；10×乙酸锂储液，100μl)，30℃摇荡30min。(6)于42℃热激15min，室温下离心5s，细胞沉淀用1ml1×te缓冲液重悬，并取其中200μl涂布在添加半乳糖的sd固体培养基平板上，30℃培养2-4天，直到出现菌落。
转化后的阳性克隆在sd-u液体培养基中培养至对数早期，浓缩，并用无菌水洗涤3次。在连续10倍稀释后，分别在含有0、3、4mmcuso4的sd-u板上点8μl的细胞悬液。将培养板在30℃下培养3天后，进行评估生长表型。在含0、3mm和6mmcu2 的sd-u液体培养基中，对不同质粒转化的cm52菌株进行了生长测定。过夜酵母菌液，用无菌蒸馏水将其浓度调整为od600为0.5。将20ul细胞悬液添加到20ml液体sd-u培养基中，培养基中分别含有0、3、6mmcuso4。在指定时间测定600nm处的od值。把生长30小时的在液体培养基离心浓缩，用去离子水洗涤3次，80℃烘干3天，然后用电感耦合等离子体质谱法测定cu2 浓度。
结果发现，与对照(0.2μmcu2 )相比，高浓度cu2 可显著诱导水稻中oshma6的表达，oshma6在100mmcu2 时表达最高，是对照的5.9倍(图2)。为了测定oshma6的cu2 转运活性，将重组的oshma6-pyes2质粒与空载体pyes2分别转进酵母菌株cm52。结果表明，与转pyes2的菌株相比，转oshma6-pyes2质粒的菌株在含有3mm或6mmcu2 的培养基上时能显著地促进cm52菌株的生长(图3)，说明oshma6具有较高的cu2 外排转运活性。我们继续在含有0，3mm，6mmcu2 的sd-u液体培养基中分析了转化后cm52菌株的生长。在含有3mm或6mmcu2 的培养基中，15小时后转oshma6-pyes2质粒的菌株的生长显著高于转pyes2的菌株(图4中b，c)。为了进一步证实这一结果，我们分析了30小时的菌株中的金属浓度。与转pyes2的菌株相比，在3mm或6mmcu2 下，转oshma6-pyes2质粒的菌株中的铜浓度分别降低了23.4％和30.3％(图4中d)。
综上所述，本发明发现表达水稻基因oshma6能显著增加酿酒酵母菌株对重金属铜的耐受性，降低酵母细胞对重金属铜的累积；本发明也可推广至农业生物技术领域，通过改变oshma6基因在农作物中的表达，调控农作物对重金属铜的耐受性和富集，以及参与农作物对其他矿质元素的耐受性和富集；可利用本发明oshma6-pyes2酵母表达载体，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如b-葡糖醛酸糖苷酶gus)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用ti质粒，ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
序列表
<110>中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120>水稻重金属转运蛋白oshma6在降低铜毒害方面的应用
<160>6
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gcctctagagtcactctacagttatttgtaacagg35
1.氨基酸序列如seqidno.2所示的水稻重金属转运蛋白oshma6在提高转基因植物对重金属铜的耐受和/或降低转基因植物对重金属铜的累积中的应用。
2.oshma6基因在提高转基因植物对重金属铜的耐受和/或降低转基因植物对重金属铜的累积中的应用，所述oshma6基因的cds为seqidno.1所示的核苷酸序列，或为与seqidno.1互为配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如seqidno.2所示的水稻核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻。
4.插入oshma6基因的酿酒酵母重组表达载体，所述oshma6基因的cds为seqidno.1所示的核苷酸序列，或为与seqidno.1互为配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如seqidno.2所示的水稻核苷酸序列。
5.权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对重金属铜的耐受性中的应用。
6.权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在降低工程菌株酿酒酵母对重金属铜的积累中的应用。
技术总结