本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种对虾耦合抗菌肽及基因、对虾耦合抗菌肽的获取方法、表达载体、重组菌和应用。
背景技术：
鱼、虾等水产品是人类日常食品蛋白重要来源，因此水产养殖在全球经济中具有相当重要的地位。然而，由于细菌或者病毒的侵害，每年水产养殖都遭受巨额经济损失。为了预防和控制病害发生，养殖户广泛使用化学药物进行场地消毒或者添加抗生素到饲料进行疾病防治。大量使用化学药物或者抗生素类药物对生态产生严重破坏作用，同时引起的食品安全问题令人堪忧。在国家加强环保和食品安全监管形势下，开发无污染、无残留、安全有效的，可全部或者部分取代化学药物或者抗生素类药物的新型渔药具有重要的社会意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种对虾耦合抗菌肽及基因、对虾耦合抗菌肽的获取方法、表达载体、重组菌和应用，本发明提供的对虾耦合抗菌肽代替目前水产饲料中使用的抗生素，以达到既可预防和治疗动物疾病，又可减少滥用素带来的不良后果的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种对虾耦合抗菌肽，所述对虾耦合抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了编码上述技术方案所述的对虾耦合抗菌肽的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的基因连接到酵母表达载体ppic9k的ecor1位点和not1位点之间，得到表达载体。
本发明还提供了一种重组菌，将上述技术方案所述的表达载体转入top10克隆菌株中，提取质粒，将所述质粒电转化到毕赤酵母中，得到重组菌。
优选的，所述毕赤酵母包括毕赤酵母gs115。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的对虾耦合抗菌肽的获取方法，将上述技术方案所述的重组菌进行液体培养，将得到的培养液离心，得到上清液，纯化所述上清液中对虾耦合抗菌肽，对虾耦合抗菌肽。
本发明还提供了上述技术方案所述的重组菌在制备水生动物抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。
优选的，所述水生动物包括鱼或虾。
本发明提供了一种对虾耦合抗菌肽及基因、对虾耦合抗菌肽的获取方法、表达载体、重组菌和应用，所述对虾耦合抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述对虾耦合抗菌肽代替目前水产饲料中使用的抗生素，以达到既可预防和治疗动物疾病，又可减少滥用素带来的不良后果的目的。
附图说明
图1为ppic9k载体的质粒图谱；
图2为wap crustinlike pvhm117串联表达序列插入ppic9k载体示意图；
图3为琼脂糖电泳结果图；
图4为1％琼脂糖凝胶电泳图；
图5为电转化后酵母在平板生长情况结果图；
图6为pcr鉴定重组酵母阳性克隆菌株结果图；
图7为wb(westernblot)鉴定上清液重组蛋白图；
图8为重组蛋白纯化结果；
图9为沙门氏菌抑菌图；
图10为溶藻弧菌抑菌图；
图11为葡萄球菌抑菌图。
具体实施方式
本发明提供了一种对虾耦合抗菌肽，其特征在于，所述对虾耦合抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体如下：
efvptrhsrprpqpkprpgtcpdtsdifsicvvterncfsdsecgpgqkccpigcgreclavvppygsgrggggsggggsggggsqdkdkagtrlgggfgvpgaggvfpgaggvpgvggvfpgaggvfpgaggigpgpgglipgggfncnycrtpvgyvcckpgrcppvrdvcpstrfgppvcrqdldcsgsdkccydvcledtvckpivagsqgggggsggggsggggsgkfrgfgqpfgglggpgggvgvgggfpggglgvggglgvggglgvggglgvggglgtgtsdcrywcktpegqayccesahepetpvgtkpldcpqvrptcprfhgppttcsndykcagldkccfdrclgehvckppsffgsqvfghhhhhh。
本发明还提供了编码上述技术方案所述的对虾耦合抗菌肽的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下：
gaattcgttccaactagacattctagaccaagaccacaaccaaaaccaagaccaggtacttgcccagatacttccgatattttctctatttgtgttgttactgagagaaactgtttttctgattccgaatgtggacctggtcaaaagtgttgcccaattggatgtggaagagagtgtttggctgttgttccaccatacggttctggtagaggtggtggtggttctggtggtggtggatctggtggtggaggatctcaggataaggataaggctggtactagattgggtggtggttttggtgttcctggtgctggtggtgtttttcctggtgctggaggtgttcctggagttggtggtgttttccctggtgctggtggagtttttcctggagctggtggtattggtcctggtcctggtggtttgattcctggtggtggtttcaattgtaattattgtagaactcctgtcggttatgtttgttgtaagccaggtagatgtcctcctgttagagatgtttgtccatctactagatttggtcctcctgtttgtagacaagatttggattgttctggttctgataagtgttgttatgatgtttgtttggaagatactgtttgtaagcctattgttgctggttctcaaggtggtggtggtggttccggtggtggtggttcaggtggtggtggttctggaaagtttagaggttttggtcagccttttggtggtttgggtggtcctggtggaggtgttggtgttggtggtggttttcctggtggtggattgggtgttggtggaggtttgggtgttggaggtggtttgggagttggtggaggattgggtgtcggtggtggtttgggtactggtacttctgattgtagatattggtgtaagactcctgagggtcaggcttattgttgtgagtctgctcatgagcctgagactcctgttggtactaagcctttggattgtcctcaagttagacctacttgtcctagatttcatggtccaccaactacatgttcaaatgattacaagtgtgctggtttggataagtgttgctttgatagatgtttgggtgagcatgtttgtaaaccaccatctttttttggttcccaagtctttggtcatcatcatcatcatcattaa。
在本发明中，所述基因优选为wap基因、crustinlike基因和pvhm117基因串联后得到，所述wap基因的ncbi登录号：ay464465.1，所述crustinlike基因的ncbi登录号：jq824114.1，所述pvhm117基因的ncbi登录号：ay488497.1。
本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的基因连接到酵母表达载体ppic9k的ecor1位点和not1位点之间，得到表达载体。本发明对所述基因连接到酵母表达载体ppic9k中的方法没有特殊限定，采用常规基因连接到酵母表达载体中的方法即可。
本发明还提供了一种重组菌，将上述技术方案所述的表达载体转入top10克隆菌株中，提取质粒，将所述质粒电转化到毕赤酵母中，得到重组菌。在本发明中，所述毕赤酵母优选包括毕赤酵母gs115。本发明对所述表达载体转入top10克隆菌株的方法没有特殊限定，采用常规方法即可，本发明对所述提取质粒和电转化的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的对虾耦合抗菌肽的获取方法，将上述技术方案所述的重组菌进行液体培养，将得到的培养液离心，得到上清液，纯化所述上清液中对虾耦合抗菌肽，得到对虾耦合抗菌肽。本发明优选使用ni-nta层析柱纯化上清液中的对虾耦合抗菌肽。
本发明还提供了上述技术方案所述的重组菌在制备水生动物抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。在本发明中，所述水生动物优选包括鱼或虾。
在本发明中，所述基因转化到毕赤酵母gs115可以获得稳定的表达重组蛋白的菌株。本发明所述重组表达方法使得目的重组蛋白获得翻译后修饰加工，因此更接近对虾体内表达的蛋白；将所述基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；重组耦合肽表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达，可分泌到发酵液中，有利于分离纯化。表达重组耦合肽的酵母菌含有动物生长发育所必需的各种营养物质，可作为优质蛋白质源添加到鸡、猪、反刍、水产等饲料中。采用本发明制备的重组菌以及其表达的重组抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果，可应用于生产鱼类和虾类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook,j.,russell,davidw.,molecularcloning:alaboratorymanual,3rdedition,2001,ny,coldspringharbor)。所用引物及dna序列均由华大基因(深圳)科技有限公司合成。
本发明采用的ppic9k载体、赤酵母gs115购自南京钟鼎生物技术有限公司，ppic9k载体的质粒图谱分别如图1所示；限制性内切酶和pfudna聚合酶购自takara公司，t4dna连接酶购自neb公司，胶回收试剂盒和质粒小量抽提试剂盒购自omega公司，质粒大量抽提试剂盒购自nucleobond公司；倒置显微镜为olympus产品，荧光倒置显微镜为nikon公司产品。proteinmarker北京全式金生物科技有限公司)，pvdf膜(购自美国millipore公司)，x光片(购自美国柯达公司)，ecl显色液(购自中国普利莱公司)，鼠抗his单抗(北京全式金生物科技有限公司)，兔抗鼠hrp二抗(北京全式金生物科技有限公司)，acr、bis、tris等(购自sigma公司)，sds(购自amresco公司)，tyrptone、yeastextract(购自oxoid公司)，pcr反应管(购自fisher公司)，0.22μm无菌滤器和透析袋(购自millipore公司)，ni2 ida亲和层析胶(zoonbio公司)agarose(购自上海基因公司)，dna胶纯化试剂盒(购自axygen公司)，saci(购自宝生物)，常规生化试剂为国产分析纯。若无特别说明，本发明采用的其他试剂均为市售商品。
实施例1
(1)根据wap、crustinlike、pvhm117基因序列信息，合成wap crustinlike pvhm117串联表达序列。如图2所示，将3个蛋白截断信号肽区域后用linker(绿色区域)串联，按照毕赤酵母表达体系优化密码子后，序列构建至ppic9k载体的ecori和noti酶切位点(紫色区域)之间。n端双划线序列为ppic9k载体上a-factorsecretionsignal序列，c端双划线序列为his标签序列。
(2)将构建好的表达载体ppic9k-wap crustinlike pvhm117转化到top10克隆菌株。具体方法：从-80℃冰箱中取出对应的top10感受态细胞，室温下置于冰盒上解冻，标记；向感受态细胞中加入2μl的重组载体，置于4℃冰箱中，冰浴30min；在42℃水浴锅中热激1min，然后立即在冰盒上放置2min；每管加900μllb培养基，37℃摇床震荡,150rpm×45min；取100μl转化液加入氨苄青霉素抗性的平板中，涂匀液体；将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
(3)重组质粒提取及鉴定：挑选步骤(2)阳性克隆菌落，接种到含有氨苄青霉素的lb培养基，放置恒温摇床37℃培养20小时。使用质粒提取试剂盒进行质粒提取，具体方法参照试剂盒说明。所提取质粒使用ecori–noti碱性双酶切鉴定，酶切体系：质粒3μl，ecori0.25μl，noti0.25μl，10×buffer1.0μl，超纯水5.5μl，反应管放置37℃水浴3小时，然后取5μl酶切反应液进行琼脂糖电泳。结果如图3所示：m为dnaladder:1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,10000bp，1为酶切前质粒，2为酶切后质粒。酶切产物含有两条dna条带：一条与质粒ppic9k分子量大小相符，一条与wap crustinlike pvhm117耦合序列分子量大小相符。酶切实验结果说明提取质粒含有wap crustinlike pvhm117目的片段，可进行下一步实验。
(4)ppic9k-wap crustinlike pvhm117质粒线性化：将20μg左右质粒dna进行saci线性化，反应体系：10×buffer40μl，saci20μl，质粒20μg，加超纯水至320μl。37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果图4所示。图中m为dna标准品(从下到2000,3000,4000,5000,6000,8000,10000bp)，1为saci酶切产物，2为回收目的片段。
(5)电转酵母细胞gs115：将10ul线性化质粒ppic9k-wap crustinlike pvhm117加入到装有80ul毕赤酵母感受态酵母细胞的1.5mlep管内，混匀后加入到直径为0.2cm电转化杯中。电击条件为：电压1700v、时间8ms、电击2次。分别吸取50ul、100ul和200ul线性化质粒混合液涂布于ypd平板上，30度恒温培养48小时，待平板长出菌落(结果如图5所示)，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有10mlypd液体培养基试管中，30度，180rpm过夜培养。
(6)pcr鉴定阳性克隆菌株：挑选10株阳性克隆，分别提取基因组dna(编号为12345678910)，使用5’pgappriming和3’aox1priming引物(seqidno.3：5′-gaattcgttccaactagaca-3′；seqidno.4：5′-gcggccgcttaatgatgatgat-3′)对目的基因进行pcr鉴定，结果显示均为阳性。pcr鉴定阳性克隆子，预期条带大小约1.0k.。如图6所示，图中：m为dnamarker，从下到上各条带分别为100,250,500,750,1000,2000bp；1为空载质粒扩增条带，2-11为阳性克隆菌pcr条带，12为阴性对照。
(7)小试表达：wap crustinlike pvhm117蛋白大小36.11kda，翻译后氨基酸序如seqidno.1所示。取鉴定的阳性菌株2#、3#、8#、11#，50μl接入装有10mlbmgy的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至od600＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10mlbmmy重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；取0，24，48，72，96h样品10000r/min离心2min，使用sds-page电泳。
(8)wb(westernblot)鉴定：步骤(11)sds-page电泳结束后，将凝胶剪裁至合适大小，用转膜缓冲液平衡20min。按凝胶大小剪裁滤纸数块及pvdf膜一块，浸入转膜缓冲液中10min。在转膜装置中由正极到负极按顺序叠放24层滤纸、pvdf膜、凝胶、24层滤纸并精确对齐，玻璃棒小心排除气泡。放置完成后接通电源,恒流20v恒压或30ma恒流转印1-2h。转移结束后，将pvdf膜取出,观察预染marker是否转移良好。用镊子取出pvdf膜，浸泡于pbs-t液中漂洗3次，每次5min。取出pvdf膜放到封闭液中，室温平稳摇动2h。然后用pbst清洗pvdf膜三次，每次5min。将膜放入塑胶袋中，对膜的正面做好标记，然后向袋内滴加稀释好的一抗，加入6-histag单克隆抗体，37℃孵育1h。将膜取出，用pbs-t清洗三次，每次5min。以同样的方法将pvdf膜用羊抗鼠igg-hrp抗体孵育1-2h。二抗作用后，取出膜以pbs-t清洗三次，每次3-5min。然后将膜放入塑胶袋中，滴加适量dab显色液避光显色至有清晰的目标蛋白带出现，用ddh2o终止反应，把膜置于滤纸上，待膜干透后拍照或封存。
结果如图7所示，图中lanem：proteinmarker；1：gs115菌株培养72小时分泌上清；2：2#阳性菌株培养72小时分泌上清；3：2#阳性菌株培养96小时分泌上清；4：3#阳性菌株培养72小时分泌上清；5：3#阳性菌株培养96小时分泌上清；6：8#阳性菌株培养72小时分泌上清；7：8#阳性菌株培养96小时分泌上清；8：11#阳性菌株培养72小时分泌上清；9：11#阳性菌株培养96小时分泌上清。经分析结果显示2#、3#、8#、11#菌株上清均有目的蛋白存在，其中11#菌株表达效果较好，72小时、96小时培养物上清液均有重组蛋白表达。
(9)wap crustinlike pvhm117重组蛋白纯化：选择11#菌株进行菌株放大培养，按步骤(7)方法培养96小时，5000rpm×10min离心菌液，取上清液进行蛋白纯化。具体方法：将层析柱固定在支架上，关闭层析柱的帽子；轻微混匀ni-nta树脂填料(填料中含有等体积的30％乙醇)，取4-5ml装入层析柱中，静置待填料全部自然沉降至底部后，松开帽子让30％乙醇流出，然后以8倍柱体积的bufferb平衡柱子一次；往平衡好的柱子加入约8倍柱体积的蛋白溶液，调整帽子控制流速，在重力作用下自然过柱；用8倍柱体积用bufferc冲洗柱子2次，收集流出液。用1倍柱体积的用bufferd洗脱柱子4次，收集流出液；用1倍柱体积的buffere洗脱柱子4次，收集流出液；取穿透液以及各梯度流出液进行sds-page电泳及wb(westernblot)鉴定，分析重组蛋白质在各管中分布情况。使用蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度。蛋白纯化结果如图8所示，1：gs115对照菌株培养96小时上清液；2：11#阳性菌株培养96小时上清液。
(10)wap crustinlike pvhm117重组蛋白抑菌实验：取30ul对数生长期细菌，加入到lb培养基，混匀涂布到平板上；用灭菌纸片充分浸泡到浓度为(0.03mg/ml)的wap crustinlike pvhm117蛋白溶液，然后取出贴至平板上，培养20h。设立pbs(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照，操作方法同wap crustinlike pvhm117蛋白实验组，设立设立氨苄青霉素及链霉素药敏纸片作为阳性对照，直接取药敏纸片贴至已经涂布有细菌的平板上。
分别用沙门氏菌、溶藻弧菌和葡萄球作为实验菌株，通过抑菌圈实验鉴定抑菌效果，结果分别如图9、10、11所示。图9中，1：头孢噻吩；2：重组蛋白；3：pbs阴性对照；4：氨苄西林；5：链霉素；6：杆菌肽。图10中，1：头孢噻吩；2：重组蛋白；3：pbs阴性对照；4：氨苄西林；5：链霉素；6：杆菌肽。图11中，1：链霉素；2：卡那霉素；3：氟苯尼考；4：重组蛋白；5：pbs阴性对照。实验结果表明，重组蛋白对葡萄球菌抑菌效果显著，对融藻弧菌以及沙门氏菌菌具有一定的抑菌作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广西壮族自治区水产科学研究院
<120>一种对虾耦合抗菌肽及基因、对虾耦合抗菌肽的获取方法、表达载体、重组菌和应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>381
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gluphevalprothrarghisserargproargproglnprolyspro
151015
argproglythrcysproaspthrseraspilepheserilecysval
202530
valthrgluargasncyspheseraspserglucysglyproglygln
354045
lyscyscysproileglycysglyargglucysleualavalvalpro
505560
protyrglyserglyargglyglyglyglyserglyglyglyglyser
65707580
glyglyglyglyserglnasplysasplysalaglythrargleugly
859095
glyglypheglyvalproglyalaglyglyvalpheproglyalagly
100105110
glyvalproglyvalglyglyvalpheproglyalaglyglyvalphe
115120125
proglyalaglyglyileglyproglyproglyglyleuileprogly
130135140
glyglypheasncysasntyrcysargthrprovalglytyrvalcys
145150155160
cyslysproglyargcysproprovalargaspvalcysproserthr
165170175
argpheglyproprovalcysargglnaspleuaspcysserglyser
180185190
asplyscyscystyraspvalcysleugluaspthrvalcyslyspro
195200205
ilevalalaglyserglnglyglyglyglyglyserglyglyglygly
210215220
serglyglyglyglyserglylyspheargglypheglyglnprophe
225230235240
glyglyleuglyglyproglyglyglyvalglyvalglyglyglyphe
245250255
proglyglyglyleuglyvalglyglyglyleuglyvalglyglygly
260265270
leuglyvalglyglyglyleuglyvalglyglyglyleuglythrgly
275280285
thrseraspcysargtyrtrpcyslysthrprogluglyglnalatyr
290295300
cyscysgluseralahisgluprogluthrprovalglythrlyspro
305310315320
leuaspcysproglnvalargprothrcysproargphehisglypro
325330335
prothrthrcysserasnasptyrlyscysalaglyleuasplyscys
340345350
cyspheaspargcysleuglygluhisvalcyslysproproserphe
355360365
pheglyserglnvalpheglyhishishishishishis
370375380
<210>2
<211>1146
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gaattcgttccaactagacattctagaccaagaccacaaccaaaaccaagaccaggtact60
tgcccagatacttccgatattttctctatttgtgttgttactgagagaaactgtttttct120
gattccgaatgtggacctggtcaaaagtgttgcccaattggatgtggaagagagtgtttg180
gctgttgttccaccatacggttctggtagaggtggtggtggttctggtggtggtggatct240
ggtggtggaggatctcaggataaggataaggctggtactagattgggtggtggttttggt300
gttcctggtgctggtggtgtttttcctggtgctggaggtgttcctggagttggtggtgtt360
ttccctggtgctggtggagtttttcctggagctggtggtattggtcctggtcctggtggt420
ttgattcctggtggtggtttcaattgtaattattgtagaactcctgtcggttatgtttgt480
tgtaagccaggtagatgtcctcctgttagagatgtttgtccatctactagatttggtcct540
cctgtttgtagacaagatttggattgttctggttctgataagtgttgttatgatgtttgt600
ttggaagatactgtttgtaagcctattgttgctggttctcaaggtggtggtggtggttcc660
ggtggtggtggttcaggtggtggtggttctggaaagtttagaggttttggtcagcctttt720
ggtggtttgggtggtcctggtggaggtgttggtgttggtggtggttttcctggtggtgga780
ttgggtgttggtggaggtttgggtgttggaggtggtttgggagttggtggaggattgggt840
gtcggtggtggtttgggtactggtacttctgattgtagatattggtgtaagactcctgag900
ggtcaggcttattgttgtgagtctgctcatgagcctgagactcctgttggtactaagcct960
ttggattgtcctcaagttagacctacttgtcctagatttcatggtccaccaactacatgt1020
tcaaatgattacaagtgtgctggtttggataagtgttgctttgatagatgtttgggtgag1080
catgtttgtaaaccaccatctttttttggttcccaagtctttggtcatcatcatcatcat1140
cattaa1146
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gaattcgttccaactagaca20
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gcggccgcttaatgatgatgat22
1.一种对虾耦合抗菌肽，其特征在于，所述对虾耦合抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1所示。
2.编码权利要求1所述的对虾耦合抗菌肽的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，将权利要求2所述的基因连接到酵母表达载体ppic9k的ecori位点和noti位点之间，得到表达载体。
4.一种重组菌，其特征在于，将权利要求3所述的表达载体转入top10克隆菌株中，提取质粒，将所述质粒电转化到毕赤酵母中，得到重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母包括毕赤酵母gs115。
6.一种权利要求1所述的对虾耦合抗菌肽的获取方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的重组菌进行液体培养，将得到的培养液离心，得到上清液，纯化所述上清液中对虾耦合抗菌肽，得到对虾耦合抗菌肽。
7.权利要求4或5所述的重组菌在制备水生动物抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水生动物包括鱼或虾。
技术总结