本发明涉及一种ω-芋螺毒素多肽的制备方法，属于生物化学和分子生物学领域。技术背景芋螺毒素是一类芋螺分泌的、用于麻醉猎物的神经毒素肽。芋螺毒素的生物活性强，能特异性地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道。芋螺毒素现已被广泛应用于神经药理学中，在镇痛、戒烟、戒毒，以及治疗帕金森症等重大疾病方面具有极好的应用前景。芋螺毒素作为具有特异活性和高选择性的天然产物，具有开发成有价值的药物或者药物先导化合物的潜能。我们发现seqidno.1与mviia具有约80％的相似度。通过文献发现，ω-芋螺毒素mviia作为一种神经元中n型电压敏感钙离子通道的可逆且有效的阻断剂，可抑制辣椒素诱导的drg神经元中的ca2 流入，可阻断n型ca2 通道介导的脑中神经递质释放而具有镇痛的功能。而且ω-mviia先前得到美国fda的批准上市，其作用是阻断疼痛通路的n型ca2 通道，用以治疗慢性疼痛。实验数据验证与mviia具有约80％相似度的芋螺毒素seqidno.1，也具有较强的镇痛活性。技术实现要素：本发明的目的是解决一种ω-芋螺毒素多肽的制备方法及其在制备镇痛药物中应用的问题，提供一种ω-芋螺毒素多肽的制备方法。本发明解决上述问题采用的技术方案：ω-芋螺毒素多肽的序列如下：seqidno.1：ckgkgascsrtmyncctgscnrgkc*，其中*表示为c端酰胺化；seqidno.1的n末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸形成二硫键，第三个半胱氨酸与第六个半胱氨酸形成二硫键；ω-芋螺毒素多肽的制备方法步骤如下：(1)在cemliberty全自动微波辅助多肽合成仪上使用树脂进行接肽反应；采用各侧链保护的氨基酸，按树脂载量4倍摩尔数投量；肽键形成采用n’-四甲基脲六氟磷酸盐偶联，重复脱保护-偶联步骤，最后除去n端氨基酸的fmoc保护基，肽链在多肽合成仪上构建完成后，进行后续处理；(2)肽树脂用裂解液25℃裂解反应2h，加入预冷的4℃无水乙醚沉淀出粗肽，并经无水乙醚反复洗涤4～5次回收多肽粗品；粗肽溶于体积百分比0.1％三氟乙酸，c18柱经体积百分比25％乙腈等度洗脱，收集8～10min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥16～20h后备用；裂解液中三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水的体积比为95∶2.5∶2.5；(3)将冷冻干燥后的样品以1mg/ml溶于50mmol/lnh4hco3水溶液，25℃反应48h；c18柱经体积百分比25％乙腈等度洗脱，收集12～14min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥16～20h后即为seqidno.1。本发明获得的ω-芋螺毒素多肽，经体内实验证明其具有较强的镇痛活性，故而可作为镇痛药物中的应用。本发明化合物用于药物时，可以单独使用或制成其他临床可用的不同剂型的药物，剂型包括散剂、注射剂、胶囊剂、丸剂、微胶囊、片剂、膜剂、软胶囊剂、膏剂、栓剂、气雾剂、酊剂、口服液、颗粒剂。可按照药物制剂学添加医学上可接受的药用辅料，包括填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、ph调节剂或润滑剂等。本发明的有益效果：所涉及的ω-芋螺毒素多肽，经动物水平的热板法和烫尾法实验后，证明其具有较强的镇痛活性，故而可作为在镇痛药物中的应用。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1本发明所述ω-芋螺毒素多肽的序列如下：seqidno.1：ckgkgascsrtmyncctgscnrgkc*，其中*表示为c端酰胺化；seqidno.1的n末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸形成二硫键，第三个半胱氨酸与第六个半胱氨酸形成二硫键。ω-芋螺毒素多肽seqidno.1的制备方法本实施例针对所述ω-芋螺毒素多肽seqidno.1的制备方法步骤如下：(1)在cemliberty全自动微波辅助多肽合成仪上使用树脂进行接肽反应。采用各侧链保护的氨基酸，按树脂载量4倍摩尔数投量。肽键形成采用n’-四甲基脲六氟磷酸盐偶联，重复脱保护-偶联步骤，最后除去n端氨基酸的fmoc保护基；肽链在多肽合成仪上构建完成后，进行后续处理；(2)肽树脂用裂解液即三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水的体积比为95∶2.5∶2.5，25℃裂解反应2h，加入预冷的4℃无水乙醚沉淀出粗肽，并经无水乙醚反复洗涤5次回收多肽粗品；粗肽溶于体积百分比0.1％三氟乙酸，c18柱经体积百分比25％乙腈等度洗脱，收集8～10min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥18h后备用；(3)将冷冻干燥后的样品以1mg/ml溶于50mmol/lnh4hco3水溶液，25℃反应48h；c18柱经体积百分比25％乙腈等度洗脱，收集12：14min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥18h后收集即为seqidno.1。本实施例的应用效果：通过对上述化学合成方法，获得纯度为95％的ω-芋～螺毒素多肽seqidno.1。实施例2ω-芋螺毒素多肽的大鼠体内镇痛实验本实施例针对本发明所述ω-芋螺毒素多肽的大鼠镇痛实验。实验动物：雄性sd大鼠，spf级，6-8周龄，体重180±20g，购自中国军事医学科学院实验动物中心，合格证号：scxk-(军)2012-2004。正常适应性饲养条件：独立隔离饲养笼饲养，温度18-21℃，湿度＞40％，150pa加压送风，循环光照(12h光照，12h黑暗)，自由进水进食(标准颗粒饲料)，隔天换一次垫料和饲料。热板法实验分组和处理：将实验大鼠置于热板上，调节温度为55±0.5℃，测定各大鼠的正常痛反应。以大鼠舔后足或抬后足并回头为标准，痛闭时间为5-30s为正常，60s为最大值。筛选45只合格大鼠随机分成3组，分别为对照组(15只)、seqidno.1组(15只)和吗啡组(15只)。以生理盐水为对照，用生理盐水倍比稀释多肽和吗啡，seqidno.1组的给药剂量为20μg/kg，吗啡为阳性对照的给药剂量为1.5mg/kg，对大鼠进行侧脑室给药，记录给药后不同时间(15min，30min，45min，60min，90min，120min，150min)的痛阈。求出各组平均值，计算痛阈提高的百分率(pmap)。pmap＝(给药后痛域值-基础痛域值)÷(60-基础痛域值)×100％烫尾法实验分组和处理：调节恒温水浴55±0.5℃，将大鼠尾巴置于水浴锅内。正常鼠痛域一般为2s，痛域为5s为完全镇痛。筛选45只合格大鼠随机分成3组，分别为对照组(15只)、seqidno.1组(15只)和吗啡组(15只)。以生理盐水为对照，用生理盐水倍比稀释多肽和吗啡，seqidno.1组的给药剂量为20μg/kg，吗啡为阳性对照的给药剂量为1.5mg/kg，对大鼠进行侧脑室给药，记录给药后不同时间(15min，30min，45min，60min，90min，120min，150min)的痛阈。求出各组平均值，计算痛阈提高的百分率(pmap)。pmap＝(给药后痛域值-基础痛域值)÷(5-基础痛域值)×100％ω-芋螺毒素多肽对大鼠热板法镇痛作用的影响结果如下表1所示。与对照组相比，seqidno.1组能显著性提高大鼠的痛阈值(p＜0.05)，且结果优于阳性对照吗啡组；与基础痛域值相比seqidno.1组给药处理后，也能显著性提高该组大鼠的痛阈值(p＜0.05)，且结果优于阳性对照吗啡组。表1#p＜0.05，与基础痛域值相比。*p＜0.05，与对照组相比。ω-芋螺毒素多肽对大鼠热板法镇痛作用的痛阈提高的百分率(pmap)结果如下表2所示。表2给药时间对照组seqidno.1组吗啡对照组15min1.0663.9540.3130min0.2460.6435.3045min0.6355.9724.1760min2.5450.4029.6490min5.1449.4013.56120min10.0653.3815.84150min12.5554.7313.45由表1和2数据表明，ω-芋螺毒素多肽seqidno.1对大鼠热板法镇痛作用效果显著。具有较好的镇痛药效活性。并且seqidno.1的镇痛效果优于阳性对照吗啡。seqidno.1在热板法实验中显示较强的镇痛的作用，可以作为新的镇痛药物开发利用。ω-芋螺毒素多肽对大鼠烫尾法镇痛作用的影响结果如下表3所示。与对照组相比，seqidno.1组能显著性提高大鼠的痛阈值(p＜0.05)，且结果优于阳性对照吗啡组；与基础痛域值相比seqidno.1组给药处理后，能显著性提高该组大鼠的痛阈值(p＜0.05)，且结果优于阳性对照吗啡组。表3#p＜0.05，与基础痛域值相比。*p＜0.05，与对照组相比。ω-芋螺毒素多肽对大鼠烫尾法镇痛作用的痛阈提高的百分率(pmap)结果如下表4所示。表4给药时间对照组seqidno.1组吗啡对照组15min0.3582.7875.4430min1.0681.6872.2445min3.9076.9271.5360min4.8383.8873.3190min16.7676.5673.67120min10.0758.2464.06150min8.8252.3853.74由表3和4数据表明，ω-芋螺毒素多肽seqidno.对大鼠烫尾法镇痛作用效果显著。具有较好的镇痛药效活性。并且芋螺毒素多肽seqidno.1的镇痛效果优于阳性对照吗啡。seqidno.1在烫尾法实验中显示较强的镇痛的作用，可以作为新的镇痛药物开发利用。本实施例的应用效果：经动物水平的热板法和烫尾法对ω-芋螺毒素多肽seqidno.1进行了镇痛活性的验证，结果表明seqidno.1具有较强的镇痛活性，可以作为新型的镇痛药物开发应用。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种ω-芋螺毒素多肽的制备方法，其特征在于ω-芋螺毒素多肽的序列如下：
seqidno.1：ckgkgascsrtmyncctgscnrgkc*，其中*表示为c端酰胺化；
seqidno.1的n末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键，第二个半胱氨酸与第五个半胱氨酸形成二硫键，第三个半胱氨酸与第六个半胱氨酸形成二硫键；
ω-芋螺毒素多肽的制备方法步骤如下：
(1)在全自动微波辅助多肽合成仪上使用树脂进行接肽反应；采用各侧链保护的氨基酸，按树脂载量4倍摩尔数投量；肽键形成采用n’-四甲基脲六氟磷酸盐偶联，重复脱保护-偶联步骤，最后除去n端氨基酸的fmoc保护基，肽链在多肽合成仪上构建完成后，进行后续处理；
(2)肽树脂用裂解液25℃裂解反应2h，加入预冷的4℃无水乙醚沉淀出粗肽，并经无水乙醚反复洗涤4～5次回收多肽粗品；粗肽溶于体积百分比0.1％三氟乙酸，c18柱经体积百分比25％乙腈等度洗脱，收集8～10min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥16～20h后备用；裂解液中三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶水的体积比为95∶2.5∶2.5；
(3)将冷冻干燥后的样品以1mg/ml溶于50mmol/lnh4hco3水溶液，25℃反应48h；c18柱经体积百分比25％乙腈等度洗脱，收集12～14min出现的吸收峰，在-40℃条件下，冷冻干燥16～20h后即为seqidno.1。
技术总结本发明涉及一种ω‑芋螺毒素多肽的制备法，属于生物化学和分子生物学领域。所述ω‑芋螺毒素多肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。所述的ω‑芋螺毒素多肽，经动物水平的热板法和烫尾法实验后，证明其具有较强的镇痛活性，故而可作为在镇痛药物中的应用。
技术研发人员：蒋辉;刘秀洁;王康;姚戈;刘艳丽;宋天宇;万秀坤;熊珊珊;梁雅婷
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院防化研究院
技术研发日：2020.03.27
技术公布日：2020.06.05
