本发明属于分子生物学，免疫学，生物信息学领域，具体涉及过敏性疾病领域，特别涉及从猫中鉴定新型过敏原npc2。
背景技术：
过敏性疾病，又称变态反应性疾病，是一种常见的慢性炎症性疾病。随着工业化社会的发展，人们生活方式和生态环境的改变，其发病率目前约占世界人口的25％，且逐年递增，已严重影响人们生活质量，被世界卫生组织(who)列入21世纪重点防治的三大疾病之一。过敏性疾病，主要包括花粉症、过敏性鼻炎、过敏性支气管哮喘、过敏性皮炎、荨麻疹、血管神经性水肿等其他过敏反应，这些疾病主要由存在于空气中的过敏原引起，如花粉、屋尘螨、动物皮屑、蟑螂、真菌等。此外，一些常见的食品例如花生、大豆、牛奶、鸡蛋、鱼虾等也含有过敏原成分。
目前检测过敏原的常用方式为过敏原皮肤点刺试验、血清学检测、过敏原激发试验。而过敏性疾病的治疗主要包含避免接触过敏原、药物治疗、特异性免疫治疗(脱敏治疗)，其中脱敏治疗被who认为是唯一可根治过敏性疾病的治疗方法，其主要通过给予患者免疫原制剂以诱导免疫耐受。过敏原的诊断和治疗均主要依赖于过敏原的粗提物，但商品化的粗提物存在以下问题：①粗提物中过敏原组份的种类无法确定，其不但含有过敏原成分，还含有大量非特异性抗原；②粗提物中过敏原各组份含量不一导致其产生效力不同；③粗提物的来源、提取方法不同使得各批次之间存在差异。因此在检测过程中容易出现假阳性或阴性结果，在免疫治疗过程中会产出局部、系统、乃至致命的反应。基于以上问题，我们迫切需要分离和鉴定出过敏原各个组份，明确主要过敏原和次要过敏原及其过敏强度必不可少。随着分子克隆和基因工程技术的不断发展，通过克隆表达在生物、结构、免疫学方面与天然蛋白具有同等效力的重组过敏原蛋白，利用纯度高、性质单一的过敏原进行临床诊断和免疫治疗是当今过敏性疾病诊疗的发展趋势。
猫作为一种常见的家庭宠物，是室内吸入性过敏原的主要来源之一。猫过敏原可诱发多种严重程度不一的过敏反应，包括过敏性鼻炎、支气管哮喘、结膜炎等。迄今为止，猫中已有8种过敏原被who-iuis命名，分别为feld1，一个38kda的分泌球蛋白(uteroglobin)；feld2，一个69kda的血清白蛋白(serumalbumin)；feld3，一个11kda的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)；feld4，一个22kda的脂运载体蛋白(lipocalin)；feld5，一个400kda的免疫球蛋白a(immunoglobulina)；feld6，一个800-1000kda的免疫球蛋白m(immunoglobulinm)；feld7，一个17.5kda的脂质运载蛋白(vonebnerglandprotein)；feld8，一个24kda的latherin样蛋白(latherin-likeprotein)。这些过敏原主要分布在猫的的皮屑、唾液、毛发、血清以及尿液中。其中feld1能被90％的猫过敏患者的血清特异性ige识别，目前被认为是猫最主要的过敏原。但缺失feld1的猫皮毛提取物仍具有40％的过敏原活性，因此，其他猫过敏原和潜在过敏原对过敏患者仍起相当重要的作用。对于猫引发的过敏性疾病，现阶段最有效的方式是避免接触猫，但由于猫过敏原粘附能力强，易粘附于衣服和家具表面或吸附于小颗粒物表面(直径小于2微米)长期悬浮于空气中，从而被携带或传播到没有猫的公共环境中，因此防止接触猫过敏原在现实生活中较难实现。此外，猫和狗过敏原特征和生物学功能具有相似，因而存在交叉过敏活性。因此，分析单一过敏原组份的ige应答有利于提高特异性ige诊断的精确度和灵敏度，也可用于区分交叉反应过敏原致敏和天然过敏原致敏。脱敏治疗目前被认为是唯一可改变过敏性疾病病程的疗法。但传统依赖粗提物的脱敏治疗，周期长，易产生不良反应，患者依从性差。随着科学技术和猫过敏原组份深入研究，成分清晰且作用机理明确的新型过敏原疫苗有望成为给予猫粗提物疗法的替代方案，从而高效地预防和治疗猫过敏性疾病。
技术实现要素：
本发明目的在于鉴定一种来自猫的过敏原feliscatusnpcintracellularcholesteroltransporter2(cat-npc2)，提供cat-npc2天然蛋白的基因序列，提供一种基因优化的cat-npc2序列，提供一种以his作为标签融合表达重组cat-npc2以及其纯化的制备方法，探明npc2的过敏原活性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：猫过敏原npc2蛋白，所述蛋白的其氨基酸序列为seqidno.1，或与上述氨基酸序列至少有90％的同源性，其中，第1位～第19位的氨基酸为信号肽。
密码子优化猫过敏原npc2蛋白，蛋白是由seqidno.2所示核苷酸序列组成的蛋白质。
重组猫过敏原npc2蛋白，重组蛋白是由seqidno.3所示核苷酸序列组成的蛋白质。
重组猫过敏原npc2蛋白的制备方法，包括以下步骤：
利用trizol法提取猫皮毛中总rna逆转录合成cdna，根据ncbigenbank基因库预测的序列设计特异性引物，通过pcr合成cat-npc2天然基因序列seqidno.2；
对过敏原cat-npc2的天然基因序列进行密码子优化，得到优化后的cat-npc2序列seqidno.3；
通过将cat-npc2优化后的基因克隆到大肠杆菌pet28a表达载体上，再将获得的重组质粒pet28a-npc2转化大肠杆菌表达菌株bl21；
经iptg诱导胞内表达，收集菌体经超声破碎后采用ni-nta亲和层析纯化，透析复性得到高纯度重组cat-npc2蛋白。
猫过敏原npc2蛋白在制备用于治疗或预防猫过敏性疾病的药物组合物中的用途。
药物组合物，包括猫过敏原npc2蛋白。
进一步的，药物组合物为过敏原疫苗。
诊断试剂盒，包括seqidno.1的猫过敏原npc2蛋白或权利要求6的组合物，用于体外诊断猫过敏性疾病。
本发明利用分子生物学、细胞免疫学和生物信息学等技术鉴定分析猫的npc2蛋白为猫过敏原。对cat-npc2天然基因进行了密码子优化并构建可稳定表达过敏原cat-npc2的重组大肠杆菌，提供了一种制备重组cat-npc2的方法。同时通过免疫学实验证明cat-npc2和狗过敏原canf7存在交叉活性。新过敏原的鉴定一方面有利于提高过敏性疾病诊断的精确度和灵敏度，另一方面可通过制备过敏原疫苗用于过敏性疾病的脱敏治疗和预防。因此以上发明对临床诊断和治疗猫过敏患者均具有重要价值。
附图说明
图1是cat-npc2蛋白的pcr电泳图，最左侧m泳道为dna2000maker；1号泳道为cat-npc2天然蛋白pcr扩增产物。
图2是cat-npc2优化前后的cdna序列，以及其编码的氨基酸序列，其中第1位～第19位的氨基酸为信号肽。
图3a是rcat-npc2的诱导表达的sds-page电泳图，最左侧m泳道为蛋白分子maker；1号泳道为未iptg诱导重组e.coli菌液；2号泳道为iptg诱导重组e.coli菌液；3号泳道为菌体破碎液上清；4号泳道为菌体破碎液沉淀。
图3b是rcat-npc2经ni-nta亲和层析纯化后的sds-page电泳图，最左侧m泳道为蛋白分子maker；1-4号泳道为500mm咪唑洗脱下的rcat-npc2。
图4a是elisa法检测rcat-npc2与猫过敏患者血清中特异性ige的结合活性，110例猫过敏患者的血清中，28例显示ige对rcat-npc2呈阳性反应。
图4b是westernblot法验证rcat-npc2与猫过敏患者血清中特异性ige的结合活性。
图4c是竞争elisa方法测定rcat-npc2对猫粗提物结合猫过敏患者血清ige的抑制效率
图5是rcanf7对猫过敏患者血清ige结合rcat-npc2的抑制，在测定ige结合rcat-npc2前，用10μg/mlrcanf7(右侧)或pbs(左侧)预孵育rcat-npc2阳性反应血清。
图6是纯化复性后rcat-npc2和rcanf7通过圆二色谱进行二级结构分析的结果。
图7是预测软件分析cat-npc2蛋白的二级结构。
图8是cat-npc2和canf7的氨基酸序列比对，黑底为共有序列，白底黄色为保守序列。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些。
本发明提供一种猫过敏原npc2蛋白，氨基酸序列为seqidno.1，或与上述氨基酸序列至少有90％的同源性，其中，第1位～第19位的氨基酸为信号肽。
密码子优化猫过敏原npc2蛋白，蛋白是由seqidno.2所示核苷酸序列组成的蛋白质。
重组猫过敏原npc2蛋白，重组蛋白是由seqidno.3所示核苷酸序列组成的蛋白质。
并提供猫过敏原npc2蛋白在制备用于治疗或预防猫过敏性疾病的药物组合物中的用途。
提供包含过敏原npc2蛋白的药物组合物，药物组合物包括过敏原疫苗，过敏原疫苗包括dna疫苗、重组活菌疫苗和重组蛋白疫苗。
提供包含过敏原npc2蛋白的诊断试剂盒。
利用trizol法提取猫皮毛中总rna逆转录合成cdna，通过ncbigenbank基因库预测的序列(ncbireferencesequence:xm_003987833.5)设计特异性引物，上游引物如seqidno.4所示，下游引物seqidno.5所示。以25ul的体系进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察后，切胶回收纯化后连接到pce2ta/blunt-zero质粒载体上，转化至e。colijm109克隆菌中，通过抗氨苄筛选，挑选含重组表达质粒的阳性菌落，经菌落pcr测序验证得到cat-npc2天然蛋白序列seqidno.2(genbank登录号mn737596)。克隆得到的cat-npc2基因由594个碱基组成，其中开放阅读框为450个碱基(含终止子)，编码150个氨基酸，其中，第1位～第19位的氨基酸为信号肽，理论分子量为14.4kda。
分析大肠杆菌的密码子偏好性，gc含量等参数对过敏原cat-npc2的天然基因序列seqidno.2进行密码子优化，得到可以在大肠杆菌内高效表达的基因，其基因序列为seqidno.3。
将优化后的cat-npc2基因(如seqidno.3所示)克隆到大肠杆菌pet28a表达载体(融合his标签)的saci和xhoi位点之间，获得重组质粒pet28a-npc2。
将重组质粒pet28a-npc2转化大肠杆菌表达菌株bl21(de3)，挑选单克隆菌落接种于含50ug/ml卡那霉素的lb液体培养基中过夜培养，次日按照1％的接种量接种于新鲜培养液中，37℃摇菌至od600为0.5后加入终浓度为1mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，以37℃160转/分钟诱导表达8小时，4℃收集菌体后用菌体裂解平衡液lebuffer(50mmnah2po4，300mmnacl，ph8.0)重悬，经超声破碎后离心收集上清和沉淀。his融合蛋白cat-npc2的理论分子量约为18.7kda。sds-page电泳验证his融合蛋白cat-npc2分子量大小与理论值相符且以包涵体表达。
将包涵体用含尿素的lebuffer溶解后离心收集上清液，并上样于已用含尿素的缓冲液平衡好的ni-nta琼脂糖凝胶柱上，先用洗涤缓冲液(100mmnah2po4，10mmtris，8murea，10mmimidazole，ph8.0)洗涤2个柱体积，去除非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(100mmnah2po4，10mmtris，500mmimidazole，8murea，ph8.0)竞争洗脱下融合蛋白his-cat-npc2。利用尿素梯度和氧化还原复性液(0.1mtris，0.5ml-arginine，1mmoxidizedglutathione，1mmedta，5mmreducedglutathione，ph8.5)复性具有生物活性的重组cat-npc2蛋白(rcat-npc2)。sds-page分析纯度约90％～95％。
使用elisa法测定rcat-npc2与猫过敏患者的血清ige反应。用10μg/mlrcat-npc2包被聚苯乙烯板，100μl每孔，4℃过夜。次日洗涤后，bsa封闭2小时。加入10倍稀释的猫过敏原患者血清，37℃下孵育2小时。洗涤后，加入100μl的抗人ige过氧化物酶37℃孵育1小时，洗涤后加入显色液30分钟后终止，酶标仪od450检测。110例猫过敏患者的血清中，28例显示ige对rcat-npc2呈阳性反应。
westernblot进一步证明了rcat-npc2与猫过敏患者血清中特异性ige的结合活性。利用sds-page电泳分离rcat-npc2蛋白后转移至pvdf膜上，牛奶封闭2小时后，用10倍稀释的猫过敏患者血清4℃过夜孵育。次日洗涤后，加入抗人ige过氧化物酶室温孵育1小时，洗涤后进行特异性检测。
竞争elisa方法测定rcat-npc2蛋白对猫粗提物结合猫过敏患者血清ige的抑制效率。用10μg/ml猫粗提液包被聚苯乙烯板，100μl每孔，4℃过夜。次日bsa封闭2小时。将猫粗提液和rcat-npc2制成若干稀释液，37℃下与10倍稀释的血清(80号&92号)预孵育1小时。然后转移血清至孔板中37℃再孵育1小时。洗涤后，加入100μl的抗人ige过氧化物酶37℃孵育1小时，洗涤后加入显色液30分钟后终止，酶标仪od450检测。通过公式计算结果表明rcat-npc2蛋白对猫粗提物结合猫过敏患者血清ige的最大抑制率在14％～17％。
利用westernblot法，将纯化的rcat-npc2蛋白吸附于pvdf固相载体上，用经rcanf7(10μg/ml)或pbs4℃过夜孵育的猫过敏患者血清测定ige的结合。结果显示9/10份血清中rcanf7几乎完全抑制ige结合rcat-npc2蛋白，表明rcat-npc2和rcanf7存在交叉致敏活性。
通过psipred、predictprotein和netsurfpv1.1在线软件分析重组cat-npc2蛋白的二级结构，综合结果表明cat-npc2存在9个β折叠，分别为cat-npc2氨基酸序列seqidno.1的第22-26位,第34-40位，第48-50位，第54-63位，第70-78位，第81-85位，第106-114位，第122-132位，第137-148位。
以上虽然已结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。本领域技术人员可在不脱离本发明的技术思想和主旨的范围内对这些实施方式进行适当的变更，而这些变更后的实施方式显然也包括在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120>一种来自猫的新过敏原npc2
<160>5
<210>seqidn0.1
<211>149
<212>prt
<213>猫（felisdomesticus）
<400>1
metargserleualavalalaphevalleuleualaleuseralaser
151015
glyleualagluprovalilephelysaspcysglyserglyphegly
202530
valilelysgluleuasnvalserprocysprothrglnprocyslys
354045
leuhislysglyglnsertyrservalasnvalthrphethrserasn
505560
valserserglnglyserlysalaleuvaltyrglyileleumetgly
65707580
valalavalpropheproileproglualaaspglycyslyssergly
859095
ileasncysproileglnglnglylysthrtyrsertyrleuasnlys
100105110
leuprovallysasnglutyrproserilelysvalmetvallystrp
115120125
glnleuleuglyasplysgluglnasnleuphecystrpgluilepro
130135140
valglnileglugly
145
<210>seqidn0.2
<211>839
<212>dna
<221>cds
<222>(120)...(566)
<400>2
cctggttgctggtgagagtcgcctgacctggctcctccccaggcccgcccgggcaggttt60
atcttgtgactgaggcggtcgcttcttccttcttcgtgcttggaacctgttcagctgcg119
atgcgttccctggccgtcgcgttcgtgctcctggcgctcagcgcctcc167
metargserleualavalalaphevalleuleualaleuseralaser
51015
ggcctcgccgagccagtgattttcaaggactgcggttctgggtttgga215
glyleualagluprovalilephelysaspcysglyserglyphegly
202530
gttataaaggagctgaatgtgagcccatgccccacccagccctgcaaa263
valilelysgluleuasnvalserprocysprothrglnprocyslys
354045
ttgcacaaaggccagtcttacagtgtcaatgtcaccttcaccagtaat311
leuhislysglyglnsertyrservalasnvalthrphethrserasn
505560
gtttcatctcagggtagcaaagctttggtgtatggcatcctgatgggc359
valserserglnglyserlysalaleuvaltyrglyileleumetgly
65707580
gtagcagttccctttcccattcctgaggctgatggttgtaagagtgga407
valalavalpropheproileproglualaaspglycyslyssergly
859095
atcaactgccccatccagcaaggcaagacctatagctacctgaataaa455
ileasncysproileglnglnglylysthrtyrsertyrleuasnlys
100105110
ctaccagtgaagaatgaatacccctctataaaagtgatggtgaagtgg503
leuprovallysasnglutyrproserilelysvalmetvallystrp
115120125
cagcttctgggcgacaaggaacagaatctcttctgctgggagatccca551
glnleuleuglyasplysgluglnasnleuphecystrpgluilepro
130135140
gtgcagattgaaggctagaggtgctaatgccagcatgttgcgtgggggtgagaga606
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145
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acagctgtttggtgcctctcagtctccagaaggttccagaccctgtttcctgagagctca726
gaactattgcccttgtagtatctttggtgaagggttggagggaagaagagagggggagag786
aggcacggatttaatttgtcttcagtattttttgcgttggaaaaaggaaggtc839
<210>seqidn0.3
<211>450
<212>cds
<400>3
atgcgttctctggctgttgctttcgttctgctggctctgtctgcttctggtctggctgaa60
ccggttatcttcaaagactgcggttctggtttcggtgttatcaaagaactgaacgtttct120
ccgtgcccgacccagccgtgcaaactgcacaaaggtcagtcttactctgttaacgttacc180
ttcacctctaacgtttcttctcagggttctaaagctctggtttacggtatcctgatgggt240
gttgctgttccgttcccgatcccggaagctgacggttgcaaatctggtatcaactgcccg300
atccagcagggtaaaacctactcttacctgaacaaactgccggttaaaaacgaatacccg360
tctatcaaagttatggttaaatggcagctgctgggtgacaaagaacagaacctgttctgc420
tgggaaatcccggttcagatcgaaggttag450
<210>seqidn0.4
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gcaggtttatcttgtgactgagg23
<210>seqidn0.5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
aggttagactcgatttctcccg22
1.猫过敏原npc2蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列为seqidno.1，或与上述氨基酸序列至少有90％的同源性，其中，第1位～第19位的氨基酸为信号肽。
2.密码子优化猫过敏原npc2蛋白，其特征在于：所述蛋白是由seqidno.2所示核苷酸序列组成的蛋白质。
3.重组猫过敏原npc2蛋白，其特征在于：所述重组蛋白是由seqidno.3所示核苷酸序列组成的蛋白质。
4.重组猫过敏原npc2蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
利用trizol法提取猫皮毛中总rna逆转录合成cdna，根据ncbigenbank基因库预测的序列设计特异性引物，通过pcr合成cat-npc2天然基因序列seqidno.2；
对过敏原cat-npc2的天然基因序列进行密码子优化，得到优化后的cat-npc2序列seqidno.3；
通过将cat-npc2优化后的基因克隆到大肠杆菌pet28a表达载体上，再将获得的重组质粒pet28a-npc2转化大肠杆菌表达菌株bl21；
经iptg诱导胞内表达，收集菌体经超声破碎后采用ni-nta亲和层析纯化，透析复性得到高纯度重组cat-npc2蛋白。
5.权利要求1的猫过敏原npc2蛋白在制备用于治疗或预防猫过敏性疾病的药物组合物中的用途。
6.药物组合物，其特征在于：包括权利要求1的猫过敏原npc2蛋白。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为过敏原疫苗。
8.诊断试剂盒，其特征在于：包括seqidno.1的猫过敏原npc2蛋白或权利要求6的组合物，用于体外诊断猫过敏性疾病。
技术总结