本发明涉及基因表达技术领域，具体涉及一种将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法。
背景技术：
黑色素瘤分化相关基因-7/白细胞介素24(mda-7/il-24)编码一种206个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约23.8kda。il-24具有广谱而特异的抗瘤活性，能够在体内外特异性地抑制多种肿瘤生长，并选择性诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞几乎没有影响。同时，il-24具有刺激机体抗肿瘤免疫反应的能力，它不仅能刺激外周血单核细胞分泌产生炎性细胞因子，如il-6、il-1β、il-12、gm-csf和ifn-γ等，还能增加cd3 cd8 t细胞数量，从而触发机体产生抑制原发部位肿瘤细胞和转移部位肿瘤细胞的免疫反应，这是p53和rb等抑癌基因所不具备的特点。而且，il-24可以增强肿瘤细胞放化疗敏感性，与靶向药物、化疗药物或放疗联用可产生叠加或协同的抗瘤效果。正因为上述的特点，il-24被称为治疗肿瘤的“神奇子弹”，对其进行深入研究不仅具有重要的理论意义，而且具有重大的临床应用价值。
在将il-24用于临床肿瘤治疗研究中，美国introgentherapeutics公司率先开发了il-24重组腺病毒—“ingn241”。2002年该公司公布的ⅰ期临床试验结果表明ingn241对28位实体瘤(乳腺癌、肺癌和结肠癌)患者的治疗效果良好。但是，腺病毒的缺陷(如靶向性、有效清除、生物安全性等问题)限制了它的发展，从2005年开始的ⅱ期临床试验始终未见报告，提示安全问题可能是主要原因之一。与腺病毒相比，蛋白类的抗癌药物更为安全。同传统化学合成药物相比，蛋白类药物已成为生物技术新药的主要品种，该类药物与体内正常生理物质十分接近，药理活性高、副作用小、用量少、生物活性强、疗效好等特点。
目前rhil-24在大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中都获得表达，但在不同宿主细胞中获得的il-24基因工程蛋白的生物学活性差异显著。大肠杆菌和酵母表达的rhil-24同样具有免疫调节作用，但所用剂量大(单位是μg/ml)，而在hek293细胞分泌表达的rhil-24剂量单位是ng/ml；同样，在rhil-24抑制黑色素瘤细胞体外增殖实验中，大肠杆菌表达的rhil-24在μg/ml水平才表现出活性，而哺乳动物细胞分泌表达的rhil-24的有效浓度仅为在5ng/ml。
用哺乳动物细胞表达rhil-24，多用重组质粒pcep4-il-24构建稳定表达的hek293细胞株，或是用重组腺病毒ad-il-24感染人永生化正常细胞或肿瘤细胞。利用flp-in系统构建了表达rhil-24的cho定点整合细胞株fcho/il-24，相同细胞密度和培养时间下，rhil-24表达水平远高于三株随机整合的hek293细胞株(hek293/psectag2a-il-24,hek293/pcdna3.1myc/his-il-24andhek293/pcep4-il-24)。定点整合系统构建稳定高产的细胞株，不仅能提高产物比生成速率，而且有利于后续大规模培养过程优化。通常外源基因是随机整合于宿主细胞染色体上，容易导致插入的染色体区域“位置效应”，从而影响基因表达水平；而定点整合系统将外源基因定向插入于转录活跃区，不仅能直接获得基础表达水平较高的克隆，而且因为位点固定使加压扩增程序重复性更好，能够大大缩短构建重组蛋白高表达细胞株的周期和工作量(细胞定点整合高效表达系统的建立)。
尽管如此，fcho/il-24细胞是用含10％血清的f12培养基贴壁培养的，其分泌表达rhil-24水平仍然有限。在培养基中添加刺激物也是一个提高工程细胞株表达目的蛋白水平的有效方法，其中最常用的是丁酸钠。丁酸钠是一种短脂肪酸链，作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，通过降低酶活性改变哺乳动物细胞染色质结构，进而通过组蛋白的乙酰化和去乙酰化调节基因的转录水平。1973年就发现它能够显著提高cho细胞中重组蛋白表达水平，至今已有许多成功例子，如干扰素γ]、组织型纤溶酶原激活剂t-pa、红细胞生成素epo、血友病因子vwf、促血小板生成素tpo、干扰素β、催乳素prl、促甲状腺素tsh、八因子及一些抗体等。丁酸钠可以刺激cho细胞和人内皮细胞，在不同培养条件下(贴壁培养和无血清悬浮培养)提高t-pa表达水平。
综上所述，il-24对多种肿瘤细胞体内外增殖具有特异的抑制作用，对正常细胞几乎没有毒性。哺乳动物细胞表达的rhil-24活性远高于细菌表达的，但是表达水平仍然极低。针对哺乳动物细胞表达rhil-24研究中，目前尚未有使用丁酸钠来提高工程细胞株表达rhil-24水平的相关技术研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种以表达rhil-24的cho定点整合细胞株fcho/il-24为研究对象，分析丁酸钠对工程细胞株分泌表达rhil-24水平的影响，为筛选无血清培养基添加剂提供实验数据的用丁酸钠促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，以解决上述背景技术中存在的至少一项技术问题。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：
本发明提供一种将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，包括对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养一定时间后，将培养基更换为含有丁酸钠nabu的培养基继续培养。
优选的，所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养为10％血清贴壁培养。
优选的，所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养为0.5％血清贴壁培养。
优选的，所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养为0.5％血清悬浮培养。
优选的，所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养的培养基为dmem/f12培养基。
优选的，所述培养基中补充有100μg/ml的双抗和50μg/ml的潮霉素。
优选的，所述丁酸钠在培养基中的浓度为0.25-2mmol/l，更换后的培养基中血清含量不变。
优选的，进行10％血清贴壁培养时，96孔板中每孔接种细胞数为650个，6孔板中每孔接种细胞数为1×105个。
优选的，进行0.5％血清贴壁培养时，96孔板中每孔接种细胞数为1500个，6孔板中每孔接种细胞数为1×105个。
优选的，进行0.5％血清悬浮培养时，摇瓶接种体积为20ml，摇床转速119rpm，孵箱条件为37℃、5％co2，细胞接种密度为5×105个细胞/ml。
本发明有益效果：nabu可以提高cho细胞分泌表达外源蛋白的水平，促进工程细胞分泌表达rhil-24的水平，促使工程细胞发生g0/g1期阻滞，并可改变贴壁培养条件下细胞的代谢活力；将nabu作为细胞株无血清培养基的添加剂，在高密度的悬浮培养中，进一步提高细胞株分泌表达rhil-24的水平，不仅为fcho/il-24细胞的大规模培养提供实验数据，同时也可为用哺乳动物细胞表达其他基因工程蛋白提供借鉴。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例所述的10％血清贴壁培养中加入不同浓度的丁酸钠对细胞生长影响显微扫描图。
图2为本发明实施例所述的在培养基中加入丁酸钠后细胞生长状态变化曲线示意图。
图3为本发明实施例所述的10％和0.5％血清贴壁培养下，不同浓度丁酸钠细胞培养上清中rhil-24浓度(**p<0.01)曲线图。
图4为本发明实施例所述的10％和0.5％血清贴壁培养条件下，不同浓度丁酸钠处理后的细胞比产率变化曲线图。
图5为本发明实施例所述的0.5％血清悬浮培养条件下使用nabu处理的第3天，2mm丁酸钠浓度下上清中的il-24浓度曲线示意图。
图6为本发明实施例所述的为0.5％血清悬浮培养条件下，nabu处理的第3天，比产率随丁酸钠浓度的变化曲线示意图。
图7为本发明实施例所述的10％血清贴壁培养下丁酸钠对细胞g0/g1期的影响结果示意图。
图8为本发明实施例所述的0.5％血清贴壁培养下丁酸钠对细胞g0/g1期的影响结果示意图。
图9为本发明实施例所述的不同浓度丁酸钠对细胞凋亡的影响结果示意图。
图10为本发明实施例所述的不同浓度丁酸钠处理后的上清液中葡萄糖浓度示意图。
图11为本发明实施例所述的不同浓度丁酸钠处理后的上清液中乳酸浓度示意图。
图12为本发明实施例所述的不同浓度丁酸钠处理后的上清液中氨浓度示意图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件和/或它们的组合。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在本专利的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为便于理解本发明，下面结合附图以具体实施例对本发明作进一步解释说明，且具体实施例并不构成对本发明实施例的限定。
本领域技术人员应该理解，附图只是实施例的示意图，附图中的部件并不一定是实施本发明所必须的。
实施例
本发明实施例提供一种使用丁酸钠促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，对分泌表达rhil-24的定点整合工程细胞株fcho/il-24进行10％血清贴壁、0.5％血清贴壁和0.5％血清悬浮培养的基础上，用不同终浓度(0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l)丁酸钠处理细胞株。
分别用mtt、流式检测、elisa等方法检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和rhil-24的表达水平；并检测丁酸钠处理对10％和0.5％血清贴壁培养细胞上清中的葡萄糖、乳酸和氨浓度的影响。
结果：首先，不同浓度nabu都能够提高工程细胞株分泌表达rhil-24水平，用1mmol/l的nabu处理3天后，在10％血清浓度贴壁培养、0.5％血清浓度贴壁培养和0.5％血清悬浮培养条件下，细胞株表达rhil-24水平分别提高119.94±1.5％(**p<0.01)，57.49±2.4％(**p<0.01)和20.17±3.03％(*p<0.05)。其次，丁酸钠对细胞株增殖具有时间和剂量依赖的抑制作用，在同前的培养条件和丁酸钠处理条件下，对细胞增殖的抑制率分别为9±3％(*p<0.05)，13±2％(**p<0.01)和12±2％(**p<0.01)。但是对细胞凋亡没有明显的促进作用，2mmol/l的丁酸钠处理3天仅使10％血清贴壁培养细胞的凋亡率增加1.84±1.06％(p>0.05)。然而，丁酸钠能促使细胞发生g0/g1期阻滞，1mmol/l处理3天，10％和0.5％血清贴壁培养细胞的g0/g1期分别增加11.3±0.5％(**p<0.01)和15.0±2.6％(**p<0.01)。最后，以不添加丁酸钠的组为对照，随着丁酸钠浓度增高，10％和0.5％血清贴壁培养细胞上清中的葡萄糖浓度升高，乳酸和氨的浓度降低，显著性具有统计学意义(**p<0.01)。
结论：丁酸钠处理能够显著提高工程细胞株fcho/il-24分泌表达rhil-24的能力。
本发明实施例在cho定点整合工程细胞株的培养基中加入丁酸钠后，对细胞分泌物及细胞生长状态的研究实验方法，具体如下：
实验材料：丁酸钠(b5887-250mg)和mtt(m2128-250mg)购自sigma公司；il-24的elisa试剂盒(f01531)购自上海西唐公司；葡萄糖检测试剂盒(e1010)购自北京普利莱基因技术有限公司；乳酸检测试剂盒(a019-2)和尿素氮试剂盒(c013-2)购于南京建成生物工程研究所；悬浮培养的摇瓶(431143)购自康宁公司。
细胞培养：细胞株的培养条件有三种，10％血清贴壁培养、0.5％血清贴壁培养和0.5％血清悬浮培养，后两种是在10％血清贴壁的常规培养基础上驯化的，培养基均为dmem/f12，向培养基中补充100μg/ml双抗和50μg/ml潮霉素。悬浮培养时，摇瓶接种体积为20ml，摇床转速119rpm。孵箱条件为37℃，5％co2。
丁酸钠处理：贴壁培养时，在10％和0.5％血清条件下，96孔板中每孔接种细胞数分别为650和1500个；6孔板中，每孔接种1×105个细胞。24h后，换为含不同浓度的丁酸钠(0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l)的培养基，血清浓度不变。如果实验超过3天，每3天更换培养基，保持丁酸钠浓度不变。悬浮培养时，细胞接种密度为5×105个细胞/ml，同时加入丁酸钠处理，终浓度同前，连续培养过程中不换液。
细胞活力检测：96孔板中进行，每种处理至少六孔；细胞用不同浓度丁酸钠处理一定时间后，每孔加入20μlmtt，4h后，小心吸出孔板中的上清；每孔加入150μldmso，充分溶解，用酶标仪检测od490值。将测得的od值减去空白孔od值，删除6个数值中的最大值和最小值，求平均值。
rhil-24浓度的检测：按照elisa试剂盒说明书检测细胞培养上清中的rhil-24浓度。首先，用蒸溜水稀释10×样本稀释液和20×洗涤液。其次，用1×样本稀释液配制不同浓度il-24蛋白的标准溶液(0、31.25、62.5、125、250、500、1000和2000ng/ml)；将细胞培养上清稀释5-20倍。之后，向酶标板中加入标准品或待测样品100μl，37℃反应40min，用洗涤液充分洗涤3次，每孔加洗涤液200μl，滤纸上拍干。然后，向每孔中加入100μl第一抗体工作液，37℃反应20min，同前洗板。再向每孔加入底物工作液100μl，37℃暗处反应15min。最后，向每孔中加入100μl终止液，混匀，30min内用酶标仪测定450nm处吸光值。根据标准品的od值拟合标准曲线，并计算样品中的il-24浓度。标准曲线od值在0.1-3.0之间，样品的od值要在标准曲线范围之内。
细胞周期检测：用2ml培养基在6孔板中接种1×105个细胞，37℃、5％co2孵箱中培养24h；更换含有不同终浓度nabu(0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l)的培养基。nabu处理3天后，收集每孔上清，用不含edta的胰酶消化细胞，用各孔收集的上清终止消化，1000rpm离心5min收集细胞。加入1mlpbs轻柔吹打重悬细胞，离心洗涤两次。用300μlpbs重悬细胞，滴入700μl预冷的无水乙醇进行固定，混匀，-20℃保存。检测前，1000rpm离心5min，弃去上清，同前用pbs离心洗涤两次；加入300μlpi(50μg/ml)和10μlrnasea(10mg/ml)，37℃避光孵育30min后上机检测。
细胞凋亡检测：铺板细胞数和丁酸钠处理同细胞周期检测；pbs离心洗涤收集的细胞后，用200μlbindingbuffer重悬后，加入5μlannexinv和5μlpi，避光孵育30min。流式检测前，每个样品补加300μlbindingbuffer。
上清中代谢物检测：样品为mtt实验中收集的细胞培养上清，按照试剂盒说明书，检测上清中的葡萄糖、乳酸和氨浓度。葡萄糖浓度检测时，工作液(试剂r1：试剂r2＝4:1)当天使用或4℃保存一周；配制不同浓度的葡萄糖标准溶液(2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μmol/l)，用蒸馏水作空白对照；96孔板中，加入标准品或待测样品5μl后，加入工作溶液195μl，37℃反应20min，酶标仪测od550值。氨浓度检测时，倍比稀释法配制氯化铵标准溶液(2.5、1.25和0.625mmol/l)；向离心管加入标准品或样品20μl，然后加入酚显色剂和碱性次氯酸钠各1ml，混匀后37℃水浴10min；取出300μl反应液加入96孔板中测定od640值。乳酸浓度检测时，1:100稀释的酶贮备液现用现配；配制的显色剂4℃可保存2周。先向离心管中加入需要检待测样品20μl，然后加入酶工作液和显色剂各1ml，37℃水浴10min，加入2ml终止液，从每个离心管中取出300μl加入96孔板中，测od530值。将标准曲线拟合为经验公式，用于计算样品浓度。
统计学分析：使用excel2016软件对数据进行统计分析，在mtt、细胞计数、细胞流式检测等实验中，使用标准差函数计算组内标准差，t检验函数计算组间差异显著性；elisa实验数据和上清代谢物检测数据采用origin2018软件进行标准曲线拟合和样品浓度计算。在显著性检验中，*p<0.05表示具有显著性差异，**p<0.01表示具有极显著性差异。
在本发明实施例中，上述实验检测分析结果具体如下：
一、丁酸钠抑制工程细胞的体外增殖
nabu可以提高cho细胞分泌表达外源蛋白的水平，但对细胞增殖具有抑制作用。丁酸钠抑制不同培养条件下工程细胞fcho/il-24的体外增殖如图1和图2所示。图1为10％血清贴壁培养条件下，nabu浓度越高，细胞形态越差，细胞密度越低。图2(a)、(c)、(e)分别为不同培养条件下(10％血清贴壁培养、0.5％血清贴壁培养和0.5％血清悬浮培养)下不同终浓度nabu(0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l)处理7天的细胞生长曲线。图2(b)、(d)和(f)分别不同种浓度nabu对不同培养条件下的细胞fcho/il-24的相对活力具有明显的抑制作用，细胞培养条件分别同(a)、(c)、(e)。
本实验中，设置了6个丁酸钠浓度梯度，即0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l。对于10％血清贴壁培养的fcho/il-24细胞，随着nabu浓度增加，细胞密度降低，丁酸钠浓度为1或2mmol/l时，细胞形态变化明显，死亡细胞显著增多，如图1所示。但即使在nabu作用下，从第4天开始进入大量增殖的指数期，在第6天达到饱和，进入平台期，如图2(a)所示。从图2(b)可以看出，同一nabu浓度下，随着培养时间延长，相对细胞活力逐渐下降；在相同时间点，随着nabu浓度增加，相对细胞活力也是下降的。
在0.5％血清浓度贴壁培养条件下，nabu对细胞增殖的抑制作用与10％血清的相似，如图2(c)、图2(d)所示。在0.5％血清悬浮培养条件下，第2天细胞即进入指数增长期，第4天达到最高值，随后因为没有换液而快速衰亡，图2(e)所示。同样，nabu对悬浮培养细胞的相对活力也具有抑制作用，图2(f)所示。以1mmol/l的nabu作用3天为例，不同培养条件下(10％血清贴壁培养，0.5％血清贴壁培养和0.5％血清悬浮培养)对细胞增殖的抑制率分别为9±3％(*p<0.05)，13±2％(**p<0.01)和12±2％(**p<0.01)。结果表明：nabu对工程细胞fcho/il-24体外增殖具有剂量和时间依赖的抑制作用。
二、丁酸钠促进工程细胞分泌表达rhil-24的水平
如图3至图6所示，为确定nabu处理对工程细胞分泌表达rhil-24的影响，对不同培养条件下(10％和0.5％血清贴壁培养，0.5％血清悬浮培养)细胞培养上清中rhil-24浓度进行了检测。对于贴壁培养，检测的是第3天的培养上清。图3中，10％和0.5％血清贴壁培养下，不同浓度丁酸钠显著提高细胞培养上清中rhil-24浓度(**p<0.01)。图4中，10％和0.5％血清贴壁培养条件下，不同浓度丁酸钠处理后的细胞比产率升高显著(**p<0.01)。图5中，0.5％血清悬浮培养条件下，nabu处理的第3天，2mm丁酸钠浓度下上清中的il-24浓度达到最高值。图6中，为0.5％血清悬浮培养条件下，nabu处理的第3天，比产率随丁酸钠浓度的变化曲线。
elisa结果表明，无论是10％或者0.5％血清贴壁培养条件下，尽管细胞增殖受到抑制，但是rhil-24的分泌表达水平都明显提高了。
10％血清浓度培养的，rhil-24浓度变化与nabu浓度正相关；在丁酸钠终浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l时，rhil-24浓度分别为1.62±0.05、1.50±0.50、1.93±0.80、2.67±0.55、3.56±0.09％和4.21±0.65ng/ml。
0.5％血清浓度培养时，nabu为0.25-2mmol/l时进入最高值的平台期，平均值为2.34±0.17ng/ml，如图3所示。随着nabu浓度增加，对应的细胞比产率也是提高的，变化趋势与rhil-24浓度一致，如图4所示。虽然在2mmol/l丁酸钠处理时，细胞的表达水平最高，但是结合mtt结果，2mmol/l的nabu处理3天，对细胞增殖的抑制率为18±4％(10％血清)和20±5％(0.5％血清)，而nabu浓度为1mmol/l时，抑制率分别为9±3％和13±2％。
为了保持较高的相对细胞活力，以便后续增殖，同时rhil-24浓度也处于最高值，在10％与0.5％血清浓度贴壁培养条件下，选择nabu处理的最适条件是：终浓度1mmol/l，作用3天。
在0.5％血清悬浮培养条件下，使用不同浓度的丁酸钠(0、0.125、0.25、0.5、1和2mmol/l)处理3天，上清中的rhil-24浓度随着丁酸钠浓度的增加而增加，分别为3.67±0.41，3.67±0.23，3.86±0.26，3.83±0.26，4.39±0.15，4.80±0.30ng/ml，如图5所示。结合2mmnabu处理3天对细胞的抑制率只有12±1％，选择悬浮培养条件下nabu的处理条件为：2mmol/l，作用3天。
三、丁酸钠促使工程细胞发生g0/g1期阻滞
如图7至图8所示，为了分析nabu对工程细胞贴壁培养条件下对细胞周期的影响，在6孔板每孔铺1×105个细胞，分别用含10％和0.5％血清的dmem/f12培养基。不同终浓度nabu处理3天后进行流式检测。在两种血清浓度下，g0/g1期细胞均随着nabu浓度的增加而显著增多。图7为10％血清条件下的流式结果，随着nabu浓度提高，g0/g1期比例逐渐增加，s期比例降低，g2/m期比例变化不明显。图8为0.5％血清条件下的流式结果，随着nabu浓度提高，g0/g1期比例逐渐增加，s期比例降低，g2/m期比例变化不明显，与10％血清浓度下变化一致。
10％血清浓度下，随着nabu浓度的升高(0.125-2mmol/l)，g0/g1期细胞比例从对照组的37.60±3.75％，逐渐上升到丁酸钠2mmol/l时的55.02±5.46％，增长率为46±8％(**p<0.01)。而0.5％血清浓度下，对照组g0/g1期细胞比例为46.06±1.37％，2mmol/l的nabu实验组为65.46±1.97％，增长率42±8％(**p<0.01)。
而s期的变化与g0/g1期相反，即nabu终浓度越高，s期细胞比例越低。以nabu终浓度2mmol/l为例，10％血清浓度下，实验组s期细胞比例为25.38±5.46％，而对照组为41.23±6.76％，降低38±14％(**p<0.01)；0.5％血清浓度下，实验组为16.49±1.16％，对照组为30.21±3.70％,降幅高达45±11％(**p<0.01)。
整体上看，nabu浓度相同时，在0.5％血清培养条件下，对照组细胞的g0/g1期阻滞高于10％血清培养条件的，提示血清浓度降低能促进g0/g1期阻滞；而s期阻滞明显低于10％血清的。细胞周期这样的变化，可能是低血清浓度抑制细胞增殖的一个重要原因。
另外，两种血清浓度下，随着nabu浓度的增加，g2/m期细胞比例略有降低，但变化幅度不大。10％血清浓度下，对照组为21.17±6.85％，nabu终浓度2mmol/l的实验组为19.59±8.78％；0.5％血清浓度下，对照组和实验组分别为23.73±2.97％和18.05±1.53％。结合elisa结果，说明g0/g1期比例增加可能与蛋白表达水平提高相关。
四、丁酸钠对工程细胞凋亡的促进作用不显著
为了分析nabu对工程细胞凋亡的影响，在6孔板每孔铺1×105个细胞，分别用含10％和0.5％血清的dmem/f12培养基，不同终浓度nabu处理3天后进行annexin-v染色和流式检测。图9表明，nabu会促使工程细胞发生凋亡，随着nabu浓度从0-2mmol/l增加，凋亡细胞从对照组的4.63±2.02％，依次升高为4.70±1.24％、4.96±1.54％、5.41±2.01％、6.47±3.08％和7.21±3.29％。但是变化不显著(p>0.05)，远远低于mtt实验中nabu对细胞增殖的抑制率，说明细胞活力降低，更多源自细胞周期的g0/g1期阻滞，而不是细胞凋亡。图9中，随着nabu浓度增加，细胞凋亡率有所增加，但不显著(p>0.05)。
五、丁酸钠处理会改变贴壁培养条件下细胞的代谢活力
用不同终浓度的nabu处理3天后，用试剂盒检测10％和0.5％血清贴壁培养条件下，细胞培养上清中葡萄糖、乳酸和氨的浓度。不同血清浓度培养条件下，葡萄糖、乳酸和氨浓度变化趋势分别一致，即随着nabu终浓度升高到2mm，实验组细胞培养上清中的葡萄糖浓度显著升高(**p<0.01)，而乳酸和氨浓度均显著降低(**p<0.01)。葡萄糖作为细胞代谢的供能分子，细胞增殖越旺盛，消耗越快，上清中的浓度就会越低；正因为nabu浓度越高，对工程细胞株体外增殖能力的抑制作用越强，因而葡萄糖的消耗就越少，使得上清中葡萄糖浓度越高。而乳酸和氨均为细胞代谢的产物，细胞培养上清中浓度变化规律，与葡萄糖正好相反。与10％血清培养条件相比，相同的nabu浓度下，0.5％血清浓度下上清中的葡萄糖浓度更高，乳酸和氨浓度更低，说明降低血清和添加nabu都会导致细胞的代谢水平下降。
如图10所示，丁酸钠终浓度越高，培养上清中的葡萄糖浓度越高。如图11所示，丁酸钠浓度越高，上清中乳酸浓度越低。如图12所示，丁酸钠浓度越高，上清中氨浓度越低。
综上所述，本发明实施例中，在构建稳定分泌表达rhil-24的定点整合工程细胞株fcho/il-24基础上，分析了不同终浓度nabu(0、0.125、0.25、0.5、1、2mm)对不同培养条件下(10％血清贴壁培养，0.5％血清贴壁培养和0.5％血清悬浮培养)fcho/il-24细胞增殖能力，表达rhil-24水平，细胞周期，细胞凋亡和代谢物浓度等的影响。
不同浓度nabu都能够提高工程细胞株分泌表达rhil-24水平，用1mmol/l的nabu处理3天后，在10％血清浓度贴壁培养，0.5％血清浓度贴壁培养和0.5％血清悬浮培养条件下，细胞株表达rhil-24水平分别提高119.94±1.5％(**p<0.01)，57.49±2.4％(**p<0.01)和20.17±3.03％(**p<0.01)。10％血清贴壁培养条件下，丁酸钠终浓度为2mmol/l处理3天时，对工程细胞fcho/il-24增殖的抑制率为18±4％，而培养上清中rhil-24浓度为4.2ng/ml；而用1mmol/l处理3天，细胞增殖的抑制率为9±3％，培养上清中rhil-24浓度为3.6ng/ml。
因此，用1mmol/l的nabu处理3天作为贴壁培养的最适条件。而在0.5％血清悬浮培养条件下，活细胞密度变化与丁酸钠和培养时间都有相关性，结合rhil-24浓度变化，用2mmol/l丁酸钠处理3天作为悬浮培养的最适合条件。
用流式细胞仪检测结果表明，在相同时间点，nabu浓度越高，细胞发生g0/g1期阻滞的比例就越高，而s期细胞比例则明显降低。丁酸钠处理并不会引起严重的细胞凋亡，而工程细胞相对细胞活力降低更多是因为周期的g0/g1期阻滞。在10％和0.5％血清贴壁培养条件下，随着丁酸钠浓度增加，上清中葡萄糖浓度均增加，乳酸和氨浓度都降低。其中，丁酸钠通过抑制工程细胞的增殖，降低细胞消耗葡萄糖和产生乳酸与氨的速率，从而导致细胞培养上清中葡萄糖浓度提高和乳酸与氨浓度的降低。
总之，在不同血清含量以及不同培养方式下，丁酸钠都会以剂量依赖的方式抑制工程细胞fcho/il-24的体外增殖，但同时提高细胞培养上清中的rhil-24浓度以及细胞的比产率。nabu抑制细胞株体外增殖的主要原因是诱导g0/g1期阻滞，细胞凋亡的贡献有限；同时，细胞株相对活力的降低，对细胞培养上清中葡糖糖消耗和乳酸与氨的生成都产生影响。在这些结果的基础上，可以将nabu作为细胞株无血清培养基的添加剂，在高密度的悬浮培养中，进一步提高细胞株分泌表达rhil-24的水平，不仅为fcho/il-24细胞的大规模培养提供实验数据，同时也可为用哺乳动物细胞表达其他基因工程蛋白提供借鉴。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
1.一种将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养一定时间后，将培养基更换为含有丁酸钠nabu的培养基继续培养。
2.根据权利要求1所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养为10％血清贴壁培养。
3.根据权利要求1所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养为0.5％血清贴壁培养。
4.根据权利要求1所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养为0.5％血清悬浮培养。
5.根据权利要求1-4任一项所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：所述对定点整合工程细胞株fcho/il-24进行培养的培养基为dmem/f12培养基。
6.根据权利要求5所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：所述培养基中补充有100μg/ml的双抗和50μg/ml的潮霉素。
7.根据权利要求6所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：所述丁酸钠在培养基中的浓度为0.25-2mmol/l，更换后的培养基中血清含量不变。
8.根据权利要求7所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：进行10％血清贴壁培养时，96孔板中每孔接种细胞数为650个，6孔板中每孔接种细胞数为1×105个。
9.根据权利要求7所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：进行0.5％血清贴壁培养时，96孔板中每孔接种细胞数为1500个，6孔板中每孔接种细胞数为1×105个。
10.根据权利要求7所述的将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhil-24的方法，其特征在于：进行0.5％血清悬浮培养时，摇瓶接种体积为20ml，摇床转速119rpm，孵箱条件为37℃、5％co2，细胞接种密度为5×105个细胞/ml。
技术总结