本发明涉及副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)的特定菌株或包含所述菌株的组合物在预防和/或治疗与艰难梭菌(clostridiumdifficile)感染(优选肠道感染)或所谓的cd相关疾病(cdad)或cd感染(cdi)有关/相关的生理病理学疾病中的应用。现有技术艰难梭菌是革兰氏阳性、厌氧、形成孢子的杆状细菌，在自然界广泛分布于地下土壤和宠物的肠道中。这种微生物的污染也通过粪-口途径发生；特别是，摄入的孢子在胃的酸屏障中存活并在结肠中生长。在人类中，在约3％的健康成年人中可能会发现艰难梭菌是肠道腐生菌群的组成部分，而在1岁以下的婴儿中，这一比例显著更高(15-70％)。艰难梭菌通常不引起任何疾病。但是，在某些情况下，其可能引起不同强度的腹泻，在某些情况下，它可能与发烧以及从身体、心理和社会角度对人的健康状况造成主要一般性损害有关。实际上，腹泻常伴有其他主要症状，例如：恶心、呕吐、全身不适、疼痛、腹胀和脱水。在临床领域，已知艰难梭菌是严重形式的结肠炎(定义为假膜性结肠炎)的主要原因，其特征是或多或少的广泛性坏死，普遍影响直肠和乙状结肠，并常伴有大量腹泻。在这方面引起关注的原因特别是几种艰难梭菌菌株，其被定义为产肠毒素的，因为它们能够产生肠毒素a和/或细胞毒素b。这些毒素被肠粘膜内在化，导致肠细胞的细胞死亡。组织损伤的范围从i型到iii型，i型的特征在于与结肠内腔内的炎性浸润有关的分散的上皮坏死，iii型的特征在于被灰色假膜覆盖的溃疡(因此称为假膜性结肠炎)，其由黏蛋白、嗜中性粒细胞、纤维蛋白和细胞碎片组成。艰难梭菌肠道感染的严重性是可变的。症状实际上范围可从轻度到大量腹泻(每天高达10升浆液性分泌物)，并伴有中毒性巨结肠、肠穿孔、低钾血症、肠出血和脓毒症。腹泻可伴有发烧、恶心、厌食、全身不适、疼痛、腹胀和脱水。腹泻可能与粘液、血液和发烧有关。婴儿通常是无症状的携带者。事实上，尽管一方面似乎肠道菌群的不成熟有利于定殖，但另一方面，缺乏病理进化是由于毒素无法结合肠上皮细胞的受体导致，其也仍然是不成熟的。感染通常在积极的抗生素治疗后表现出来，并且在医院环境中非常普遍地传播。腹泻是抗生素治疗的常见副作用，但是一旦在治疗结束后中止药物，该疾病通常就可以解决。然而，在梭菌属的情况下，伴随其他症状的腹泻没有显示出减轻或改善的迹象。在艰难梭菌感染的危险因素中，我们可能提到：·长期使用抗生素，尤其是广谱抗生素(即能够消灭各类细菌的抗生素)，或联用不同的抗生素以治疗耐药性感染；·需要住院治疗或留在其他治疗机构中；·消化系统手术；·涉及肠的腹部外科手术；·处在幼儿园、托儿所或休养所；·结肠问题，例如肠易激综合征或结肠直肠癌；·肾脏问题；·免疫系统减弱(由于糖尿病或药物)；·摄入质子泵抑制剂或其他能够降低胃酸度的药物，这些药物通常用于防止感染；·以前的艰难梭菌感染；·65岁以上。在任何情况下，感染的治疗都需要使用抗生素，尽管这些抗生素特别靶向这种特定细菌。如前所述，大多数艰难梭菌感染发生在诸如医院和养老院等环境中，在这些环境中，许多个体服用抗生素并彼此密切接触。严重的艰难梭菌感染的致死性相当大，以致于必须采取预防措施以阻止疾病在医院环境中的传播。近年来，已经通过粪便移植方法成功治疗了各种病例。事实证明，借助益生菌，通过竞争性抑制病原体、稳定驻留的微生物群和减弱肠通透性的增加(其例如与轮状病毒感染有关)，可有效预防/治疗大多数类型的腹泻，包括确实由艰难梭菌引起的腹泻。鉴于上述情况，强烈需要一种新型和/或替代性的治疗方案，其可以减轻与生理病理学疾病相关的症状和/或治疗所述生理病理学疾病，所述生理病理学疾病与艰难梭菌感染(优选肠道感染)有关/相关。申请人已经发现使用基于细菌和/或酵母和/或其他微生物的益生菌作为上述需求的方案。特别地，本方案提出使用属于乳杆菌属和/或双歧杆菌属的细菌，优选副干酪乳杆菌的细菌物种。实际上，由于使用如下详细描述的益生菌，观察到了对艰难梭菌的抑制，这尤其是在体外置换试验(invitrodisplacementtest)中很明显。附图说明以下，还将借助于以下附图和不旨在具有任何限制特征的实例来详细描述本发明。具体而言：-图1a显示竞争粘附测试的结果，即真核细胞与益生菌以及与病原体的共温育。更具体地，该图以图表表示将ht29细胞与cdif以及与测试的各种益生菌共同温育后的cdif粘附，其以粘附的存活细胞的百分比计。图1b显示了去除粘附病原体的测试结果，即用病原体预处理真核细胞并随后与益生菌一起温育。更具体地，该图以图表表示在用cdif攻击真核细胞后，将ht29细胞与测试的不同益生菌一起温育后的cdif粘附，其以粘附的存活细胞的百分比计。-图2a显示了粘附排斥测试的结果(用益生菌biok 预处理真核细胞，然后与病原体一起温育)。更具体地，该图以图表表示通过将ht29-mtx细胞与测试的益生菌产品bio-k 接触而进行预刺激后的cdif粘附，其以粘附的存活细胞的百分比计。图2b显示了竞争粘附测试的结果(真核细胞与益生菌以及与病原体的共温育)。更具体地，该图以图表表示将ht29-mtx细胞与cdif以及经测试的益生菌产品bio-k 共温育后的cdif粘附，其以粘附的存活细胞百分比计。图2c显示了去除粘附的病原体的测试结果(用病原体预处理真核细胞并随后与益生菌一起温育)。更具体地，该图以图表表示在用cdif攻击真核细胞后，将ht29细胞与测试的不同益生菌一起温育后的cdif粘附，其以粘附的存活细胞的百分比计。-图3显示了与称为bio-k 的商业产品相比，用益生菌的具体实例进行的测试结果之间的比较分析的结果，表明了抗艰难梭菌感染。具体实施方式在这种情况下，“益生菌”的定义是由fao和who于2001年联合召集的一组专家所制定的：“活微生物，其在足量给予时赋予宿主健康益处”。特别是在意大利，卫生部将益生菌定义为“一旦摄入足够量就能发挥有益于身体的功能的微生物”，这基本上与上述两个组织的定义相呼应。艰难梭菌(以下称为cd)是一种临床上对各种类型的感染或与其相关的疾病/病症(被称为cd相关疾病(cdad)或cd感染(cdi))负责的细菌，并且其特征可以在于严重程度不同。实际上，感染自身可表现为轻度腹泻，但也可能导致假膜性结肠炎、中毒性巨结肠和肠穿孔。如果感染是由新的更具毒性的细菌菌株持续感染，则严重的临床表现(最重要的死亡风险与其相关)是更常见的。cd感染通常是医院引起的，并且自身也很经常表现出流行病特征。本发明的第一方面涉及干酪乳杆菌和/或副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株或包含所述菌株的组合物，其应用于预防和/或用于治疗与艰难梭菌感染(优选肠道感染)或所谓的cd相关疾病(cdad)或cd感染(cdi)有关/相关的生理病理学疾病。与艰难梭菌相关的所述疾病优选选自：假膜性小肠结肠炎、假膜性结肠炎、无假膜的结肠炎、暴发性结肠炎、伴随有中毒性巨结肠和肠穿孔的结肠炎、与抗生素相关的结肠炎，与抗生素相关的腹泻、与艰难梭菌感染相关的腹泻。两种菌株均由sofars.p.a分离并保藏。干酪乳杆菌(副干酪乳杆菌cncmi-1572)细菌菌株保藏于巴黎巴斯德研究所国家微生物培养物保藏中心(nationalcollectionofculturesofmicro-organismsofthepasteurinstituteofparis)，保藏号为cncmi-1572。该菌株最初命名为干酪乳杆菌dg干酪亚种(lactobacilluscaseidgsub.casei)。副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株保藏于dsmz，保藏号如下：dsm26760。在本文中提及的艰难梭菌菌株优选地被定义为产肠毒素的菌株，即能够产生肠毒素/细胞毒素如细胞毒素b和/或肠毒素a的菌株。更广义的来说，也会考虑不产生毒素、不致病且是新出现的菌株的艰难梭菌菌株，其是高毒性的，对抗生素具有抗性并且是孢子的高产者。干酪乳杆菌细菌菌株和/或副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株或所述组合物的施用优选有效减轻和/或治疗和/或治愈与所述感染/cdad/cdi有关的症状，和/或由cd感染或cd相关疾病引起的组织损伤。实际上，由cd引起的感染/相关疾病的特征在于严重性不同。感染可自身表现为轻度腹泻，但也可能最终导致腹部情况，例如蛋白质丢失性肠病和复发性腹泻，以及肠外情况，例如菌血症和脾脓肿。严重的临床表现，如脱水、低血钾、脓毒性休克、假膜性结肠炎、中毒性巨结肠和肠穿孔等，最重要的是其与死亡风险相关，但如果感染是由新的更具毒性的细菌菌株所维持，则更为常见。因此，根据本发明的优选方面，与所述感染/cdad/cdi有关的所述症状选自：腹泻、脱水、假膜性结肠炎、肠病、中毒性巨结肠，肠穿孔、脓毒症、肠出血和低血钾。组织学损伤优选为i型和/或iii型。根据本发明的优选方面，所述组合物包含其他微生物，优选细菌，优选益生菌，和/或酵母和/或真菌。所述细菌优选属于选自以下的属：乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、气球菌属、肠球菌属及其组合；更优选地，所述细菌属于乳杆菌属和/或双歧杆菌属。根据本发明的另一个优选方面，乳酸杆菌属的细菌属于以下物种中的至少一种：副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、解淀粉乳杆菌(lactobacillusamylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(lactobacillusamylovorus)、消化乳杆菌(lactobacillusalimentarius)、鸟乳杆菌(lactobacillusaviaries)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、纤维二糖乳杆菌(lactobacilluscellobiosus)、棒状乳杆菌(lactobacilluscoryniformis)、卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)、弯曲乳杆菌(lactobacilluscurvatus)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、香肠乳杆菌(lactobacillusfarciminis)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、鸡乳杆菌(lactobacillusgallinarum)、加氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、希氏乳杆菌(lactobacillushilgardii)、约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、马乳样乳杆菌(lactobacilluskefiranofaciens)、开菲尔乳杆菌(lactobacilluskefiri)、粘膜乳杆菌(lactobacillusmucosae)、面包乳杆菌(lactobacilluspanis)、丘状乳杆菌(lactobacilluscollinoides)、类植物乳杆菌(lactobacillusparaplantarum)、戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、庞氏乳杆菌(lactobacilluspontis)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)、清酒乳杆菌(lactobacillussakei)、唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)和旧金山乳杆菌(lactobacillussanfranciscensis)。根据另一个优选的实施方式，属于乳杆菌属的所述细菌不是嗜酸乳杆菌cl1285和/或干酪乳杆菌lbc80r和/或鼠李糖乳杆菌clr2。根据本发明的另一个实施方式，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株或包含所述菌株的所述组合物进一步包含(与它们结合使用)属于乳杆菌属的细菌，所述细菌不是嗜酸乳杆菌cl1285和/或干酪乳杆菌lbc80r和/或鼠李糖乳杆菌clr2菌株。据本发明的另一个优选方面，双歧杆菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：动物双歧杆菌(b.animalis)、双歧双歧杆菌(b.bifidum)、短双歧杆菌(b.breve)、婴儿双歧杆菌(b.infantis)、长双歧杆菌(b.longum)、青春双歧杆菌(b.adolescentis)、链状双歧杆菌(b.catenulatum)、角双歧杆菌(b.angulatum)、星状双歧杆菌(b.asteroides)、布氏双歧杆菌(b.boum)、豚双歧杆菌(b.choerinum)、棒状双歧杆菌(b.coryneforme)、串孔双歧杆菌(b.cuniculi)、齿垢双歧杆菌(b.denticolens)、齿双歧杆菌(b.dentium)、高卢双歧杆菌(b.gallicum)、加氏双歧杆菌(b.gallinarum)、印度双歧杆菌(b.indicum)、奇异双歧杆菌(b.inopinatum)、乳酸双歧杆菌(b.lactis)、大双歧杆菌(b.magnum)、瘤胃双歧杆菌(b.merycicum)、最小双歧杆菌(b.minimum)、假链状双歧杆菌(b.pseudocatenulatum)、伪长双歧杆菌(b.pseudolongum)、小鸡双歧杆菌(b.pullorum)、反刍双歧杆菌(b.ruminantium)、世纪双歧杆菌(b.saeculare)、纤细双歧杆菌(b.subtile)、嗜热酸双歧杆菌(b.thermacidophilum)、嗜热双岐杆菌(b.thermophilum)和图氏双歧杆菌(b.tsurumiense)；更优选选自：克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、耐盐芽孢杆菌(bacillushalodurans)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)、异常芽孢杆菌(bacillusinsolitus)和海洋芽孢杆菌(bacillusmarinus)。根据本发明的另一个优选方面，丙酸杆菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：谢氏丙酸杆菌(p.shermanii)、痤疮丙酸杆菌(p.acnes)、太空丙酸杆菌(p.australiense)、卵白丙酸杆菌(p.avidum)、环己脂酸丙酸杆菌(p.cyclohexanicum)、费氏丙酸杆菌(p.freudenreichii)、颗粒丙酸杆菌(p.granulosum)、詹氏丙酸杆菌(p.jensenii)、微需氧丙酸杆菌(p.microaerophilum)、丙酸丙酸杆菌(p.propionicum)和特氏丙酸杆菌(p.thoenii)。根据本发明的另一个优选方面，链球菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、唾液链球菌(streptococcussalivarius)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、咽峡炎链球菌(streptococcusanginosus)、牛链球菌(streptococcusbovis)、犬链球菌(streptococcuscanis)、星座链球菌(streptococcusconstellatus)、汗毛链球菌(streptococcusdownei)、停乳链球菌(streptococcusdysgalactiae)、马链球菌(streptococcusequinus)、野鼠链球菌(streptococcusferus)、婴儿链球菌(streptococcusinfantarius)、海豚链球菌(streptococcusiniae)、中间链球菌(streptococcusintermedius)、米勒链球菌(streptococcusmilleri)、缓症链球菌(streptococcusmitis)、变异链球菌(streptococcusmutans)、口腔链球菌(streptococcusoralis)、鼠口腔链球菌(streptococcusorisratti)、副血链球菌(streptococcusparasanguinis)、极小链球菌(streptococcusperoris)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、假肺炎链球菌(sreptococcuspseudopneumoniae)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、鼠链球菌(streptococcusratti)、虎链球菌(streptococcustigurinus)、血链球菌(streptococcussanguinis)、表兄链球菌(streptococcussobrinus)、猪链球菌(streptococcussuis)、乳房链球菌(streptococcusuberis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、草绿色链球菌(streptococcusviridans)和兽疫链球菌(streptococcuszooepidemicus)。根据本发明的另一个优选方面，乳球菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：春冈乳球菌(l.chungangensis)、台湾桧木乳球菌(l.formosensis)、弗氏乳球菌(l.fujiensis)、格氏乳球菌(l.garvieae)、乳酸乳球菌(l.lactis)、雌蕊乳球菌(l.piscium)、植物乳球菌(l.plantarum)、棉籽糖乳球菌(l.raffinolactis)和台湾乳球菌(l.taiwanensis)。根据本发明的另一个优选方面，气球菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：脲气球菌(a.urinae)、血气球菌(a.sanguinicola)、柯氏气球菌(a.christensenii)、猪气球菌(a.suis)、马脲气球菌(a.urinaeequi)和人尿气球菌(a.urinaehominis)。根据本发明的另一个优选方面，肠球菌属的细菌属于选自以下的至少一个物种：鸟肠球菌(enterococcusavium)、耐久肠球菌(enterococcusdurans)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(enterococcusgallinarum)、溶过氧化肠肠球菌(enterococcushaemoperoxidus)、海氏肠球菌(enterococcushirae,)、病臭肠球菌(enterococcusmalodoratus)、摩拉维亚肠球菌(enterococcusmoraviensis)、蒙氏肠球菌(enterococcusmundtii)、伪禽肠球菌(enterococcuspseudoavium)、棉籽糖肠球菌(enterococcusraffinosus)和孤立肠球菌(enterococcussolitarius)。根据本发明的另一个优选方面，酵母属于酿酒酵母属，更优选地为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和/或布拉酵母(saccharomycesboulardii)。所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物优选是活的。在后一种情况下，所得组合物也可定义为益生剂。备选地，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物是死亡的或减活的(tyndallized)。在另一个实施方式中，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物为裂解物和/或提取物的形式。在后一种情况下，所得组合物也可定义为副益生菌(paraprobiotic)。作为选择，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物可以以其单独组分或几种组分作为胞外多糖存在于细菌壁中。在本发明的另一个实施方式中，组合物还包含由所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物产生的代谢生物产物(定义为后益生菌)和/或任何其他细菌衍生产物。因此，如上所述的组合物也可定义为已知或假定的益生菌或副益生菌或后益生菌，或细菌壁的组分。通常，本发明的组合物中还包含的所述微生物是efsa的qps列表中指定的单一微生物或任何微生物物种的组合。所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物能够在胃肠道中存活并因此活着到达结肠。所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物(如果存在)的每次施用的施用量为10亿至3000亿(或更多，视情况而定)，更优选500亿至2500亿，甚至更优选为750至1500亿个细胞，优选细菌细胞。在通过灌肠和/或粪便移植施用的情况下，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物(如果存在)每次施用/应用的施用量为1000亿至3000亿，更优选1500亿至2000亿个细胞，优选细菌细胞/益生菌/组合物。根据一个优选方面，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述其他微生物(如果存在，优选细菌)每天施用至少一次至两次。在本发明中设想了每种施用途径。如上所述的所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述组合物的施用优选为口服，更优选为以丸剂、胶囊剂、片剂、粒状粉剂、硬壳胶囊、口服溶解颗粒、小袋剂、锭剂或可饮用小瓶的形式。备选地，如上所述的所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述组合物的施用，为液体形式，优选糖浆或饮料。备选地，所述干酪乳杆菌细菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述组合物的施用通过添加至食品中来进行，所述食品优选酸奶、奶酪或果汁。本发明的另一方面涉及益生菌或包含所述益生菌的组合物，所述益生菌优选包含属于选自以下的属的细菌：乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、气球菌属、肠球菌属及其组合，所述益生菌或包含所述益生菌的组合物用于预防和/或治疗与艰难梭菌感染(优选肠道感染)或所谓的cd相关疾病(cdad)或cd感染(cdi)有关/相关的生理病理学疾病，其中所述益生菌或组合物经配制以发挥局部地起作用，优选通过直肠施用，优选作为灌肠剂，优选通过粪便微生物群移植。所述细菌优选是如上所述的干酪乳杆菌细菌菌株和/或副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株和/或所述组合物。如上所述的益生菌或组合物的制剂还包含通常适用于生产益生菌和/或药物产品的赋形剂。根据本发明的优选方面，益生菌或组合物的制剂还包含抗结块剂，优选二氧化硅和/或硬脂酸镁。根据本发明的优选方面，所述组合物还包含包衣剂，优选明胶。在本发明的另一个实施方式中，益生菌或组合物的制剂还包含维生素、微量元素(优选锌或硒)、酶和/或益生元物质(优选低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、菊粉、瓜尔豆胶或其组合)。根据本发明的一个优选方面，益生菌或组合物的制剂可以与其他治疗方法关联或组合，所述其他治疗方法优选为药理或社会行为类型，优选饮食和/或健康生活方式。实施例以下实施例中使用的病原体是从atcc美国典型培养物保藏中心获得的，属于以下菌株：艰难梭菌atcc43255-vpi10463。测试的菌株如下：1)干酪乳杆菌(副干酪乳杆菌cncmi-1572)，2)副干酪乳杆菌lpc-s01；和3)比例为1:1的干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌lpc-s01的组合(混合物)。4)鼠李糖乳杆菌atcc53103(“商业”阳性对照)将细菌菌株培养在rogosa琼脂(干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌)和bhi脑心浸液(艰难梭菌)中。目的是验证乳杆菌菌株对cdif发挥抑制作用的能力。用于验证益生菌实例粘附至肠上皮细胞的能力的粘附力测试作为能够产生粘液的人肠上皮细胞系的一个实例，使用了ht29-mtx-e12(ecacc)。特别地，在具有高葡萄糖浓度的dmem(dulbecco改良eagle培养基)中培养细胞直至形成汇合的单层。dmem中补充有10％的胎牛血清，50μg/ml的硫酸庆大霉素和2mm的l-谷氨酰胺。在37℃下将细胞保持在具有5％co2的温育器中。在附着力测试之前，将细胞用汉克平衡盐溶液洗涤，胰蛋白酶化，重悬并通过一次性血细胞计数器计数，以便可以将其以已知浓度接种在多孔板上。在进行附着力测试之前，使细胞生长2天以形成汇合的单层。在附着力测试的当天，除去用过的培养基，将单层用盐水溶液(汉克平衡盐溶液)洗涤，将不含抗生素或谷氨酰胺但补充有1％胎牛血清的dmem培养基添加到细胞。细胞单层在与细菌接触之前，先在37℃和5％co2下温育1小时。该操作去除了可能干扰测试的任何抗生素残留。随后将细胞“感染”，观察到moi(感染复数)为1:10(细胞：细菌)。达到汇合后48小时，将细胞洗涤并与含有示例细菌菌株(单菌株或如上所述的组合菌株)的dmem培养基以1:10的感染复数(moi，上皮细胞：细菌)一起温育。在37℃下温育60分钟，将板轻微振荡以利于与细胞接触。温育结束时，弃去培养基，用无菌dmem洗涤细胞以除去未粘附细菌，并使用连续稀释液通过活菌计数对粘附的细菌细胞进行量化，所述连续稀释液接种在具有厌氧条件下于37℃下温育的琼脂糖化mrs培养基的板上。附着力排除测试(排除/预温育)在确定每孔的ht29细胞数之后，单独添加或以1:1的比例(混合物)组合添加副干酪乳杆菌菌株。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并用无菌培养基洗涤细胞以除去未粘附至单层的细菌。然后将cdif(moi1:10)添加至单层，并将细胞在37℃下温育60分钟。温育结束时，除去培养基，并通过用无菌培养基洗涤而除去未粘附细菌。为了量化粘附在ht29细胞上的cdif，首先将细胞分离，然后裂解，在37℃下在厌氧下接种在艰难梭菌选择性琼脂上48至72小时之后，通过活细菌计数对细菌进行量化。将未与副干酪乳杆菌菌株预温育而是与仅接种cdif的ht29细胞用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞用作阴性对照(无菌测试)。竞争粘附的测试(竞争/共温育)确定每孔的ht29-mtx细胞数量后，将两种副干酪乳杆菌菌株(单独和以1:1比例组合)与cdif同时添加。以总moi为1:10且益生菌与病原体的比例为1:1地添加细菌。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并用无菌培养基洗涤细胞以除去未粘附至单层的细菌。为了量化粘附在ht29细胞上的cdif，首先将细胞分离，然后裂解，在37℃下在厌氧下接种在艰难梭菌选择性琼脂上48至72小时之后，通过活细菌计数对细菌进行量化。仅接种cdif的ht29细胞用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞用作阴性对照(无菌测试)。关于去除附着的病原体(置换/温育后)的测试确定每孔中ht29-mtx细胞的数量后，添加cdif(moi1:10)。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并通过用无菌培养基反复洗涤除去未粘附至单层的细菌。然后，以益生菌与粘附病原体的比例为10:1地加入副干酪乳杆菌的两种菌株(单独和以1:1的比例组合)。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并用无菌培养基洗涤细胞以除去未粘附至单层的细菌。为了量化粘附在ht29细胞上的cdif，首先将细胞分离，然后裂解，在37℃下在厌氧下接种在艰难梭菌选择性琼脂上48至72小时之后，通过活细菌计数对细菌进行量化。仅接种cdif的ht29细胞用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞用作阴性对照(无菌测试)。结果结果总结在图1a和1b中，并证明：1)与细胞仅与病原体温育的情况相比，干酪乳杆菌菌株显示出直接将cdif的粘附降低约7％的中等能力，而副干酪乳杆菌lpc-s01菌株在竞争性地排除cdif方面表现出更大的功效(粘附降低22％)。菌株的混合物证明能够增强抑制能力，使cdif的粘附降低31％(图1a)。2)与细胞仅与病原体温育的情况相比，干酪乳杆菌菌株显示出(图1b)将cdif的粘附降低约27％的中等能力，而副干酪乳杆菌lpc-s01菌株显示出“去除”cdif的显著效果(粘附降低75％)。实施例2将示例菌株与旨在用于相同目的的商业产品进行比较。所使用的病原体与先前实施例中所使用的菌株相同。产品bio-k 包含以下混合物：嗜酸乳杆菌cl1285，干酪乳杆菌lbc80r和鼠李糖乳杆菌clr2，声明的浓度为每98g瓶500亿cfu，因此声明的浓度为5.0×1010cfu/98g(5.1×108cfu/g)。将产物在选择培养基中进行十进制计数(istisan方法08/36)，以便对实际总乳酸菌浓度进行量化。存活细胞的浓度为1.2×109cfu/g，因此约为理论计算浓度的两倍。粘附排除测试(排除/预温育)确定每孔中ht29细胞的数量后，按照病原体/益生菌moi为1:10将产品添加到单层中。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并用无菌培养基洗涤细胞以除去未粘附至单层的细菌。然后将cdif添加到单层(moi1:10)，并将细胞在37℃温育60分钟。温育结束时，除去培养基，并通过用无菌培养基洗涤而除去未粘附的细菌。为了量化粘附在ht29细胞上的cdif，将细胞分离并裂解，在37℃下在厌氧下接种在艰难梭菌选择性琼脂上48至72小时之后，通过活细菌计数对细菌进行量化。未与产品预温育但仅接种cdif的ht29细胞的孔用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞的孔用作阴性对照(无菌测试)。竞争粘附的测试(竞争/共温育)确定每孔中ht29-mtx细胞的数量后，将产物与cdif同时加入。根据总moi为1:10添加细菌。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并用无菌培养基洗涤细胞以除去未粘附至单层的细菌。为了量化粘附在细胞的cdif，将细胞分离并裂解，在37℃下在厌氧下接种在艰难梭菌选择性琼脂上48至72小时之后，通过活细菌计数对细菌进行量化。仅接种cdif的ht29细胞的孔用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞孔用作阴性对照(无菌测试)。关于去除粘附的病原体的测试(置换/温育后)确定每孔中ht29-mtx细胞的数量后，添加cdif(moi1:10)。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并通过用无菌培养基反复洗涤除去未粘附至单层的细菌。然后按通常的细菌/细胞比例10:1加入产品。使细菌与保持在37℃的细胞接触并轻微振荡60分钟。温育结束时，除去培养基，并用无菌培养基洗涤细胞以除去未粘附至单层的细菌。为了量化粘附在细胞上的cdif，将细胞分离并裂解，在37℃下在厌氧下接种在艰难梭菌选择性琼脂上48至72小时之后，通过活细菌计数对细菌进行量化。仅接种cdif的ht29-mtx细胞的孔用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞的孔用作阴性对照(无菌测试)。结果图2a所示的结果涉及cdif的粘附，其以通过使ht29-mtx细胞与被测益生菌产品接触而预刺激后粘附的存活细胞的百分比计。换句话说，在将没有益生菌刺激的cdif粘附的值指定为100时，测试菌株的抑制能力表示为与阳性对照相比的cdif粘附降低的百分比。可以注意到，被测产品显示出能够增强抑制能力，从而导致cdif粘附非常高的降低，等于90％。此外，验证了在同时用益生菌和病原体处理细胞系后cdif对ht29-mtx细胞粘附的可能降低，以评估益生菌在与cdif一起温育时所发挥的竞争性抑制的作用(如果有)。仅用cdif的ht29细胞的孔用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞的孔用作阴性对照(无菌测试)。图2b所示的结果涉及cdif粘附，以在ht29-mtx细胞与cdif以及不同的被测益生菌共温育后粘附的存活细胞的百分比计。如前所述，在将没有益生菌刺激的cdif粘附的值指定为100时，测试菌株的抑制能力表示为与阳性对照相比的cdif粘附降低的百分比。可以注意到，测试产品显示出能够增强抑制能力，从而使cdif粘附降低30％。最后，证实了用病原体预处理细胞系并在除去非粘附病原体后与益生菌一起温育后，cdif对ht29-mtx细胞的粘附是否有任何降低。仅接种cdif的ht29细胞的孔用作阳性对照，而未与任何细菌温育的细胞的孔用作阴性对照(无菌测试)。图2c所示的结果涉及cdif粘附，其以在用cdif攻击真核细胞后将ht29细胞与所测试的各种益生菌一起温育后存活细胞粘附的百分比表示。如前所述，在将没有益生菌刺激的cdif粘附的值指定为100时，测试菌株的抑制能力表示为与阳性对照相比的cdif粘附降低的百分比。可以注意到，该产品显示出非常适度的抑制能力，使cdif粘附降低了8％。对于3种不同的实验方案，与约为1.0×106cfu的初始病原体负荷相比，在2个连续测试中获得的cdif计数范围总结于下表中。bio-k 抑制活性3次测试的范围艰难梭菌单独1.0×103至1.4×103共温育方案5.1×102至9.0×102预温育方案1.0×102至1.4×102温育后方案8.0×102至1.1×103将本研究期间获得的数据与干酪乳杆菌副干酪乳杆菌lpc-s01菌株和这两种菌株的混合物(先前研究的对象)相关的数据进行比较，可以绘制出如下所示的表：粘附排除测试(用益生菌预处理真核细胞，随后与病原体一起温育)细菌菌株/产品cdif粘附的降低％干酪乳杆菌dg20副干酪乳杆菌s010dg s01的1:1混合物46bio-k 90鼠李糖乳杆菌atcc5310312竞争粘附的测试(真核细胞与益生菌和与病原体共温育)细菌菌株/产品cdif粘附的降低％干酪乳杆菌dg7副干酪乳杆菌s0122dg s01的1:1混合物31bio-k 30鼠李糖乳杆菌atcc531030粘附病原体的去除测试(用病原体对真核细胞进行预处理，然后与益生菌一起温育)细菌菌株/产品cdif粘附的降低％干酪乳杆菌dg27副干酪乳杆菌s0175dg s01的1:1混合物57bio-k 8鼠李糖乳杆菌atcc53103703个表中显示的总体结果表明：1)副干酪乳杆菌lpc-s01最有效；特别是，在置换测试期间，它显示出非常高的针对cdif的抑制能力(75％)。换句话说，副干酪乳杆菌lpc-s01在病原体粘附后起作用并除去它，这与仅起到预防作用的被测试的商业产品不同，因为它可以防止病原体cd粘附到细胞上。在这种情况下，当病原体cd已经粘附时，测试的副干酪乳杆菌lpc-s01也可以起作用；并且2)干酪乳杆菌 副干酪乳杆菌lpc-s01的1:1组合在降低cdif对细胞系的粘附能力方面表现出令人注意的协同作用。在预处理和共温育方案中，与单独的菌株相比，该组合显示出优势，而在置换测试中，副干酪乳杆菌lpc-s01的菌株被证明比2种益生菌的组合更有效。当前第1页1 2 3
技术特征：1.干酪乳杆菌和/或副干酪乳杆菌lpc-s01细菌菌株或包含所述菌株的组合物，其应用于预防和/或治疗与艰难梭菌感染有关/相关的生理病理学疾病和/或与所述生理病理学疾病相关的症状和/或由所述艰难梭菌感染引起的组织损伤。
2.如权利要求1所述应用的细菌菌株或组合物，其中，所述艰难梭菌感染是肠感染。
3.如权利要求1或2所述应用的细菌菌株或组合物，其中，与艰难梭菌感染有关/相关的所述生理病理学疾病选自：假膜性小肠结肠炎、假膜性结肠炎、无假膜的假膜性结肠炎、暴发性结肠炎、伴随有中毒性巨结肠和肠穿孔的结肠炎、与抗生素相关的结肠炎、与抗生素相关的腹泻、与艰难梭菌感染相关的腹泻。
4.如权利要求1至3中任一项所述应用的细菌菌株或组合物，其中，与所述感染/cdad/cdi相关的所述症状选自：腹泻、脱水、假膜性结肠炎、肠病、中毒性巨结肠、肠穿孔、脓毒症、肠道出血和低钾血症。
5.如权利要求1至4中任一项所述应用的细菌菌株或组合物，其中，所述组合物包含其他微生物，优选细菌，优选益生菌，和/或酵母和/或真菌。
6.如权利要求5所述应用的细菌菌株或组合物，其中，所述细菌属于选自以下的属：乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、气球菌属、肠球菌属及其组合，优选地，所述细菌属于乳杆菌属和/或双歧杆菌属。
7.如权利要求1至6所述应用的细菌菌株或组合物，其中，所述干酪乳杆菌和/或所述副干酪乳杆菌lpc-s01和/或所述其他微生物的每次摄入施用量为10亿至3000亿(或更多，视情况而定)，更优选500亿至2500亿，甚至更优选为750至1500亿个细胞，优选细菌细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述应用的细菌菌株或组合物，其中，所述菌株和/或所述组合物每天施用至少一次至两次。
9.如权利要求1至8中任一项所述应用的细菌菌株或组合物，其被配制用于口服施用，优选形式为丸剂、胶囊剂、片剂、颗粒粉剂、盖膜剂(opercula)、口溶性颗粒剂、小袋剂、糖衣丸剂或可饮用瓶；或为液体形式，优选糖浆或饮料；或添加到食品中，所述食品优选酸奶、奶酪或果汁。
10.如权利要求1至8中任一项所述应用的细菌菌株或组合物，其被配制用于局部作用，优选通过直肠施用，优选作为灌肠剂，优选通过粪便微生物群移植。
技术总结本发明涉及副干酪乳杆菌的特定菌株或包含所述菌株的组合物在预防和/或治疗与艰难梭菌感染(优选肠道感染)或所谓的CD相关疾病(CDAD)或CD感染(CDI)有关/相关的生理病理学疾病中的应用。
技术研发人员：A·比菲
受保护的技术使用者：索法尔公司
技术研发日：2018.09.12
技术公布日：2020.06.05
