本发明涉及胰岛素结晶技术领域，具体涉及一种甘精胰岛素晶体的制备方法。
背景技术：
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。于1921年由加拿大人f.g.班廷和c.h.贝斯特首先发现。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长，胰岛素的需求越来越多，单纯的从动物细胞提取已满足不了病人的需求，胰岛素及胰岛素类似物的生产迫在眉睫。其中一种新开发的长效胰岛素类似物-甘精胰岛素，正在越来越多被医生和患者所接受和使用。
甘精胰岛素(recombinantglycine-arginineinsulin)是一种通过基因重组技术获得并用于治疗ⅰ、ⅱ型糖尿病的长效胰岛素类生物制品，其持续控制血糖的原理为：皮下注射后甘精胰岛素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰岛素沉淀物，机体吸收延迟，其降糖作用的时间也被延长。甘精胰岛素是当前治疗ⅰ、ⅱ型糖尿病十分方便和有效的药物。国外由aventis公司生产的甘精胰岛素注射液(商品名lantus)与人胰岛素的不同之处在于其a链羧基端21位的天门冬氨酸被甘氨酸所取代，b链羧基端30位苏氨酸后的31和32位连接了两个精氨酸，改造后的活性胰岛素即甘精胰岛素，由e.coli表达生产。可在糖尿病患者体内平稳发挥药效24小时以上，并且无明显的血药高峰值和低峰值，很适合用于低基础胰岛素的替代治疗。
甘精胰岛素是一种在中性液中溶解度低的人胰岛素类似物。在本品酸性(ph＝4)注射液中，完全溶解。其主要作用是调节糖代谢。中国糖尿病防治指南认可：甘精胰岛素是唯一平稳无峰、作用时间长达24小时的胰岛素。符合人类生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和医生所青睐。
目前，现有技术中对甘精胰岛素结晶方法的报道均是用于甘精胰岛素工艺生产的结晶方法，得到的产品多为混晶形式，纯度低，干扰杂质较多，无法用于晶体结构的解析。因此，需要一种能够制备单晶形式的甘精胰岛素晶体的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种甘精胰岛素晶体的制备方法和结构解析方法，以得到单晶形式的甘精胰岛素晶体，提高其纯度。
本发明第一方面提供一种制备甘精胰岛素晶体的方法，采用气相扩散悬滴法，包括如下步骤：
(1)配制含有如下成分的结晶液：tris0.2～1.0m，柠檬酸0.2～1.0m；所述结晶液的ph为8.0～11.0；
(2)将甘精胰岛素溶液与所述结晶液混合，得到混合结晶溶液；
(3)将所述混合结晶溶液悬滴于盛有所述结晶液的母液池上方，静置培养。
作为一种优选的实施方案，所述结晶液的ph为9.0～10.5。
作为一种优选的实施方案，所述结晶液中含有如下成分：tris0.4～0.8m，柠檬酸0.4～0.8m。
作为一种优选的实施方案，所述结晶液中还含有乙酸铵。
作为一种更优选的实施方案，所述结晶液中乙酸铵的浓度为10.0～100mm，优选为15～35mm。发明人意外地发现，乙酸铵的浓度在此范围，甘精胰岛素的结晶效果较好。
作为一种优选的实施方案，所述甘精胰岛素溶液中甘精胰岛素的浓度为3～10mg/ml。
作为一种更优选的实施方案，所述甘精胰岛素溶液中还含有酚类衍生物、含锌物质和酸。其中，所述酚类衍生物可以选自苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯，优选为苯酚。所述含锌物质可以选自乙酸锌、氯化锌、溴化锌或硫酸锌，优选为乙酸锌。所述酸选自醋酸、柠檬酸、盐酸或硫酸，优选为盐酸。
作为一种优选的实施方案，在所述甘精胰岛素溶液中，苯酚的浓度为3～10mm，乙酸锌的浓度为0.6～1.5mm。
作为一种更优选的实施方案，所述甘精胰岛素溶液中含有如下成分：甘精胰岛素3～5mg/ml，苯酚4～6mm，乙酸锌0.6～0.8mm。
作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，将所述甘精胰岛素溶液与所述结晶液混合时二者的体积比为1:(0.5～1.5)，优选为1:1。
作为一种优选的实施方案，所述静置培养的温度为20～25℃；优选地，所述静置培养的时间为1～4天。
利用本发明提供的制备甘精胰岛素晶体的方法能够得到形状规则，单晶形式的大小合适的甘精胰岛素晶体。并且晶体生长快，晶体规则、稳定，x-射线衍射分辨率高，可正确解析甘精胰岛素的晶体结构。不仅如此，该方法操作简单，不需要特殊的仪器设备。
本发明第二方面提供一种甘精胰岛素晶体结构解析方法，先用本发明第一方面提供的方法制备得到甘精胰岛素晶体。利用本发明提供的方法能够得到形状规则，单晶形式的大小合适的甘精胰岛素晶体，x-射线衍射分辨率高，可正确解析甘精胰岛素的晶体结构。
附图说明
图1为实施例1制备的甘精胰岛素晶体的显微照片。
图2为实施例1制备的甘精胰岛素晶体的衍射图。
图3为实施例1制备的甘精胰岛素的a链的氨基酸残基的代表性电子密度图。
图4为实施例1制备的甘精胰岛素的b链的氨基酸残基的代表性电子密度图。
图5为甘精胰岛素的空间结构示意图。其中a为实施例1制备的甘精胰岛素晶体的空间结构；b为数据库中编号为5viz的甘精胰岛素晶体的空间结构；c为a与b叠加。
图6为实施例1制备的甘精胰岛素晶体的空间结构与数据库中编号为5viz的甘精胰岛素晶体的空间结构叠加的正面图。
图7为实施例1制备的甘精胰岛素晶体的空间结构与数据库中编号为5viz的甘精胰岛素晶体的空间结构叠加的背面图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种制备甘精胰岛素晶体的方法。
1、配制储备溶液
1m柠檬酸-1mtris缓冲液：称取无水柠檬酸19.2g，tris12.1g，加水100ml溶解，用naoh溶液调节ph，得ph值为8.0-11.0的缓冲液。
1m乙酸铵溶液：称取0.77g乙酸铵，加水10ml溶解即得。
4mnaoh：称取氢氧化钠1.16g，加水5ml溶解。
1m苯酚溶液：称取苯酚94mg，加水1ml溶解，混匀即得。
0.5m乙酸锌溶液：称取乙酸锌219mg，加水2ml溶解，混匀即得。
0.01m盐酸溶液：量取盐酸0.9ml，用水稀释成1000ml，摇匀即得。
2、配制甘精胰岛素溶液
称取甘精胰岛素20mg，加0.01m盐酸溶液5ml溶解，加入1m苯酚溶液25μl，0.5m乙酸锌溶液6.7μl，摇匀即得。
按照上述方法配制得到的甘精胰岛素结晶溶液中含有：甘精胰岛素4mg/ml，苯酚5mm，乙酸锌0.67mm。
3、配制结晶液
将1m柠檬酸-1mtris缓冲液、1m乙酸铵溶液稀释混合，并利用4mnaoh调节ph值，配制得到的结晶液组成为：tris0.75m，柠檬酸0.75m，乙酸铵20mm，ph9.0。
4、制备结晶：
将400μl结晶液加入带硅胶的24孔悬滴法晶体培养板的母液池中；取2μl结晶液与2μl甘精胰岛素溶液在盖玻片上混匀，得到混合结晶溶液；将盖玻片倒盖在所述母液池上，使所述混合结晶溶液悬滴在所述结晶液的上方，在温度22℃下静置培养。
培养1-4天后在显微镜下观察晶体，得到规则的立方体形状的晶体，晶体大小约80μm，结果见图1。
将培养得到的晶体进行x射线晶体衍射过程：(1)单晶挑取：在显微镜下观察甘精胰岛素溶液结晶盖玻片中晶体大小，选取0.1-0.2mmloop环，挑取晶体并转移到抗冻剂(抗冻剂由10微升甘油和90微升结晶溶液混合均匀)中，再用0.1-0.2mmloop环从抗冻剂中挑取晶体；(2)衍射试验：将已挑取带有单晶的loop环，立即转移至x射线衍射仪上，并置于氮气气流保护下，氮气气流的温度为100.0k，调整loop环载样台位置，使晶体置于检测器中心点，进行衍射分析；(3)衍射分析：完成x射线衍射仪参数设置后开始曝光分析，分析结束后，关闭x射线，取下loop环。衍射结果见图2。
实验参数设置如下：
phi角：0度，chi角：0度，2theta角：0度，omega角：-90度～90度。
距离：50mm，曝光时间：90s。
照片帧数：180，每帧宽度：1度。
甘精胰岛素晶体的数据采用rigakumicromax-007hfx射线发生器，液氮冷却(100.0k)，波长1.5418埃，收集180张图像。收集的数据用hkl3000处理。典型的衍射图如图2所示，其中omega角：-90度。随后对180张衍射图进行整合，分析获得71981个衍射数据，其中特有的衍射数据为3871个，数据完整度为99.7％。
进一步空间群进行分析发现，本发明的甘精胰岛素晶体结构的空间群为i213，其边长a，b，c分别为77.988，77.988，77.988埃，角度为90，90，90度。国际蛋白质数据库(www.rcsb.org)中存储有三个甘精胰岛素的单晶结构，编号分别为：4iyd、4iyf、5viz。自研甘精胰岛素晶体结构的空间群和数据库中编号为5viz的结构高度接近，本实施例的甘精胰岛素晶体的结构的空间群也是i213，边长a，b，c分别为77.997，77.997，77.997埃，角度为90，90，90度。因此，本发明提供的甘精胰岛素的晶体结构空间群与该结构的数据高度一致。
以蛋白质数据库中编号为5viz的甘精胰岛素晶体结构为模型，利用分子置换的方法，确定了制备得到的甘精胰岛素晶体结构的空间相位。制备得到的甘精胰岛素晶体数据收集与结构修正各指标统计如表1所示，电子密度所显示残基的分布情况见图3和图4(角：-90度)。通过结构解析和修正，获得了制备得到的甘精胰岛素的空间结构，如图5所示，从图5中可以很清晰地看清甘精胰岛素晶体的二聚体构象，其中的二硫键以棍棒模式显示。将其与数据库中甘精胰岛素晶体结构(5viz)比较，发现他们的晶体结构和疏水核心高度一致，结果见图5、图6和图7。通过晶体学实验，证实制备得甘精胰岛素二聚体形态单晶的空间结构与数据库中已知的甘精胰岛素空间结构高度一致。
表1制备的甘精胰岛素晶体数据收集与结构修正各指标统计表
由上述结果可知，本发明提供的制备甘精胰岛素晶体的方法能够获得高纯度的单晶形式的甘精胰岛素晶体，并且能够用于甘精胰岛素晶体结构解析。
实施例2
本实施例提供制备甘精胰岛素晶体的方法。与实施例1相比，区别仅在于，结晶液的组成为：tris0.4m，柠檬酸0.4m，乙酸铵25mm；所述结晶液的ph为8.5。
本实施例可以得到单晶形式的甘精胰岛素晶体。
实施例3
本实施例提供制备甘精胰岛素晶体的方法。与实施例1相比，区别仅在于，结晶液的组成为：tris0.7m，柠檬酸0.7m，乙酸铵30mm；所述结晶液的ph为9.0。
本实施例可以得到单晶形式的甘精胰岛素晶体。
实施例4
本实施例提供制备甘精胰岛素晶体的方法。与实施例1相比，区别仅在于，结晶液的组成为：tris0.8m，柠檬酸0.8m，乙酸铵20mm；所述结晶液的ph为9.5。
本实施例可以得到单晶形式的甘精胰岛素晶体。
实验例5：不同结晶液ph值的考察
配制溶液：
甘精胰岛素结晶母液(8mg/ml)：甘精胰岛素42.72mg，500mm苯酚溶液50μl，0.1m醋酸锌60μl，0.01mhcl4.9ml。
甘精胰岛素结晶溶液(4mg/ml)：取甘精胰岛素结晶母液(8mg/ml)300μl，加300μl水，混匀。
1mtris-1m柠檬酸溶液：称取tris12.10g，无水柠檬酸19.27g，加水100ml溶解。
4mnaoh：称取氢氧化钠1.16g，加水5ml溶解。
ph系列结晶母液：用4mnaoh调节1mtris-1m柠檬酸溶液ph值至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5。
ph系列结晶液：将ph系列结晶母液稀释至表2中的浓度，制成ph系列结晶液，详见表2。
表2结晶液的浓度和ph值
该方法包括以下步骤：
分别取表2中的结晶液500μl加入带硅胶的24孔悬滴法晶体培养板的母液池中。
分别取2μl结晶液和2μl胰岛素结晶溶液在盖玻片上混匀，将盖玻片倒盖在母液池上，胰岛素结晶溶液悬滴在盖玻片上，在温度22℃下静置培养。培养2-4天后在显微镜下观察晶体。
结果：在ph4.0-8.5条件下，均有大量沉淀析出，无法形成甘精胰岛素晶体；ph9.0时沉淀析出不明显，相对饱和度较为合适。
实验例6：不同结晶液ph值的考察
配制溶液：
甘精胰岛素结晶溶液：称取甘精胰岛素23.24mg，加0.01m盐酸溶液5ml溶解，加1m苯酚溶液25μl，0.5m乙酸锌溶液6.7μl，摇匀即得。
1mtris-1m柠檬酸溶液：称取tris12.12g，无水柠檬酸19.36g，加水100ml溶解。
12mnaoh：称取氢氧化钠24.03g，加水30ml溶解。
ph系列结晶母液：用12mnaoh调节1mtris-1m柠檬酸溶液ph值至9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0。
ph系列结晶液：将ph系列结晶母液稀释至表2中的浓度，制成ph系列结晶液，详见表3。
表3不同ph值的结晶液的组成
该方法包括以下步骤：
分别取表3中的结晶液400μl加入带硅胶的24孔悬滴法晶体培养板的母液池中。
分别取2μl结晶液和2μl胰岛素结晶溶液在盖玻片上混匀，将盖玻片倒盖在母液池上，胰岛素结晶溶液悬滴在盖玻片上，在温度22℃下静置培养。培养1-4天后在显微镜下观察晶体。
结果：
ph在9.0-10.5间均有规则的六面体晶体出现，即单晶；ph在11.0-12.0间晶体为不规则边缘模糊的混晶。
实验例7：不同结晶液组分和浓度的筛选
配制溶液：
甘精胰岛素结晶母液(8mg/ml)：甘精胰岛素42.72mg，500mm苯酚溶液50μl，0.1m醋酸锌60μl，0.01mhcl4.9ml。
甘精胰岛素结晶溶液(4mg/ml)：取甘精胰岛素结晶母液(8mg/ml)300μl，加300μl水，混匀。
1mtris-1m柠檬酸溶液：称取tris12.10g，无水柠檬酸19.27g，加水100ml溶解。
4mnaoh：称取氢氧化钠1.16g，加水5ml溶解。
1m乙酸铵：称取乙酸铵388.6mg，加水5ml溶解。
4mnacl：称取氯化钠1.16g，加水5ml溶解。
结晶液母液：用4mnaoh调节1mtris-1m柠檬酸溶液ph值至9.0。
不同的结晶液：将结晶母液分别稀释至表3中的浓度，依据表4所示分别加入不同浓度的乙酸铵、乙腈、乙醇和nacl，详见表4。
表4不同的结晶液的组成
该方法包括以下步骤：
分别取表3中的结晶液500μl加入带硅胶的24孔悬滴法晶体培养板的母液池中。
分别取2μl结晶液和2μl胰岛素结晶溶液在盖玻片上混匀，将盖玻片倒盖在母液池上，胰岛素结晶溶液悬滴在盖玻片上，在温度22℃下静置培养。培养2-4天后在显微镜下观察晶体。
结果：
1、序号1～4对应的条件中，tris和柠檬酸的浓度在0.25～1.0m，未加入乙酸铵、乙腈、乙醇或氯化钠等其它物质。当tris和柠檬酸的浓度在0.75m和0.5m时，有晶体析出，但是形状不规则，没有棱角，不是单晶，其中0.75m时的析出的晶体较0.5m略多；其他浓度没有晶体析出。
2、序号6～8对应的条件中，结晶液含有乙腈、乙醇或nacl但没有乙酸铵，没有晶体析出。
3、当结晶液ph9.0，加入乙酸铵且浓度在20～100mm时，均有晶体析出；当乙酸铵浓度在20mm时，析晶效果最佳，有规则的立方体形状的晶体出现。
4、在0.75mtris、0.75m柠檬酸、20mm乙酸铵、ph9.0条件下晶体生长状况最好，能够形成规则的立方体形状的单晶。
实验例8：不同结晶液乙酸铵浓度优化
配制溶液：
甘精胰岛素结晶溶液：称取甘精胰岛素23.24mg，加0.01m盐酸溶液5ml溶解，加1m苯酚溶液25μl，0.5m乙酸锌溶液6.7μl，摇匀即得。
1mtris-1m柠檬酸溶液：称取tris12.12g，无水柠檬酸19.36g，加水100ml溶解。
12mnaoh：称取氢氧化钠24.03g，加水30ml溶解。
1m乙酸铵：称取乙酸铵388.6mg，加水5ml溶解。
结晶液母液：用12mnaoh调节1mtris-1m柠檬酸溶液ph值至10.5。
乙酸铵系列结晶液：将结晶母液分别稀释至表4中的浓度，制成乙酸铵系列结晶液，详见表5。
表5含有不同浓度乙酸铵的结晶液的组成
该方法包括以下步骤：
分别取表3中的结晶液400μl加入带硅胶的24孔悬滴法晶体培养板的母液池中。
分别取2μl结晶液和2μl胰岛素结晶溶液在盖玻片上混匀，将盖玻片倒盖在母液池上，胰岛素结晶溶液悬滴在盖玻片上，在温度22℃下静置培养。培养1-4天后在显微镜下观察晶体。
结果：
当乙酸铵浓度为10mm时，没有长出晶体；乙酸铵浓度在15-35mm之间，均可得到晶体；当乙酸铵浓度为25mm时，晶体为规则的立方体即单晶。
对比例1
本对比例提供制备甘精胰岛素晶体的方法。与实施例1相比，区别仅在于，结晶液的ph值为8.0。
在本对比例提供的条件下，有大量沉淀析出，得不到甘精胰岛素晶体。
对比例2
本对比例提供制备甘精胰岛素晶体的方法。与实施例1相比，区别仅在于，结晶液中tris和柠檬酸的浓度均为0.3m。
在本对比例提供的条件下，得到的晶体大多形状不规则，偶尔有立方体形状的晶体，不能用于晶体结构解析。
对比例3：选用市售试剂盒中的结晶液制备甘精胰岛素晶体
配制溶液：
甘精胰岛素结晶溶液：甘精胰岛素42.72mg，500mm苯酚溶液50μl，0.1m醋酸锌60μl，0.01mhcl4.9ml。
结晶试剂盒(48个条件)：macromolecularcrystallizationkit-crystalscreen2(hamptonresearch)
取试剂盒中48个条件分别取500μl加入带硅胶的24孔悬滴法晶体培养板的母液池中加入，取2μl结晶液和2μl胰岛素结晶溶液在盖玻片上混匀，将盖玻片倒盖在母液池上，胰岛素结晶溶液悬滴在盖玻片上，在温度22℃下静置培养。培养2-4天后在显微镜下观察晶体。
结果：各条件下均没有得到甘精胰岛素晶体；在ph6.5-7.5条件下更易析出沉淀，即在此条件下相对饱和度过高，蛋白发生变性或形成异构体；在以盐为沉淀剂的条件下更易析出沉淀，说明甘精胰岛素在此条件下溶解度较差。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
1.一种制备甘精胰岛素晶体的方法，其特征在于，采用气相扩散悬滴法，包括如下步骤：
(1)配制含有如下成分的结晶液：tris0.2～1.0m，柠檬酸0.2～1.0m；所述结晶液的ph为8.0～11.0；
(2)将甘精胰岛素溶液与所述结晶液混合，得到混合结晶溶液；
(3)将所述混合结晶溶液悬滴于盛有所述结晶液的母液池上方，静置培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结晶液的ph为9.0～10.5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结晶液中还含有乙酸铵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述结晶液中乙酸铵的浓度为10.0～100mm，优选为15～35mm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘精胰岛素溶液中甘精胰岛素的浓度为3～10mg/ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甘精胰岛素溶液中还含有酚类衍生物、含锌物质和酸；
所述酚类衍生物选自苯酚、间甲酚或对羟基苯甲酸甲酯，优选为苯酚；
所述含锌物质选自乙酸锌、氯化锌、溴化锌或硫酸锌，优选为乙酸锌；
所述酸选自醋酸、柠檬酸、盐酸或硫酸，优选为盐酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述甘精胰岛素溶液中，苯酚的浓度为3～10mm，乙酸锌的浓度为0.6～1.5mm；
优选地，所述甘精胰岛素溶液中含有如下成分：甘精胰岛素3～5mg/ml，苯酚4～6mm，乙酸锌0.6～0.8mm。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述甘精胰岛素溶液与所述结晶液混合时二者的体积比为1:(0.5～1.5)，优选为1:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静置培养的温度为20～25℃；优选地，所述静置培养的时间为1～4天。
10.一种甘精胰岛素晶体结构解析方法，其特征在于，先用权利要求1～9任意一项所述方法制备得到甘精胰岛素晶体。
技术总结