本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种可调控频数的稳定且均一的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物(peptide-mhc，pmhc)多聚体(dna-pmhc)及其制备方法，以及用于小鼠抗原特异性t细胞检测的应用。
背景技术：
t细胞是适应性细胞免疫的核心，可以抵抗病原体感染和癌症。关于抗原特异性t细胞的检测、分析及分型的研究，对监测预防型或治疗型疫苗、免疫治疗的病程进展起着至关重要的作用。pmhc与某特定特异性(由主要组织相容性复合物(mhc)等位基因和肽的组合决定)的t细胞受体(tcr)直接结合。因此，抗原特异性t细胞可以通过可溶性pmhc被检测、分析、及分选出来。tcr-pmhc相互作用决定了t细胞的选择、发育、分化、功能。然而，tcr与pmhc的结合亲和力很弱(kd，约1-200μm，比典型抗体-抗原相互作用弱1000-200000倍)，且解离速率非常快(koff，～0.05s-1)。
由于核酸框架结构的特殊性质，即可寻址性，可以选取组成核酸框架结构中的短的单链dna的个数及其位置，实现所需要修饰上的单体的个数及位置定位。目前关于pmhc多聚体的合成中，还没有涉及到单体的数目以及位置的可调控性的相关报道。
已存在的pmhc多聚体主要还存在以下几个问题：i.制备方面，合成的多聚体不均一；ii.性能方面，商品化四聚体和五聚体相比于单体，与t细胞表面的受体结合力有所提高，但仍较低；iii.免疫检测方面，pmhc多聚体用于检测抗原特异性t细胞的灵敏度较低，难以实现低亲和力或低频数的t细胞检测。因此，制备出稳定、均一的pmhc多聚体用于抗原特异性t细胞的高灵敏度检测，将具有重要的研究意义和应用价值。
技术实现要素：
针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于解决了多聚体合成不均一的问题，实现了生物蛋白分子在纳米尺度上相对位置及数目的可控性；选用了生物相容性好的核酸结构作为支架，制备得到的dna-pmhc多聚体具有良好的稳定性，可用于抗原特异性t细胞的有效检测。
本发明提出的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物(peptide-mhc，pmhc)多聚体(dna-pmhc)的制备方法中，dna-pmhc多聚体的制备机理如图1所示：
以长的m13mp18单链噬菌体dna为支架，短的单链dna作为“订书钉链”，根据核酸框架结构的可寻址性，实现纳米粒子、生物蛋白分子等的精准组装和定位，通过合理设计，选择一定个数及位置(即生物素在dna上的位置)的生物素修饰的短的单链dna做生物素化修饰，经过pcr退火处理后，形成有一定个数及位置生物素化的核酸框架结构(所述生物素化的个数由选取的短链dna数目决定，所述生物素化的位置与核酸框架结构设计图位置相对应)；通过链霉亲和素-生物素系统，即先将藻红蛋白修饰的链霉亲和素结合至所述核酸框架结构修饰有生物素化dna的位置，再以链霉亲和素为媒介将生物素化的pmhc单体定点结合到所述核酸框架结构上(即设计所述生物素修饰的短的单链dna的位置)，最终形成dna-pmhc多聚体。
根据上述原理，本发明采用如下的技术方案：
本发明提出的一种基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物(peptide-mhc，pmhc)多聚体(dna-pmhc)的制备方法，包括以下步骤：
(1)将m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的短的单链dna、生物素修饰的短的单链dna混合，溶液体系为含有镁离子的1xtae缓冲体系，通过梯度pcr仪进行95～25℃的梯度降温，得到生物素化的核酸框架结构；
(2)合成核酸框架结构后，用超滤管进行纯化去除多余短链dna，加入藻红蛋白修饰的链霉亲和素孵育后，用超滤管去除未连接的藻红蛋白修饰的链霉亲和素，随后加入生物素化的肽-主要组织相容性复合物单体(pmhc单体)，得到所述基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)。
本发明中，所述多聚体dna-pmhc上修饰有一定个数及间距的pmhc单体。该多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的个数及间距，由设计核酸结构时选取的生物素化的单链dna条数及在核酸框架结构上的位置所决定，多聚体dna-pmhc所带有的荧光种类由添加的链霉亲和素所修饰的荧光基团(如藻红蛋白是一种荧光基团，商品化的荧光基团修饰的链霉亲和素有很多种，还有例如fitc、cy5等)所决定。
本发明中，所述“可调控频数的稳定且均一”是指由于核酸框架结构的特殊性质，即可寻址性，本发明可以选取组成核酸框架结构中的短的单链dna的个数及其位置，实现所需要修饰上的pmhc单体的个数及位置定位。
其中，所述步骤(1)中，
所述m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的短的单链dna、生物素修饰的短的单链dna的摩尔浓度比为：1：(5～10)：(5～10)；优选是1：10：10。
所述溶液体系镁离子的浓度为10mmol/l～12.5mmol/l；优选地，为12.5mmol/l。
所述梯度降温为从95℃降至25℃，每秒降低0.1℃。
所述m13mp18单链dna是指来自m13mp18的单链环状病毒dna。m13mp18噬菌体在大肠杆菌er2738中繁殖，噬菌体经聚乙二醇沉淀纯化，然后用苯酚提取所获得的单链dna，所述m13mp18单链dna已经商品化，常作为核酸框架结构的脚手架链。在一具体实施方式中，所述m13mp18单链dna长7249个碱基。
所述短的单链dna作为核酸框架结构的“订书钉链”，可以将m13mp18折叠并组装成方形、三角形和十字形等形状。
所述生物素修饰的短的单链dna是指选择所需要的“订书钉链”在5’端作生物素化修饰。
本发明所述核酸框架结构的合成是基于dna折纸术，即从m13mp18噬菌体中提取的一种长单链dna分子(脚手架链)被订书钉链折叠并组装成方形、三角形和五角星等图案。
所述生物素修饰的短的单链dna可实现多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的不同数目和间距的调控；所述数目的范围为1～15，间距的范围为20nm～100nm(优选为20nm或40nm)。
其中，所述步骤(2)中，
所述超滤管为100kd。
所述超滤的条件为超滤离心的转速为10000g～12000g，时间为2min～3min；优选为：超滤离心的转速为10000g，时间为2min。
所述生物素化的pmhc单体为h-2kb限制性ova的抗原肽(siinfekl)。
所述核酸框架结构与藻红蛋白修饰的链霉亲和素的摩尔浓度比为1：(5～10)；优选为1：5。
所述核酸框架结构修饰上的链霉亲和素的浓度和生物素化的pmhc单体的摩尔浓度比是1：(5～10)；优选为1：5。其中，核酸框架结构修饰上的链霉亲和素的浓度是由核酸框架结构的浓度乘以修饰上的链霉亲和素的个数得出。
m13mp18单链dna是已经商品化的产品，其序列已经公开。不同形状的核酸框架结构有不同数目不同序列的上百条单链dna，即“订书钉链”，本发明具体实施例采用了三角形的形状，长链是有7249个碱基的m13mp18单链dna，有208条单链dna，已有文献报道了该三角形结构。本发明也可以采用其他形状的核酸框架结构。
具体地，所述步骤包括：
(1)将一条长的7249碱基的m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的几百条短的单链dna、几条生物素修饰的短的单链dna按照1：10：10的摩尔比混合，溶液体系为含有12.5mmol/l镁离子的1xtae缓冲体系，使用梯度pcr仪以每秒降0.1℃的速度，从95℃缓慢降到25℃，得到生物素化的核酸框架结构，其形状为边长约为120nm的三角形，上有一定的生物素位点。
(2)将上述步骤(1)的生物素化的核酸框架结构采用100kd的超滤管超滤纯化，超滤离心的转速为10000g，时间2min，随后倒扣超滤管于接收管中，离心转速2000g，2min，获得纯化后的生物化的核酸框架结构。以1：5的摩尔浓度(所述核酸框架结构：藻红蛋白修饰的链霉亲和素)加入藻红蛋白修饰的链霉亲和素后，在振荡器上室温震荡30min后采用相同的超滤纯化后，以1：20的摩尔浓度加入生物素化的pmhc单体，室温震荡30min，制得基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)。该多聚体dna-pmhc上修饰有一定个数及间距的pmhc单体。该多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的个数及间距，由设计核酸结构时选取的生物素化的单链dna条数及位置所决定，多聚体dna-pmhc所带有的荧光种类由添加的链霉亲和素所修饰的染料所决定。
其中，步骤(1)中，得到的生物素化的核酸框架结构保存于4℃冰箱内。
其中，步骤(2)中，超滤纯化的次数可多次，优选为三次。
本发明还提供了由上述方法制备得到的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，所述基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc上修饰有一定个数及间距的pmhc单体；该多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的个数及间距，由设计核酸结构时选取的生物素化的单链dna条数及在核酸框架结构上的位置所决定，多聚体dna-pmhc所带有的荧光种类由添加的链霉亲和素所修饰的荧光基团所决定(如藻红蛋白是一种荧光基团，商品化的荧光基团修饰的链霉亲和素有很多种，还有例如fitc、cy5等)。
本发明的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)组成简单、制备方便、生物相容性好、稳定性高、特异性好。
在一具体实施方式中，所述核酸结构为由一条长的m13mp18单链dna和208条短的单链dna通过碱基互补配对原则，形成边长约为120nm的二维三角形框架结构；通过选取208条短链dna中的任意一条或多条替换为相应的生物素化dna，即可通过链霉亲和素-生物素系统，将pmhc单体定位至所选取的核酸框架结构上的位置(即选取生物素化dna的位置)；得到的多聚体dna-pmhc所带有的荧光种类由添加的链霉亲和素所修饰的染料所决定。
本发明还提出了一种基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc，该多聚体dna-pmhc上修饰有一定个数及间距的pmhc单体。该多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的个数及间距，由设计核酸结构时选取的生物素化的单链dna条数及位置所决定，多聚体dna-pmhc所带有的荧光种类由添加的链霉亲和素所修饰的染料所决定。
本发明还提出了所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)检测抗原特异性t细胞中的应用，所述多聚体dna-pmhc可以用于小鼠抗原特异性t细胞中的检测。
本发明还提出了一种免疫检测试剂或试剂盒，用于检测抗原特异性t细胞，所述试剂或试剂盒中含有所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)作为一种免疫检测试剂。
本发明中，所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)可以有效检测抗原特异性t细胞。
本发明中，所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)用于t细胞检测，具有如下特征：①dna-pmhc多聚体具有较强且稳定的荧光标记；②dna-pmhc多聚体具有良好的生物相容性，不会对细胞产生杀伤性作用；②dna-pmhc多聚体检测具有较高的灵敏度和特异性。
本发明中，所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，使用的pmhc单体包括但不仅限于小鼠h-2kb限制性ova的抗原肽(siinfekl)。
本发明中，所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，包括但不限于作为免疫检测试剂。
本发明中，所述基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，包括但不限于用于小鼠t细胞检测。
本发明有益效果包括：本发明所提供的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)的制备方法，反应条件简单，耗时短，产品均一性高。所述制备方法反应条件简单，合成步骤少，耗时短。本发明所提供的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，具有生物相容性好，荧光强度标记高、检测灵敏度好的优点，可实现抗原特异性t细胞的有效检测。本发明所述的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)用于高效检测分析抗原特异性t细胞，具有潜在的应用价值。所述核酸框架结构生物相容性好，可通过设计生物素化dna的位置与数目，精确控制pmhc组装的位置和数量，合成稳定且均一的多聚体。多聚体与某特定特异性(由主要组织相容性复合物(mhc)等位基因和肽的组合决定)的t细胞受体直接结合。本发明所述的多种dna-pmhc多聚体可用于检测淋巴细胞中抗原特异性t细胞群，灵敏度高，特异性好，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是本发明基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)的制备机理图。
图2是本发明实施例1中制备的三种连有链霉亲和素的核酸结构和基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)的原子力显微镜表征图。
图3是核酸结构(实施例2中制备的生物素化的核酸结构)在血清培养中孵育不同时间的稳定性情况。
图4是核酸结构(实施例2中制备的生素化的核酸结构、连有链霉亲和素的核酸结构)的细胞毒性实验。
图5是特异性组和对照组(实施例2中制备的dna-pmhc多聚体)的小鼠抗原特异性t细胞检测实验。
具体实施方法
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有限制内容。
实施例1
(1)将m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的单链dna、生物素修饰的单链dna按照1：10：10的摩尔比混合，溶液体系为含有12.5mm镁离子的1xtae缓冲体系，使用梯度pcr仪以每秒降0.1℃的速度，从95℃缓慢降到25℃，得到生物素化的核酸框架结构。共制备得到三种有不同个数及位置生物素化位点的核酸结构，分别为有3个生物素化位点的三角形、有6个位点的三角形、有15个位点的三角形。
(2)将上述步骤(1)的三种有不同个数及位置生物素化位点的核酸结构采用100kd的超滤管超滤纯化，超滤离心的转速为10000g，时间2min，随后倒扣超滤管于接收管中，离心转速2000g，2min，获得纯化后的生物化的核酸框架结构。以1：5的摩尔浓度加入链霉亲和素后，在振荡器上室温震荡30min后采用相同的超滤纯化后，按照核酸框架结构对应链霉亲和素摩尔浓度和pmhc单体的摩尔浓度比是1：5，加入生物素化的pmhc单体，室温震荡30min，制得基于三种核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，分别为单体个数为3个且三角形的框架结构三边各一个，单体个数为6个且三角形的框架结构每边两个其间距为40nm，单体个数为15个且每边为5个其间距为20nm。
实施例2
(1)将m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的单链dna、生物素修饰的单链dna按照1：10：10的摩尔比混合，溶液体系为含有12.5mm镁离子的1xtae缓冲体系，使用梯度pcr仪以每秒降0.1℃的速度，从95℃缓慢降到25℃，得到15个生物素化位点的核酸框架结构。
(2)将上述步骤(1)的核酸结构采用100kd的超滤管超滤纯化，超滤离心的转速为10000g，时间2min，随后倒扣超滤管于接收管中，离心转速2000g，2min，获得纯化后的生物化的核酸框架结构。将生物素化的核酸结构与含有10％的细胞培养基在37℃下分别混合0.5、1、4、8、12、24小时，通过1％的琼脂糖凝胶电泳表征，电压100v，时间90min，染色剂gelred，以m13mp18为marker，存在于1xtae中的结构为对照组。经过24小时，不同条带依旧清晰，且与对照组相比无明显变化。这说明核酸结构可以稳定地存在完全培养基中。
实施例3细胞毒性实验
用0.22μm无菌滤膜对实验例2中制备的核酸结构和连有链霉亲和素的核酸结构进行过滤，除去溶液中的细菌。将除菌的结构用于小鼠淋巴细胞毒性实验，作为实验组；空白作为对照组。
本实验采用mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法测定细胞的活力。通过测定核酸结构对细胞的毒性，进而评价核酸结构的生物相容性。
(1)用无菌pbs充填96孔板的边缘孔；采用淋巴分离液获得小鼠淋巴细胞悬液，调整细胞悬浮浓度为50000个/ml，每孔加入100μl细胞悬液。
(2)5％co2，37℃孵育，加入10μl核酸结构和链霉亲和素化的核酸结构，使其终浓度分别为1nm、5nm、10nm、20nm，每组设定3复孔。
(3)细胞放入培养箱，在5％co2，37℃孵育24h。
(4)每孔加入20μl5mg/mlmtt，继续培养4h。
(5)终止培养，离心去除细胞上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜重悬，摇床低速振荡10分钟，之后用酶标仪检测od490nm各孔的吸光值。
(6)同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、同浓度的核酸结构、培养基、mtt、二甲基亚砜)。
(7)计算细胞存活率(cellviability)：
细胞存活率＝(核酸结构组a值-调零孔a值)/(对照孔a值-调零孔a值)*100％
如图4所示，用淋巴细胞进行细胞毒性实验。实验结果显示，不同浓度核酸结构下细胞的存活率都接近100％。这说明核酸结构对淋巴细胞的毒性小，即说明了核酸结构的生物相容性好。
实施例4：
以实施例1中制备的dna-pmhc多聚体用于ot-i小鼠淋巴细胞的检测，为实验组；以野生型小鼠为对照组。
(1)淋巴细胞制备
取6-8周小鼠颈椎脱臼处死后，取脾脏研磨获得单细胞悬液后，采用淋巴分离液分离获得小鼠淋巴细胞。用rpmi1640完全培养基重悬细胞备用。以ot-i小鼠为阳性组，野生型小鼠为阴性组。
(2)细胞染色
调整细胞浓度为1x106/ml，取100ul细胞加入染色管，取上清液后，用染色缓冲液重悬，加入1％cd16/cd32在4℃下孵育30min。然后分别用三种dna-pmhc多聚体(3位点、6位点、15位点)、bv570anti-cd8,percp/cyanine5.5anti-cd4,fitcanti-cd3,anti-cd11b,anti-cd11c,anti-gr1,anti-f4/80,andaqualive/deadcell混合液室温下染色30min。随后用流式细胞仪检测分析。
如图5所示，通过阴性组和阳性的对照比较，发现阴性组基本均未检测到细胞，阳性组检测到的比例很高，且15位点检测到的百分比最大。说明基于基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)能有效地检测到抗原特异性t细胞，灵敏度好，特异性高。
如上述仅为本发明的几个具体实施例，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，采用与其相同或相似方法得到的基于核酸结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体(dna-pmhc)，均在本发明保护范围内。
1.一种基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc的制备方法，其特征在于，该方法的步骤包括以下：
(1)将m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的短的单链dna、生物素修饰的短的单链dna混合，溶液体系为含有镁离子的1xtae缓冲体系，进行梯度降温，得到所述核酸框架结构；
(2)合成所述核酸框架结构后，用超滤管进行纯化去除多余短链dna，加入藻红蛋白修饰的链霉亲和素孵育后，用超滤管去除未连接的藻红蛋白修饰的链霉亲和素，随后加入生物素化的pmhc单体，得到所述基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述m13mp18单链dna、组成核酸框架结构的短的单链dna、生物素修饰的短的单链dna混合的摩尔浓度比为：1：(5～10)：(5～10)。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述生物素修饰的短的单链dna可实现多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的不同数目和间距的调控；所述数目的范围为1～15，间距的范围为20nm～100nm。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述溶液体系镁离子的浓度为12.5mmol/l。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述梯度降温为从95℃降至25℃，每秒降低0.1℃。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述超滤管为100kd。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述核酸框架结构与藻红蛋白修饰的链霉亲和素的摩尔浓度比为1：(5～10)。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述pmhc单体为h-2kbova-siinfekl。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述核酸框架结构对应链霉亲和素和生物素化的pmhc单体的摩尔浓度比是1：(5～10)。
10.如权利要求1所述制备方法制备得到的基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc。
11.一种基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc，其特征在于，所述基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc上修饰有一定个数及间距的pmhc单体；该多聚体dna-pmhc修饰上的pmhc单体的个数及间距，由设计核酸结构时选取的生物素化的单链dna条数及在核酸框架结构上的位置所决定，所述多聚体dna-pmhc所带有的荧光种类由添加的链霉亲和素所修饰的荧光基团所决定。
12.如权利要求10、11所述的基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc在检测抗原特异性t细胞中的应用。
13.如权利要求10、11所述的基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc在制备免疫检测试剂中的应用。
14.一种抗原特异性t细胞的免疫检测试剂或试剂盒，其特征在于，含有如权利要求10、11所述的基于核酸框架结构的肽-主要组织相容性复合物多聚体dna-pmhc。
技术总结