本发明涉及能够以高亲和力识别衍生自wt1抗原短肽的tcr。本发明还涉及转导上述tcr获得的wt1特异性的t细胞，以及他们在预防和治疗与wt1相关肿瘤中的应用。
背景技术：
t细胞免疫疗法是肿瘤免疫治疗中一种十分重要的方法。通过从肿瘤组织中分离出肿瘤浸润性淋巴细胞(til)，经过体外克隆和扩增后再回输给病人，能够对放、化疗产生耐受的晚期癌症病人产生良好的临床治疗效果(dudleymeetal.，science，2002，298(5594)：850-854)。但由于til的分离和培养不仅条件苛刻，为达到临床治疗的细胞数所需的时间长，更主要的是到目前为止，能够成功地分离出til的肿瘤组织还非常有限，从而使得til在肿瘤临床中的应用受到了限制。
t细胞识别肿瘤主要是通过其表面上的t细胞受体(tcellreceptor，tcr)来实现。tcr具有识别肿瘤细胞上人类主要组织相容性复合体(mhc)-抗原肽复合物的能力。tcr由α、β两条肽链形成异质二聚体结构。每条肽链各包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常被视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(frameworkregions)中的3个cdr(互补决定区)，即cdr1、cdr2和cdr3。cdr区决定了tcr与mhc复合物的结合，其中cdr3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区，它直接决定了tcr的抗原特异性。在tcr识别mhc-抗原肽复合物时，cdr3可直接与抗原肽结合。tcr的α和β链一般看作各有两个“结构域”，即可变区和恒定区，其中可变区中包含连接区。tcr恒定区的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(imgt)的公开数据库中找到，如tcr分子α链的恒定区序列为“trac”，tcr分子β链的恒定区序列为“trbc1”或“trbc2”。此外，tcr的α和β链还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。
利用基因转导的方法将能够识别肿瘤细胞的tcr转入病人的免疫t细胞中去，就可以将病人的t细胞改造为对肿瘤有特异性的细胞毒性t细胞(tcr-t)。当将此种基因工程改造的tcr-t送到病人体内时，这些对肿瘤有特异性的tcr-t在遇到肿瘤细胞上的mhc-肽复合物时，就会通过识别而被激活，从而在病人体内扩增，并通过杀伤肿瘤细胞而达到治疗肿瘤的效果。
wt1属于肿瘤相关性抗原(tumorassociatedantigen，taa)。wt1是一个胚胎发育过程中的转录因子。在成年人中，wt1在肾足细胞，睾丸，卵巢，乳腺肌上皮细胞和部分来自骨髓的cd34 干细胞中都有一定的表达，但是wt1在正常组织中的表达程度很有限(yangletal.，leukemia，2007，21(5)：868-876)。而在大多数白血病中，wt1则明显过度表达(menssenhdetal.，leukemia，1995，9(6)：1060-1067；yongasetal.，leukemia，2008，22(9)：1721-1727)。尤其是在aml和cml的cd34 的干细胞中明显过度表达(saitoyetal.，scitranslmed，2010，2(17)：17ra9；gerberjmetal.，amjhematol，2011；86(1)：31-37)。由于wt1的表达水平与预后结果呈负相关(bergmannletal.，blood，1997，90(3)：1217-1225)，所以目前临床上采用wt1作为标志物来监测白血病人的残留疾病(cillonid&sagliog.actahaematol，2004，112(1-2)：79-84；schroedertetal.，blood，2014，124(21)：4661-4662)，并预测白血病的复发(tamakihetal.，blood，1996，88(11)：4396-4398)。除了在多种白血病中过度表达外，wt1还在多种实体瘤中也过度表达(nakatsukas等，modpathol，2006，19(6)：804-814)。所以有研究指出wt1是肿瘤免疫治疗的优良靶抗原(cheevermaetal.，clincancerres，2009，15(17)：5323-5337)。wt1在细胞内生成后被降解成小分子多肽，在与mhc分子结合形成复合物后，被呈递到细胞表面。rmfpnapyl是衍生自wt1抗原的短肽，是治疗wt1相关肿瘤的一个靶标。对于上述这些与wt1相关的恶性肿瘤，传统的疗法是采用放疗和化疗等方法，但都会对病人的正常细胞造成损害。最新的研究表明，利用能够识别rmfpnapyl抗原肽的tcr-t来对肿瘤进行免疫基因治疗时，它不仅可以克服传统放、化疗的无特异性以及相应的毒副作用，而且通过给病人输入能够识别rmfpnapyl抗原肽的wt1-tcr-t时，可以使100％的肿瘤病人不再复发(chapuis等，natmedicine，2019，25(7)：1064-1072)。这无疑是一个十分喜人的研究成果。该文献报道的tcr是从人白细胞抗原hla-a2阳性供者的t细胞中分离而来，那么根据免疫学原理，它应该不是一个高亲和力的tcr。这是因为wt1是一个自身抗原，所以为了避免自身免疫疾病，hla-a2阳性供者体内对wt1具有高亲和力的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)早在胸腺细胞的阴性选择过程中就被删除掉了。这样一来，在供者体内自身的t细胞中，往往只有对wt1这一自身抗原产生耐受而且亲和力较低的wt1-ctl才能存活下来。由于低亲和力的ctl往往具有较差的抗肿瘤活性(derby等，j.immunol.2001，166：1690-1697)，因此以t细胞为基础的肿瘤免疫治疗的一个非常重要的目标就是要能够获取对肿瘤抗原具有高亲和力和特异性的ctl(zeh等，jimmunol.1999，162∶989-994)。
美国专利us8697854b2描述了一种非自我限制性或者叫异体限制性ctl的方案来获取高亲和力的ctl。通过采用异体限制性ctl的方案，他们获得了对肿瘤相关性抗原酪氨酸酶有特异性的ctl与高亲和力的tcr。该技术的原理是基于采用自身的mhc-肽复合物来刺激异体的ctl，由于来自异体的ctl并未经过自身mhc的阴性选择过程，因而它们含有对自身mhc高度敏感的ctl与高亲和力的tcr。但该方案也有一个明显的缺点就是在对自身的mhc-肽复合物产生免疫应答的t细胞中，只有一小部分是既受mhc的限制，又对抗原肽有特异性，而往往大部分的细胞是只识别了mhc，而不具备对抗原肽的特异性。也就是说用此方法刺激出来的ctl，其中大多数是非特异性的t细胞。如果用这样的ctl来治疗肿瘤，则它们会引起严重的非特异性免疫反应。
因此，仍然需要寻找其他对肿瘤抗原wt1既有高亲和力又具特异性的ctl，进而分离并获取对肿瘤抗原具有高亲和力和特异性的tcr。
技术实现要素：
为了获得既受mhc的限制，又对抗原肽有特异性的那一小部分有益的ctl，我们对在刺激过程中产生免疫应答的混合t细胞进行单细胞克隆。由于培养t细胞本身就是一个十分困难的实验，如果要把它们分放在每孔中只有一个t细胞的环境中，则就更是难上加难了，因为一个t细胞是很难生存的，所以要想让它生存下来并得到扩增，则整个实验的难度将大大增加，或者说实验成功的可能性也就大大降低了。经过多次的重复实验与大量的筛选工作，我们获得了一株对wt1具有高亲和力与特异性的细胞毒性ctl，并进一步分离而获得了其对wt1具有高亲和力与特异性的tcr。
第一方面，本发明提供了一种t细胞受体(tcr)，其特征在于，所述t细胞受体能够以高亲和力与rmfpnapyl-hla-a0201复合物结合，所述的tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区；优选地，所述tcrα链可变区包含三个互补决定区(cdr)，其序列为seqidno：2-4；所述tcrβ链可变区包含三个互补决定区(cdr)，其序列为seqidno：5-7。
第二方面，本发明提供了一种多价tcr复合物，其特征在于，包含至少两个tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为第一方面所述的tcr。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码第一方面所述的tcr的核苷酸序列或其互补序列，或第一方面所述的tcr的氨基酸序列对应的密码子优化的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供了一种载体，其特征在于，所述的载体含有第三方面所述的核酸分子。
第五方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有第四方面所述的载体或染色体中整合有外源的第三方面所述的核酸分子。
第六方面，本发明提供了一种细胞，其特征在于，所述细胞为被第三方面所述的核酸分子或第四方面所述载体转导的细胞。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有第一方面所述的tcr、第二方面所述的tcr复合物、第三方面所述的核酸分子、或第六方面所述的细胞，以及可药用的载体。
第八方面，本发明提供了第一方面所述的t细胞受体、或第二方面所述的tcr复合物或第六方面所述的细胞用于制备治疗肿瘤或其他免疫性疾病的药物的用途。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。
附图说明
图1表示wt1特异性单克隆t细胞的cd8 及四聚体-pe双阳性染色结果。
图2表示将本发明的wt1-tcr转入人的t细胞后，wt1-tcr能够表达在被转导t细胞的表面上，并能被wt1-四聚体染色，从而显示它们通过tcr转导而具有wt1特异性；而模拟转导的t细胞则不能被wt1-四聚体染色，显示它们没有wt1特异性。
图3表示本发明的wt1-tcr新鲜转导的tcr-t细胞经抗原肽rmfpnapyl刺激后，其中wt1特异性的t细胞明显扩增。
图4表示本发明所用到的阳性靶细胞k562-a2-cd34-gfp与对照靶细胞raji-a2-cd34中a2与cd34染色以及gfp的表达情况。
图5表示本发明的wt1-tcr-t细胞在被特异性抗原肽刺激后能够产生ifn-γ，但在被对照抗原肽刺激后，并不产生ifn-γ，表明其具有自己应有的抗原特异性。
图6表示本发明的wt1-tcr-t细胞可以特异性识别纳摩尔级的wt1抗原肽。
图7表示用cba免疫因子检测法证明本发明的wt1-tcr-t细胞在被wt1抗原肽刺激后能够产生抗原特异性ifnγ、il2和tnfα，具有抗原特异性。
图8表示本发明的wt1-tcr-t细胞对白血病靶细胞具有选择性的杀伤作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
经过反复深入而又细致的大量研究，本发明人找到了能够与wt1抗原短肽rmfpnapyl(seqidno：1)特异性结合的tcr，所述抗原短肽rmfpnapyl可与hla-a0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述tcr的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体，被转导本发明tcr的细胞。本发明还提供了所述tcr、核酸分子、载体以及细胞用于制备治疗肿瘤或其他免疫性疾病的药物的用途。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述tcr的α链可变区包含具有以下氨基酸序列的cdr：
cdr1α-tsesdyy(seqidno：2)
cdr2α-qeaykqq(seqidno：3)
cdr3α-ayaynnndmr(seqidno：4)；和/或
所述tcrβ链可变区的3个互补决定区为：
cdr1β-mdhen(seqidno：5)
cdr2β-sydvkm(seqidno：6)
cdr3β-asspyyeqy(seqidno：7)。
其中一个或多个cdr中的至多三个(优选一个或两个)氨基酸残基可被另一氨基酸残基替代。通常，在这些变体中，一些氨基酸将被保守氨基酸所替换。这些保守氨基酸，我们包括以下几组：g、a；s、a、t；f、y、w；d、e；n、q和i、l、v。
可以将上述本发明的cdr区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合tcr。只要框架结构与本发明的tcr的cdr区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的cdr区就能够设计或合成出具有相应功能的tcr分子。因此，本发明tcr分子是指包含上述α和/或β链cdr区序列及任何适合的框架结构的tcr分子。
本发明tcrα链可变区为与seqidno：8具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列同一性的氨基酸序列；和/或本发明tcrβ链可变区为与seqidno：12具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的tcr分子是由α与β链构成的异质二聚体。
具体地，一方面所述异质二聚tcr分子的α链包含可变区和恒定区，所述α链可变区氨基酸序列包含上述α链的cdr1(seqidno：2)、cdr2(seqidno：3)和cdr3(seqidno：4)。优选地，所述tcr分子包含α链可变区氨基酸序列seqidno：8。更优选地，所述tcr分子的α链可变区氨基酸序列为seqidno：8。
另一方面，所述异质二聚tcr分子的β链包含可变区和恒定区，所述β链可变区氨基酸序列包含上述β链的cdr1(seqidno：5)、cdr2(seqidno：6)和cdr3(seqidno：7)。优选地，所述tcr分子包含β链可变区氨基酸序列seqidno：12。更优选地，所述tcr分子的β链可变区氨基酸序列为seqidno：12。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的tcr分子是由α链的部分或全部和/或β链的部分或全部组成的单链tcr分子。有关单链tcr分子的描述可以参考文献chung等(1994)proc.natl.acad.sci.usa91,12654-12658。
根据文献中所述，本领域技术人员能够容易地构建包含本发明cdrs区的单链tcr分子。具体地，所述单链tcr分子的α链和β链存在于同一多肽链中，其包含vα、vβ和cβ，优选地按照从n端到c端的顺序连接。为了表达单链tcr，提供一个编码tcrα链恒定区的构建体是十分有用的。
所述单链tcr分子的α链可变区氨基酸序列包含上述α链的cdr1(seqidno：2)、cdr2(seqidno：3)和cdr3(seqidno：4)。优选地，所述单链tcr分子包含α可变区氨基酸序列seqidno：8。更优选地，所述单链tcr分子的α链可变区氨基酸序列为seqidno：8。所述单链tcr分子的β链可变区氨基酸序列包含上述β链的cdr1(seqidno：5)、cdr2(seqidno：6)和cdr3(seqidno：7)。优选地，所述单链tcr分子包含β链可变区氨基酸序列seqidno：12。更优选地，所述单链tcr分子的β链可变区氨基酸序列为seqidno：12。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的tcr分子的恒定区是人的恒定区。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或imgt(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定区氨基酸序列。例如，本发明tcr分子α链包含的恒定区序列可以为“trac”，tcr分子β链包含的恒定区序列可以为“trbc1”或“trbc2”。imgt在trac中给出其第50位的氨基酸序列为leu，则在此表示为：trac的leu50，其他以此类推。优选地，本发明tcr分子α链的氨基酸序列为seqidno：10，和/或β链的氨基酸序列为seqidno：14。
在一个具体实施方案中，所述tcr为单链；优选地，所述tcr的α链可变区氨基酸序列为seqidno：26和/或所述tcr的β链可变区氨基酸序列为seqidno：28；更优选地，所述tcr是由α链可变区与β链可变区通过连接肽链seqidno：32连接而成，所述tcr的氨基酸序列为seqidno：30。
在本发明的另一个优选实施方案中，可以在α链恒定区的thr48和β链恒定区的ser57之间引入一个新的人工二硫键(通过用半胱氨酸代替这些残基来实现。而tcr连接肽中原有的天然二硫键则可以被继续保留在原位或被除掉。boulter等，2003，proteineng.16：707-711)。因此，本发明的tcr可以包含在其α和β链恒定区的残基间引入的由半胱氨酸形成的人工二硫键。应注意，恒定区间含或不含上文所述引入的人工二硫键，本发明的tcr均可含有trac恒定区序列和trbc1或trbc2恒定区序列。在天然tcr近膜区的cα与cβ链间存在一组天然二硫键，本发明中称其为“天然链间二硫键”，我们把在本发明中人工引入的，位置与天然链间二硫键位置不同的链间共价二硫键称为“人工链间二硫键”。优选地，所述人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：trac的thr48和trbc1或trbc2的ser57；trac的tyr10和trbc1或trbc2的ser17；trac的ser15和trbc1或trbc2的val13；trac的thr45和trbc1或trbc2的ser77；trac的thr45和trbc1或trbc2的asp59；trac的leu50和trbc1或trbc2的ser57；trac的arg53和trbc1或trbc2的ser54；trac的ser61和trbc1或trbc2的arg79；trac的pro89和trbc1或trbc2的ala19。
根据文献(knies等，oncotarget2016，7(16)：21199-21221)报道，在tcr的α链可变区与β链恒定区之间引入人工链间二硫键能够使tcr的稳定性得到提高。因此，本发明的tcr的α链可变区与β链恒定区之间还可以含有人工链间二硫键。在本发明中，可变区trav与trbv的氨基酸序列的位置编号，均按照imgt中列出的位置编号。具体地，在所述tcr的α链可变区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：trav的第46位氨基酸和trbc1或trbc2的第60位氨基酸；trav的第47位氨基酸和trbc1或trbc2的61位氨基酸；trav的第46位氨基酸和trbc1或trbc2的第61位氨基酸；或trav的第47位氨基酸和trbc1或trbc2的第60位氨基酸。
在另一个实施方案中，所述人工二硫键的半胱氨酸残基还取代了选自下列的一组或多组位点：trav的第48位，或第49位，或第50位的氨基酸，α链可变区与β链可变区之间的连接肽链的第17位，或第18位，或第19位的氨基酸。
另外，本发明的tcr还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合tcr。例如，有研究(cohen等，cancerres.2006，66：8878-8886)显示鼠科tcr在人t细胞中比人tcr能够更有效地表达。因此，本发明的tcr可包含由人的可变区和鼠的恒定区组成的杂合tcr。
将本发明的双链tcr分子(例如，包含seqidno10和no14中给出氨基酸序列的α和β链分子)或包含如上所述的特定cdr的嵌合tcr分子转入人的t细胞可以获取抗原特异性ctl；类似地，转导单链tcr也可用于获取抗原特异性ctl，并且单链tcr具有不与内源性tcr配对的优点。单链tcr也可以类似于抗体的方式制备成可溶性tcr。在可溶性tcr中，单链tcr不包含跨膜区域(参见chung等，同上；boulter等，同上)。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：ala(a)、arg(r)、asn(n)、asp(d)、cys(c)、gln(q)、glu(e)、gly(g)、his(h)、ile(i)、leu(l)、lys(k)、met(m)、phe(f)、pro(p)、ser(s)、thr(t)、trp(w)、tyr(y)、val(v)。
本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面tcr分子或其部分的核酸分子，所述部分可以是一个或多个cdr，α和/或β链的可变区，以及α链和/或β链。
编码本发明第一方面tcr分子α链cdr区的核苷酸序列如下：
cdr1α-accagtgagagtgattattat(seqidno：16)
cdr2α-caagaagcttataagcaacag(seqidno：17)
cdr3α-gcttatgcgtacaataacaatgacatgcgc(seqidno：18)
编码本发明第一方面tcr分子β链cdr区的核苷酸序列如下：
cdr1β-atggaccatgaaaat(seqidno：19)
cdr2β-tcatatgatgttaaaatg(seqidno：20)
cdr3β-gccagcagtccatactacgagcagtac(seqidno：21)
因此，编码本发明tcrα链的核酸分子的核苷酸序列包括seqidno：16、seqidno：17和seqidno：18，和/或编码本发明tcrβ链的核酸分子的核苷酸序列包括seqidno：19、seqidno：20和seqidno：21。
本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的，该核酸分子可以是dna或rna，并且可以包含或不包含内含子。优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明tcr的多肽，例如编码本发明tcrα链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含seqidno：9和/或编码本发明tcrβ链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含seqidno：13。或者，编码本发明tcrα链可变区的本发明核酸分子的核苷酸序列包含seqidno：27和/或编码本发明tcrβ链可变区的本发明核酸分子的核苷酸序列包含seqidno：29。或者，本发明核酸分子的核苷酸序列包含编码tcrα链的核苷酸序列seqidno：11和/或包含编码tcrβ链的核苷酸序列seqidno：15。或者，本发明核酸分子的核苷酸序列为seqidno：31。
应理解，由于遗传密码的简并，不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此，编码本发明tcr的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以本发明中的其中一个例子来说明，“简并的变异体”是指编码具有seqidno：8的蛋白序列，但与seqidno：9的序列有差别的核酸序列。
核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明tcr(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。dna可以是编码链或非编码链。
本发明还提供了一种表达载体，它包含本发明的多核苷酸。当存在于合适的宿主细胞中时，这样的表达载体允许表达目的多肽。优选地，该表达载体能够在哺乳动物细胞中表达多肽。更优选地，该表达载体能够在t细胞(例如人ctl)中表达多肽。通常，表达载体包含其在特定细胞类型中有活性的启动子，该启动子有可能是可控的(例如可诱导的)。
优选地，该表达载体是病毒载体；更优选地，该表达载体合适地是逆转录病毒载体，其能够转染到哺乳动物宿主细胞例如人的t细胞中。典型地，该载体是逆转录病毒载体。
本发明的另一方面提供了包含本发明的多核苷酸或本发明载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何细胞，例如细菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞或哺乳动物细胞，并且将多核苷酸转入此类细胞的方法是本领域众所周知的。通常，细菌细胞，例如大肠杆菌细胞用于本发明的多核苷酸和载体的繁殖与扩增。其他宿主细胞可以用于表达本发明的tcr分子，为了表达本发明的tcr分子，该宿主细胞需要包含一个或多个既编码α链部分又编码β链部分的核苷酸或载体。特别地，该细胞可以是哺乳动物细胞，例如人细胞。如下面关于使用本发明的tcr分子的治疗方法所描述的，特别理想的是，宿主细胞是t细胞，并且(优选地)源自待治疗的患者，通常是患有表达wt1恶性肿瘤患者的t细胞。
因此，本发明还包括表达本发明的tcr的细胞，特别是t细胞。优选地，该t细胞是来自肿瘤患者的t细胞，该t细胞(以患者为例)通常来源于外周血单核细胞(pbmc)，可以是在包含cd4 辅助性t细胞和/或cd8 细胞毒性t细胞的混合细胞群中。通常，t细胞可用抗体(如抗cd3和/或抗cd28抗体)来激活，以便使它们能够更容易地接受编码本发明tcr分子的逆转录病毒载体的转导并促进逆转录病毒的整合和肿瘤特异性tcr的稳定表达。本发明还涵盖了被本发明的核酸或载体转导的细胞；优选地，所述细胞为t细胞或干细胞；更优选地，所述细胞为来自患者的t细胞或干细胞。
临床治疗：
将本发明的tcr分子转入患有表达wt1的恶性肿瘤患者自身的t细胞(或来自供体的t细胞)，然后通过将这些tcr基因工程改造的细胞输入患者，可以实现对病人的治疗。因此，本发明的另一方面提供了一种治疗患有表达wt1的恶性肿瘤的方法，该方法包括用本发明的tcr分子优先转导来自患者的t细胞，然后将表达本发明tcr分子的t细胞再回输给患者。该治疗方法通常包括：(1)从患者获取t细胞，(2)将编码并能够表达本发明tcr分子的一种或多种多核苷酸在体外转入t细胞，(3)将tcr基因改造的t细胞回输给患者。如果t细胞是来自患者自身的，则是特别优选的。分离、转导以及回输给患者的细胞数量可以由医师确定。
备选地，本发明的细胞还可以是或衍生自人的干细胞，如造血干细胞(hsc)。将tcr基因转入hsc不会导致其细胞表面表达tcr，因为干细胞表面不表达cd3分子。然而，当tcr基因转导的干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoidprecursor)时，cd3分子的表达将会把该转入的tcr分子带到胸腺细胞的表面上来而形成肿瘤特异性t细胞。
通常情况下，用编码本发明tcr分子的逆转录病毒载体可以感染人的cd4 或cd8 t淋巴细胞并可介导tcr基因的表达：其逆转录病毒载体系统kat是一种优选的可能性(参见finer等(1994)blood，83(1)：43-50)。表达本发明tcr的t细胞可以用于过继免疫治疗恶性肿瘤。本领域技术人员能够知晓进行过继性免疫治疗的许多合适的方法(如，rosenberg等，(2008)natrevcancer，8(4)：299-308)。
本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与wt1相关疾病的方法，其包括过继性输入wt1特异性t细胞至该受试者的步骤。该wt1特异性t细胞可识别肿瘤细胞表面上表达的hla-a2/rmfpnapyl的复合物。
本发明的wt1特异性的t细胞可用于治疗任何递呈wt1抗原短肽rmfpnapyl-hla-a2复合物的wt1相关疾病。包括但不限于肿瘤，优选地所述肿瘤包括白血病(例如aml、cml和mds等)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、头颈癌、胶质母细胞瘤和肉瘤等。
临床治疗后，可以从患者体内取出t细胞，并进行冷冻保存。如果该患者出现复发，则可以对病人的t细胞进行tcr的重新转导与回输。
一个患者的肿瘤是否表达wt1可以使用rt-pcr或细胞内染色技术(采用抗wt1抗体)来确定。
虽然在研究情况下可以使用动物，但是患者优选为人类患者。特别优选地，患者是hla-a2阳性的。可以通过本领域众所周知的方法确定患者是否为hla-a2阳性。
本发明的另一方面提供了一种t细胞的用途，优选地是来源于患者的t细胞，该t细胞被修饰以表达本发明的tcr分子从而将其制成能够抵抗病人体内表达wt1肿瘤的药物。
本发明的主要优点在于：本发明的tcr能够以高亲和力与wt1抗原短肽复合物rmfpnapyl-hla-a2结合，因此本发明的wt1特异性的t细胞可用于治疗任何呈递wt1抗原短肽rmfpnapyl-hla-a2复合物的相关肿瘤。由于转导了本发明tcr的t细胞不仅能被呈递wt1的靶细胞特异性激活并扩增(图3)，而且能够产生抗原特异性免疫因子(图5-7)，同时能对肿瘤细胞产生选择性的杀伤作用(图8)，因此它比传统疗法可能具有更强的肿瘤特异性和更低的毒副作用。尤其是当肿瘤疾病发展到晚期扩散时，在传统疗法束手无策的时候，通过将本发明的wt1特异性的t细胞输入病人体内，则这些对wt1有特异性的t细胞就可以在体内通过循环而追踪任何转移的肿瘤细胞。
本文将通过以下具体实施例进一步阐述本发明。但应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1获取wt1抗原短肽特异性t细胞克隆
将来自hla-a2阴性的健康志愿者的外周血单核细胞(pbmc)用加载了合成短肽rmfpnapyl(seqidno：1；由深圳博润思达公司合成)的t2细胞(该细胞本身表达hla-a2，但由于其缺失了抗原处理相关因子tap，故可有效地加载外源肽)进行刺激，pbmc中能够识别hla-a2/rmfpnapyl复合物的t细胞将被激活并扩增。其中对抗原短肽rmfpnapyl有特异性的t细胞可以用pe标记的hla-a2-rmfpnapyl四聚体(mbl公司)进行检测。经扩增后的t细胞用四聚体-pe和抗cd8-apc进行染色分选，则可获得双阳性细胞。为了获得既受hla-a2的限制，又能识别抗原肽rmfpnapyl的真正的肿瘤特异性ctl，我们采用了有限稀释法对四聚体-pe和抗cd8-apc染色分选所获的双阳性细胞进行了单克隆培养。在筛选了360多个单克隆后，我们获得了一个既受到hla-a2的限制，又能识别抗原肽rmfpnapyl的肿瘤特异性t细胞克隆。该单克隆t细胞在用cd8和四聚体染色后，其流式细胞的facs数据如图1所示。
实施例2获取wt1抗原短肽特异性t细胞克隆的tcr基因与载体的构建
基因的克隆与重组的方法是本领域众所周知的，并在诸如(sambrook和russell等人，《分子克隆实验室手册》(molecularcl0ning-alaboratorymanual)(第三版)(2001)cshl出版社)等标准手册中有详细的描述。
具体地，用rnapure培养细胞总rna提取试剂盒(北京，天根生化科技有限公司)抽提实施例1中筛选到的抗原短肽rmfpnapyl特异性、hla-a2限制性的t细胞克隆的总rna。cdna的合成采用clontech的smarterracecdna扩增试剂盒，cdna的扩增采用的引物是3’-引物设计在人类tcr基因的c端恒定区，5’-引物则采用smarterracecdna扩增试剂盒中的smarteroligo，通过迅速扩增cdna而获得具有完整5’端的tcr的序列。扩增的产物在克隆到t载体(invitrogen)中后进行测序。所得序列为互补序列，并不包含内含子。经测序，该双阳性克隆表达tcr的α链包含具有以下氨基酸序列的cdr：
cdr1α-tsesdyy(seqidno：2)
cdr2α-qeaykqq(seqidno：3)
cdr3α-ayaynnndmr(seqidno：4)
β链包含具有以下氨基酸序列的cdr：
cdr1β-mdhen(seqidno：5)
cdr2β-sydvkm(seqidno：6)
cdr3β-asspyyeqy(seqidno：7)
采用重叠(overlap)pcr将tcrα链和β链的部分或全长基因通过gsg接头与p2a序列连接，就可以获得tcrα-2a-tcrβ片段。将此片段通过bamhi ecori双酶切，并克隆至逆转录病毒表达载体pbabe(addgene)当中，即可获得重组质粒pbabe-tcrα-2a-tcrβ。该重组质粒既能表达包含seqidno：8和12所示的tcrα链和β链可变区的氨基酸序列，也可以表达包含seqidno：30所示的单链tcr的氨基酸序列。
为了使本发明的tcr分子的α和β链在转导过程中能够更有效地形成正确的配对，在本发明的tcr分子的α和β链的恒定区中分别引入了一个半胱氨酸残基以形成人工链间二硫键，引入半胱氨酸残基的位置分别为trac的thr48和trbc的ser57；其α链的氨基酸序列与核苷酸序列分别如seqidno：10和seqidno：11所示，其β链的氨基酸序列与核苷酸序列分别如seqidno：14和seqidno：15所示，引入的半胱氨酸残基以加粗和加下划线字母表示。通过《分子克隆实验室手册》(参见sambrook和russell等，同上)中描述的标准方法将上述tcrα和β链的目的基因序列经合成后分别插入到表达载体pbabe(addgene)中，上下游的克隆位点分别是bamhi和ecori。插入片段进行测序确认其无误。
实施例3tcr-逆转录病毒的制备
重组质粒的制备：将实施例2中所获的重组质粒pbabe-tcr转化dh5a感受态细胞，均匀涂布与含氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，37℃培养24h后，挑取单个菌落至含氨苄青霉素的lb液体培养基中，于37℃、220rpm/min震荡培养14-16h，抽提质粒。
重组质粒的包装：取对数生长期phenix细胞作为包装细胞，接种到含有培养基(含10％fbs的imdm)的10厘米盘中，细胞密度达到80-85％时，用标准的磷酸钙沉淀法对实施例2中所述的重组质粒pbabe-tcr进行转染。培养8-9小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。24小时后，收集培养液并用0.45μm的滤膜过滤以除去细胞残渣，即可获得tcr-逆转录病毒悬液，置于-80℃保存。
实施例4wt1特异性tcr-t细胞的制备与其tcr的表达分析
取健康志愿者外周血，使用淋巴细胞分离管(深圳达科为)分离得到人外周血单核细胞(pbmc)。将细胞密度调整至1×106个细胞/ml，并给细胞培养液中加入okt-3抗体(30ng/ml)和il-2(600u/ml)，以激活其中的t细胞。48小时后，从-80℃低温冰箱中取出逆转录病毒，迅速在37℃水浴锅中解冻。在事先retronectin(takara)包被的24孔板中，每孔放置0.5×106pbmc，加入1.5ml的病毒上清液，同时加入il-2(600u/ml)，轻轻吹打混匀，930g于32℃下离心90分钟。然后置于37℃、5％co2的培养箱中继续培养。24小时后，用新鲜培养基换掉含有病毒的培养上清液，继续培养。第4天时用facs检测wt1-tcr在t细胞上的表达，如图2所示，模拟转导的t细胞不能被wt1-四聚体染色，显示它们没有wt1特异性；而wt1-tcr转导的t细胞则能够被wt1-四聚体染色，显示它们通过tcr转导而获得了wt1特异性。将图2所示的新鲜转导的wt1-tcr-t用wt1抗原肽rmfpnapyl负载的t2细胞进行刺激，则其中的wt1特异性t细胞就会明显扩增，如图3所示。
实施例5靶细胞k562-a2-cd34-gfp与raji-a2-cd34的制备
采用基因合成的办法可以获得hla-a2-cd34-gfp，其中a2与cd34通过p2a序列连接，cd34与gfp通过f2a连接。采用实施例2中相同的方法可以获得重组质粒pbabe-hla-a2-cd34-gfp。采用与实施例3和4中相同的方法即可把hla-a2-cd34-gfp转入表达wt1的白血病细胞株k562中而获得本发明所需要的阳性靶细胞k562-a2-cd34-gfp，该靶细胞的a2与cd34染色以及gfp的表达情况见图4。由图4可见，该靶细胞既表达a2与cd34又表达gfp，其中a2与wt1的表达可使其被本发明的wt1-tcr-t所识别，而gfp的表达则可以用来显示该靶细胞是否被杀伤。用类似的办法可以获得重组质粒pbabe-hla-a2-cd34，将其转入不表达wt1的raji细胞，则可获得对照靶细胞raji-a2-cd34。
实施例6细胞内免疫因子染色法检测wt1特异性tcr-t细胞的功能
将人工合成的wt1抗原肽rmfpnapyl和对照肽sllmwitqc与t2细胞在37℃、5％co2条件下孵育2h(多肽的浓度为50μm、t2细胞的浓度为5×106个/ml)，辐照70gy后，洗涤去除未结合的抗原肽和对照肽，然后收集细胞，即可获得抗原肽和对照肽负载的t2细胞。
将实施例4中所获的wt1特异性的tcr-t细胞与特异性抗原肽rmfpnapyl或对照抗原肽sllmwitqc负载的t2靶细胞，在96孔板中于37℃、5％co2条件下共培养，其中t细胞与靶细胞的浓度均为3×105个/孔，并加入bfa(bfa的作用是使t细胞中的免疫因子置留于细胞内而不被释放出来，以便用facs进行染色监测)使其终浓度为1.5μg/ml。共培养24小时后收集细胞，首先用抗cd3/cd8-apc进行细胞表面染色，然后使用fixandperm试剂盒(invitrogen)按照厂家说明进行细胞内免疫因子染色，染色后的细胞用facs检测其各种免疫因子的产生情况。图5显示wt1-tcr-t与t2靶细胞共培养后，wt1抗原肽负载的t2细胞可刺激tcr-t分泌ifn-γ，而对照抗原肽负载的t2细胞不能引起tcr-t表达ifn-γ。图6则显示该wt1-tcr-t识别特异性抗原肽的浓度可以低至1nm。这些结果表明本发明所获的高亲和力tcr可以特异性识别纳摩尔级的wt1抗原肽rmfpnapyl，转导该tcr的t细胞在识别靶细胞后，能够分泌ifn-γ，从而起到杀伤靶细胞的作用，而与对照靶细胞相遇时，并不产生ifn-γ，从而可以避免不必要的副作用。
实施例7细胞外免疫因子检测法测量wt1特异性tcr-t细胞的功能
将实施例4中所获的wt1特异性的tcr-t细胞与实施例6中所获的抗原肽负载的t2细胞在96孔板中于37℃、5％co2条件下共培养，其中t细胞与靶细胞的浓度均为1×105个/孔。共培养24小时后收集上清液，然后用cba免疫因子检测试剂盒(humancbakit，bd)检测上清液中的ifn-γ、il-2和tnfα等免疫因子的表达。图7显示wt1-tcr-t与t2靶细胞共培养后，wt1抗原肽负载的t2细胞可刺激tcr-t分泌ifn-γ、il-2和tnfα，而对照抗原肽负载的t2细胞不能刺激wt1-tcr-t产生免疫因子，且二者具有显著性差异。此结果表明该wt1-tcr可以特异性识别抗原肽rmfpnapyl，转导该wt1-tcr的t细胞识别靶细胞后，能够分泌ifn-γ、il-2和tnfα，从而起到杀伤靶细胞的作用，而与对照靶细胞相遇时，并不产生免疫因子，从而可避免不必要的副作用。
实施例8流式细胞仪检测wt1-tcr-t细胞对靶细胞的杀伤作用
将实施例5中构建的k562-a2-cd34-gfp作为阳性靶细胞，以raji-a2-cd34为对照阴性靶细胞，在圆底96孔板的200μlrpmi1640培养基中将1×105阳性靶细胞与1×105阴性靶细胞混合，然后加入i×106wt1-tcr-t细胞进行混合培养。24小时后，吸出各孔的全部细胞于1.5ml离心管中，在用1mlfacs缓冲液洗涤后，首先用cd34-apc染色以便将靶细胞从混合细胞群里圈分出来，然后在cd34 的靶细胞中观察阳性靶细胞(gfp )与对照靶细胞(gfp-)之间比例的变化。图8显示在未加wt1-tcr-t细胞的情况下，对照靶细胞raji-a2-cd34与阳性靶细胞k562-a2-cd34-gfp，均存活良好，但在加入wt1-tcr-t细胞的情况下，阳性靶细胞k562-a2-cd34-gfp被明显杀伤，然而对照靶细胞raji-a2-cd34仍然存活良好，这说明本发明的wt1-tcr-t细胞能够选择性地杀伤表达wti的白血病细胞。
以上对本发明所提供的一种能够以高亲和力识别wti抗原短肽rmfpnapyl的特异性tcr及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，但并不用于限制本发明的范围。应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，然而这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
seqidno：1：wt1抗原短肽氨基酸序列
argmetpheproasnalaprotyrleu
seqidno：2：tcrα链可变区cdr1α氨基酸序列
thrsergluserasptyrtyr
seqidno：3：tcrα链可变区cdr2α氨基酸序列
glnglualatyrlysglngln
seqidno：4：tcrα链可变区cdr3α氨基酸序列
alatyralatyrasnasnasnaspmetarg
seqidno：5：tcrβ链可变区cdr1β氨基酸序列
metasphisgluasn
seqidno：6：tcrβ链可变区cdr2β氨基酸序列
sertyraspvallysmet
seqidno：7：tcrβ链可变区cdr3β氨基酸序列
alaserserprotyrtyrgluglntyr
seqidno：8：tcrα链可变区氨基酸序列
seqidno：9：tcrα链可变区核苷酸序列
seqidno：10：tcrα链氨基酸序列
seqidno：11：tcrα链核苷酸序列
seqidno：12：tcrβ链可变区氨基酸序列
seqidno：13：tcrβ链可变区核苷酸序列
seqidno：14：tcrβ链氨基酸序列
seqidno：15：tcrβ链核苷酸序列
seqidno：16
accagtgagagtgattattat
seqidno：17
caagaagcttataagcaacag
seqidno：18
gcttatgcgtacaataacaatgacatgcgc
seqidno：19
atggaccatgaaaat
seqidno：20
tcatatgatgttaaaatg
seqidno：21
gccagcagtccatactacgagcagtac
seqidno：22：具有前导序列的tcrα链的氨基酸序列
seqidno：23：具有前导序列的tcrα链的核苷酸序列
seqidno：24：具有前导序列的tcrβ链的氨基酸序列
seqidno：25：具有前导序列的tcrβ链的核苷酸序列
seqidno：26：单链tcrα链氨基酸序列
seqidno：27：单链tcrα链核苷酸序列
seqidno：28：单链tcrβ链氨基酸序列
seqidno：29：单链tcrβ链核苷酸序列
seqidno：30：单链tcr氨基酸序列
seqidno：31：单链tcr核苷酸序列
seqidno：32：单链tcr连接氨基酸序列
seqidno：33：单链tcr连接核苷酸序列
序列表
<110>陕西九州新药评价研究有限公司（西安新药评价研究中心）
<120>识别wt1抗原短肽的t细胞受体及其应用
<130>cp1200022/cb
<141>2020-02-26
<160>33
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15
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<213>合成序列
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15
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<211>7
<212>prt
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15
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<211>5
<212>prt
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15
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15
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<211>9
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15
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aspserglnleuglyaspalaalamettyrphecysalatyralatyr
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gactcacagctgggggatgccgcgatgtatttctgtgcttatgcgtacaataacaatgac300
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aspserglnleuglyaspalaalamettyrphecysalatyralatyr
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servalserargglulyslysgluargpheserleuileleugluser
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seralathrphetrpglnasnproargasnhispheargcysglnval
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gly
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<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>17
caagaagcttataagcaacag21
<210>18
<211>30
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>18
gcttatgcgtacaataacaatgacatgcgc30
<210>19
<211>15
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>19
atggaccatgaaaat15
<210>20
<211>18
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>20
tcatatgatgttaaaatg18
<210>21
<211>27
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>21
gccagcagtccatactacgagcagtac27
<210>22
<211>274
<212>prt
<213>合成序列
<400>22
metalacysproglypheleutrpalaleuvalileserthrcysleu
151015
gluphesermetalaglnthrvalthrglnserglnproglumetser
202530
valglnglualagluthrvalthrleusercysthrtyraspthrser
354045
gluserasptyrtyrleuphetrptyrlysglnproproserarggln
505560
metileleuvalileargglnglualatyrlysglnglnasnalathr
65707580
gluasnargpheservalasnpheglnlysalaalalysserpheser
859095
leulysileseraspserglnleuglyaspalaalamettyrphecys
100105110
alatyralatyrasnasnasnaspmetargpheglyalaglythrarg
115120125
leuthrvallysproasnileglnasnproaspproalavaltyrgln
130135140
leuargaspserlysserserasplysservalcysleuphethrasp
145150155160
pheaspserglnthrasnvalserglnserlysaspseraspvaltyr
165170175
ilethrasplysthrvalleuaspmetargsermetaspphelysser
180185190
asnseralavalalatrpserasnlysseraspphealacysalaasn
195200205
alapheasnasnserileileprogluaspthrphepheproserpro
210215220
glusersercysaspvallysleuvalglulysserphegluthrasp
225230235240
thrasnleuasnpheglnasnleuservalileglypheargileleu
245250255
leuleulysvalalaglypheasnleuleumetthrleuargleutrp
260265270
serser
<210>23
<211>822
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>23
atggcatgccctggcttcctgtgggcacttgtgatctccacctgtcttgaatttagcatg60
gctcagacagtcactcagtctcaaccagagatgtctgtgcaggaggcagagaccgtgacc120
ctgagctgcacatatgacaccagtgagagtgattattatttattctggtacaagcagcct180
cccagcaggcagatgattctcgttattcgccaagaagcttataagcaacagaatgcaaca240
gagaatcgtttctctgtgaacttccagaaagcagccaaatccttcagtctcaagatctca300
gactcacagctgggggatgccgcgatgtatttctgtgcttatgcgtacaataacaatgac360
atgcgctttggagcagggaccagactgacagtaaaaccaaatatccagaaccctgaccct420
gccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgat480
tttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaa540
actgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaac600
aaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttc660
ttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagat720
acgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtg780
gccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc822
<210>24
<211>308
<212>prt
<213>合成序列
<400>24
metglyileargleuleucysargvalalaphecyspheleualaval
151015
glyleuvalaspvallysvalthrglnserserargtyrleuvallys
202530
argthrglyglulysvalpheleuglucysvalglnaspmetasphis
354045
gluasnmetphetrptyrargglnaspproglyleuglyleuargleu
505560
iletyrphesertyraspvallysmetlysglulysglyaspilepro
65707580
gluglytyrservalserargglulyslysgluargpheserleuile
859095
leugluseralaserthrasnglnthrsermettyrleucysalaser
100105110
serprotyrtyrgluglntyrpheglyproglythrargleuthrval
115120125
leugluaspleulysasnvalpheproprogluvalalavalpheglu
130135140
proserglualagluileserhisthrglnlysalathrleuvalcys
145150155160
leualathrglyphetyrproasphisvalgluleusertrptrpval
165170175
asnglylysgluvalhisserglyvalserthraspproglnproleu
180185190
lysgluglnproalaleuasnaspserargtyrcysleuserserarg
195200205
leuargvalseralathrphetrpglnasnproargasnhisphearg
210215220
cysglnvalglnphetyrglyleusergluasnaspglutrpthrgln
225230235240
aspargalalysprovalthrglnilevalseralaglualatrpgly
245250255
argalaaspcysglyphethrserglusertyrglnglnglyvalleu
260265270
seralathrileleutyrgluileleuleuglylysalathrleutyr
275280285
alavalleuvalseralaleuvalleumetalametvallysarglys
290295300
aspserarggly
305
<210>25
<211>924
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>25
atgggaatcaggctcctctgtcgtgtggccttttgtttcctggctgtaggcctcgtagat60
gtgaaagtaacccagagctcgagatatctagtcaaaaggacgggagagaaagtttttctg120
gaatgtgtccaggatatggaccatgaaaatatgttctggtatcgacaagacccaggtctg180
gggctacggctgatctatttctcatatgatgttaaaatgaaagaaaaaggagatattcct240
gaggggtacagtgtctctagagagaagaaggagcgcttctccctgattctggagtccgcc300
agcaccaaccagacatctatgtacctctgtgccagcagtccatactacgagcagtacttc360
gggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtc420
gctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtatgc480
ctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggag540
gtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgac600
tccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgc660
aaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccag720
gatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgt780
ggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatc840
ttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatg900
gtcaagagaaaggattccagaggc924
<210>26
<211>113
<212>prt
<213>合成序列
<400>26
alaglnthrvalthrglnserglnproglumetservalglngluala
151015
gluthrvalthrleusercysthrtyraspthrsergluserasptyr
202530
tyrleuphetrptyrlysglnproproserargcysmetileleuval
354045
ileargglnglualatyrlysglnglnasnalathrgluasnargphe
505560
servalasnpheglnlysalaalalysserpheserleulysileser
65707580
aspserglnleuglyaspalaalamettyrphecysalatyralatyr
859095
asnasnasnaspmetargpheglyalaglythrargleuthrvallys
100105110
pro
<210>27
<211>339
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>27
gctcagacagtcactcagtctcaaccagagatgtctgtgcaggaggcagagaccgtgacc60
ctgagctgcacatatgacaccagtgagagtgattattatttattctggtacaagcagcct120
cccagcaggcagatgattctcgttattcgccaagaagcttataagcaacagaatgcaaca180
gagaatcgtttctctgtgaacttccagaaagcagccaaatccttcagtctcaagatctca240
gactcacagctgggggatgccgcgatgtatttctgtgcttatgcgtacaataacaatgac300
atgcgctttggagcagggaccagactgacagtaaaacca339
<210>28
<211>110
<212>prt
<213>合成序列
<400>28
aspvallysvalthrglnserserargtyrleuvallysargthrgly
151015
glulysvalpheleuglucysvalglnaspmetasphisgluasnmet
202530
phetrptyrargglnaspproglyleuglyleuargleuiletyrphe
354045
sertyraspvallysmetlysglulysglyaspileprogluglytyr
505560
servalserargglulyslysgluargpheserleuileleugluser
65707580
alaserthrasnglnthrsermettyrleucysalaserserprotyr
859095
tyrgluglntyrpheglyproglythrargleuthrvalleu
100105110
<210>29
<211>330
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>29
gatgtgaaagtaacccagagctcgagatatctagtcaaaaggacgggagagaaagttttt60
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gccagcaccaaccagacatctatgtacctctgtgccagcagtccatactacgagcagtac300
ttcgggccgggcaccaggctcacggtcctc330
<210>30
<211>242
<212>prt
<213>合成序列
<400>30
alaglnthrvalthrglnserglnproglumetservalglngluala
151015
gluthrvalthrleusercysthrtyraspthrsergluserasptyr
202530
tyrleuphetrptyrlysglnproproserargcysmetileleuval
354045
ileargglnglualatyrlysglnglnasnalathrgluasnargphe
505560
servalasnpheglnlysalaalalysserpheserleulysileser
65707580
aspserglnleuglyaspalaalamettyrphecysalatyralatyr
859095
asnasnasnaspmetargpheglyalaglythrargleuthrvallys
100105110
proglythrserglyserserglyserglyserglyglyserglyser
115120125
glycysserglyaspvallysvalthrglnserserargtyrleuval
130135140
lysargthrglyglulysvalpheleuglucysvalglnaspmetasp
145150155160
hisgluasnmetphetrptyrargglnaspproglyleuglyleuarg
165170175
leuiletyrphesertyraspvallysmetlysglulysglyaspile
180185190
progluglytyrservalserargglulyslysgluargpheserleu
195200205
ileleugluseralaserthrasnglnthrsermettyrleucysala
210215220
serserprotyrtyrgluglntyrpheglyproglythrargleuthr
225230235240
valleu
<210>31
<211>726
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>31
gctcagacagtcactcagtctcaaccagagatgtctgtgcaggaggcagagaccgtgacc60
ctgagctgcacatatgacaccagtgagagtgattattatttattctggtacaagcagcct120
cccagcaggcagatgattctcgttattcgccaagaagcttataagcaacagaatgcaaca180
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atgcgctttggagcagggaccagactgacagtaaaaccaggtaccagcggcagcagtggt360
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gtcctc726
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<211>19
<212>prt
<213>合成序列
<400>32
glythrserglyserserglyserglyserglyglyserglysergly
151015
cyssergly
<210>33
<211>57
<212>dna/rna
<213>合成序列
<400>33
ggtaccagcggcagcagtggtagcggcagcggtggcagcggtagtggctgctccgga57
1.一种t细胞受体(tcr)，其特征在于，所述t细胞受体能够以高亲和力与rmfpnapyl-hla-a0201复合物结合，所述的tcr包含tcrα链可变区和tcrβ链可变区，所述tcrα链可变区包含三个互补决定区(cdr)，其序列为seqidno：2-4；所述tcrβ链可变区包含三个互补决定区(cdr)，其序列为seqidno：5-7。
2.如权利要求1所述的tcr，其特征在于，所述tcr为αβ异质二聚体，其还包含tcrα链恒定区(trac)和tcrβ链恒定区(trbc1和/或trbc2)；优选地，所述tcr的α链氨基酸序列为seqidno：10，所述tcr的β链氨基酸序列为seqidno：14。
3.如权利要求1所述的tcr，其特征在于，所述tcr为单链；优选地，所述tcr的α链可变区氨基酸序列为seqidno：26和/或所述tcr的β链可变区氨基酸序列包含seqidno：28；更优选地，所述tcr是由α链可变区与β链可变区通过连接肽链seqidno：32连接而成，所述tcr的氨基酸序列为seqidno：30。
4.一种多价tcr复合物，其特征在于，包含至少两个tcr分子，并且其中的至少一个tcr分子为权利要求1-3中任一项所述的tcr。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-3中任一项所述的tcr的核苷酸序列或其互补序列，或权利要求1-3中任一项所述的tcr的氨基酸序列对应的密码子优化的核苷酸序列；优选地，所述的核酸分子包含编码tcrα链可变区的核苷酸序列seqidno：9或seqidno：27；和/或所述的核酸分子包含编码tcrβ链可变区的核苷酸序列seqidno：13或seqidno：29；更优选地，所述核酸分子包含编码tcrα链的核苷酸序列seqidno：11和/或包含编码tcrβ链的核苷酸序列seqidno：15。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求5中所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体；更优选地，所述的载体为逆转录病毒载体。
7.一种分离的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求6中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求5中所述的核酸分子。
8.一种细胞，其特征在于，所述细胞为被权利要求5中所述的核酸分子或权利要求6中所述载体转导的细胞；优选地，所述细胞为t细胞或干细胞；更优选地，所述细胞为来自患者的t细胞或干细胞。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1-3中任一项所述的tcr、权利要求4中所述的tcr复合物、权利要求5中所述的核酸分子、或权利要求8中所述的细胞，以及可药用的载体。
10.权利要求1-3中任一项所述的t细胞受体、或权利要求4中所述的tcr复合物或权利要求8中所述的细胞用于制备治疗肿瘤或其他免疫性疾病的药物的用途。
技术总结