本发明涉及生物领域，具体涉及一种磷酸化卵白蛋白及其对大豆苷元功能特性改善的研究方法。
背景技术：
大豆黄酮(daizezein，dai)是一种富含大豆的异黄酮，分子量为254.24d.a。它具有抗氧化，抗癌，植物雌激素活性，抗动脉粥样硬化和抗骨质疏松症。然而，差的溶解度，低的油/水分配系数以及高的新陈代谢强烈地限制了其生物利用度。一种提高dai的溶解度和生物利用度的常规方法是使用基于脂质的载体，包括纳米结构脂质载体，固体脂质纳米颗粒和纳米乳液。然而，由于疏水性化合物的溶解度低和结晶度高，在储存过程中观察到药物从乳液的油相向水相连续转移，导致明显的沉淀或结晶。
本申请意在用一种磷酸化修饰的卵白蛋白作为潜在的疏水性药物结晶抑制剂，以提高dai的溶解度，并提供该蛋白与配体之间的相互作用机理的研究方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供磷酸化卵白蛋白及其对大豆苷元功能特性改善的研究方法，以提高dai的溶解度，并获得该现象机理的研究方法。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种磷酸化卵白蛋白的制备方法：包括以下步骤：s1：将含卵白蛋白的溶液与含植酸的溶液混合并调节ph至4后定容，经冷冻干燥后得到混合溶液，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，得到磷酸化卵白蛋白。
通过将卵白蛋白与植酸在加热条件下进行磷酸化反应，反应柔和，蛋白不变性，副反应少，产物纯度高，反应易控制，所用磷酸化试剂为植酸，无毒可食用，即使残留也不影响正常食用。
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，包括以下步骤：
s1：磷酸化卵白蛋白的制备；将含卵白蛋白的溶液与含植酸的溶液混合并调节ph至4后定容，经冷冻干燥后得到混合溶液，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，得到磷酸化卵白蛋白；
s2：复合物的制备：将磷酸化卵白蛋白配置为蛋白溶液，在蛋白溶液中加入大豆苷元溶液，经搅拌至大豆苷元完全溶解，再经冷冻干燥后得到复合物；
s3：表征研究。
作为优选，所述的s1步骤中，含卵白蛋白的溶液中，卵白蛋白质量分数为1％，所述含植酸的溶液中，植酸浓度为0.47～0.67mol/l。
作为优选，所述的s1步骤中，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应后，将反应物在超纯水中室温常压下透析2天，再将透析液冷冻干燥得到磷酸化卵白蛋白，提高纯度。
作为优选，所述的冷冻干燥温度为-50℃、时间为24h。
作为优选，所述的s1步骤中，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，温度为90℃，反应时间为3天。
作为优选，所述的表征研究为荧光光谱测定，具体为将s1步骤中得到的磷酸化卵白蛋白溶解于水中，配制磷酸化卵白蛋白溶液，取大豆苷元加入至乙醇溶液中，配制大豆苷元溶液，将所述磷酸化卵白蛋白溶液加入大豆苷元溶液后进行水浴孵育，并设置对照组，再采用不同波长的激光进行荧光光谱测定。
作为优选，荧光光谱测定后，结合小分子与大分子的结合参数通过以下公式计算，分析结合能力：log[(f0-f)/f]＝logka nlog[q],其中f0和f分别是淬灭剂(dai)加入前后的荧光强度，ka和n分别是结合常数和结合位点的数目，[q]是淬灭剂的浓度；
通过以下公式计算，分析荧光猝灭机理：f0/f＝1 ksvq＝1 kqτ0q，f0和f分别是淬灭剂(dai)加入前后的荧光强度，ksv是sterne-volmer淬灭常数，[q]是淬灭剂的浓度，kq是双分子猝灭常数，τ0是生物分子的平均寿命。
作为优选，所述的表征研究为同步荧光光谱测定，具体为将s1步骤中得到的磷酸化卵白蛋白溶解于水中，配制磷酸化卵白蛋白溶液，取大豆苷元加入至乙醇溶液中，配制大豆苷元溶液，将所述磷酸化卵白蛋白溶液加入大豆苷元溶液后进行水浴孵育，并设置对照组，再采用同步荧光光谱测定。
作为优选，所述的表征研究为结晶抑制现象的测定，具体为配制大豆苷元溶液，将s1步骤中得到的磷酸化卵白蛋白按照不同的配比分别加入至大豆苷元溶液中，观察结晶现象，并测定透光率以及上清液大豆苷元浓度的含量。
与现有技术相比，本发明至少能达到以下有益效果之一：
本发明提供的卵白蛋白的磷酸化方法，利用来源广泛的卵白蛋白作为原料，选择本身可作为食品添加剂或食品中常见成分--植酸作为磷酸化试剂，并采用干燥加热的方式，在完全不使用有机溶剂的条件下，制备磷酸化卵白蛋白。避免有机溶剂的使用，简化后续纯化步骤，环境友好；
本发明提供了磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性的改善方法，磷酸化卵白蛋白能较好的抑制大豆苷元结晶沉淀，能很好的解决大豆苷元的缺点，以扩展其应用，且磷酸化卵白蛋白本身可作为食品上的应用，它作为一种抑制剂安全无毒；
本发明提供了一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，为小分子和生物大分子相互作用奠定了基础，且证明了磷酸化卵白蛋白与大豆苷元是通过疏水性相互作用而结合。
附图说明
图1为本发明实施例3中n-ova-dai在25℃、激发波长：280nm的荧光光谱示意图。
图2为本发明实施例3中dh-ova-dai在298k、激发波长：280nm的荧光光谱。
图3为本发明实施例3中pa-ova-dai在25℃、激发波长：280nm的荧光光谱。
图4为本发明实施例3中n-ova-dai在37℃、激发波长：280nm的荧光光谱。
图5为本发明实施例3中dh-ova-dai在37℃、激发波长：280nm的荧光光谱。
图6为本发明实施例3中pa-ova-dai在37℃、激发波长：280nm的荧光光谱。
图7为本发明实施例3中n-ova-dai在25℃、激发波长：295nm的荧光光谱。
图8为本发明实施例3中dh-ova-dai在25℃、激发波长：295nm的荧光光谱。
图9为本发明实施例3中pa-ova-dai在25℃、激发波长：295nm的荧光光谱。
图10为本发明实施例3中n-ova-dai在37℃、激发波长：295nm的荧光光谱。
图11为本发明实施例3中dh-ova-dai在25℃、激发波长：295nm的荧光光谱。
图12为本发明实施例3中pa-ova-dai在25℃、激发波长：295nm的荧光光谱。
图13为本发明实施例4中n-ova-dai在25℃、△λ＝15nm的同步荧光光谱。
图14为本发明实施例4中dh-ova-dai在25℃、△λ＝15nm的同步荧光光谱。
图15为本发明实施例4中pa-ova-dai在25℃、△λ＝15nm的同步荧光光谱。
图16为本发明实施例4中n-ova-dai在25℃、△λ＝60nm的同步荧光光谱。
图17为本发明实施例4中dh-ova-dai在25℃、△λ＝15nm的同步荧光光谱。
图18为本发明实施例4中pa-ova-dai在25℃、△λ＝15nm的同步荧光光谱。
图19为本发明实施例5中n-ova-dai在25℃的荧光共振能量转移示意图。
图20为本发明实施例5中dh-ova-dai在25℃的荧光共振能量转移示意图。
图21为本发明实施例5中pa-ova-dai在25℃的荧光共振能量转移示意图。
图22为本发明实施例6中n-ova-dai、dh-ova-dai、pa-ova-dai结晶抑制拍照图。
图23为本发明实施例6中n-ova-dai、dh-ova-dai、pa-ova-dai结晶抑制透光率图。
图24为本发明实施例6中n-ova-dai、dh-ova-dai、pa-ova-dai不同比例下上清液大豆苷元含量图。
图25为本发明实施例7中偏光显微镜示意图，其中(a)为大豆苷元偏光显微镜示意图；(b)为n-ova-dai偏光显微镜示意图；(c)为dh-ova-dai偏光显微镜示意图；(d)为pa-ova-dai偏光显微镜示意图。
图26为本发明实施例8中x射线粉末衍射示意图。
图27为本发明实施例9中透射电子显微镜示意图，其中(a)为大豆苷元透射电子显微镜意图；(b)为n-ova-dai透射电子显微镜意图；(c)为dh-ova-dai透射电子显微镜意图；(d)为pa-ova-dai透射电子显微镜意图。
图28为本发明实施例11中圆二色谱示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
一种磷酸化卵白蛋白的制备方法：s1：将100mg卵白蛋白溶于水中，配制为质量分数1％的含卵白蛋白的溶液，此溶液中加入0.47～0.67mol/l的植酸溶液260μl，调节ph至4后定容，经-50℃冷冻干燥24h后得到混合溶液，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，得到磷酸化卵白蛋白。
实施例2：
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法：s1：将100mg卵白蛋白作为溶于水中，配制为质量分数1％的含卵白蛋白的溶液，此溶液中加入0.47～0.67mol/l的植酸溶液260μl，调节ph至4后定容，经-50℃冷冻干燥24h后得到混合溶液，混合溶液在90℃的在干燥加热条件下进行磷酸化反应3天，所得反应产物在超纯水中室温常压下透析2天，再将透析液经-50℃冷冻干燥24h得到磷酸化卵白蛋白，作为样品3(pa-ova)。设置卵白蛋白设置为样品1(ova)；再设置样品2，样品2与样品3的区别在于由样品1开始经s1步骤，但是未加入植酸，所得产物为样品2(dh-ova)。
s2：复合物的制备：分别将样品1、2、3配制为浓度为1×10-4mol/l蛋白溶液，在室温下搅拌均匀，加入浓度为1×10-4mol/l的大豆苷元，在室温下搅拌2-8h，使大豆苷元完全溶解，冷冻干燥(-50℃下冷冻24h)得到复合物，复合物分别为复合物1、复合物2、复合物3。
s3：表征研究。
实施例3：
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法：取实施例2中所得的样品1、2、3溶解于超纯水中，配置为质量分数1％的溶液，搅拌均匀，取11.44mg/ml大豆苷元加入15ml乙醇溶液中，配制浓度为3mm的大豆苷元，将上述样品1、2、3溶液中加入0～120μm的大豆苷元溶液150μl，在25℃、37℃水浴锅中孵育1～2h。
采用荧光光谱测定上述混合液。(测定条件为：分别在25℃、37℃温度下测定，激发波长分别为280nm、295nm，发射波长范围为：250nm-400nm)
结果分析：
蛋白荧光强度随着大豆苷元浓度的增加而下降，说明大豆苷元猝灭了蛋白的荧光。
实施例4：
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法：取实施例2中所得的样品1、2、3溶解于超纯水中，配置为质量分数1％的溶液，搅拌均匀，取11.44mg/ml大豆苷元加入15ml乙醇溶液中，配制浓度为3mm的大豆苷元，将上述样品1、2、3溶液中加入0～120μm的大豆苷元溶液150μl，在25℃水浴锅中孵育1-2h。
采用同步荧光光谱测定上述混合液。(测定条件为：分别在25℃温度下测定△λ＝15nm和△λ＝60nm，激发波长分别为280nm，发射波长范围为：200nm～400nm)
结果分析：
通过同步荧光光谱在25℃温度下测定△λ＝15nm和△λ＝60nm，蛋白荧光强度随着大豆苷元浓度的增加而下降，且△λ＝60nm时在波长338～342nm时发生明显的红移，说明大豆苷元影响了蛋白的trp的微环境。
实施例5：
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法：取实施例2中所得的样品1、2、3溶解于超纯水中，配制浓度为2.8×10-5mol/l的蛋白溶液，在280nm激发波长下，室温下测定200～500nm的荧光光谱，配制浓度为2.8×10-5mol/l的大豆苷元，测定波长范围200～500nm的紫外光谱。
通过荧光共振能量转移可看出，大豆苷元与蛋白发生了相互作用。
实施例6：
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法：配制浓度为20μg/ml的大豆苷元溶液，将实施例2所得样品1、2、3按照大豆苷元与蛋白浓度为1:0、1:10、1:20、1:40加入大豆苷元溶液，在室温下放置观察结晶现象，并拍照1:40混合溶液存在大豆苷元浓度为20μg/ml的照片，并测定透光率，以及上清液大豆苷元浓度的含量。
通过照片可以看出ova-dai溶液中出现浑浊，dh-ova-dai、磷酸化卵白蛋白-dai相比未出现浑浊，通过透射率和上清液dai含量可以看出，磷酸化卵白蛋白对大豆苷元显示较好的抑制结晶现象。
实施例7：
一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法：
取实施例2所得复合物1、复合物2、复合物3以及大豆苷元粉末，在玻璃片上进行测定。
通过偏光显微镜进一步证明，大豆苷元为晶形结构，复合物1、复合物2、复合物3中都未显示大豆苷元的晶型结构。
实施例8：
取实施例2所得复合物1、复合物2、复合物3以及大豆苷元粉末，制样，在x射线衍射仪进行测定。
通过xrd可看出，大豆苷元为晶形结构，复合物1、复合物2、复合物3都为无定型结构。
实施例9：
取实施例2所得复合物1、复合物2、复合物3以及大豆苷元粉末，配成浓度为5mg/ml溶液，滴在铜片上进行测定。
通过tem可看出，大豆苷元为晶形结构，复合物1、复合物2、复合物3中都未显示大豆苷元的晶型结构。
实施例10：
通过实施例3测定的荧光光谱，并结合小分子与大分子的结合参数可以通过以下公式计算：log[(f0-f)/f]＝logka nlog[q]，其中f0和f分别是淬灭剂(dai)加入前后的荧光强度。ka和n分别是结合常数和结合位点的数目，[q]是淬灭剂的浓度。ka和n的值总结在表1中，结合亲和力曲线显示出极好的拟合线性，r2>0.98。使用stern-volmer方程分析荧光猝灭机理：f0/f＝1 ksvq＝1 kqτ0q其中f0和f分别是淬灭剂(dai)加入前后的荧光强度。ksv是sterne-volmer淬灭常数，[q]是淬灭剂的浓度。kq是双分子猝灭常数，τ0是生物分子的平均寿命，而不猝灭剂(τ0：10-8s)。f0/f对[q]产量的曲线可用于使用公式计算ksv。dai淬灭的wpi荧光的sterne-volmer图显示在图中，ksv和kq的值总结在表2中。
表1
表2
结果分析：
ova的ksv与温度呈正相关，说明淬火过程中存在动态淬火。但是，kq值(表1)远远超过了双分子扩散碰撞淬火常数(2.0×1010m-1s-1)表明dai对wpi的淬火机理是由静态淬火引起的。这是因为蛋白质结构的柔韧性受到温度的影响，并加速了wpi和dai的碰撞率。由于蛋白质的展开和疏水性相互作用，氢键(一种更紧密的接触)可能会得到促进。这些结果表明，加热干燥磷酸化改善了ova与dai的结合能力。
在蛋白质结合过程中可能发生的主要结合力可以通过热力学参数来确定。δh>0并且δs>0建议的主要驱动力是疏水相互作用。δh<0并且δs<0建议的主要驱动力是范德华力和氢键相互作用。δh<0并且δs>0表明，静电力起主要作用。表1给出了dai与wpi结合的热力学参数值。δh>0并且δs>0表示疏水相互作用是主要驱动力。δg的负值表明dai与wpi的结合是自发的。
实施例11：
取实施例2所得复合物1、复合物2、复合物3以及大豆苷元粉末，用磷酸缓冲溶液(ph＝7.0)配制浓度为0.1mg/ml，在圆二色谱仪上进行测定。
通过圆二色谱看出，大豆苷元与蛋白形成的复合物二级结构影响不大。
在本说明书中所谈到多个解释性实施例，指的是结合该实施例描述的具体方法包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任意一实施例描述一个方法时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种方法落在本发明的范围内。
1.一种磷酸化卵白蛋白的制备方法：其特征在于：包括以下步骤：s1：将含卵白蛋白的溶液与含植酸的溶液混合并调节ph至4后定容，经冷冻干燥后得到混合溶液，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，得到磷酸化卵白蛋白。
2.一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
s1：磷酸化卵白蛋白的制备；将含卵白蛋白的溶液与含植酸的溶液混合并调节ph至4后定容，经冷冻干燥后得到混合溶液，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，得到磷酸化卵白蛋白；
s2：复合物的制备：将磷酸化卵白蛋白配置为蛋白溶液，在蛋白溶液中加入大豆苷元溶液，经搅拌至大豆苷元完全溶解，再经冷冻干燥后得到复合物；
s3：表征研究。
3.根据权利要求2所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的s1步骤中，含卵白蛋白的溶液中，卵白蛋白质量分数为1％，所述含植酸的溶液中，植酸浓度为0.47～0.67mol/l。
4.根据权利要求2所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的s1步骤中，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应后，将反应物在超纯水中室温常压下透析2天，再将透析液冷冻干燥得到磷酸化卵白蛋白。
5.根据权利要求2或4所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的冷冻干燥温度为-50℃、时间为24h。
6.根据权利要求2所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的s1步骤中，对所述混合溶液加热进行磷酸化反应，温度为90℃，反应时间为3天。
7.根据权利要求2所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的表征研究为荧光光谱测定，具体为将s1步骤中得到的磷酸化卵白蛋白溶解于水中，配制磷酸化卵白蛋白溶液，取大豆苷元加入至乙醇溶液中，配制大豆苷元溶液，将所述磷酸化卵白蛋白溶液加入大豆苷元溶液后进行水浴孵育，并设置对照组，再采用不同波长的激光进行荧光光谱测定。
8.根据权利要求7所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：荧光光谱测定后，结合小分子与大分子的结合参数通过以下公式计算，分析结合能力：log[(f0-f)/f]＝logka nlog[q],其中f0和f分别是淬灭剂(dai)加入前后的荧光强度，ka和n分别是结合常数和结合位点的数目，[q]是淬灭剂的浓度；
通过以下公式计算，分析荧光猝灭机理：f0/f＝1 ksvq＝1 kqτ0q，f0和f分别是淬灭剂(dai)加入前后的荧光强度，ksv是sterne-volmer淬灭常数，[q]是淬灭剂的浓度，kq是双分子猝灭常数，τ0是生物分子的平均寿命。
9.据权利要求2所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的表征研究为同步荧光光谱测定，具体为将s1步骤中得到的磷酸化卵白蛋白溶解于水中，配制磷酸化卵白蛋白溶液，取大豆苷元加入至乙醇溶液中，配制大豆苷元溶液，将所述磷酸化卵白蛋白溶液加入大豆苷元溶液后进行水浴孵育，并设置对照组，再采用同步荧光光谱测定。
10.据权利要求2所述的一种磷酸化卵白蛋白对大豆苷元功能特性改善的研究方法，其特征在于：所述的表征研究为结晶抑制现象的测定，具体为配制大豆苷元溶液，将将s1步骤中得到的磷酸化卵白蛋白按照不同的配比分别加入至大豆苷元溶液中，观察结晶现象，并测定透光率以及上清液大豆苷元浓度的含量。
技术总结