乙肝病毒的中和抗体B430及其应用的制作方法

专利2022-06-29 46

本发明涉及一种乙肝病毒的中和抗体b430及其应用。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染在全世界广泛存在，在中国尤其严重。乙肝病毒属于嗜肝病毒科的一员，其感染诱发肝炎，在中国大约有8000万-1亿人慢性感染乙肝病毒，全球约有2.4亿慢性乙肝患者。如果考虑已经恢复的急性乙肝病毒感染者，乙肝病毒感染者累计更多。有研究表明35-62％中国人感染过乙肝病毒，56-98％撒哈拉以南非洲人感染过乙肝病毒,全球约有20亿人感染过乙肝病毒，乙肝病毒感染是全球性的卫生问题。

乙肝病毒在感染过程中诱发免疫炎症损伤患者肝脏。中国乙肝患者大部分为母婴传播或者小孩时期感染乙肝病毒，绝大部分为慢性乙肝感染，终生携带乙肝病毒。成年人感染乙肝病毒，大部分可依靠自身免疫系统清除乙肝病毒，为乙肝病毒的急性感染。乙肝病毒感染导致急性慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌，其诱发肝炎机制主要是肝细胞内乙肝病毒诱发机体免疫系统的肝脏炎症，乙肝病毒的复制模板共价闭合环状dna(cccdna)作为病毒储存库稳定且随时补充，非常难以清除，乙肝病毒复制诱发持续不断和多次反复的免疫杀伤过程中造成肝脏炎症。

目前乙肝病毒疫苗预防效果很好，临床治疗上只能控制乙肝病毒复制，不能治愈乙肝病毒感染。乙肝疫苗控制了乙肝病毒在中国的广泛传播，对乙肝妈妈导致的母婴传播，临床上通过核苷药物如恩替卡韦、替诺福韦降低乙肝妈妈怀孕期间乙肝病毒复制水平，新生儿出生后注射乙肝免疫球蛋白(hbig)和及时免疫乙肝疫苗的措施综合干预，非常有效的降低了乙肝病毒的母婴传播。虽然乙肝疫苗控制了乙肝病毒的传播，但是对已感染乙肝病毒的数量众多的患者，临床治疗手段如核苷药物和干扰素，治愈不了乙肝病毒感染。核苷药物能有效控制乙肝病毒的dna复制，但不能彻底清除乙肝病毒，很难降低乙肝表面抗原，乙肝患者停药之后，乙肝病毒仍然会复发。干扰素治疗周期长，副作用大，只能在治疗期间对相当少的一部分乙肝患者有作用，治疗效果性价比很低，目前乙肝感染治疗基本以核苷药物为主。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种乙肝病毒的中和抗体b430及其应用。

本发明提供了一种igg抗体，命名为单克隆抗体b430，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次为序列表的序列1自n末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基、第116-132位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的cdr1、cdr2和cdr3依次为序列表的序列3自n末端第43-48位氨基酸残基、第66-68位氨基酸残基、第105-113位氨基酸残基。

所述重链可变区由序列表的序列1自n末端第20-143位氨基酸残基组成。

所述轻链可变区由序列表的序列3自n末端第17-123位氨基酸残基组成。

所述重链为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自n末端第20-473位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列1所示的蛋白质。

所述轻链为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列3自n末端第17-230位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列3所示的蛋白质。

编码所述igg抗体的基因也属于本发明的保护范围。

编码所述重链的基因为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表的序列2自5’末端第972-2333位核苷酸所示的dna分子；

(2)序列表的序列2自5’末端第915-2336位核苷酸所示的dna分子；

(3)序列表的序列2所示的dna分子。

编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)或(6)：

(4)序列表的序列4自5’末端第963-1604位核苷酸所示的dna分子；

(5)序列表的序列4自5’末端第915-1607位核苷酸所示的dna分子；

(6)序列表的序列4所示的dna分子。

本发明还保护以上任一所述igg抗体在制备用于抑制乙肝病毒的药物中的应用。

本发明还保护一种用于抑制乙肝病毒的药物，其活性成分为以上任一所述igg抗体。

本发明还保护以上任一所述igg抗体在制备用于中和乙肝病毒的药物中的应用。

本发明还保护一种用于中和乙肝病毒的药物，其活性成分为以上任一所述igg抗体。

本发明还保护以上任一所述igg抗体在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物中的应用。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物，其活性成分为以上任一所述igg抗体。

单克隆抗体b430能够识别不同基因型乙肝病毒，保证了抗体中和的广谱性。

所述乙肝病毒为各个基因型的乙肝病毒。例如，a基因型的乙肝病毒、b基因型的乙肝病毒、c基因型的乙肝病毒、d基因型的乙肝病毒。a基因型乙肝病毒即基因分型为a型的乙肝病毒。b基因型乙肝病毒即基因分型为b型的乙肝病毒。c基因型乙肝病毒即基因分型为c型的乙肝病毒。d基因型乙肝病毒即基因分型为d型的乙肝病毒。

相比较血清多抗，单克隆抗体在中和活性以及来源方便性上具有非常大的优势。本发明的发明人利用人源记忆性b细胞培养技术，从乙肝疫苗免疫者分离到单克隆抗体b430，可用于乙肝慢性感染患者的治疗和临床替代血清纯化多抗预防母婴传播。本发明对治疗和预防乙肝病毒感染具有重要的应用前景。

附图说明

图1为实施例3的步骤一的结果。

图2为实施例3的步骤二的结果。

图3为实施例4的步骤一的结果。

图4为实施例4的步骤二的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的pbs缓冲液均为ph7.2、10mm的pbs缓冲液。pbst溶液：含0.5％(体积百分含量)tritonx-100的pbs缓冲液。乙肝免疫球蛋白溶液(hbig溶液)：北京天坛生物，浓度约为120mg/ml。如无特殊说明，细胞培养条件为37℃、5％co2环境。jc126载体含hdv复制子，提及jc126载体的文献：李颖等,丁型肝炎病毒复制包装载体的构建.中国现代医学杂志,2017(11):第31-35页。a型乙肝包膜蛋白表达质粒即phbv1.5，记载于如下文献：bruss,v.andd.ganem,theroleofenvelopeproteinsinhepatitisbvirusassembly.procnatlacadsciusa,1991.88(3):p.1059-63.。b型乙肝包膜蛋白表达质粒即phbv1.18-b，记载于如下文献：hu,w.,etal.,cpgoligodeoxynucleotideinhibitshbvreplicationinahydrodynamicinjectionmurinemodel.antivirther,2014.。c型乙肝包膜蛋白表达质粒即phbv1.18-c。记载于如下文献：wang,x.j.,etal.,asimpleandefficientstrategyforthedenovoconstructionofgreater-than-genome-lengthhepatitisbvirusreplicons.jvirolmethods,2014.207:p.158-62.。d型乙肝包膜蛋白表达质粒即pcmv-hbv，记载于如下文献：li,j.,etal.,inhibitionofhepatitisbvirusreplicationbymyd88involvesaccelerateddegradationofpregenomicrnaandnuclearretentionofpre-s/srnas.jvirol,2010.84(13):p.6387-99.。hbs抗原：genbankaccessionno:p30019.1，vrl07-nov-2018。hbv转基因小鼠(高复制hbv转基因小鼠)：记载于如下文献：刘光泽等，高复制hbv转基因小鼠模型对抗乙型肝炎病毒药物的效应研究，中国病理生理杂志，2007,23(1):99–102。兔抗人丁型肝炎病毒δ抗原多克隆抗体(简称hdvδ抗体)：北京泽溪源有限公司。单克隆抗体mers-27及其制备方法见专利201310565893.x(公开号为cn104628848a，公告号为cn104628848b)。乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(hbsag，货号30811010101)和乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒(hbeag，货号30811010103)均为上海科华产品。

实施例1、抗体的发现

利用人源记忆性b细胞培养，从乙肝疫苗免疫者血液中寻找乙肝病毒的单克隆抗体，然后将获得的各个抗体进行效果比较。

b细胞培养筛选克隆乙肝小膜蛋白特异性b细胞抗体基因的方法：从乙肝疫苗免疫的正常人的外周血分离出外周血淋巴细胞pbmc，流式细胞仪从pbmc分选出记忆性b细胞，将记忆性b细胞和支持细胞3t3-cd40l共培养10天，利用elisa检测分泌的细胞上清中是否含有乙肝病毒小膜蛋白hbs抗体，抗体阳性孔裂解b细胞反转录cdna,利用抗体可变区特异性引物克隆出阳性孔所有抗体可变区基因，轻重链配对筛选出一对乙肝小膜蛋白特异性抗体基因。

发现一个效果良好的单克隆抗体(结合抗体)，将该单克隆抗体命名为单克隆抗体b430，简称b430抗体。

单克隆抗体b430为igg抗体，重链如序列表的序列1所示(第1-19位氨基酸残基组成信号肽，第20-143位氨基酸残基组成可变区，第144-473位氨基酸残基组成恒定区；cdr1、cdr2和cdr3依次为第45-52位、第70-77位、第116-132位)，轻链如序列表的序列3所示(第1-16位氨基酸残基组成信号肽，第17-123位氨基酸残基组成可变区，第124-230位氨基酸残基组成恒定区；cdr1、cdr2和cdr3依次为第43-48位、第66-68位、第105-113位)。

实施例2、单克隆抗体b430的制备

一、制备重组质粒

将序列表的序列2所示的dna分子插入plb-simplevector，得到重组质粒。该重组质粒已经测序验证。该质粒又命名为重链表达质粒。

序列表的序列2中，第1-666位核苷酸为cmv启动子，第915-971位核苷酸为信号肽编码区，第972-1343位核苷酸为重链可变区编码区，1344-2333位核苷酸为重链恒定区编码区，第2334-2336为终止密码子，第2395-2543位核苷酸为polya终止子。序列表的序列2所示dna分子表达序列表的序列1所示的重链。

将序列表的序列4所示的dna分子插入plb-simplevector，得到重组质粒。该重组质粒已经测序验证。该质粒又命名为轻链表达质粒。

序列表的序列4中，第1-666位核苷酸为cmv启动子，第915-962位核苷酸为信号肽编码区，第963-1283位核苷酸为轻链可变区编码区，1284-1604位核苷酸为轻链恒定区编码区，第1605-1607位核苷酸为终止密码子，第1614-1762位核苷酸为polya终止子。序列表的序列4所示dna分子表达序列表的序列3所示的轻链。

plb-simplevector为天根生物货号为vt206的plb零背景快速连接试剂盒的组件，http://www.tiangen.com/？productshow/t1/6/id/308.html。

二、制备抗体

1、采用无血清dmem培养基培养293t细胞，借助pei转染试剂共转染重链表达质粒和轻链表达质粒并培养8小时，然后更换培养基为含2％胎牛血清的dmem培养基并培养72小时，然后4℃、4000rpm离心30min，收集上清液。

2、取步骤1得到的上清液，使用econo-pac聚丙烯层析柱进行纯化。

聚丙烯层析柱(biorad，货号7321010)，1.5×12cm，柱床体积约20ml。

操作步骤：①将300-500ml上清液和约1mlproteinabeads(thermo，货号10006d)混合，4℃振荡培养10小时，然后将整个体系加入层析柱中；②用60ml结合缓冲液洗涤；③用30ml洗脱缓冲液洗脱，收集过柱后溶液。

结合缓冲液(ph8.0)：每升含甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，余量为水。

洗脱缓冲液(ph3.0)：每500ml含甘氨酸7.5g，余量为水。

3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为pbs缓冲液，得到抗体浓度约为2mg/ml的抗体溶液，命名为b430抗体溶液。

实施例3、抗体与乙肝病毒的结合能力

一、elisa检测

1、取酶标板，加入包被原溶液以进行包被(50ng包被原/孔)。

包被原为hbs抗原。用pbs缓冲液作为溶剂制备包被原溶液。

2、完成步骤1后，取所述酶标板，每孔加入200μl含2％bsa的pbs缓冲液，37℃孵育2小时以进行封闭，然后吸弃上清，用pbst溶液洗两次。

3、完成步骤2后，取所述酶标板，每孔加入200μl抗体稀释液，37℃孵育1小时，然后吸弃上清，用pbst溶液洗两次。抗体稀释液是用pbs缓冲液稀释实施例2制备的b430抗体溶液或者hbig溶液或者mers-27抗体溶液得到的。每种抗体稀释液设置5个复孔。

4、完成步骤3后，取所述酶标板，加入抗人igg-hrp(山羊抗人igg-hrp,promega，货号w4038)，37℃孵育1小时，然后吸弃上清，用pbst溶液洗6次。

5、完成步骤4后，取所述酶标板，加入显色液进行显色，适时终止，读取450nm吸光度值。

结果见图1。图1的横坐标显示的是抗体稀释液中b430抗体的浓度，hbig浓度是b430抗体浓度的1000倍，mers-27抗体浓度与b430抗体相同。例如，抗体稀释液中b430抗体的浓度为0.1μg/ml时，对应的hbig浓度为0.1mg/ml，对应的mers-27抗体浓度为0.1μg/ml。结果表明，b430抗体可以高效结合hbs抗原。

二、免疫荧光检测

供试质粒为a型乙肝包膜蛋白表达质粒或b型乙肝包膜蛋白表达质粒或c型乙肝包膜蛋白表达质粒或d型乙肝包膜蛋白表达质粒。

供试抗体溶液为实施例2制备的b430抗体溶液或mers-27抗体溶液。

1、取6孔板，铺板前每孔先放入酒精消毒后的盖玻片，然后每孔加入约10⁶个huh7细胞，培养15小时。

2、完成步骤1后，取所述6孔板，每孔加入2μg供试质粒和2μgpei转染试剂，培养72小时。

3、完成步骤2后，取6孔板中的盖玻片，用pbs缓冲液浸洗3次，然后用4％多聚甲醛溶液固定15min，然后用pbs缓冲液浸洗3次，然后用pbst溶液室温穿透20min，然后用pbs缓冲液洗涤3次，然后滴加山羊血清并室温封闭30min，然后滴加一抗工作液(将供试抗体溶液稀释至1000倍体积，即为一抗工作液)并4℃孵育15小时，然后用pbst溶液洗涤3次，然后滴加荧光二抗工作液(荧光二抗为山羊抗人igg-dylight594，货号cw0248，康为世纪)并37℃孵育1h，然后用pbst溶液浸洗3次，然后用dapi复染核，然后用pbst溶液洗涤4次，然后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在激光共聚焦显微镜下采集分析图像。

结果见图2。结果表明，b430抗体可以结合a、b、c、d基因型的乙肝病毒表达的膜蛋白。

实施例4、抗体的中和活性

一、hbv感染及抗体中和试验

供试抗体溶液为实施例2制备的b430抗体溶液或mers-27抗体溶液或hbig溶液。

1、培养hepad38细胞，收集上清，向上清中加入peg8000并使其在体系中的浓度为8％，然后离心沉淀病毒，用pmm培养基溶解，即为hbv病毒液。

2、将hepg2-ntcp细胞接种到48孔板中，贴壁约5小时后，更换为pmm培养基继续培养16小时。

3、完成步骤2后，取所述48孔板，吸弃上清，加入步骤1制备的hbv病毒液(moi＝200)、供试抗体溶液和peg8000(使peg8000的终浓度为5％)，培养16-20小时，然后吸弃上清，用pbs缓冲液洗细胞2次，然后用pmm培养基培养7-8天(两天换液一次)。

3、完成步骤2后，吸取上清，采用乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒检测hbe含量，利用graphpad拟合曲线比较抗体的中和活性。利用prism5软件计算抗体的ic50。

每种供试抗体的每种浓度设置2个复孔。

结果见图3。图3的横坐标显示的是体系中b430抗体的浓度，hbig浓度是b430抗体浓度的1000倍，mers-27抗体浓度与b430抗体相同。例如，体系中b430抗体的浓度为0.1μg/ml时，对应的hbig浓度为0.1mg/ml，对应的mers-27抗体浓度为0.1μg/ml。结果表明，b430抗体可以高效中和hbv病毒。

b430抗体的ic50值为0.019μg/ml。

hbig的ic50值为15μg/ml。

二、hdv感染及抗体中和试验

供试抗体溶液为实施例2制备的b430抗体溶液或mers-27抗体溶液或hbig溶液。设置用等体积pbs缓冲液代替供试抗体溶液的空白对照(nc)。

供试质粒为c型乙肝包膜蛋白表达质粒或d型乙肝包膜蛋白表达质粒。

1、huh7细胞在10cm直径培养皿，培养至80％-90％汇合度。

2、完成步骤1后，取所述培养皿，每个培养皿加入20μg供试质粒、10μgjc126载体和30μgpei转染试剂，培养8天后收集上清液，加入peg8000并使其在体系中的浓度为5％，然后离心沉淀病毒，用pmm培养基溶解，即为hdv病毒液。

3、将hepg2-ntcp细胞接种到48孔板中，贴壁约5小时后，更换为pmm培养基继续培养16小时。

4、完成步骤3后，取所述48孔板，吸弃上清，加入步骤2制备的病毒液(moi＝500)、供试抗体溶液和peg8000(体系中，peg8000的终浓度为5％)，培养16-20小时，然后吸弃上清，用pbs缓冲液洗细胞2次，然后用pmm培养基培养7天(两天换液一次)。

体系中，b430抗体的浓度为0.5μg/ml。体系中，hbig的浓度为0.5mg/ml，为单抗浓度1000倍。体系中，mers-27抗体的浓度为0.5μg/ml。

5、完成步骤4后，取所述48孔板，用pbs缓冲液浸洗3次，然后用4％多聚甲醛溶液固定15min，然后用pbs缓冲液浸洗3次，然后用pbst溶液室温穿透20min，然后用pbs缓冲液洗涤3次，然后滴加山羊血清并室温封闭30min，然后滴加一抗工作液(一抗为hdvδ抗体)并4℃孵育15小时，然后用pbst溶液洗涤3次，然后滴加荧光二抗工作液(二抗为驴抗兔alexafluortm594标记二抗,货号a-21207，美国invitrogen公司)并37℃孵育1h，然后用pbst溶液浸洗3次，然后用dapi复染核，然后用pbst溶液洗涤4次，然后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在激光共聚焦显微镜下采集分析图像。

结果见图4。与空白对照或者mers27抗体比较，b430抗体能够有效阻断c型乙肝包膜质粒包装的hdv病毒和d型乙肝包膜质粒包装的hdv病毒的感染。

sequencelisting

<110>清华大学

<120>乙肝病毒的中和抗体b430及其应用

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