本发明涉及藻毒素类天然毒素的检测技术领域，更具体地，涉及一种广谱识别藻毒素的纳米抗体及酶联免疫分析方法。
背景技术：
藻毒素是由天然水体中的蓝藻产生并释放到水体中的一种生物毒素，主要类别分为肝毒素、神经毒素、皮肤毒素以及脂多糖毒素四大类，其中肝毒素的毒性最强。肝毒素又包含微囊藻毒素(microcysin，mc)、节球藻毒素(nodularin，nod)和柱孢藻毒素(cylindrospermopsin，cyn)。世界卫生组织及我国新生活饮用水卫生标准(gb5749-2006)限定饮用水中mc-lr限量均为1.0μg/l。
人们在生产和生活中，会产生大量含有氮、磷化合物的废水，当排入水体中，在适宜的温度和光照条件下会使蓝藻水华大爆发，而在爆发过程中，蓝藻会向外释放一种次生代谢产物——藻毒素，从而抑制水体中其他生物的生长。由于水华爆发一般由一种或几种优势种类为主，多种蓝藻共同产生，所以在水体中能检测出一种或多种藻毒素。
藻毒素中的一大类都具有肝细胞毒性，其易溶于水，加热煮沸也不能将毒性破坏，且自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能将其完全去除。以mc-lr为例，毒理学研究表明，腹腔注射小白鼠的ld50值一般在50～60μg/kg(体重)，因此mc-lr的毒性可与有机磷类相当。
1975年，美国宾夕法尼亚小镇的饮用水爆发水华，生活用水被mcs污染，导致当地超过半数人患上急性肠胃炎。1996年，在巴西血液透析中心，因透析液被mcs污染，导致131个病人中，有116人出现视力模糊、恶心、呕吐等症状，并有50余人最终死亡。2007年，我国太湖发生了震惊全国的饮用水污染事件，大面积暴发的蓝藻水华导致无锡市饮用水遭受藻毒素污染。
现如今，云南滇池、江苏太湖、安徽巢湖的蓝藻水华事件也时有报道。此外，长江、黄河、松花江中下游等主要河流以及鄱阳湖、武汉东湖、上海淀山湖等几大淡水湖泊、水库，因为氮磷等富营养化，也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染，同时检测到了mcs的存在。对中国南北几个省市各水体进行监测，发现均有不同程度的mcs污染，其中以沟塘水、河水和水库水最为严重。因此，在日益严重的水污染环境下，对藻毒素的监测对饮用水安全将越来越重要。
针对微囊藻毒素的检测方法多样，其主要包括高效液相色谱法(hplc)、高相液相色谱串联质谱法(hplc-ms)、气相色谱法(gc)、薄层色谱法(tlc)、酶联免疫分析法。仪器法虽然准确性高，但以其价格昂贵，检测成本高，且不便于移动，无法做到现场检测。而基于抗体建立免疫分析方法，具有快速、灵敏、简便，低成本等优点，但是如今市场上所用到的单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点的不足，提供一种广谱识别藻毒素类药物的纳米抗体及酶联免疫分析方法。
本发明的第一个目的是提供一种抗藻毒素的纳米抗体。
本发明的第二个目的是提供一种抗藻毒素的纳米抗体的编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。
本发明的第五个目的是提供所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测藻毒素中的应用，或制备检测藻毒素的免疫试剂盒的应用。
本发明的第六个目的是提供一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法。
本发明的第七个目的是提供一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明首先构建了双峰驼来源的噬菌体展示纳米抗体文库，并从噬菌体展示纳米抗体文库中筛选到一种针对藻毒素类天然生物毒素的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列如seqidno：1所示，编码该纳米抗体的核苷酸序列如seqidno：2所示。
因此本发明要求保护一种抗藻毒素的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seqidno：1所示。
一种抗藻毒素的纳米抗体的编码基因，所述纳米抗体的核苷酸序列如如seqidno：2所示。
优选地，所述藻毒素为微囊藻毒素。
一种重组载体，所述重组载体含有所述编码基因。
一种重组细胞，所述重组细胞含有所述重组载体。
所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测藻毒素中的应用，或制备检测藻毒素的免疫试剂盒的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明进一步要求保护一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法，使用所述纳米抗体进行酶联免疫检测。
优选地，以偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素(mc-lr-ova)为包被原，以所述纳米抗体为抗体，进行间接竞争酶联免疫分析。
更优选地，包括以下步骤：
s1.偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素包被酶标板；
s2.将微囊藻毒素标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入权利要求1所述纳米抗体；
s3.加入酶标记的二抗，孵育；
s4.加入显色液，孵育；
s5.加入终止液并测定；
s6.以药物标准浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的藻毒素的含量。
本发明还要求保护一种间接竞争酶联免疫分析检测藻毒素的试剂盒，含有所述纳米抗体。
优选的，还含有包被有偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素的酶标版。
更优选地，还含有微囊藻毒素标准品、二抗、包被液、显色液、终止液、稀释液、洗液。
更优选地，二抗为兔抗vhh-hrp多克隆抗体。
更优选地，显色液为tmb。
更优选地，终止液为h2so4。
更优选地，稀释液为pbsph7.4。
更优选地，洗液为pbst。
最优选的，一种间接竞争酶联免疫分析检测藻毒素的试剂盒，含有所述纳米抗体、包被有偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素的酶标版、微囊藻毒素标准品、兔抗vhh-hrp多克隆抗体二抗、tmb显色液、h2so4终止液、稀释液、pbst洗液。
其使用方法为：将50μl所述纳米抗体加入到包被抗原孔内；将50μl梯度稀释的微囊藻毒素标准品和待测样本分别加入到包被抗原孔内，37℃反应40min；用300μlpbst洗板5次，加入5000倍稀释的兔抗vhh-hrp多克隆抗体二抗，37℃孵育反应40min；用300μlpbst洗板5次，然后加入100μl的tmb显色液，37℃孵育10min；最后加入50μl的10％h2so4终止液，在od450nm下读数。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明得到一种可以识别多种藻毒素的纳米抗体，且检测结果准确、效果好、稳定性好、广谱性好。该方法可以广泛的应用于饮用水中藻毒素的残留检测，避免了利用单克隆抗体和多克隆抗体建立免疫检测方法时候，目前单克隆抗体和多克隆抗体均表现稳定性差、易失活的缺点的不足，使酶联免疫分析检测法更具市场前景。本方法具有很大的应用推广价值。
附图说明
图1为ic-elisa测定上清液中抗体的活性。
图2为m110和m207抗体的氨基酸序列。
图3为纳米抗体m110的ic-elisa方法检测mc-lr的标准曲线。
图4为纳米抗体m110在不同温度中水浴10min后与抗原的结合能力曲线。
图5为纳米抗体m110在90℃水浴不同时间后与抗原的结合能力曲线。
图6为纳米抗体m110对不同浓度甲醇和乙腈的耐受性曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1纳米抗体免疫文库的构建
一、实验方法
1、mc-lr完全抗原的构建
将微囊藻毒素(mc-lr)分别与卵清白蛋白ova(albumin)和匙孔血蓝蛋白klh(keyholelimpetheocyanin)通过活泼酯法偶联制备完全抗原mc-lr-ova和mc-lr-klh。
所述mc-lr的化学式为：
2、免疫双峰驼获得血清
取500μg的mc-lr-klh与等量体积的弗氏完全佐剂乳化，对双峰驼颈部皮下进行多点免疫注射。每隔2周加强免疫一次，每次500μg的mc-lr-klh和等量体积的弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫，每次免疫一周后静脉采血。采用间接竞争elisa方法测定血清效价，取血清抑制最好的血液样品进行淋巴细胞分离以及rna的提取。
3、rna的提取
依据invitrogen公司的trizol试剂方法进行。以rna为模板，参照taraka公司第一链反转录试剂盒说明书进行cdna第一链的合成。
4、骆驼重链抗体的可变区编码基因的扩增
利用taqmixdna聚合酶，经pcr技术扩增获得骆驼重链抗体的可变区编码基因(引物如下表1)。
表1扩增vhh基因的引物序列：
第一轮pcr采用引物call001和call002扩增，第一轮pcr反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，55℃，1min，72℃，1min，30个循环；72℃延伸10min。把第一轮pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，回收600～700bp的片段，通过dna切胶回收试剂盒回收目的片段。
以第一轮pcr回收的目的片段为模板，利用第二轮引物fr4-sfii和fr1-sfii进行扩增。pcr反应条件为，94℃，4min，94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，30个循环，72℃延伸10min。把第一轮pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，回收约700bp的片段，通过进一步切胶回收得到纳米抗体基因片段，定量并置于-20℃保存备用。
5、纳米抗体基因库的构建
将噬菌粒载体pcomb3xss及纳米抗体基因片段进行sfii双酶切，通过切胶回收和pcr纯化回收获得pcomb3xss和纳米抗体基因片段。然后在16℃下，以pcomb3xss和目的片段1：3的摩尔比混合，利用t4连接酶过夜连接反应。
上述连接产物经pcr纯化试剂盒进行沉淀回收，溶于30μl的无菌水。将连接产物分5次电转化入感受态细胞er2738中，转化菌液在220rpm，37℃摇床培养1小时复苏生长。梯度稀释转化菌液，涂布含氨苄青霉素和四环素的lb培养板，37℃过夜培养，次日计算转化文库大小，转化文库库容大于107的文库用于噬菌体文库的构建。
随机挑取涂布平板的单克隆菌株，送测序公司测序，鉴定抗体库的多样性。库容依据克隆数目和多样性计算。
将培养基上的克隆用含氨苄青霉素和四环素的lb培养基刮下，加甘油调至20％浓度后分装，置于-80℃冻存，即为纳米抗体基因库。
6、抗体库的滴度的测定
取纳米抗体基因库2ml接种至400ml的lb(含100μg/ml氨苄青霉素和四环素)，37℃，220rpm，培养至er2738对数期od600约0.6。按感染复数比20：1加入辅助噬菌体m13k07静置侵染30min，然后37℃，220rpm，1h，之后加入卡那霉素(50μg/ml)，过夜培养。次日，以12000rpm，离心20min，取上清，加入1/5体积的20％peg-nacl溶液，冰上孵育5h或4℃过夜。随后，12000rpm，离心20min，用pbs重悬噬菌体，即得到抗藻毒素噬菌体展示纳米抗体库，吸取10μl测定抗体库的滴度，其余保存于-80℃备用。
二、实验结果
经6次电转化至ecolier2738中，平板计数测得构建的纳米抗体基因文库库容为8×107cfu/ml，经辅助噬菌体m13k07救援后，制备得到噬菌体展示纳米抗体文库，经平板计数得到文库滴度达4.5×1012pfu/ml。
实施例2抗藻毒素纳米抗体的筛选与鉴定
一、实验方法
1、总共进行4轮筛选，具体步骤如下：
(1)固相酶标板准备
用高吸附酶标板包被抗原，每轮包被2孔去背景孔(1mg/mlklh，3孔1mg/mlova，3孔1mg/mlbsa)以及2孔筛选孔，包被原为mc-lr-ova，每轮浓度梯度分别为：10μg/ml、2.5μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml，37℃水浴过夜。次日，用pbst洗涤2次，120μl封闭液/孔，每轮封闭液配方为：1％鱼胶、1％明胶、3％bsa和1％鱼胶，封闭3h，甩去孔内溶液，拍干，置于37℃烘箱倒扣烘干备用。
(2)淘筛
取100μl抗体库溶液(摇匀)先置于klh孔，37℃震荡反应1h，然后转移至ova孔，37℃震荡反应1h，然后转移至bsa孔，37℃震荡反应1h，去除非特异性吸附。最后转移至包被原孔，37℃震荡1h，弃孔内液体，用pbst(300μl)洗板15次，再用pbs洗板5次，拍干。加入100μl/孔竞争洗脱溶液(药物浓度梯度分别为：2μg/ml，0.5μg/ml，0.1μg/ml，10mg/ml胰蛋白酶)，37℃震荡1h，收集上清液，重复竞争两次，并最终混合两次洗脱液。取10μl洗脱液计算回收的滴度，其余噬菌体产物扩增后用于下一轮的淘筛。
2、进行4轮淘筛(淘筛策略见表2)，随机挑取第四轮的噬菌体单克隆进行表达后，采用ic-elisa测定上清液中抗体的活性。
表2：淘筛策略表：
二、实验结果
经过4轮淘筛后，获得2种不同序列的纳米抗体(具体序列如图2)：m110和m207抗体。图1为ic-elisa测定上清液中抗体的活性，对比抑制率，m110的抑制效果最好，经过测序得到其核苷酸序列如seqidno：2；其氨基酸序列如seqidno：1所示。
实施例3抗藻毒素纳米抗体的筛选与鉴定
一、实验方法
1、将携带有实施例2筛选筛选出的抗体基因的质粒m110-pcomb3xss通过提取试剂盒抽提，然后通过化学转化方法导入感受态大肠杆菌bl21(de3)。取单克隆进行pcr鉴定和测序，确定插入片段为目的片段。将含有纳米抗体目的片段的bl21(de3)菌落培养至对数期od600值为0.6，加入1mm的iptg，37℃诱导表达12h。次日，离心得菌体。然后通过冻融法提取周质腔蛋白，经一步ni柱纯化后回收周质腔中的可溶性纳米抗体。
2、以mc-lr-ova为包被原，包被浓度2ug/ml，纳米抗体浓度0.5ug/ml，以mc-lr为竞争性药物，起始浓度1ug/ml，5倍稀释，二抗稀释倍数1:5000，建立可溶性纳米抗体间接竞争elisa检测mc-lr药物。
二、实验结果
检测mc-lr如图3所示，最终获得的mc-lr特异性结合的最佳纳米抗体m110，ic50为3.55ng/ml，最低检测限为0.652ng/ml，线性范围为1.28～9.88ng/ml。
实施例4ic-elisa方法检测多种藻毒素药物
一、实验方法
以mc-lr-ova为包被原，m110为抗体，采用间接竞争elisa方法对mc-lr的特异性及灵敏度进行评价。
程序如下，将50μl的抗体和50μl梯度稀释的mc-lr、其结构类似的藻毒素药物以及黄曲霉毒素afb1加入到包被抗原孔内，37℃反应40min。用300μlpbst洗板5次，加入5000倍稀释的兔抗vhh-hrp多克隆抗体(购买于金斯瑞生物科技有限公司购买)，37℃孵育反应40min。用300μlpbst洗板5次，然后加入100μl的tmb显色液，37℃孵育10min。最后加入50μl的10％h2so4终止液，在od450nm下读数。
二、实验结果
结果显示，纳米抗体m110与藻毒素类药物均有交叉，交叉率均在36.7％以上，说明其在藻毒素类药物的检测中具有很好的广谱性，具体结果如下表3。
表3：
实施例5抗藻毒素纳米抗体的稳定性分析
一、实验方法
1、将纳米抗体m110(氨基酸序列如seqidno.1所示)分成7等份，置于水浴锅中。在4、20、37、50、70和90℃中水浴10min，水浴结束后将抗体恢复至室温。再把抗体稀释至1μg/ml，测定抗体与抗原的结合能力。以未经孵育的抗体效价作为100％，评价m110纳米抗体在不同温度下加热10min的稳定性。
2.将纳米抗体m110分成8等份，置于水浴锅中。在90℃条件下，分别加热5、10、20、30、40、50和60min，加热结束后将抗体恢复至室温。把纳米抗体稀释至工作浓度，测定抗体与抗原的结合能力。以未加热的抗体效价作为100％，评价纳米抗体m110在相同温度下不同加热时间的稳定性。
3.将纳米抗体m110稀释至工作液浓度，分别以不同浓度(10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％和80％)的甲醇，乙腈作为稀释液，测定抗体与抗原的结合能力，以未加有机溶剂的抗体与抗原结合的能力作为100％，评价纳米抗体m110对不同百分比的有机溶剂的耐受能力。
二、实验结果
探究纳米抗体m110在不同温度(4、20、37、50、70和90℃)中水浴10min后与抗原的结合能力，结果如图4所示，纳米抗体m110在90℃孵育10min仍保留超过80％活。
其次探究纳米抗体m110在90℃水浴不同时间(5、10、20、30、40、50、60min)后与抗原的结合能力，结果如图5所示，结果显示纳米抗体m110在50℃孵育10min，仍具备97％的抗原结合活性；在90℃孵育30min，仍具备81％的抗原结合活性。
探究纳米抗体m110对不同浓度甲醇和乙腈的耐受性，结果如图6所示，结果显示，纳米抗体在甲醇浓度为40％或乙腈浓度为40％时，仍具有超过80％的活性。
实施例6一种间接竞争酶联免疫分析检测藻毒素的试剂盒
组成：纳米抗体(氨基酸序列如seqidno：1所示)、包被有偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素的酶标版、微囊藻毒素标准品、兔抗vhh-hrp多克隆抗体二抗、tmb显色液、h2so4终止液、稀释液、pbst洗液。
其使用方法为：将50μl所述纳米抗体加入到包被抗原孔内；将50μl梯度稀释的微囊藻毒素标准品和待测样本分别加入到包被抗原孔内，37℃反应40min；用300μlpbst洗板5次，加入5000倍稀释的兔抗vhh-hrp多克隆抗体二抗，37℃孵育反应40min；用300μlpbst洗板5次，然后加入100μl的tmb显色液，37℃孵育10min；最后加入50μl的10％h2so4终止液，在od450nm下读数。
根据微囊藻毒素标准品绘制标准曲线，以判断样品藻毒素浓度。
序列表
<110>华南农业大学
<120>一种广谱识别藻毒素纳米抗体及酶联免疫分析方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>128
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gluvalglnleuleugluserglyglyglyservalglnalaglygly
151015
serleuargleusercysthrvalserglyserileserargserval
202530
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aspservallysaspargphethrileserhisaspasnalalysasn
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859095
tyrtyrcysalaalahisgluargtrptrpglncysglyalaasngly
100105110
serglutyrlystyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalalaser
115120125
<210>2
<211>384
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gaggtgcagctgctggagtctgggggaggctcggtccaggctggagggtctctgagactc60
tcctgtacagtctctggatccatctctagaagcgtctgtggctactggttccgccaggtt120
ccagggaaggagcgcgagggggtcgcaggggctgggtttcatatgggtgcggtgcgcgaa180
tactactacgccgactccgtgaaggaccgattcaccatctcccacgacaacgccaagaac240
actatgtatctgcaaatgaatcgcctgaaacctgaagatactgccatgtactactgtgcg300
gcacacgaacggtggtggcaatgtggggcaaatggatctgagtataagtactggggccag360
gggaccctggtcaccgtcgcctca396
1.一种抗藻毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如如seqidno：1所示。
2.一种抗藻毒素的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述纳米抗体的核苷酸序列如seqidno：2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述编码基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述重组载体。
5.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在检测藻毒素中的应用，或制备检测藻毒素的免疫试剂盒的应用。
6.一种酶联免疫分析检测藻毒素的方法，其特征在于，使用权利要求1所述纳米抗体，进行酶联免疫检测。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，以偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素为包被原，以权利要求1所述的纳米抗体为检测抗体，进行间接竞争酶联免疫分析。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1.用偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素包被酶标板；
s2.将微囊藻毒素标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入权利要求1所述纳米抗体；
s3.加入酶标记的二抗，孵育；
s4.加入显色液，孵育；
s5.加入终止液并测定；
s6.以药物标准浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的藻毒素的含量。
9.一种间接竞争酶联免疫检测藻毒素的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述纳米抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还含有包被有偶联了卵清蛋白的微囊藻毒素的酶标版。
技术总结