本发明整体涉及益生菌，具体地涉及能够生物转化橄榄多酚的益生菌。本发明涉及一种选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物的方法。本发明的另外方面包括益生菌菌株或益生菌菌株混合物用于提高橄榄多酚的功效的用途以及包含用于增强橄榄苦苷的治疗效果和/或预防效果的益生菌菌株或益生菌菌株混合物的组合物。
背景技术：
橄榄苦苷是存在于属于木犀科的植物尤其是油橄榄(oleaeuropaea)的果实、根部、树干中并且更具体地叶片中的多酚。本发明人注意到，橄榄苦苷代谢物羟基酪醇在软骨细胞代谢方面产生的体外数据获得明显的阳性结果，与橄榄苦苷相比，其显示出更高功效。不受理论的约束，基于文献，本发明人认为羟基酪醇的化学结构表明羟基酪醇具有比橄榄苦苷更高的生物利用率。再次不受理论的约束，本发明人进一步认为，一剂橄榄苦苷的一部分可在肠的较上部分按原样被吸收并且另一部分可到达结肠，在结肠中它在生物转化成羟基酪醇和/或中间代谢物诸如橄榄苦苷苷元或羟基酪醇乙酸酯后被大部分吸收。
增强橄榄苦苷代谢物在结肠处的吸收可提高橄榄苦苷的生物利用率，从而潜在提高橄榄苦苷的功效。就这一点而言，橄榄苦苷与一种或多种具有糖苷酶活性和/或酯酶活性的益生菌的共同施用可增加此益生菌在结肠中的存在，使橄榄苦苷原位降解，以便优化其代谢物的吸收和随后的效果。
已经提出了将植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)菌株b21用于去除橄榄的苦味[marsilio等人，j.sci.foodagric.76,520-524(1998)(《食物农业科技杂志》，第76期，第520-524页，1998年)]，其中显示其可降解橄榄苦苷。然而，发酵过程耗时约5天，这远远长于实际的消化时间范围，因此，植物乳杆菌菌株b21将无法提供合适的益生菌以与橄榄苦苷共同施用来增强生物利用率和/或生物功效。
本领域显然需要找到改善的方法来鉴定益生菌的，具体地讲，能够提高橄榄多酚诸如橄榄苦苷的生物利用率和/或生物功效的益生菌。
不能将本说明书中对现有技术文献中的任何参考视为承认此类现有技术为众所周知的技术或形成本领域普遍常识的一部分。如本说明书中所用，词语“包括”、“包含”和类似词语不应理解为具有排他性或穷举性的含义。换句话讲，这些词语旨在意指“包括，但不限于”。
技术实现要素：
本发明的目的是改善现有技术，并且提供针对益生菌鉴定问题的改善解决方案，或至少提供有用的替代方法。
本发明的目的通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步拓展本发明的构想。
因此，本发明在第一方面提供了一种选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.通过计算机分析来鉴定具有β-葡糖苷酶编码基因的益生菌菌株，
和/或通过体外分析多个菌株来鉴定具有β-葡糖苷酶活性的益生菌菌株；
b.通过计算机分析来鉴定具有酯酶编码基因的益生菌菌株，和/或通过体外分析多个菌株来鉴定具有酯酶活性的益生菌菌株；
c.将橄榄苦苷与i)在步骤a中被鉴定为具有β-葡糖苷酶活性的益生菌菌株和在步骤b中被鉴定为具有酯酶活性的益生菌菌株的细菌培养物、或ii)在步骤a和步骤b中被鉴定为具有β-葡糖苷酶活性和酯酶活性两者的益生菌菌株的细菌培养物一起发酵；
d.鉴定在步骤c的发酵期间形成的代谢物是否包含羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇或榄香醇酸；
e.测量在步骤c中作为发酵时间函数而剩余的橄榄苦苷的比例；以及
f.选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物，其中所述益生菌菌株或益生菌菌株混合物在步骤c中短于24的时间段内消耗至少10重量％的橄榄苦苷，并且其中在步骤c的所述发酵期间形成的所述代谢物包含选自羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇和榄香醇酸的分子。
在第二方面，本发明涉及根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物用于提高橄榄多酚的功效的用途。
本发明的第三方面涉及一种组合物，该组合物包含根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物，其用于增强橄榄苦苷对个体的治疗效果和/或预防效果。
本发明人惊奇地发现，通过本发明方法所选的益生菌或益生菌混合物能够增强橄榄多酚诸如橄榄苦苷的生物利用率及其功效(即其生物功效)。通过本发明方法所选的益生菌或益生菌混合物能够在对于消化时段而言有效的时段后将橄榄苦苷转化成其代谢物。这使得益生菌在与橄榄苦苷共同施用或者单独施用时但在彼此施用的几小时内是有效的。
橄榄苦苷的吸收机制尚不明确。然而，橄榄苦苷抵抗上胃肠道和小肠中的降解，因此一剂橄榄苦苷的至少一部分将到达结肠。结肠中的微生物区系可随后对该橄榄苦苷进行生物转化。
如图2所示，去糖基化将橄榄苦苷转化为橄榄苦苷苷元(也称为3,4-二羟基苯基乙醇-榄香醇酸或“3,4-dhpea-ea”)。然后水解(例如，通过酯酶)可形成羟基酪醇乙酸酯和/或榄香醇酸，并且进一步的水解可由羟基酪醇乙酸酯形成羟基酪醇。
根据文献，橄榄苦苷苷元的吸收为羟基酪醇的2.2分之一，但为橄榄苦苷的吸收的13.5倍。与羟基酪醇和橄榄苦苷相比，橄榄苦苷苷元从血浆中的清除较慢。此外，橄榄苦苷苷元具有与咖啡酸、橄榄苦苷和羟基酪醇相当的抗氧化活性。
羟基酪醇的吸收高于橄榄苦苷和橄榄苦苷苷元，羟基酪醇乙酸酯的吸收甚至高于羟基酪醇的吸收。就这一点而言，由于在羟基酪醇乙酸酯中存在酯基，因此羟基酪醇乙酸酯比羟基酪醇更易溶于亲脂相中。本发明人认为，这种增强的亲脂性表明羟基酪醇乙酸酯比游离的羟基酪醇在整个肠上皮细胞单层中被更好地吸收。
橄榄苦苷可在上胃肠道中按原样被吸收或可到达结肠，在结肠中它在生物转化成橄榄苦苷苷元、羟基酪醇乙酸酯和/或羟基酪醇后被大部分吸收。然而，在上胃肠道中未被吸收并因此到达结肠以在生物转化后进一步代谢的橄榄苦苷的比例没有明确的限定。因此，不受理论的约束，本发明人认为，增强橄榄苦苷或其衍生物在结肠中的吸收可提高橄榄苦苷在口服摄入后的潜在功效，从而提高其生物利用率。实际上，橄榄苦苷或其衍生物在结肠中的增强吸收可提供来自至少两个吸收位点和至少两种循环化合物(即母体化合物和一种或多种代谢物)的功效(例如双重功效)。
具体地讲，橄榄苦苷与根据本发明方法所选的一种或多种益生菌的共同施用可增加益生菌在结肠中的存在，从而允许橄榄苦苷原位降解，以便优化橄榄苦苷的吸收和随后的效果。例如，具有β-糖苷酶活性、优选地β-葡糖苷酶活性(并且优选地不具有酯酶活性)的益生菌可在结肠中将橄榄苦苷转化为橄榄苦苷苷元。具有β-糖苷酶活性(优选地β-葡糖苷酶活性)和酯酶活性的益生菌可在结肠中将橄榄苦苷转化为羟基酪醇乙酸酯和/或羟基酪醇。在结肠中建立和/或增加此类微生物的存在可增强橄榄苦苷施用的效果，由此提供随时间推移的橄榄苦苷的延长吸收(例如，在两种不同水平上的吸收：小肠，结肠)，例如吸收相对于本身提供更急性吸收峰的羟基酪醇延长。代谢物由于橄榄苦苷和根据本发明方法所选的益生菌的共同施用而更快产生，其生物利用率的开始可能更早，从而导致更长的总吸收期。
附图说明
图1示出了橄榄苦苷的化学结构。
图2示出了通过微生物区系进行的橄榄苦苷的生物转化。
具体实施方式
因此，本发明部分地涉及一种选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物(例如，以提高橄榄多酚的生物功效)的方法，该方法包括以下步骤：
a.通过计算机分析来鉴定具有β-葡糖苷酶编码基因的益生菌菌株，和/或通过体外分析多个菌株来鉴定具有β-葡糖苷酶活性的益生菌菌株；
b.通过计算机分析来鉴定具有酯酶编码基因的益生菌菌株，和/或通过体外分析多个菌株来鉴定具有酯酶活性的益生菌菌株；
c.将橄榄苦苷与i)在步骤a中被鉴定为具有β-葡糖苷酶活性的益生菌菌株和在步骤b中被鉴定为具有酯酶活性的益生菌菌株的细菌培养物、或ii)在步骤a和步骤b中被鉴定为具有β-葡糖苷酶活性和酯酶活性两者的益生菌菌株的细菌培养物一起发酵；
d.鉴定在步骤c的发酵期间形成的代谢物是否包含羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇或榄香醇酸；
e.测量在步骤c中作为发酵时间函数而剩余的橄榄苦苷的比例；以及
f.选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物，其中所述益生菌菌株或益生菌菌株混合物在步骤c中短于24的时间段内消耗至少10重量％的橄榄苦苷，并且其中在步骤c的所述发酵期间形成的所述代谢物包含选自羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇和榄香醇酸的分子。
步骤c中的发酵可在或接近益生菌菌株的最佳生长条件下进行，此类条件易于被技术人员确定。步骤c中的发酵可在不存在糖的情况下进行，作为橄榄苦苷分子的一部分的葡萄糖部分除外。
根据本发明的方法在步骤a中通过计算机分析进行的益生菌菌株的鉴定可通过提供益生菌菌株的基因组并在益生菌菌株的基因组中进行β-葡糖苷酶编码基因的序列相似性搜索来进行。根据本发明的方法在步骤b中通过计算机分析进行的益生菌菌株的鉴定可通过提供益生菌菌株的基因组并在益生菌菌株的基因组中进行酯酶编码基因的序列相似性搜索来进行。例如，此前证实了约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)ncc533包含肉桂酰基酯酶的基因编码[lai等人，applenvironmicrobiol,75(15):5018-24(2009)(《应用与环境微生物学》，第75卷第15期，第5018-5024页，2009年)]。因此，基因lj1228可作为参考蛋白质，用以搜索益生菌基因组中的其它酯酶编码基因，按序列相似性(blastp)进行搜索。也可在蛋白质层面进行序列相似性搜索。例如，对于β-葡糖苷酶，可使用得自数据库诸如uniprot的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质的序列。示例将是来自嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)ncfm的q5fjd3。
根据本发明的方法在步骤a和步骤b中通过体外分析进行的益生菌菌株的鉴定可通过表型筛选进行。例如，可使用用于鉴定酶活性的半定量微量法，诸如apizym系统。
在步骤c的发酵期间形成的代谢物中的至少一种的鉴定可例如通过hplc分析来进行。
作为发酵时间函数的步骤c中剩余的橄榄苦苷的比例可例如通过分光光度法来进行。例如，使用可区分橄榄苦苷及其代谢物的波长。本发明人发现300nm是可测量橄榄苦苷浓度而不会因羟基酪醇的吸收而显著受影响的波长。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤：确定益生菌菌株或益生菌菌株混合物是否改善了橄榄苦苷的生物利用率(任选地确定载体基质的效果)，使用原软骨细胞和成骨细胞培养物来评估体外功效，和/或使用临床试验来研究橄榄苦苷和益生菌菌株对健康结果例如骨骼和关节健康结果的效果。
在又一方面，根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物可用于提高橄榄多酚诸如橄榄苦苷的功效(例如生物功效)。例如，根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物可对橄榄苦苷起作用以形成选自橄榄苦苷苷元、羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇以及它们的混合物的代谢物。橄榄苦苷和橄榄苦苷代谢物提供的治疗效果和/或预防效果比通过单独施用橄榄苦苷或其代谢物所获得的效果具有更长持续时间。橄榄多酚在口服摄入后的功效可通过如下方式来增强：通过增强其在结肠处的吸收来增大橄榄苦苷的生物利用率，从而提供来自至少两个吸收位点和至少两种循环化合物(即母体化合物和一种或多种代谢物)的功效(例如，双重功效)。本发明可提供包含根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物的组合物，用于提高橄榄多酚诸如橄榄苦苷的功效(例如生物功效)。
有利的是，根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物可对在小肠中部分吸收橄榄苦苷之后到达结肠的橄榄苦苷的部分进行生物转化；预期3,4-二羟基酚乙醇-榄香醇酸(也称为橄榄苦苷苷元和3,4-dhpea-ea)和/或羟基酪醇和/或羟基酪醇乙酸酯在结肠中的吸收率更高。
根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物的另一个优点是提供一剂橄榄苦苷的更长持续时间的治疗效果，可能通过提供随时间推移的延长吸收来实现，其中橄榄苦苷或其代谢物在小肠和结肠这两种不同水平上被吸收。
本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是减少橄榄苦苷摄入的剂量，同时实现相同的功效。
在一个实施方案中，益生菌或益生菌菌株混合物包含在还包含橄榄多酚(例如橄榄苦苷)的食品或饮料组合物中。在另一个实施方案中，益生菌或益生菌菌株混合物包含在将要相继地与橄榄多酚(诸如橄榄苦苷)一起消耗的食品或饮料组合物中。
橄榄多酚的膳食有益效果为健康个体所享有。橄榄作为健康食品具有很强的消费者接受度。(例如在食品中)产生橄榄多酚代谢物有益于健康个体，例如当代谢物提供增强的橄榄多酚的生物利用率和功效时。根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物可以非治疗方式用于提高橄榄多酚诸如橄榄苦苷的功效。
本发明还提供根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物用于增强橄榄多酚诸如橄榄苦苷对个体的治疗效果和/或预防效果的用途。
本公开提供的一个或多个实施方案的优点是年老、虚弱或虚弱前期个体的移动性，例如经历康复恢复或具有肌肉减少症风险的此类个体，具体地讲针对此类个体的骨和关节有益效果。
本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是治疗或预防骨量减少(骨量的轻微损失)，促进年轻个体的骨生长，和/或治疗或预防与骨形成和骨吸收之间的比例失衡相关的障碍。
本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是针对患有骨质疏松症、假体附近的骨质溶解、牙周病、骨关节炎和/或骨量减少的个体刺激骨形成或抑制骨吸收。
本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是增强骨形成和/或软骨合成代谢；预防或治疗软骨破坏；和/或在老化期间限制滑膜炎和随后的关节软骨劣化(骨关节炎)。
本公开提供的一个或多个实施方案的另一个优点是增强个体例如老年个体的微生物区系。
本发明的一个方面提供一种组合物，该组合物包含根据本发明方法所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物，用于增强橄榄多酚诸如橄榄苦苷对个体的治疗效果和/或预防效果。在一个实施方案中，益生菌菌株或益生菌菌株混合物形成选自橄榄苦苷苷元、羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇以及它们的混合物的橄榄苦苷代谢物。橄榄苦苷和橄榄苦苷代谢物可提供的治疗效果和/或预防效果比通过单独施用橄榄苦苷代谢物所获得的效果具有更长持续时间。组合物可按有效量来施用。组合物还可包含橄榄多酚，例如橄榄苦苷。
就这一点而言，橄榄多酚(例如橄榄苦苷)与根据本发明方法所选的益生菌或益生菌混合物的“共同施用”是指将益生菌或益生菌混合物施用给已经服用了橄榄多酚(例如橄榄苦苷)和/或将服用橄榄多酚的个体，并且不一定意味着它们同时在同一组合物中施用。虽然同时施用实际上是优选的，但本公开不限于该实施方案。如果橄榄多酚(例如橄榄苦苷)和益生菌或益生菌混合物包含在同一组合物中，则橄榄苦苷可与益生菌分开以防止橄榄多酚在储存时发酵。例如，益生菌可与橄榄多酚分开包封。优选地，益生菌或益生菌混合物仅在施用后与橄榄多酚反应，例如在个体的消化道中反应。
在一个实施方案中，橄榄多酚(例如橄榄苦苷)和益生菌可在单独的组合物相继施用。术语“相继地”是指橄榄多酚(例如橄榄苦苷)和益生菌菌株或益生菌菌株混合物以连续的方式施用，使得橄榄多酚(例如橄榄苦苷)在没有益生菌菌株或益生菌菌株混合物的第一时间施用，而益生菌菌株或益生菌菌株混合物在没有橄榄多酚(例如橄榄苦苷)的第一时间之后的第二时间施用。相继施用之间的时间可为例如一天中的一秒或若干秒、一分钟或若干分钟或一小时或若干小时；一个月中的一天或若干天或一周或若干周；或一年中的一个月或若干个月。相继施用的次序可以颠倒。
根据本发明的组合物的治疗效果和/或预防效果可选自以下：治疗或预防中老年人(例如老年个体)的移动性受损；针对具有包括骨形成和骨吸收失衡的病症的个体刺激骨形成和/或抑制骨吸收；治疗或预防滑膜炎；治疗或预防患有滑膜炎或经历滑膜炎恢复的个体的滑膜炎后关节软骨退化；以及治疗或预防软骨破坏。
在一个实施方案中，治疗效果和/或预防效果是治疗或预防中老年人的移动性受损，并且中老年人具有选自以下的病症：虚弱、虚弱前期、肌肉减少症、经历肌肉减少症恢复、骨质疏松症、骨关节炎、营养不良、处于营养不良的风险中、正在进行康复、计划在次年内进行康复以及它们的组合。
在另一个实施方案中，治疗效果和/或预防效果是针对具有包括骨形成和骨吸收失衡的病症的个体刺激骨形成和/或抑制骨吸收，并且该病症选自骨质疏松症、佩吉特病、假体附近的骨质溶解、转移性骨疾病、甲状腺机能亢进、由癌症引起的高钙血症、多发性骨髓瘤、牙周病、骨关节炎、骨量减少、由骨折引起的骨缺损、骨折愈合以及它们的组合。
在另一个实施方案中，治疗效果和/或预防效果是治疗或预防滑膜炎，并且滑膜炎与选自狼疮、痛风、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨软骨炎疾病、骨关节病以及它们的组合的病症相关。
在一个实施方案中，向个体施用组合物持续至少一个月的时间段；优选至少两个月，更优选至少三个月、四个月、五个月或六个月；最优选至少一年。在该时间段期间，可将组合物施用给个体每周至少一天；优选每周至少两天，更优选每周至少三天、四天、五天或六天；最优选每周七天。组合物可每天以单次剂量或每天以多种单独剂量施用。
在一些实施方案中，组合物用于美国专利申请公布号2016/0045519和2016/0120891以及国际专利申请公布号wo2015/055468所公开的方法中的一种，这些文献全文以引用方式并入本文。
组合物的有效量随具体组合物、接受者的年龄和病症以及所治疗的具体障碍或疾病而变化。然而，在一般实施方案中，组合物可以每天提供105至1012菌落形成单位(cfu)的益生菌菌株或益生菌菌株混合物，优选地每天提供107至1011cfu的益生菌菌株或益生菌菌株混合物的量施用给个体。在其中组合物包含橄榄苦苷的实施方案中，组合物可以每天提供0.01mg至2g的橄榄苦苷，优选每天提供0.1mg至1g的橄榄苦苷，并且更优选每天提供1mg至200mg的橄榄苦苷的量施用给个体。
在一个实施方案中，橄榄苦苷的至少一部分通过提取获得，例如通过从植物诸如属于木犀科的植物中提取，优选地从属于木犀科的植物诸如油橄榄(橄榄树)、女贞属的植物、丁香属的植物、白蜡属的植物、茉莉属的植物和木犀属的植物的茎、叶、果实或果核中的一者或多者中提取。除此之外或另选地，橄榄苦苷的至少一部分可通过化学合成获得。
组合物可包含有效量的橄榄苦苷与益生菌或益生菌混合物的组合。例如，组合物的单次服用量或剂量可包含该有效量，并且包装件可包含一次或多次服用量或剂量。
组合物可包含选自以下的食品添加剂：酸化剂、增稠剂、用于ph调节的缓冲剂或试剂、螯合剂、着色剂、乳化剂、赋形剂、调味剂、矿物质、渗透剂、药学上可接受的载体、防腐剂、稳定剂、糖、甜味剂、质构剂、维生素、矿物质以及它们的组合。
组合物可包含用于骨质量的附加成分，例如蛋白质、维生素c、维生素d、维生素k2、钙、磷、镁、锌、橙皮苷(黄烷酮)或它们的组合。组合物可包含用于关节质量的附加物，该附加物包含至少一种用于短期关节质量的成分，例如葡萄糖胺(如硫酸葡萄糖胺)、软骨素(如硫酸软骨素)、透明质酸(如富含透明质酸的鸡冠提取物)或它们的组合(优选地至少透明质酸)和/或至少一种用于长期关节质量的成分，例如维生素c、另一种多酚(如姜黄素、槲皮素和/或芦丁)、ω-3脂肪酸或它们的组合。用于关节质量的其它合适附加成分的非限制性示例包括胶原、水解胶原、齿叶乳香、蔷薇果以及它们的组合。
蛋白质可为乳清，例如，天然乳清、完整未水解乳清、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、酸乳清、甜乳清、改性甜乳清(已从其中去除酪蛋白糖巨肽的甜乳清)、乳清蛋白的级分物或乳清蛋白水解产物；酪蛋白；植物蛋白质诸如大豆蛋白；以及它们的组合。酪蛋白可以游离形式或盐形式提供，例如钠盐、钙盐或钾盐。虽然蛋白质可包括植物蛋白质，但在一些实施方案中，组合物是无谷蛋白的。
蛋白质可为由酸或酶处理的动物和植物蛋白质(诸如酪蛋白水解产物、乳清水解产物、酪蛋白/乳清水解产物、大豆水解产物以及它们的混合物)制备的深度水解的蛋白质水解产物。“深度水解的”蛋白质水解产物意指完整的蛋白质被水解成肽片段，其中大多数肽片段的分子量小于1,000道尔顿，优选地至少约75％并且最优选地至少约95％的肽片段的分子量小于约1,000道尔顿。游离氨基酸和合成短肽链可被取代或添加到蛋白质水解产物中。
在一个实施方案中，蛋白质包含乳清蛋白胶束，如美国专利申请公开2009/0035437及其等同专利ep1839492a1所述，并且在c.schmitt等人，softmatter6:4876-4884(2010)中有进一步表征，在该文献中乳清蛋白胶束被称为乳清蛋白微凝胶(wpm)。具体地讲，“乳清蛋白胶束”是可通过美国专利申请公开2009/0035437及其等同专利ep1839492a1所公开的方法获得的包含在乳清蛋白胶束浓缩物的胶束。其中，用于生产乳清蛋白胶束浓缩物的方法包括以下步骤：a)将乳清蛋白水溶液的ph值调节到3.0至8.0的值；b)使该水溶液经受80℃至98℃的温度；以及c)浓缩步骤b)中获得的分散体。因此，所产生的胶束具有非常集中的尺寸分布，使得所产生的胶束中超过80％具有直径小于1微米的尺寸，并且优选尺寸为100nm至900nm。乳清蛋白胶束可呈液体浓缩物或粉末形式。重要的是，无论是呈液体浓缩物形式、呈粉末形式中，还是例如在水中利用粉末重构，乳清蛋白的基本胶束结构都是保守的。乳清蛋白胶束在分散体中、作为粉末以及在喷雾干燥或冷冻干燥期间是物理稳定的。
合适的碳水化合物的非限制性示例包括淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固形物、麦芽糖糊精、改性淀粉、直链淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、木糖醇、山梨糖醇或它们的任意组合。合适的脂质的非限制性示例包括植物脂肪(诸如，橄榄油、玉米油、葵花油、高油酸葵花油、油菜籽油、低芥酸菜籽油、榛子油、大豆油、棕榈油、椰子油、黑加仑籽油、琉璃苣油、卵磷脂等)、动物脂肪(诸如，乳脂肪)或它们的组合。脂肪来源也可以是这些脂肪的较低精炼形式(例如，含有多酚的橄榄油)。
组合物可为任何口服营养形式，例如作为保健饮料，作为即用型饮料，任选地作为软饮料，包括果汁、奶昔、酸奶饮料、思慕雪或基于大豆的饮料；在营养补充剂中；在食物棒中；或分散在任何种类的食品中，诸如烘焙产品、谷物棒、乳品棒、零食、汤、早餐谷物、牛奶什锦早餐、糖果、片剂、曲奇饼、饼干、薄脆饼干(诸如米饼)和乳制品。组合物可为例如针对伴侣动物的宠物护理产品。
组合物可为例如片剂、胶囊、锭剂或液体的形式。组合物还可含有保护性亲水胶体(诸如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、涂层、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、共化合物、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、流动剂、掩味剂、增重剂、胶凝剂以及凝胶形成剂。
根据本发明的组合物可为用于口服的组合物。
定义
下文提供了一些定义。然而，定义可位于说明书的其它部分，并且以上标题“定义”并不表示“实施方案”段落中的此类公开内容不是定义。
益生菌是当以足够的量施用时给宿主带来健康有益效果的微生物。例如，根据本发明的益生菌可属于乳杆菌属、双歧杆菌属、乳球菌属或链球菌属，例如加氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、约翰逊乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、乳酸乳杆菌(lactobacilluslactis)、德氏乳杆菌(lactobacillusdelbrueckii)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、唾液链球菌(streptococcussalivarius)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、乳酸双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(bifidobacteriuminfantis)、青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、假链状双歧杆菌(bifidobacteriumpseudocatenulatum)或它们的混合物。再如，益生菌可以选自以下：加氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约翰逊乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、短乳杆菌、乳酸乳球菌、唾液链球菌、嗜热链球菌、乳酸双歧杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、假链状双歧杆菌或它们的混合物。
本文中表示的所有百分数均以占组合物的总重量的重量计，除非另有表示。如本文所用，“约”、“大约”和“基本上”应理解为是指某一数值范围内的数字，例如该所提及数字的-10％至 10％的范围内，优选该所提及数字的-5％至 5％，更优选该所提及数字的-1％至 1％，最优选该所提及数字的-0.1％至 0.1％。本文中的所有数值范围都应理解为包含该范围内的所有整数或分数。另外，这些数值范围应理解为对涉及该范围内任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，1至10的公开应理解为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。
如在本公开和所附权利要求中所用，单数形式“a,”“an”和“the”(“一个”、“一种”和“所述(该)”)包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种组分”或“所述组分”包括两种或更多种组分。
词语“包括”(“comprise,”“comprises”and“comprising”)都将被解释为包含性的而非排他性的。同样地，术语“包含”和“或”(“include,”“including”和“or”)都应当视为包含性的，除非上下文明确禁止这一解释。然而，本文所公开的组合物可不含本文未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的组分组成”的实施方案和“由所指明的组分组成”的实施方案的公开内容。“基本上由…组成”的组合物含有至少50重量％的参考组分，优选至少75重量％的参考组分，更优选至少85重量％的参考组分，最优选至少95重量％的参考组分。
在“x和/或y”的上下文中使用的术语“和/或”应被解释为“x”或“y”或“x和y”。在本文中使用的情况下，术语“示例”和“诸如”(尤其是当随后是术语列表时)仅仅是示例性和说明性的，并且不应被视为是排他性或全面性的。如本文所用，“与…相关联(associatedwith)”和“与…相关(linkedwith)”意指同时发生，优选地意指由相同的潜在病症引起，并且最优选地意指所识别的病症之一由另一个所识别的病症引起。
术语“食品”、“食物产品”和“食品组合物”意指旨在供个体(诸如，人)摄入并且向个体提供至少一种营养物质的产品或组合物。本公开(包括本文所述的多个实施方案)的组合物可包含、由或基本上由以下要素组成：本文所公开的要素，以及本文所述的或者说可用于饮食中的任何另外的或任选的成分、组分或要素。
在本发明的上下文中，术语“个体”不限于人。个体可例如是人、牲畜或伴侣动物。
“预防”包括降低病症或障碍的风险和/或严重程度。术语“治疗”和“缓解”既包括预防性或防止性治疗(防止和/或延缓目标病理学病症或障碍的发展)，也包括治愈性、治疗性或疾病改善性治疗，包括治愈、延缓、减轻确诊的病理学病症或障碍的症状和/或中断其进展的治疗性措施；和治疗存在染病风险或怀疑已染病的患者，以及治疗患病或已经诊断为患有疾病或医学病症的患者。该术语不一定表示个体被治疗直至完全恢复。术语“治疗”也指在未患疾病但可能易于发展不健康状况的个体中进行的健康维持和/或促进。术语“治疗”和“缓解”还旨在包括强化或以其他方式增强一种或多种主要的预防性或治疗性措施。术语“治疗”和“缓解”还旨在包括疾病或病症的膳食管理或用于预防或防止疾病或病症的膳食管理。治疗可为患者相关的或医生相关的。
在人的上下文中，术语“老年”是指自出生起的年龄为至少60岁，优选63岁以上，更优选65岁以上，并且最优选70岁以上。在人的上下文中，术语“中老年”是指自出生起年龄为至少45岁、优选50岁以上、更优选55岁以上的年龄，并且包括老年个体。
“肌肉减少症”被定义为与年龄相关的肌肉质量和功能(包括肌肉力量和步行速度)的损失。
如本文所用，“虚弱”被定义为一种脆弱性增加的临床可识别状态，该脆弱性增加是由于多个生理系统中的储备和功能的老化相关下降所致，使得应对日常或急性压力的能力受到损害。在没有确定的定量标准的情况下，fried等人在操作上将虚弱定义为满足五个表型标准中的三个，这些标准表明能量受到损害：(1)无力(握力为基线群体的最低20％，根据性别和身体质量指数进行调整)，(2)耐力和精力不佳(自我报告的消耗与
如本文所用，“有效量”是在个体中预防缺陷、治疗疾病或医学病症的量，或更一般地说，是降低症状、管理其疾病进展或向个体提供营养、生理或医学有益效果的量。有效实现该目的的量将取决于本领域技术人员已知的许多要素，诸如个体的障碍严重程度以及体重和一般情况。在预防应用中，将根据本发明的组合物以足以至少部分地降低发展障碍的风险的量施用给易患特定障碍或者处于特定障碍风险的个体。这样的量被定义为有效量。同样，精确用量取决于患者的若干具体因素，诸如个体的健康状况和体重。相对术语“改善”、“增加”、“增强”等是指相对于缺乏益生菌菌株或益生菌菌株混合物但其它方面相同的组合物，本文所公开的组合物(即包含益生菌菌株或益生菌菌株混合物的组合物)的效果。
本领域的技术人员将理解，他们可自由地组合本文所公开的本发明的所有特征。具体地，针对本发明的产品描述的特征可与本发明的方法组合，反之亦然。另外，可组合针对本发明的不同实施方案所描述的特征。对于具体的特征如果存在已知的等同物，则此类等同物被纳入，如同在本说明书中明确提到这些等同物。
根据附图，本发明的其他优点和特征将显而易见。
1.选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.通过计算机(insilico)分析来鉴定具有β-葡糖苷酶编码基因的益生菌菌株，和/或通过体外分析多个菌株来鉴定具有β-葡糖苷酶活性的益生菌菌株；
b.通过计算机分析来鉴定具有酯酶编码基因的益生菌菌株，和/或通过体外分析多个菌株来鉴定具有酯酶活性的益生菌菌株；
c.将橄榄苦苷与i)在步骤a中被鉴定为具有β-葡糖苷酶活性的益生菌菌株和在步骤b中被鉴定为具有酯酶活性的益生菌菌株的细菌培养物、或ii)在步骤a和步骤b中被鉴定为具有β-葡糖苷酶活性和酯酶活性两者的益生菌菌株的细菌培养物一起发酵；
d.鉴定在步骤c的发酵期间形成的代谢物是否包含羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇或榄香醇酸(elenolicacid)；
e.测量在步骤c中作为发酵时间函数而剩余的橄榄苦苷的比例；以及
f.选择益生菌菌株或益生菌菌株混合物，其中所述益生菌菌株或益生菌菌株混合物在步骤c中短于24小时的时间段内消耗至少10重量％的橄榄苦苷，并且其中在步骤c的所述发酵期间形成的所述代谢物包含选自羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇和榄香醇酸的分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a中通过计算机分析进行的益生菌菌株的鉴定通过提供所述益生菌菌株的基因组并在所述益生菌菌株的基因组中进行β-葡糖苷酶编码基因的序列相似性搜索来进行；并且其中在步骤b中通过计算机分析进行的益生菌菌株的鉴定通过提供所述益生菌菌株的基因组并在所述益生菌菌株的基因组中进行酯酶编码基因的序列相似性搜索来进行。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤a和步骤b中通过体外分析的益生菌菌株的鉴定通过表型筛选来进行。
4.根据权利要求1至3中任一项所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物用于提高橄榄多酚的功效的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述益生菌或益生菌菌株混合物包含在还包含橄榄多酚的食品或饮料组合物中。
6.组合物，所述组合物包含根据权利要求1至3中任一项所选的益生菌菌株或益生菌菌株混合物，其用于增强橄榄苦苷对个体的治疗效果和/或预防效果。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述益生菌菌株或益生菌菌株混合物形成选自橄榄苦苷苷元、羟基酪醇乙酸酯、羟基酪醇以及它们的混合物的橄榄苦苷代谢物。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的组合物，所述组合物还包含橄榄多酚(例如橄榄苦苷)。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的组合物，其中所述治疗效果和/或预防效果选自：治疗或预防中老年人的移动性受损；针对具有包括骨形成和骨吸收失衡的病症的个体刺激骨形成和/或抑制骨吸收；治疗或预防滑膜炎；治疗或预防患有滑膜炎或经历滑膜炎恢复的个体的滑膜炎后关节软骨退化；以及治疗或预防软骨破坏。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述治疗效果和/或预防效果是治疗或预防中老年人的移动性受损，并且所述中老年人具有选自以下的病症：虚弱、虚弱前期、肌肉减少症、经历肌肉减少症恢复、骨质疏松症、骨关节炎、营养不良、处于营养不良的风险中、正在进行康复、计划在次年内进行康复以及它们的组合。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述治疗效果和/或预防效果是针对具有包括骨形成和骨吸收失衡的病症的个体刺激骨形成和/或抑制骨吸收，其中所述病症选自骨质疏松症、佩吉特病、假体附近的骨质溶解、转移性骨疾病、甲状腺机能亢进、由癌症引起的高钙血症、多发性骨髓瘤、牙周病、骨关节炎、骨量减少、由骨折引起的骨缺损、骨折愈合以及它们的组合。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述治疗效果和/或预防效果是治疗或预防滑膜炎，并且其中所述滑膜炎与选自狼疮、痛风、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨软骨炎疾病、骨关节病以及它们的组合的病症相关。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的组合物，其中所述组合物为口服施用的组合物。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物为食品或饮料产品。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物包含选自蛋白质、碳水化合物、脂肪以及它们的组合的组分。
技术总结