本发明属于治疗性抗体药领域，涉及一种用于延长药物半衰期和提高药物生物利用率的抗体及其应用。
背景技术：
：大多数蛋白和多肽药物的半衰期很短，一是因为蛋白质药物会被体内的蛋白酶降解而快速清除；二是由于肾小球的过滤作用使分子量小于60kda的药物在肾脏代谢中也易被清除。现有技术中，尝试了各种方法延长药物体内半衰期，包括对分子结构进行改造和缀合，然而各种分子设计都或多或少存在一些问题。以glp-1(胰高血糖样素-1)分子为例，天然的glp-1在人体血循环中可以被二肽酶ⅳ(dipeptidylpepidiaseⅳ，dppⅳ；cd26)迅速降解，其体内半衰期只有2-5分钟，不具备成药性。采用氨基酸突变、赖氨酸残基脂肪链修饰、peg化等技术可以达到每天一次用药。已经上市的此类glp-1类似物包括(1)艾塞那肽(商品名byetta)是第一个上市的glp-1类似物，皮下注射，初始计量一次5ug，一天两次；(2)利拉鲁肽(商品名victoza/saxenda)每日注射一次，每次注射0.6mg-1.8mg；(3)利司那肽(商品名lyxumia)起始剂量为10μg，每日一次，应用14天，维持剂量：在第15天开始20μg为固定维持剂量，每日一次。上述方法中，较为常用的方法是将多肽或蛋白质药物直接与化合物peg相连形成聚合物，然而这样会使药物的分子量变大，同时会增加药物的副作用。在此基础之上研制的二代glp-1类似物，采用hsa或fc蛋白融合技术，可以达到一周一次用药。例如，将多肽或蛋白质药物直接与人fc区相连融合表达的杜拉鲁肽(商品名：)是由美国lily公司研发的新型长效glp-1r激动药，由两个具有dpp-4抑制作用的glp-1类似物和人免疫球蛋白重链igg4-fc片段融合得到，其活性与内源性glp-1相似，半衰期为5天，能有效延缓肾脏的清除作用。fda于2014批准的杜拉鲁肽皮下注射液上市。每周给药一次，每次给药量0.75mg-1.5mg。然而与人fc区融合表达的药物具有引发adcc、cdc的风险。另一种方法是将多肽或蛋白质药物直接与化合物peg相连形成聚合物，然而这样会使药物的分子量变大，同时会增加药物的副作用。还有一种方法是将多肽或蛋白质药物直接与人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)相连融合表达。人血清白蛋白是人体血液中的主要蛋白，该蛋白由585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为34～54g/l.白蛋白是最丰富的血浆蛋白，具有高度的可溶性，非常稳定，能与人体内药物分子结合运输到体内各个部位发挥疗效。目前市场上的阿必鲁肽(albiglutide)，是两个glp-1分子串联后在c端连上改造后的人血清白蛋白，建议给药量30毫克，每周一次。然而与人血清白蛋白融合表达的药物分子量较大，不具有很好的细胞穿透性。尽管目前市场上已有多种延长多肽或蛋白质药物半衰期的药物，但不是用量大就是半衰期短，仍有必要进一步开发具有延长的药物半衰期，同时成本更为低廉，患者依从性更好的药物结构。技术实现要素：本发明涉及一种延长治疗性蛋白质治疗效果特别是延长其半衰期的方法，特别是该方法中使用的具有特定结构的抗体，以及依照该方法所获得的包含治疗性蛋白质的融合蛋白。具体而言，本发明利用特定引物扩增获得的抗体cdna而构建噬菌体库，并筛选得到了与人血清白蛋白结合的一组抗人血清白蛋白抗体，该抗体在与特定治疗性蛋白质药物融合表达后可延长药物半衰期。本发明的一方面涉及一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的重链可变区，优选由fr1、fr2、fr3、fr4、cdr1、cdr2、cdr3组成。优选的，所述抗体的cdr区如表1的seqidno:1-28任一序列的三个cdr区的组合所示。表1如seqidno:1-28所示的抗体氨基酸序列结构优选的，所述抗体的氨基酸序列如seqidno:1-28的任一项所示，或者与seqidno:1-28的任一项具有至少70％的序列同一性，更优选的，与seqidno:1-28的任一项具有至少80％的同一性，再优选的，与seqidno:1-28的任一项具有至少90％的同一性，进一步优选的，与seqidno:1-28的任一项具有至少95％的同一性。本发明的第二方面涉及一种包含治疗性蛋白质以及上述抗体的融合蛋白。可选的，所述治疗性蛋白质选自短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子，干扰素，肿瘤坏死因子，肿瘤标志分子。优选的，所述治疗性蛋白质为glp-1或其类似物、衍生物。优选的，使用胰高血糖素样肽-1(glucagon-like-peptide1，glp-1)，其是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素。glp-1(7-37)的序列如seqidno:70所示：haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg。glp-1的类似物或衍生物是指与glp-1具有同源性，并且具有相同生物学活性的结构类似物，包括但不限于下列药物的治疗性蛋白部分：杜拉鲁肽(dulaglutide)、利拉鲁肽(liraglutide)、索马鲁肽(semaglutide)、阿比鲁泰(albiglutide)、他司鲁泰(taspoglutide)、tirzepatide、利西拉来(lixisenatide)等。本发明的抗体片段包括但不限于，例如单链抗体(singlechainantibodyfragment，scfv)及其多价形式，fab和重链抗体。本发明的第三方面涉及包含glp-1或其类似物、衍生物，以及由抗人血清白蛋白抗体重链可变区组成的抗体的融合蛋白。作为进一步优选的实施方案，本发明的融合蛋白在抗体和治疗性蛋白质之间包含连接短肽，所述连接短肽具有下述任一种结构：(1)(gx1ggs)n其中x1为g或s，n为2-7任一值，或(2)(gggs)n，其中n＝2。作为具体的实施方式，本发明融合蛋白的氨基酸序列选自seqidno:35-41。本发明的又一方面涉及一种上述抗体的筛选方法。所方法包括如下步骤：(1)以人血清白蛋白免疫羊驼(llama)；(2)分离羊驼外周血pbmc，提取mrna，反转录成cdna；(3)两轮pcr扩增目的片段，构建成噬菌体库，利用elisa筛选免疫阳性克隆；(4)将阳性克隆进行诱导表达纯化，测定与人血清的亲和力；进一步的，本发明还涉及利用所述抗体制备融合蛋白的方法，其进一步包括以下步骤：(5)将阳性克隆序列与治疗性蛋白质序列在原核系统中融合表达、纯化。在上述制备方法中，使用特定的引物扩增目的抗体片段是关键的。本发明利用统一的两套引物分别进行两轮pcr扩增，实现了对目的抗体dna序列的扩增。所述引物为：引物名称引物序列kz-001caggtgaaggtcatcgartc(seqidno:29)kz-002gatgctcttgtgactcaggaatc(seqidno:30)kz-003ggaattccatatggattataaagatgatgataaacgcagagacagtgaccagagt(seqidno:31)kz-004ggaattccatatggattataaagatgatgataaacaggtcaccttgaaggagtctgg(seqidno:32)kz-005ggaattccatatggattataaagatgatgataaacaggtgcagctgcaggagtcggg(seqidno:33)kz-006ccacgattctgcggccgcttactgaggagacagtgacctgggtcc(seqidno:34)其中，第一轮扩增使用引物kz-001和kz-002，第二轮扩增使用引物kz-003、kz-004、kz-005和kz-006。本发明的融合蛋白具有治疗活性，根据所包含的治疗性蛋白的生物活性，所述融合蛋白表达后保留甚至提高了原有生物活性，其可用于原有治疗性蛋白所覆盖的任何疾病以及治疗领域。优选的，本发明结合了glp-1或其类似物、衍生物的融合蛋白可以用于治疗糖尿病，更优选为非胰岛素依赖性糖尿病。所述融合蛋白还可以具有以下治疗活性：减少体重：glp-1主要通过作用于大脑与胃肠道起到减肥效果，一方面其可降低大脑的进食欲望并使人体的能量消耗加强，另一方面可减缓胃排空增加饱胀感，减少患者进食，从而达到降体重的效果。心血管受益与肾脏保护：glp-1可通过降血压、加强心肌收缩与肾脏的钠排泄等作用机制从而达到轻度降压、保护肾脏的作用，可降低多重心血管危险因素，有效减少心血管事件的发生(参考文献：diabetescare.1998；21:1925-1931；diabetessectrum，2004；17:183-190；diabetessectrum.2004；17:183-190)。技术效果：本发明实现了将抗体与蛋白质药物融合表达，在保留甚至进一步提高了蛋白质药物药效的前提下，延长了药物的半衰期，提高了生物利用率，同时相比其他蛋白质药物改构方式而言，工艺简单，成本低廉。具体而言，本发明在以下方面获得了有益效果。1.产品结构与性质方面与fc区或完整hsa融合蛋白形式相比，本发明的抗体融合蛋白是新一代glp-1类似物。将glp-1与本发明的抗体融合，具有分子量小，易穿过屏障的优点，避免了fc区融合蛋白具有的引发adcc、cdc的风险。更为重要的是，依照本发明所获得的融合蛋白相比其他改构形式具有更长的半衰期，前期数据表明，半衰期能达到两周甚至更长。如
背景技术：
所述，这样的半衰期相较于目前的第一代和二代glp-1类似物而言，半衰期大大提高，增加了患者服药的方便性和依从性。同时，本发明获得的融合蛋白取得了相比类似治疗活性的药物更高的生物利用率。2制备工艺方面本发明与现有的延长半衰期的技术相比，无需peg修饰、微球释放、脂肪酸修饰、掺入非天然氨基酸等复杂的技术工艺。并且，本发明的融合蛋白无需担心翻译后修饰，特别是不需要糖基化，融合蛋白可以直接选用原核细胞如大肠杆菌进行表达，而无需采用昂贵的哺乳动物细胞表达系统，制备工艺更为简单，使成本大大降低。附图说明图1为本发明的技术流程图。图2为利用抗原免疫血清cdna获取抗体目的片段的第一轮pcr扩增产物电泳图。第1泳道：dl2000marker(2000bp,1000bp,750bp，500bp,250bp,100bp)，2-5泳道：pcr产物。图3为利用抗原免疫血清cdna获取抗体目的片段的第二轮pcr扩增产物电泳图。第1泳道：dl2000marker(2000bp,1000bp,750bp，500bp,250bp,100bp)，2-5泳道：pcr产物。图4为抗人血清白蛋白抗体与抗原结合的elisa结果，每个样品左侧的柱形为od490值，右侧为空白孔。图5为抗人血清白蛋白抗体与人血清elisa结合结果。图6为本发明中各实例抗体端elisa活性检测。图7为实例1-7的融合蛋白在猕猴体内的降糖长效实验结果。图8为融合表达的蛋白在纯化后的sds-page图。m：marker，泳道1-7：依次是纯化后7个样品。具体实施方式以下实施例将进一步说明本
发明内容，但本发明的范围不限于此。如无具体说明，以下实施例中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购途径获得；所使用的实验方法是常规实验方法，本领域技术人员根据现有技术完全可以知道如何重复所述实验并获得相应结果。实施例1：免疫羊驼及其效价测定将人血清白蛋白多点皮下注射进羊驼体内，经多次免疫后取少量血清测效价(酶联免疫法，靶抗原为人hsa蛋白，一抗为抗his-hrp，tmb显色，450nm检测o.d值)。当效价达到血清稀释32万倍后酶联免疫结果在1.0以上即可。检测时将血清用ph7.4pbs缓冲液稀释，其中血清被稀释倍数为100倍、1000倍、10000倍、40000倍、8万倍、16万倍、32万倍、64万倍。表2不同血清稀释倍数下的效价测定结果血清被稀释倍数1:1001:1k1:10k1:40k1:80k1:160k1:320k1:640k空白孔elisa结果3.2623.3163.4583.4263.5083.2963.171.020.057实施例2：构建噬菌体库及筛选1.cdna的获取对实施例1获得的血清满足效价要求的羊驼进行大量采血，分离pbmc，用15×106个pbmc细胞提取总rna，提取总rna的方法为trzol手提操作法。使用thermo公司反转录试剂盒将总rna反转录成cdna，将得到的cdna混匀分装备用。2抗体目的片段的获取利用下列2组pcr引物进行两步pcr扩增，获得目的片段。引物名称引物序列kz-001caggtgaaggtcatcgartckz-002gatgctcttgtgactcaggaatckz-003ggaattccatatggattataaagatgatgataaacgcagagacagtgaccagagtkz-004ggaattccatatggattataaagatgatgataaacaggtcaccttgaaggagtctggkz-005ggaattccatatggattataaagatgatgataaacaggtgcagctgcaggagtcgggkz-006ccacgattctgcggccgcttactgaggagacagtgacctgggtcc反应试剂如下：反应程序如下：以kz-001和kz-002为引物进行第一轮pcr，用takara公司高保真pcr聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟,(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸40秒)循环18轮，72℃末端延伸10分钟，4℃降温1分钟。回收750bp条带。以kz-003、kz-004、kz-005和kz-006为引物进行第二轮pcr，用takara公司高保真pcr聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟,(94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸30秒)循环20轮，72℃末端延伸10分钟，4℃降温1分钟。回收450bp条带。.3抗hsa抗体库的构建与筛选经过两轮pcr扩增得到大量目的片段后进行sfii/noti双酶切，使用商业化t4dna连接酶将酶切完成的目的片段连入噬菌体载体中，之后电击转入tg1感受态。建库库容为1.07×108，随机挑取20个克隆进行测序，测序结果分析显示，插入的片段皆为重链可变区片段，阳性率100％，包装成噬菌体库，滴度为：2.15×1012pfu/ml。采用固相筛选方法筛选噬菌体库。筛选流程是将靶分子包被在96孔表面用，洗去未吸附的靶分子，然后封闭，之后用扣除背景的噬菌体抗体库加入到孔中结合。洗去未结合的噬菌体，再用0.2m甘氨酸-盐酸洗脱得到亲和噬菌体。每轮通过降低包被靶分子浓度和加大洗涤力度(本发明是减小靶分子浓度增加洗液中吐温20浓度)得到高亲和力噬菌体。每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的抗体在噬菌体库中得到富集。经过3轮筛选后富集达到1000倍以上，进行挑取单克隆验证。3轮筛选,筛选结果如下：表3富集筛选结果筛选轮数投入量产出富集空白扩增后滴度12.15×10113.58×1076.01×1048.5×1063.06×101223.06×10111.24×1072.47×1041.4×1062.33×101332.33×10111.64×1081.42×1032×1051.62×1013从第3轮筛选产物中挑取80个单克隆进行elisa鉴定，elisa鉴定方法如下：用ph9.6包被液稀释靶蛋白hsa，37℃静置1小时进行包被，pbs洗3次。加入封闭液进行封闭37℃静置1小时，甩出多余的封闭液pbs洗3次。取扩增产物用1％的m-pbs(脱脂奶粉-pbs)10倍稀释混匀50μl/孔37℃静置1小时。一抗：用1％m-pbs按1：1000稀释兔抗m1350μl/孔37℃静置1.0h。二抗：用1％的m-pbs按1：3000稀释hrp-羊抗兔50μl/孔37℃静置1.0h。显色：取0.2mna2hpo4 0.1m柠檬酸各4.5ml加入少量opd，60μlh2o2混匀，50μl/孔。2m硫酸终止50μl/孔。490nm检测。phageelisa最少要重复一次。阳性克隆保存：取0.5mlphage 0.3ml50％甘油，混匀。-80℃保存。鉴定结果如图4，共获得28个阳性克隆，命名为nbhsa。将elisa中所有阳性序列送测序，得到不同抗体序列，按照图4由左至右依次为编号为1-28，对应seqid:1-28，对应的dna序列如seqidno:42-69所示。实施例3抗hsa抗体阳性克隆体外活性检测将实施例2得到的28个阳性克隆进行进化树分析后选择13个克隆进行诱导表达纯化，得到小量样品进一步进行活性鉴定。将初步留下的序列进行人血清elisa结合实验，用来判断这些序列是否与人血清结合，结果见图5。将初步得到的抗人血清白蛋白抗体与抗原进行亲和力测定，使用仪器octetred96自动读值，使用生物素标签标记抗原，抗原浓度为20μg/ml，检测每个样品，每个样品的稀释梯度为6.25nm、12.5nm、25nm、50nm、100nm、200nm，同一样品不同浓度下获得了相同的亲和力，结果见表4。表4不同nbhsa与抗原亲和力由小到大的示意图编号kd(m)211.985e-0982.884e-0913.229e-0943.476e-0954.105e-0965.124e-0978.188e-09189.943e-091113.779e-091021.118e-091250.811e-099142.022e-0916157.102e-09从测定的亲和力数值表中选择7号克隆进行elisa验证活性，与亲和力验证。实施例4glp-1与nbhsa进行融合将不同序列的glp-1与本发明实施例3中的7号抗体序列进行融合设计，所涉及的氨基酸序列可以通过化学合成的方式获得，也可以通过重组表达获得。融合蛋白的氨基酸序列如下:实例1：使用杜拉鲁肽的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白hgegtftsdvssyleeqaakefiawlvkgggggggsgggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:35)实例2：使用利拉鲁肽的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白haegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrgggggsggggsggggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:36)实例3：使用索马鲁肽的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白xegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrgggggsggggsggggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:37)其中x是非天然氨基酸氨基异丁酸实例4：使用阿比鲁泰的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白hgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrggggsggggsggggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:38)实例5：使用他司鲁泰的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白egtftsdvssylegqaakefiawlvkxrggggsggggsggggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:39)其中x是非天然氨基酸氨基异丁酸实例6：使用tirzepatide的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白xegtftsdysixldkiaqkafvqwliaggpssgapppsggggsggggsggggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:40)其中x是非天然氨基酸氨基异丁酸实例7：使用利西拉来的治疗性蛋白部分获得的融合蛋白hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappskkkkkkggggsggggsggggsqvqlvesggalvqaggslrlscaasglaleyyhmgwfrqapekerefvagitwtgrntiyadsvtgrftiardnakntmflqmnslqpeetavyycaasaagdltkdmkdykywgqgtqvtvss(seqidno:41)实施例5融合蛋白的重组表达将表达实施例4的氨基酸序列的dna序列(其中编码nbhsa部分的dna序列如seqidno:48所示，glp-1部分的dna序列为本领域已知，可分别从相应蛋白的gengbank数据库获得，对于原始glp-1的dna序列可以参考例如seqidno:71)，利用ndei/xhoi两个酶切位点，直接插入原核载体pet30a( )中，转化大肠杆菌，利用浓度1mmiptg37℃诱导表达，培养基为lb培养基。tris缓冲液进行包涵体清洗，8-25ml变性液溶解包涵体，复性液中复性12-72h。阳离子或者阴离子树脂进行层析，随后凝胶层析(sds-page)，纯化目标蛋白。经过复性纯化后得到纯度不低于95％的样品，纯化后的电泳图如图8所示。变性液配方：3-6m盐酸胍或者4-8m尿素或者采用碱变性，氧化还原电对(包括但不限于gsh/gssg,胱氨酸/半胱氨酸等)ph7.5-12。复性液配方：(0-4m尿素，氧化还原电对(包括但不限于gsh/gssg,胱氨酸/半胱氨酸等)ph7.5-10)。实施例6各样品中抗体端elisa活性检测将实施例5得到的7个样品中抗体端进行elisa活性检测，用ph9.6包被液稀释人血清，37℃静置包被，2％牛奶封闭。取13个样品用1％m-pbs10倍稀释混匀50μl/孔37℃静置1小时。一抗：用1％m-pbs按1：2000稀释hrp-etag50μl/孔37℃静置1.0h。显色：取0.2mna2hpo4 0.1m柠檬酸各4.5ml加入少量opd，60μlh2o2混匀，50μl/孔。2m硫酸终止50μl/孔，490nm检测。结果见图6结果显示，每个样品中的抗体均呈现阳性。实施例7实例1的融合蛋白glp-1-nbhsa与多肽glp-1的药效对比实验购买雄性6-8周小鼠15只，禁食24小时，只供饮水，称重，分成5组；合成多肽glp-1与实例1样品glp-1-nbhsa的浓度均用pbs稀释至1μg/ul；第一组空白组注射100μlpbs；第二组注射0.55μg/100μl的纯glp-1多肽；第三组注射低剂量终浓度为0.26μg/100μl的实例1样品；第四组注射中剂量2.6μg/100μl的实例1样品；第五组注射高剂量26μg/100μl的实例1样品。灌糖时，灌糖后30分钟、45分钟、60分钟、90分钟之后抽血，用三诺安稳免调码血糖仪测量数值，所有数值单位均是mmol/l(毫摩尔每升)。结果如表5所示：实例1样品与glp-1阳性对照比较有较好的药效。表5不同剂量实例1与多肽glp-1小鼠灌糖实验结果实施例8实例1-7的融合蛋白glp-1-nbhsa与多肽glp-1的药效对比实验利用实例1的数据作为参考，将多肽glp-1和7个实例样品进行小鼠灌糖实验，具体实验如下：购买雄性6-8周小鼠36只，禁食24小时，只供饮水，称重,分成9组；合成多肽glp-1与实例7个样品glp-1-nbhsa的浓度均用pbs稀释至1μg/μl；第一组空白组注射100μlpbs；第二组注射0.6μg/100μl的纯glp-1多肽；第三组注射低剂量终浓度为2.4μg/100μl的实例1样品；第四组注射中剂量2.4μg/100μl的实例2样品；第五组注射高剂量2.4μg/100μl的实例3样品；第六组注射中剂量2.4μg/100μl的实例4样品；第七组注射高剂量2.4μg/100μl的实例5样品；第八组注射中计量2.4μg/100μl的实例6样品；第九组注射高剂量2.4μg/100μl的实例7样品。表67个实例在同一浓度下小鼠体内降糖效果结果如表6所示：实例1样品与glp-1阳性对照比较有较好的药效，所有实例均有较好的降糖效果。当然本发明中存在小鼠实验是用实例1的样品进行剂量摸索，这样得到的是实例1的适合浓度，但从表6总体数据来看可以看出，所有实例均有较好得降血糖作用。实施例9猕猴降糖长效实验购买8只糖尿病猕猴，一只用来进行空白对照；7只用来进行实验；实验开始前3天每天对四只猕猴进行早餐前抽血，与早餐餐后2小时，早餐后4小时抽血。记录血糖值，保证糖尿病猴血糖值稳定；根据猴体重与小鼠体重比例进行剂量换算(换算方法见参考文献：实验动物与人用药量的新换算，熊远珍，江西医学院学报，1997年04期)，注射，给药量为130μg/kg。每隔4小时进行采血测血糖，直至检测到血糖又恢复注射样品前值。再继续抽少量血液进行持续检测，保证8只猕猴的血糖值又回升到初始糖尿病数值。结果见表7以及图7。从结果中可以看到glp-1多肽半衰期约2小时，而实例1-7最短半衰期约9天最长可达2周甚至更长。表7各个实例在猴子体内长效实验结果以上数据表明，本发明的融合蛋白半衰期可达2周，并且在用量上会有所减少，用量少，半衰期长，代表生物利用率高。而现有技术中已有药物半衰期均在一周以内。例如，杜拉鲁肽：每周一次，初始计量0.75mg，以后增加到去1.5mg；利拉鲁肽：每天给药一次，初始计量0.6后-增加到1.8mg；索马鲁肽：每-周一次，初始剂量0.25毫克，后增至1毫克；阿比鲁泰：每周一次，每次30毫克，后可增加至50毫克；他司鲁泰：皮下注射1次/周，目前正在进行3期临床；tirzepatide：礼来正在进行2期临床研究，每周给药1次，皮下注射；利西拉来：每天一次，10微克，15天后增加到20微克每天一次。序列表<110>康维众和（中山）生物药业有限公司<120>用于延长药物半衰期的抗体、其融合蛋白和应用<160>71<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>122<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>1provalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalavalserglyleuthrsergluaspala202530provalglytrppheargglnalaproglylysgluarggluglyleu354045alacysilealaasnasnproglyglyleutrptyrlysglnglyile505560lysglyargphethrileserargasnasnalaasnasnthrvaltyr65707580leuglnmetasnserleugluproglyaspthralavaltyrhiscys859095seralavalsertyrcystyrtyrglyleuglyleutyrgluhistrp100105110glyglnglythrglnvalthrvalserser115120<210>2<211>130<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>2glnvalglnleuvalgluserglyglyglyservalglnalaglygly151015serleuargleusercysalathrserglyproasnleuserargtyr202530tyrileglytrppheargglnalaproglylysgluarggluleuval354045alaalailesertrpargglythrthrtyrasnseraspservallys505560glyargphethrileserarggluasnalalysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyrtyrcysala859095alagluileasnseralatyrthrseralathrasptrpasptyrtrp100105110glyglnglythrglnvalthrvalsersergluprolysthrglnasn115120125hislys130<210>3<211>125<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>3glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserargaspilepheglypheasn202530glyhisthrmetalatrptyrargglnalaproglylysglnargglu354045leuvalalaserilethrserglyglyphethraspvalalaaspser505560vallysglyargphethrileserargalaasnalalysasnthrval65707580tyrleuglnmetaspserleulyssergluaspthralailetyrtyr859095cysasnalaargilevalargvalasptyrtrpglyglnglythrgln100105110valthrvalserseralahishissergluaspproser115120125<210>4<211>126<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>4glnvalglnleuvalgluserglyglyglythrvalglnalaglygly151015serleuargleusercysseralaserglyserileargserilelys202530alametglytrptyrargglnalaproglylysglnarggluleuval354045alathrilethrserargglyaspthrphetyrglyaspservallys505560glyargphethrileserargaspglythrgluasnthrvalhisleu65707580glnmetasnglyleulysvalgluaspthralavaltyrtyrcysgly859095alaaspglupheglygluargprothrpheasptyrtrpglyglngly100105110thrglnvalthrvalsersergluprolysthrprolyspro115120125<210>5<211>124<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>5glnvalglnleuvalgluileglyglyglyleuvalleualaglyasp151015serleuargleusercysalaalaserglyargthrpheileprotyr202530thrthrglytrppheargglnalaproglylysgluargglupheval354045alathrilethrtrpserglyalaserilelystyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrvaltyr65707580leuglnmetaspserleulysprogluaspthralavaltyrtyrcys859095alaalaglyserglyglyglyleutyrthrthrsertrpglntyrasp100105110tyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserser115120<210>6<211>124<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>6glnvalglnleuvalgluserglygluglyleuglyglnalaglyasn151015serleuargleusercysalaalaserglyargthrpheglyalatyr202530glnmetalatrppheargglnalaprolyslysgluargalapheval354045alaglyilesertrpasnleuglyserthrtyrtyrserasnserval505560lysglyargphethrmetserlyslysilealalysasnthrglytyr65707580leuglnmetaspserleulysprogluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysglyleuglyglyglyargtyrargaspalaprosertyrglu100105110leutrpglyglnglythrglnvalthrvalserser115120<210>7<211>124<212>prt<213>羊驼(vicugnapacos)<400>7glnvalglnleuvalgluserglyglyalaleuvalglnalaglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyleualaleuglutyrtyr202530hismetglytrppheargglnalaproglulysgluargglupheval354045alaglyilethrtrpthrglyargasnthriletyralaaspserval505560thrglyargphethrilealaargaspasnalalysasnthrmetphe65707580leuglnmetasnserleuglnproglugluthralavaltyrtyrcys859095alaalaseralaalaglyaspleuthrlysaspmetlysasptyrlys100105110tyrtrpglyglngl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技术特征：1.一种抗体，其特征在于仅包含抗人血清白蛋白抗体的重链可变区，并由fr1、fr2、fr3、fr4、cdr1、cdr2、cdr3组成；优选的，所述抗体的cdr区如表1的seqidno:1-28任一序列的三个cdr区的组合所示。
2.根据权利要求1的抗体，其氨基酸序列如seqidno:1-28中的任一项所示，或者与seqidno:1-28的任一项具有至少70％的序列同一性，优选的，所述抗体的编码基因序列如seqidno:42-69所示。
3.一种融合蛋白，包含治疗性蛋白质以及权利要求1-2任一项的抗体。
4.根据权利要求3的融合蛋白，其中，所述治疗性蛋白质选自短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、肿瘤标志分子。
5.根据权利要求3的融合蛋白，其中，所述治疗性蛋白质为glp-1或其类似物、衍生物，glp-1优选具有如seqidno:70所示的氨基酸序列。
6.一种融合蛋白，包含glp-1或其类似物、衍生物，还包含由抗人血清白蛋白抗体重链可变区组成的抗体。
7.根据权利要求3-6中任一项的融合蛋白，在抗体和治疗性蛋白质之间包含连接短肽，所述连接短肽具有下述任一种结构：
(1)(gx1ggs)n其中x1为g或s，n为2-7任一整数值，或
(2)(gggs)n，其中n＝2。
8.根据权利要求7的融合蛋白，其氨基酸序列选自seqidno:35-41。
9.权利要求1-5的抗体或权利要求6-8的融合蛋白的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以人血清白蛋白免疫羊驼；
(2)分离羊驼外周血pbmc，提取mrna，反转录成cdna；
(3)两轮pcr扩增目的片段，构建成噬菌体库，利用elisa筛选免疫阳性克隆；
(4)将阳性克隆进行诱导表达纯化，测定与人血清的亲和力；
(5)将阳性克隆序列与治疗性蛋白质序列在原核系统中融合表达、纯化，
其中，两轮pcr所用引物分别为seqidno:29-seqidno:30以及seqidno:31-seqidno:34。
10.权利要求6-8的融合蛋白在制备治疗性药物中的用途，优选的，所述治疗性药物用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病，或者所述治疗性药物为减肥药或心血管疾病治疗药。
技术总结本发明属于治疗性抗体药领域，具体涉及一种用于延长药物半衰期的抗体。所述抗体序列是针对人血清白蛋白的仅包含特定重链可变区的抗体。所述抗体可以与短肽分子、抗体分子、抗体片段、细胞因子、干扰素、肿瘤坏死因子、肿瘤标志分子等治疗性蛋白质或多肽药物在原核系统中融合表达，产物具有延长的药物半衰期和提高的生物利用率。
技术研发人员：李福胜;庄文超;赵运星;凌志;莫春生;林兆新
受保护的技术使用者：康维众和(中山)生物药业有限公司
技术研发日：2020.02.12
技术公布日：2020.06.05
