本发明涉及一种用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1(分形趋化因子)的过表达引起的疾病的组合物，其包含死亡受体5(dr5)抑制剂作为活性成分，并且其通过使用控制dr5表达或活性的试剂(例如使用抑制剂)来抑制fasl与细胞表面上的dr5结合，从而能够降低趋化因子cx3cl1的表达，由此其能够有效地预防和治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病。
背景技术：
近来，作为癌症治疗剂开发的目标物质，仅选择性地诱导癌细胞的凋亡而不影响正常细胞的通过tnf相关的凋亡诱导配体(trail或apo2l)的凋亡途径及其受体之一dr5(死亡受体5)系统被认为具有重要性(ashkenazi等，natrevcancer2:420,2002)。目前，作为靶向dr5的癌细胞治疗剂，已经开发了重组trail和凋亡受体特异性抗体。
但是，trail具有对dr5的特异性低的问题，因为其与递送凋亡信号的dr4(死亡受体4，trail受体1)和dr5(死亡受体5，trail受体2)以及不能递送凋亡信号的dcr1(诱饵受体1，trail受体3)和dcr2(诱饵受体1，trail受体4)结合。另外，重组trail较不稳定并且具有在诸如星形胶质细胞、肝细胞、角质形成细胞等正常细胞中引起凋亡的副作用(jo等，naturemedicine6,564-567,2000)。
因此，近年来，已经积极研究了诱导癌细胞选择性凋亡的抗dr5至抗dr4抗体的开发。
然而，直到现在，研究仍集中在通过dr5系统使用细胞凋亡途径的癌细胞治疗剂的开发上，并且对于诱导dr5炎症的机理和使用其的炎症治疗剂的开发的具体研究，还没有特定研究。
fas配体(fasl、cd95l、cd178、apo-1)是ii型膜蛋白之一，属于具有tnf、cd40l、4-1bbl等的肿瘤坏死因子(tnf)系统，并且主要在免疫豁免位点(例如活化的t细胞、nk细胞、肿瘤细胞和眼球等)中表达。fas配体(下文中称为fasl)具有同源三聚体结构，并且已知与作为其受体的fas受体(fas；fasr；cd95；uniprotp25445)一起通过三聚作用杀死靶细胞。
fasl可分为膜fasl和可溶性fasl(sfasl)。由于凋亡是通过细胞间接触引起的，因此膜fasl起通过与fas形成死亡诱导信号传导复合物(disc)来杀死细胞的作用。sfasl是被丝氨酸基质金属蛋白酶3或7(mmp-3或mmp-7)切割的fasl膜的裂解物，并且已知其抑制靶细胞的凋亡，与膜fasl的功能相反，或者充当趋化物，这取决于细胞微环境。
关于fasl在炎性疾病、特别是类风湿性关节炎(ra)中的特定作用的报道很少。据目前所知，对rap患者和骨关节炎患者中sfasl的量的比较结果是ra患者中sfasl的量增加，这是显示通过减少滑膜成纤维细胞分泌的vegf而起抑制血管生成的作用的唯一报道。减少滑膜成纤维细胞分泌的vegf。另一方面，关于膜fasl，有报道称，在cia(胶原诱导的关节炎)模型中，通过fas-fasl的细胞凋亡在类风湿性关节炎的早期会抑制自反应细胞的产生，从而在减轻类风湿性关节炎中起作用。
考虑到趋化因子在各种疾病的发生中起重要作用，关于开发能够有效预防或治疗由趋化因子引起的各种疾病的趋化因子抑制剂以及使用其的治疗剂的研究是重要的，另外，特别是，需要揭示在细胞中诱导诸如趋化因子炎症等疾病的机制，并开发具有优异效果的靶向新靶标的治疗剂。但是，具体的研究结果仍然微不足道。
技术实现要素：
技术问题
因此，本发明人新确定了抑制dr5抑制剂的活性或表达的调节剂在抑制趋化因子cx3cl1的表达上的应用，从而提供一种用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的组合物和一种用于抑制趋化因子cx3cl1的表达的组合物，其含有抑制dr5抑制剂的活性或表达的调节剂作为活性成分。
另一个实施方式提供一种筛选趋化因子表达的调节剂以及靶向dr5蛋白的用于由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的治疗剂的方法。
另一个实施方式涉及一种用于预防和/或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，该方法包括向需要预防和/或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的患者施用治疗有效量的dr5的表达或活性抑制剂。
其他实施方式提供dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用。
技术方案
本发明提供一种有效的预防和治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，该方法通过使用控制死亡受体5(dr5)的表达或活性的试剂(例如抑制剂)而降低作为炎性细胞因子之一的cx3cl1的表达，从而抑制细胞表面上fasl与dr5结合来进行。
因此，本发明提供一种用于预防和/或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，该方法包括向需要预防和/或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的患者施用治疗有效量的dr5的表达或活性抑制剂。另一个实施方式提供了dr5的表达或活性抑制剂用于预防和/或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用。
dr5也称为trail受体2(trailr2)或肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(tnfrsf10b)，是与trail结合的tnf受体超家族的细胞表面受体，并递送细胞凋亡信号来介导细胞凋亡。已知dr5与半胱天冬酶8、半胱天冬酶10、fadd(具有死亡结构域的fas相关蛋白)和trail等相互作用。dr5可以源自哺乳动物，例如，其可以是人dr5(例如ncbi登录号uniprotkb/swiss-prot:q6fh58等)。
本发明的一个具体实施方式提供一种用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的组合物，其包含dr5的表达或活性抑制剂作为活性成分。
dr5的表达或活性抑制剂的种类没有特别限制，但是是指所有起到降低、去除和/或阻断dr5作用(包括降低或去除dr5的活性，以及抑制、去除和失活dr5的表达)的物质。例如，其可以是选自由sirna、shrna、mirna、核酶(ribozym)、dna酶、pna(肽核酸(peptidenucleicacid))、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质等组成的组中的一种或多种，优选可以使用抗体或sirna。
根据本发明的一个实施方式，dr5的表达或活性抑制剂可以与dr5的crd2结构域或dr5的crd3结构域结合，或者与crd2结构域和crd3结构域都结合。
根据本发明的另一个实施方式，所述抗体可以结合作为抗原的seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分。
优选地，所述抗体可以与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域都结合，例如其可以是与hudr5的crd2结构域或hudr5的crd3结构域(作为抗原表位)结合的抗体。
根据本发明的一个实施方式，sirna可以是与编码由seqidno：4的第301至363位序列组成的dr5的crd2结构域的序列、或编码由seqidno：4的第430至483位序列的dr5的crd3结构域的序列、或者编码dr5的crd2结构域的序列和编码dr5的crd3结构域的序列结合的sirna。优选地，其可以是与编码dr5的crd2结构域的序列和编码dr5的crd3结构域的序列的每一个都结合从而抑制dr5的crd2和crd3的表达的sirna。
趋化因子cx3cl1称作分形趋化因子(fkn)，被称为趋化因子(c-x3-c基序)配体1，是涉及引起炎症的趋化因子。cx3cl1是独特的趋化因子，其包括胞外n端结构域、粘蛋白样茎、跨膜α螺旋和短的胞浆内尾，并且由373个氨基酸组成。特别地，已知cx3cl1的水性类型在单核细胞、nk细胞和t细胞中显示趋化活性。此外，cx3cl1在类风湿关节炎(ra)滑膜组织的巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和树突细胞中表达，并在白细胞中充当粘附分子，且增强白细胞经内皮的外渗。另外，已知由tnf-α、ifn-γ和il-1β诱导的cx3cl1与硬结、类风湿性关节炎(ra)、hiv感染、癌症和其他各种疾病及并发症等有关，但是迄今仍没有靶向cx3cl1的临床治疗方法。
由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的种类没有特别限制，但可以是选自由关节炎、心血管疾病、癌症、hiv感染、原发性胆汁性肝硬化、肾疾病、同种异体移植排斥、高血压、眼病、慢性胰腺炎、神经性疼痛、干燥综合征、慢性阻塞性肺病和气肿(copd和气肿；amjpathol.2008oct；173(4):949-61)、肺纤维化(annrheumdis.2005jan；64(1):21-8.)、特应性皮炎(jallergyclinimmunol.2004may；113(5):940-8)和狼疮性肾炎(arthritisrheum.2005may；52(5):1522-33)组成的组中的一种或多种，特别是，其可以是关节炎、心血管疾病、癌症和hiv感染之一，并且优选地，其可以是关节炎。
具体而言，关节炎可以是骨关节炎、退行性关节炎、脱屑性骨关节炎、关节韧带损伤、半月板损伤、关节畸形、无血管性坏死、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、创伤、炎性关节炎或由感染引起的关节炎。
另一方面，心血管疾病可以是动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、中风或颈动脉粥样硬化，并且癌症可以是结肠直肠癌或肺癌。
用于预防或治疗疾病的组合物可以进一步包含一种或多种选自由载体、赋形剂、崩解剂、甜味剂、包衣材料、膨胀剂、润滑剂、流动助剂、调味剂、抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂组成的组中的佐剂。
具体而言，载体、赋形剂和稀释剂可以是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，并且用于口服的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，且这些固体制剂可以通过以下方法制备：将至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合到组合物中。此外，除简单的赋形剂外，还可以使用诸如硬脂酸镁和滑石等润滑剂。用于口服的液体制剂包括混悬剂、口服液、乳剂和糖浆等，以及除常用的简单稀释剂、水和液体石蜡之外的各种赋形剂，例如可以包含润湿剂、甜味剂、增甜剂、调味剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为混悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油等植物油以及诸如油酸乙酯等可注射酯等。作为栓剂的基础材料，可以使用维比索尔(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯和甘油明胶等。
组合物的配方没有特别限制，但是种类可以选自由颗粒、粉剂、包衣片剂、片剂、丸剂、胶囊、栓剂、凝胶、糖浆、果汁、悬浮液、乳剂、滴剂或液体。
本发明组合物的有效剂量范围可以根据各种因素例如性别、严重性、年龄、施用方法、靶细胞和表达水平等而不同，并且可以由本领域技术人员容易地确定。
此外，通过特定实验(请参见以下实施例4)，本发明人已经确认，当fasl和dr5特异性结合为fasl-dr5结合时(这与当通常称为与dr5配体结合的trail处理为trail-dr5结合相互作用不同)，胞内cx3cl1的量增加。另外，已经确认，当抗dr5抗体或用于敲低dr5基因的sirna处理为fasl-dr5以中断fasl-dr5复合物的形成时，分泌的cx3cl1的量减少(参见以下实施例5)。
换言之，本发明人发现，当用dr5的表达或活性抑制剂处理时，可以显著抑制胞内趋化因子cx3cl1的表达，并且如上所述，他们发现dr5的表达或活性抑制剂可以用作用于预防和治疗由cx3cl1的过表达引起的疾病的组合物的活性成分(参见实施例6)。
基于所述发现，在本发明的另一个实施方式中，提供了一种抑制趋化因子cx3cl1表达的组合物，其包含dr5的表达或活性抑制剂作为活性成分。
dr5蛋白与fasl结合并增加胞内cx3cl1的表达，因此当用本发明的dr5的表达或活性抑制剂处理时，可以显著抑制胞内cx3cl1的表达。
对dr5抑制剂的种类没有特别限制，但是其可以是选自由sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质等组成的组中的一种或多种，并且优选可以使用抗体或sirna。
根据本发明的一个实施方式，dr5的表达或活性抑制剂可以与dr5的crd2结构域或dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域结合。
根据本发明的另一个实施方式，所述抗体可以结合作为抗原的seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分。
优选地，所述抗体可以与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合，例如，其可以是与作为抗原的dr5的crd2结构域或hudr5的crd3结构域的每一个结合的sirna。
根据本发明的一个实施方式，sirna可以是与编码由seqidno：4的第301至363位序列组成的dr5的crd2结构域的序列或编码由seqidno：4的第430至483位序列的dr5的crd3结构域的序列或者编码dr5的crd2结构域的序列和编码dr5的crd3结构域的序列结合的sirna。优选地，其可以是与编码dr5的crd2结构域的序列和编码dr5的crd3结构域的序列的每一个都结合从而抑制dr5的crd2和crd3的表达的sirna。
另外，在本发明的其他具体实施方式中，提供了
趋化因子表达抑制剂的筛选方法，其包括：
使候选物质与样品反应；和
测量所述样品的dr5活性或表达，
并且包括当用所述候选物质处理的样品中的dr5活性或表达低于未用所述候选物质处理的样品中的dr5时，将所述候选物质确定为趋化因子cx3cl1表达抑制剂。
通过筛选方法选择的趋化因子cx3cl1表达抑制剂可以用作用于由趋化因子cx3cl1过表达引起的疾病的预防剂和/或治疗剂，所述疾病例如关节炎、心血管疾病、癌症、hiv感染、原发性胆汁性肝硬化、肾疾病、同种异体移植排斥、高血压、眼病、慢性胰腺炎、神经性疼痛、干燥综合征、慢性阻塞性肺病、气肿、肺纤维化、特应性皮炎和狼疮性肾病等。因此，筛选方法可以是用于由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的预防剂和/或治疗剂的筛选方法。
样品可以是动物，优选地，是从哺乳动物获得的细胞、组织或器官，并且优选地，可以包括ra(类风湿关节炎)位点和免疫豁免位点等，并且更优选是t细胞、nk细胞、类风湿细胞、肿瘤细胞或眼球等。
dr5的活性可以通过常规方法测量，并且本领域技术人员可以容易地看出。例如，对dr5与样品之间的反应的确认可以使用通常用于确认蛋白质-蛋白质之间或蛋白质-化合物之间的反应的方法。例如，在使dr5与测试对象物质反应后测量活性的方法，酵母双杂交，利用搜索与dr5结合的噬菌体展示肽克隆的使用hts(高通量筛选)的筛选方法、天然产物和化学物质文库等，药物命中hts或基于细胞的筛选等，但不限于这些方法。
此外，可以通过确认包含编码dr5的基因的组合物与样品之间的反应来测量dr5的表达，并且反应确认可以使用用于确认dna-dna、dna-rna和dna-蛋白质之间的反应的常用方法。例如，在体外，可以使用用于确认基因与测试对象物质之间的结合的杂交测试，用于在哺乳动物细胞与测试对象物质反应后通过northern分析来测量基因的表达率的方法，或用于将报告基因连接至所述基因以将其导入细胞内然后使其与与测试对象物质反应以测量报告蛋白的表达率的方法，等等，但不限于这些方法。
在本发明的筛选方法中，可以根据通常的选择方法将样品推定为具有预防或治疗由趋化因子cx3cl1(分形趋化因子)的过表达而引起的疾病的可能性，或者可以是随机选择的核酸、蛋白质、其他提取物或天然产物、或化合物等。
通过该筛选方法获得的物质具有下述优点：具有预防由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的发生的效果和在所述疾病的发生的早期具有治疗效果，以及缓解和治疗具有某些进展的中后期疾病状况的优异效果，并且可以在用于由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的预防剂或治疗剂开发过程中充当先导化合物(leadingcompound)。通过修饰和优化先导化合物的结构，可以开发新型治疗剂，并且该物质通过抑制dr5的表达或活性而表现出抑制cx3cl1表达的作用，因此可以预防或治疗由cx3cl1的过表达引起的疾病，例如关节炎、心血管疾病、癌症、hiv感染、原发性胆汁性肝硬化、肾疾病、同种异体移植排斥、高血压、眼病、慢性胰腺炎、神经性疼痛、干燥综合征、慢性阻塞性肺病、气肿、肺纤维化、特应性皮炎和狼疮性肾病等，特别是关节炎，包括类风湿性关节炎。
本发明的一个实施方式提供一种预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，该方法包括向需要预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的受试者施用治疗有效量的dr5的表达或活性抑制剂。
dr5的表达或活性抑制剂可以是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质，并且优选地，其可以是抗体或sirna。
根据本发明的一个具体实施方式，dr5的抑制剂可以与dr5的crd2结构域、dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域都结合。
另外，抗体可以结合seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分，并且优选地，可以与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合。
本发明的一个其他实施方式提供dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用。
dr5的表达或活性抑制剂可以是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质，并且优选地，其可以是抗体或sirna。
根据本发明的一个具体实施方式，dr5的抑制剂可以与dr5的crd2结构域、dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域都结合。
另外，抗体可以结合seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分，并且优选地，可以与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合。
因此，包括本文提出的dr5的表达或活性抑制剂作为活性成分的预防和/或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的炎症和疾病的技术，以及使用其筛选新型趋化因子表达抑制剂的技术，不仅可以有效地预防由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的发生，而且即使经过了一定的进展也能获得优异的治疗效果，因此，它们是治疗许多患病患者的非常有用的技术，并且它们可以有用地用于研究和开发由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的预防剂或治疗剂。
另一方面，在本发明的其他实施方式中，可以提供通过向需要降低趋化因子表达的患者或趋化因子过度表达的细胞施用dr5抑制剂来降低趋化因子cx3cl1表达的方法，以及通过向趋化因子过度表达的细胞施用dr5抑制剂来预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的炎症和疾病(特别是关节炎)的方法。
对dr5抑制剂没有特别限制，只要其是抑制dr5基因表达或抑制dr5蛋白活性的物质，并且dr5抑制剂可以是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质。
有益效果
本发明通过减少作为炎性细胞因子之一的cx3cl1的表达，通过使用控制dr5表达或活性的试剂(例如抑制剂)抑制细胞表面上fasl与dr5之间的结合，能够有效地预防和治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病。
附图说明
图1(a)显示在从正常小鼠(正常)和关节炎诱导的小鼠(ra)获得的关节中分离滑膜细胞(贴壁细胞/adh.)和正常免疫细胞(上清细胞/sup.)之后，通过实时pcr确认dr5基因表达的结果，图1(b)显示通过流式细胞术确认在从关节炎诱导的小鼠(ra)获得的关节的滑膜细胞中dr5表面蛋白表达的结果，并且图1(c)显示通过流式细胞术确认在hfls(人成纤维样滑膜细胞)中dr5表面蛋白表达的结果。
图2显示确认fasl-dr5相互结合的实验结果，图2(a)显示当通过用抗dr5抗体处理而抑制fasl与hfls的结合时，通过确认抑制fasl-igg结合来验证fasl-dr5的相互作用的结果，并且图2(b)是通过流式细胞术确认在用sirna处理在hfls中敲低dr5后用结合igg的fasl处理的细胞表面上的igg信号强度的结果。
图3显示在fasl和trail单独或组合处理hfls后通过elisa确认cx3cl1的分泌的结果。
图4(a)显示在通过用抗dr5抗体处理hfls而抑制fasl与dr5的相互作用之后，通过elisa测量分泌的cx3cl1的量的结果，并且图4(b)显示在用抗dr5抗体处理小鼠滑膜细胞然后fasl处理之后，通过elisa测量分泌的cx3cl1的量的结果。
图5(a)是显示由于dr5sirna处理导致在hfls的细胞表面上dr5表面蛋白的表达减少的结果的图，并且图5(b)是显示由于dr5sirna处理导致在hfls中cx3cl1的分泌减少的结果的图。
图6显示当向fasl突变的gld小鼠(其是fasl缺陷小鼠)注射sfasl并同时注射抗dr5抗体时，确认由sfasl注射引起的疾病症状的结果。其显示用k/bxn血清处理的gld小鼠、用k/bxn血清和sfasl处理的gld小鼠以及用k/bxn血清、sfas配体和抗dr5抗体(抗dr5)处理的gld小鼠中的关节炎症状的变化，(a)是测量关节厚度的图，(b)是测量临床指标的图。
图7a显示hudr5-crd2和hudr5-crd3，其是预期hudr5蛋白氨基酸序列会与sfasl结合的候选位点，并且第111、114、119、120、148、148、150、153和156位氨基酸是丙氨酸取代的突变发生位点。
图7b显示作为hudr5dna序列的seqidno：4的第1至840位序列，由第334至363位序列组成的多核苷酸和由第445至471位序列组成的多核苷酸是突变发生位点。
图8a显示了hudr5-crd2和hudr5-crd3以及dr5facs抗体的免疫原位点，它们是预期会与hudr5蛋白氨基酸序列、sfasl结合的候选位点。
图8b显示在表达其中hudr5-crd2或hudr5-crd3发生突变的dr5后，使用其中结合了与hudr5结合的免疫球蛋白(igg)的人fasl进行流式细胞术的结果。
图9显示由于sfasl与人源fls的dr5受体结合而促进scx3cl1表达并且由于该scx3cl1增加来自免疫细胞的趋化因子如ccl2、ccl3和cxcl10等的表达而诱导炎症的机制模型的示意图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例仅旨在说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1.鉴定与sfas配体(dr5)结合的膜蛋白
迄今为止，已知fasl与其受体fas结合，诱导靶细胞凋亡，从而引起关节发炎。另外，在本发明人的先前研究中，已经揭示fasl以不同于常规炎症诱导fas-fasl凋亡的新机制来控制趋化因子的表达，并且已经确定fasl自身起着吸引炎症细胞的趋化因子的作用。然而，在先前的研究中，尚未具体揭示fasl如何通过在新的由fasl引起炎症的机制中通过与该膜蛋白结合而控制炎症的发生。
因此，本发明人进行了蛋白质鉴定实验，以发现在新的由fasl引起炎症的机制中与sfasl(可溶性fas配体)结合的蛋白质。
首先，在体外获得关节炎患者的滑膜，然后用胶原酶消化并培养3天后，分离贴壁细胞以获得人成纤维样滑膜细胞(hfls)。通过将获得的hfls进行生物素化获得的生物素化sfasl与重组人fas配体(r&dsystems126-fl-010)以及sulfo-nhs-ss-biotin-thermoscientific#21331反应，使sfasl和hfls靶向受体蛋白结合。然后，在使用交联剂(双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐；bs3)进行交联之后，进行细胞裂解。
然后，为了分离与sfasl结合的hfls靶蛋白，进行亲和素纯化，从而将与其结合的生物素化的sfas配体重组蛋白和hfls靶向受体蛋白一起分离。之后，通过sds-page分离样品，并对凝胶进行分级分离，然后通过凝胶内消化法提取肽。
使用高分辨率混合四极杆-静电场轨道阱(orbitrap)质谱仪重复分析提取的肽两次后，使用sequest算法选择未显示在对照组(生物素化fc)中而仅在实验组中显示出至少一次的蛋白质。通过uniprot数据库的分类，对所选蛋白质中已知存在于细胞膜或细胞外基质中的蛋白质进行分类，并在其中鉴定出dr5。
实施例2.在关节炎诱导的小鼠的hfls和关节滑膜细胞中确认dr5表面蛋白的表达
为了确认dr5表面蛋白在关节炎诱导的小鼠的人源fls(hfls)和关节滑膜细胞中的表达，进行了流式细胞术和实时pcr。在实时荧光定量pcr中，使用appliedbiosystems7500实时pcr系统，使用f:gggccacagggacacctt/r:gcatctcgcccggtttt作为引物，使其分别在50℃2分钟、95℃2分钟、95℃15秒然后60℃1分钟反应循环40次。
然后，在分别从正常小鼠(正常)和关节炎诱导小鼠(ra)获得的关节中分离出滑膜细胞(贴壁细胞/adh.)和正常免疫细胞(上清液细胞/sup.)后，在每个细胞中比较dr基因的表达。实验结果示于图1。
如图1(a)中所确认的，在从关节炎诱导的小鼠获得的关节的滑膜细胞中的dr5表面蛋白的相对表达比正常小鼠中增加，并且如图1(b)和(c)的流式细胞术结果所确认，dr5表面蛋白经确认在关节炎诱导的小鼠滑膜细胞(贴壁细胞)和hfls中表达。
因此，可以看出，与正常小鼠相比，在hfls和从关节炎诱导的小鼠的关节获得的细胞中，特别是在滑膜细胞中，dr5表面蛋白的表达增加。
实施例3.fasl-dr5相互结合的确认
3-1.dr5抗体处理
为了确认fasl和膜蛋白dr5是否真正结合，用抗dr5抗体(r&dsystemsaf631)对hfls进行处理，以中断fasl与细胞表面dr5的结合。
然后，处理与igg结合的fasl，并通过流式细胞术确认表面上的igg信号强度，结果示于图2(a)。如在图2(a)中可以看到，当用抗dr5抗体处理时，igg的信号强度降低，而当抗dr5抗体抑制dr5活性时，fasl-dr5结合降低。
3-2.使用针对dr5的sirna进行敲低
为了确认fasl和膜蛋白dr5是否真正结合，用sirna(sigmaaldrichmissionsirna；sasi_hs01_00040567)处理hfls，并使用电穿孔仪(neon转染系统，thermofisherscientific)敲低dr5的表达。
然后，在处理与igg结合的fasl后，通过流式细胞术确认表面上的igg信号强度，结果示于图2(b)。如在图2(b)中可以看到的，可以看出当用sirna处理时，igg的信号强度降低，即，igg的信号强度降低，这是因为当hfls表面的dr5的表达减少时，fas配体的结合减少。
从以上结果确认，fasl和dr5彼此特异性地相互结合。
实施例4.通过fasldr5结合确认趋化因子cx3cl1表达的增加
为了确认因fasl-dr5结合导致表达增加的趋化因子，用200ng/ml的fasl和trail单独或组合处理hfls24小时，然后根据由elisa制造商(r&dsystemsdy365)提供的方案确认cx3cl1的分泌，结果示于图3。如从图3可以看出，确认了当用已知为dr5的常见配体的trail处理时，cx3cl1的量没有增加，但是，当用fasl处理时，cx3cl1的量增加。
由此可以看出，通过fasl和dr5的结合，趋化因子cx3cl1的表达在hfls中增加。这确认了cx3cl1是引起炎症的趋化因子之一，并且在fasl-dr5结合引起炎症的过程中促进了hfls细胞的cx3cl1的分泌。
实施例5.通过抑制fasl-dr5来确认趋化因子表达的降低
为了确认在抑制fasl与dr5的相互作用时用fasl处理时分泌的趋化因子cx3cl1的分泌是否降低，进行以下实验。
5-1.dr5抗体处理
用0.5ug/ml的针对dr5(r&dsystemsaf631)的抗体(r&dsystemsaf631)处理hfls或小鼠滑膜细胞1小时并用fasl200ng/ml处理后，通过elisa确认cx3cl1的分泌量，结果如图4所示。图4(a)显示用dr5抗体处理hfls，cx3cl1的表达在抗dr5中比同种型(山羊igg，r&dsystemsab-108-c)减少，并且图4(b)显示用抗dr5抗体处理小鼠滑膜细胞，并且可以看出，在抗dr5中cx3cl1的表达也减少。
5-2.sidr5敲低
用sirna(sigmaaldrichmissionsirna；sasi_hs01_00040567)处理hfls，并使用电穿孔仪(neon转染系统，thermofisherscientific)敲低dr5的表达，结果，如图5(a)可以看出，确认了通过dr5sirna处理，hfls的细胞表面dr5表面蛋白的表达减少。
然后，在用fasl200ng/ml处理24小时后，通过elisa确认了cx3cl1的分泌量，结果，如图5(b)可以看出，与对照组相比，通过fasl处理分泌的cx3cl1的量降低。
综合以上结果可以看出，fasl与dr5结合，并且由于该dr5结合而导致cx3cl1的表达增加，并且当中断fasl-dr5相互作用时，cx3cl1的表达减少。由此可以确认，当用dr5抗体处理、或敲低dr5以中断dr5与fasl之间的结合时，引起细胞内炎症的趋化因子cx3cl1的表达减少，从而抑制了炎症的发生，并且不仅在炎症(尤其是关节炎)发生的早期而且在其发生后均有效地抑制关节炎症状。
实施例6.当注射抗dr5抗体时减轻关节炎症状的测试
为了在向由fasl诱导的关节炎小鼠模型注射抗dr5抗体时确认减轻关节炎症状，首先，从缺乏fasl的gld小鼠(中央实验动物)和关节炎自然发生的k/bxn小鼠(由马萨诸塞州波士顿市哈佛医学院的d.mathis和c.benoist博士提供的krntcr转基因小鼠和nod小鼠杂交获得)。
向gld小鼠1)注射上面获得的k/bxn血清(-)、和2)注射k/bxn血清和sfas配体((-) sfas配体))、并且3)注射k/bxn血清、sfas配体和抗dr5抗体(抗dr5)10天，并用卡尺(manostat，瑞士)测量每个关节的厚度，并测量临床指标。
临床指标如下：
0：无关节肿胀，
1：一根手指关节肿胀，
2：手腕或脚踝轻度肿胀，
3：手腕或脚踝严重肿胀。
如上所述测量的关节的厚度和临床指标示于图6。如图6(a)所确认的，当用血清和sfasl处理gld小鼠时，从第4天起关节开始肿胀，并且在第9～10天观察到最高指数。但是，当用血清和sfasl以及抗dr5一起处理gld小鼠时，几乎观察不到关节肿胀。另外，如图6(b)所确认的，同样在临床指标的情况下，当用sfasl和抗dr5一起处理gld小鼠时，临床指标保持在3～4分，并且几乎观察不到关节的肿胀。
从以上结果可以确认，通过抗dr5处理阻断dr5-fasl的结合，抑制了炎症反应，并且其可以用作用于预防和治疗包括关节炎在内的炎症的药剂。
实施例7.通过dr5诱变确认sfasl-dr5结合位点
为了确认sfasl和dr5的结合位点，使用hudr5(表1中的seqidno：1)克隆的pires3-puro载体作为模板，并使用overlappcr法，在预期sfasl会结合在hudr5蛋白质氨基酸序列的候选位点(参见图7a)(选择其中dr5的配体trail常规结合的位点为候选位点)，hudr5-crd2(总序列中的334～363)或hudr5-crd3(总序列中的445～471)，将图7b中蓝色所示的氨基酸序列用丙氨酸取代，然后克隆，以制备hudr5突变dna(参见图7b和表1)。
在将突变的hudr5dna转染至小鼠细胞并表达其中hudr5-crd2发生突变的dr5(表1，seqidno：4)或其中hudr5-crd3发生突变的dr5(表1，seqidno：5)中的每一个后，使用人fasl(其中结合有仅与表达hudr5的细胞结合的免疫球蛋白(igg))进行流式细胞术，并且结果示于图8b。
如在图8b中可以看出，hufasl-igg不与其中crd2或crd3发生突变的hudr5结合，由此可以确认，与trail相似，fasl-dr5之间的结合位点使用dr5的crd2和crd3结合。
表1
<110>首尔大学校产学协力团
<120>含有死亡受体抑制剂的预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的药物组合物
<130>opp20182293r
<160>6
<170>kopatentin3.0
<210>1
<211>410
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>野生型hudr5蛋白
<400>1
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<213>人工序列
<220>
<223>包含突变的crd2的hudr5蛋白
<400>2
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<210>3
<211>410
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<213>人工序列
<220>
<223>包含突变的crd3的hudr5蛋白
<400>3
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<210>4
<211>1236
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>野生型hudr5蛋白的dna序列
<400>4
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gttgtcgccgcggtcctgctgttggtctcagctgagtctgctctgatcacccaacaagac180
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tgtccacctggacaccatatctcagaagacggtagagattgcatctcctgcaaatatgga300
caggactatagcactcactggaatgacctccttttctgcttgcgctgcaccaggtgtgat360
tcaggtgaagtggagctaagtccctgcaccacgaccagaaacacagtgtgtcagtgcgaa420
gaaggcaccttccgggaagaagattctcctgagatgtgccggaagtgccgcacagggtgt480
cccagagggatggtcaaggtcggtgattgtacaccctggagtgacatcgaatgtgtccac540
aaagaatcaggcatcatcataggagtcacagttgcagccgtagtcttgattgtggctgtg600
tttgtttgcaagtctttactgtggaagaaagtccttccttacctgaaaggcatctgctca660
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gtcaacaaaaccgggcgagatgcctctgtccacaccctgctggatgccttggagacgctg1140
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tatctagaaggtaatgcagactctgccatgtcctaa1236
<210>5
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tatctagaaggtaatgcagactctgccatgtcctaa1236
1.一种用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1(分形趋化因子)的过表达引起的疾病的组合物，其包含死亡受体5(dr5)的表达或活性抑制剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是抗体或sirna。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述dr5的表达或活性抑制剂与dr5的crd2结构域或dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域结合。
5.如权利要求3所述的组合物，其中所述抗体结合seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分。
6.如权利要求3所述的组合物，其中所述抗体与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述疾病是选自由关节炎、心血管疾病、癌症、hiv感染、原发性胆汁性肝硬化、肾疾病、同种异体移植排斥、高血压、眼病、慢性胰腺炎、神经性疼痛、干燥综合征、慢性阻塞性肺病、气肿、肺纤维化、特应性皮炎和狼疮性肾病组成的组中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、中风或颈动脉粥样硬化。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述癌症是结肠直肠癌或肺癌。
10.一种用于抑制趋化因子cx3cl1的表达的组合物，其包含死亡受体5(dr5)的表达或活性抑制剂作为活性成分。
11.如权利要求10所述的用于抑制趋化因子cx3cl1的表达的组合物，其中所述dr5蛋白与fas配体结合而增加cx3cl1的表达。
12.如权利要求10所述的组合物，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质。
13.如权利要求12所述的组合物，其中dr5的抑制剂是抗体或sirna。
14.如权利要求12所述的组合物，其中dr5的抑制剂与dr5的crd2结构域或dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域结合。
15.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体结合seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分。
16.如权利要求13所述的组合物，其中所述抗体与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合。
17.一种趋化因子cx3cl1表达抑制剂的筛选方法，该方法包括：
使候选物质与样品反应；和
测量所述样品的dr5活性或表达，
其中，当用所述候选物质处理的样品中的dr5活性或表达低于未用所述候选物质处理的样品中的dr5时，将所述候选物质确定为趋化因子cx3cl1表达抑制剂。
18.一种由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的治疗剂的筛选方法，该方法包括：
使候选物质与样品反应；和
测量所述样品的dr5活性或表达，
其中，当用所述候选物质处理的样品中的dr5活性或表达降低、或者其低于未用所述候选物质处理的样品中的dr5活性时，将所述候选物质确定为由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的治疗剂。
19.如权利要求18所述的筛选方法，其中所述由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病是选自由关节炎、心血管疾病、癌症和hiv感染中的一种或多种。
20.一种用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，所述方法包括向需要预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的患者施用治疗有效量的dr5的表达或活性抑制剂。
21.如权利要求20所述的用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质。
22.如权利要求20所述的用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是抗体或sirna。
23.如权利要求20所述的用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，其中所述dr5的表达或活性抑制剂与dr5的crd2结构域或dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域结合。
24.如权利要求22所述的用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，其中所述抗体结合seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分。
25.如权利要求22所述的用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的方法，其中所述抗体与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合。
26.dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用。
27.如权利要求26所述的dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是sirna、shrna、mirna、核酶、dna酶、pna(肽核酸)、反义寡核苷酸、肽、抗体、适体、天然提取物或化学物质。
28.如权利要求26所述的dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用，其中所述dr5的表达或活性抑制剂是抗体或sirna。
29.如权利要求26所述的dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用，其中所述dr5的表达或活性抑制剂与dr5的crd2结构域或dr5的crd3结构域结合或者与crd2结构域和crd3结构域结合。
30.如权利要求28所述的dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用，其中所述抗体结合seqidno：1的氨基酸序列中的第53至181位氨基酸部分。
31.如权利要求29所述的dr5的表达或活性抑制剂用于预防或治疗由趋化因子cx3cl1的过表达引起的疾病的应用，其中所述抗体与由seqidno：1的第101至120位氨基酸序列组成的dr5的crd2结构域或由seqidno：1的第143至160位氨基酸序列组成的dr5的crd3结构域结合或者与该crd2和crd3结构域结合。
技术总结