本发明公开了一种抗体，属于多肽
技术领域：
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背景技术：
：补体系统由30余种可溶性蛋白分子组成，是天然免疫系统的一部分，其组成成分包括补体固有成分、多种调节因子和补体受体等30多种分子。补体系统可通过3条既相对独立又相互联系的途径被激活，从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种生物学效应，包括增强吞噬作用、增强吞噬细胞的趋化性、增加血管的通透性、中和病毒、细胞溶解作用、免疫反应的调节作用等。虽然补体活化为抵抗潜在病原体提供了有价值的第一线防御力，但促进保护性炎症应答反应的补体激活也可能表现为对宿主的潜在威胁。补体激活和其在靶结构上的沉积也可以间接地引起细胞或组织破坏。在补体途径中的各个点产生介导组织损害的补体激活产物。宿主组织上不适当的补体激活在许多自身免疫病和炎性疾病的病理学中起重要作用。补体激活的途径有3个，即经典途径、甘露聚糖结合凝集途径和旁路途径。补体经典激活途径是通过抗原-抗体复合物激活的，参与该途径的成分包括c1-c9，按其在激活过程中的作用，人为地分成三组，即识别单位(clq、clr、cls)、活化单位(c4、c2、c3)和膜攻击单位(c5-c9)，分别在激活的不同阶段即识别阶段、活化阶段和膜攻击阶段中发挥作用。甘露聚糖结合凝集途径是经典途径的一个变化，由血浆中甘露聚糖结合凝集素(mannan-bindinglectin，mbl)直接识别多种病原微生物表面的n-氨基半乳糖或甘露糖，进而依次活化masp-1、masp-2、c4、c2、c3，形成和经典途径相同的c3与c5转化酶，激活补体级联酶促反应的活化途径。旁路激活途径是通过外来物质、死亡组织、细胞、细菌等激活的，旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了c1、c4、c2三种成分，直接激活c3继而完成c5至c9各成分的连锁反应。c3活化后，在经典途径中涉及多种蛋白质，例如c1q、c1r/c1s、c4和c2。经典途径c3转化酶由c3bc4b2a组成。在旁路途径活化中，补体系统产生的c3b可以与备解素和因子b结合，从而形成复合物“pc3bb”。然后，在该复合物内，因子d将因子b切割成bb和ba。该切割使得ba由复合物中释放，并形成旁路途径c3转化酶pc3bbb。pc3bbb将c3切割成c3a和c3b，从而建立旁路途径的放大环路。此外，旁路途径除了在补体激活中作为独立途径而被广泛认可的作用以外，经典途径和甘露聚糖结合凝集途径还可以为引发旁路途径的补体激活提供放大环。在这种旁路途径介导的放大机制中，激活产生的c3转化酶c3bc4b2a将c3切割为两个活性片段：过敏毒素c3a以及具有调理作用的c3b。c3a是一种强效过敏毒素，可导致各种临床疾病。c3a能激活中性粒细胞、单核细胞、血小板、肥大细胞和t细胞。在佐剂诱导的关节炎模型中已证明c3a对诱导脚爪浮肿至关重要。新形成的c3b加入已产生的c3转化酶可形成c5转化酶，后者可切割c5产生c5b和c5a。c5为分子量为190kda的糖基化的β球蛋白，其在血清中的浓度为75μg/ml(0.4.mu.m)，分子量中的1.5-3％为碳水化合物。成熟的c5为异二聚体，由999氨基酸长度、约115kda的α链以二硫键与656氨基酸长度75kdaβ连接。c5的编码基因为单拷贝，其蛋白翻译产物为一个1659氨基酸长度的c5前体蛋白以及18个氨基酸长度的前导肽。c5前体蛋白在655至659氨基酸处被切断产生出1-655氨基酸长度的β链，以及660-1658氨基酸残基的α链，两者中间的四个氨基酸残基则被切除(havilandetal.j.immunol.1991,146:362-368)。c5a是在c5转化酶的切割作用下由α链的氨基端前74个氨基酸残基产生的，如果在该切割位点有特异性分子的结合，c5转化酶的切割效应被阻断，则该分子就可以作为一种补体抑制剂。c5a也是一种强效过敏毒素，能引起平滑肌、血管紧张度和血管渗透性的改变，其还是中性粒细胞、单核细胞、血小板、内皮细胞和t细胞的强效趋化因子和激活剂。c5a介导的细胞激活通过诱导释放其它炎症介质，包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢产物和活性氧可显著放大炎症应答反应。另一个切割产物c5b则插入靶细胞表面的脂质双层中成为c6、c7、c8和c9沉积的核心，形成c5b-9复合物。c5b-9也称为膜攻击复合物(mac)。现有证据显示在炎症中mac起着重要作用，此外它还起着裂解细胞的孔形成复合物的作用。虽然补体活化为抵抗潜在病原体提供了有价值的第一线防御力，但促进保护性炎症应答反应的补体激活也可能表现为对宿主的潜在威胁。例如，可将c3a和c5a过敏毒素招募到患病部位并激活中性粒细胞、单核细胞和血小板。这些激活的细胞不加选择地释放破坏性酶，可能引起器官损伤。因此，基于下调或者抑制补体激活治疗一些因补体激活所导致炎症性疾病成为本
技术领域：
的一个新的尝试，目前研究显示在动物模型和体外研究中证实下调或者抑制补体激活对于治疗一些疾病适应症是有效的，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎等。已有几种作为重组蛋白的内源性可溶的补体抑制因子(c1-抑制因子、可溶的补体受体1或scr1)在临床研究中得到了了评价。抗c5重组人源型单克隆抗体能特异性地键合到人末端补体蛋白c5，通过抑制人补体c5向c5a和c5b的裂解以阻断炎症因子c5a的释放及c5b-9的形成。临床前研究表明该抗体对c5有高度亲和力,能阻断c5a和c5b-9的形成,并保护哺乳动物细胞不受c5b-9介导的损伤(thomasetal.,molimmunol1996,33:1389)，该文献公开的抗c5抗体仅仅显示了在亲和力和中和抑制方面的性能，对于在抑制补体介导的病理损伤方面还没有得到证实。该技术在2002年获得美国专利授权us6355245，2011年9月，美国食品和药物管理局(fda)批准其作为治疗典型溶血性尿毒症(ahus)患者的孤儿药，即抗c5抗体上市药物依库丽单抗(eculizumab)。但是依库丽单抗在临床应用治疗溶血症尿毒综合征时的疗效还存在着争议。鉴于c5分子在补体激活途径中的关键作用，本发明的目的就是提供一种特异性结合c5分子的单克隆抗体，以能够有效抑制c5分子的裂解，抑制作为其裂解产物的过敏毒素c5a的产生以达到抑制或者降低炎症反应的程度，同时抑制另一裂解产物c5b的产生，进而同时有效阻止c5b-9即膜攻击复合物(mac)的形成，抑制补体激活放大回路的路径，进而提供所述抗体在免疫复合物损害为主的红斑狼疮等自身免疫性疾病治疗药物中的应用。技术实现要素：基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体，所述抗体轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seqidno:1第25-35、51-57和90-99位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seqidno:5第30-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。在一个优选的实施方案中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示。在一个更为优选的实施方案中，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno:3所示，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如seqidno:7所示。其次，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seqidno:2所示，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seqidno:6所示。在一个更为优选的实施方案中，编码所述抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno:4所示，编码所述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno:8所示。第三，本发明还提供了表达上述编码单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸的载体。本发明对于表达上述编码单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸的载体并无特别限定，只要是能够表达所述编码多核苷酸的真核表达载体均可。在本发明的一个优选的实施方案中，表达编码单克隆抗体轻链的多核苷酸的载体为pabλ载体，表达编码单克隆抗体重链的多核苷酸的载体为pabh载体。。第四，本发明还提供了一种含有上述载体的宿主细胞，所述细胞为expi293f细胞。最后，本发明提供了上述的单克隆抗体在制备自身反应性疾病治疗药物中的应用。在一个优选的实施方案中，所述自身免疫性疾病为红斑狼疮。本发明公开的抗c5抗体的轻链和重链具有独特的cdr区，在抗原结合能力上显示了优异的抗原结合活性，ka(1/(m*s)为7.68×104，kd(1/s)为4.12×10-5，kd(m)为6.82×10-10。在细胞裂解抑制实验中，抗c5单抗抑制抗体致敏的cho细胞和红细胞溶解效果明显，抑制50％cho细胞发生溶解的补体抑制物浓度是18nmol/l，抑制50％红细胞发生溶解的补体抑制物浓度是12nmol/l，显示抗c5单抗能够有效抑制补体激活途径。本发明公开的抗c5单抗在mrl/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，能够明显提升小鼠的存活率，高剂量治疗组整个治疗过程能够完全保护mrl/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，而低剂量组即使在第24周也能保持在90％以上的存活率。而且治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善，显示本发明提供的抗c5单克隆抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。附图说明图1.抗c5抗体的12％sds-page鉴定图谱；图2.抗c5抗体的westernblot鉴定图谱；图3.靶向c5的单链抗体治疗mrl/lpr小鼠的存活率对照图；图4.靶向c5的单链抗体治疗mrl/lpr小鼠的蛋白尿变化对照图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。实施例1.抗补体c5分子的全人源单克隆抗体的制备1.1噬菌体抗体表达文库的构建及表达参见中国发明专利申请cn109575132a的实施例1，本申请通过引用，将cn109575132a的公开内容作为本申请的一部分并入到本申请说明书中。1.2重组噬菌体抗体的筛选：用c5抗原(complementtechnology，i货号：a120lot#，accession#p06684)包被聚乙烯培养皿，将含有重组噬菌体的上清与该培养皿中37℃孵育2小时。用pbs洗平皿20次，再用pbst(含0.05％tween20的pbs)洗平皿20次，弃pbst。加入10ml处于对数生长期tg1细胞，37℃培养1小时。离心，收集上清，进行下一轮筛选。重复“吸附-洗脱-繁殖”的筛选过程2次。在以m13k07辅助噬菌体超感染，就可以生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。1.3单克隆重组噬菌体的筛选与鉴定：第三轮筛选后，用2×yt将tg1菌液做倍数稀释(原液、1:10、1:100、1:1000)，然后涂布在sobag固体培养基(分子克隆，第三版，黄培堂等译)上，30℃培养过夜。从平板上随机挑取94个单菌落，分别接种于100μl2×ytag(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)培养液中，30℃培养过夜。取20μl培养液，转接于200μl含5×108pfu/mlm13k07的2×ytag培养液中，37℃培养2小时。离心，用200μl2×ytak(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×yt)重悬沉淀细胞，30℃培养过夜。离心、收集上清，即为单克隆重组噬菌体。用c5抗原包被酶联板，用0.5％bsa作为阴性对照，用羊抗m13噬菌体抗体作为阳性对照。1％bsa的37℃封闭1小时。把100μl重组噬菌体抗体上清和封闭液的等体积混合物加入到酶联板中，对照孔中加入m13噬菌体。37℃孵育1小时，pbst(含0.05％tween20的pbs)洗板3次，pbs洗板3次。每孔加入100μl羊抗m13噬菌体抗体igg-hrp(1:2000)，37℃孵育1小时。pbst和pbs一次各洗板3次，加入新鲜配制的底物h2o2-opd，室温反应20min，加入50μl2mh2so4终止反应，在a490处检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与c5结合活性最强的阳性克隆。1.4利用pcr技术分别扩增出结合活性最强的阳性克隆的轻链和重链片段，轻链和重链片段的上游带有bsrgi的酶切位点，下游带有bamhi的酶切位点；轻链上游引物：5’>cgcgtgtacaggaagctgggccgatatcgttctgactcaacctc<3’轻链下游引物：5’>cgcgaagcttggtgccaccgccaaacac<3’重链上游引物：5’>gcgccccttaagggcgtgcagtgcgaagtgcaattggtggaaagc<3’重链下游引物：5’>cggtgctagcgctcgacacggtcaccagagt<3’pcr反应条件为95℃预变性5分钟，然后进入扩增循环，95℃变性50秒，68℃退火40秒，72℃延伸50秒，经过25个循环后72℃再延伸10分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，轻链扩增产物长度约300kb，重链扩增产物长度约400kb，轻链和重链扩增产物长度均符合预期。1.5利用试剂盒纯化片段。1.6利用bsrgi和bamhi酶进行酶切片段将酶切过后的轻链片段和重链片段分别与pabλ载体(本实验室保存)以及pabh载体(本实验室保存)进行连接。1.7将连接的片段，转到top10(北京康为世纪生物科技有限公司，cw0807s)(也可以选择dh5α)感受态细胞中，复苏，氨苄抗性培养板中培养过夜，培养出单克隆。1.8阳性克隆重组质粒的dna序列分析：用t7dna序列taatacgactcactataggg测定该阳性重组质粒上抗c5抗体的dna序列，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seqidno:1第25-35、51-57和90-99位氨基酸序列所示，编码轻链可变区的多核苷酸序列如seqidno:2所示；轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno:3所示，编码轻链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno:4所示。所述抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示，重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seqidno:5第30-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seqidno:6所示；重链恒定区的氨基酸序列如seqidno:7所示，编码所述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno:8所示。1.9比对序列，将片段与载体连接正确的菌液，扩大培养，提取质粒。1.10单抗的瞬时表达和亲和层析纯化使用expi293表达系统，此表达系统将高表达expi293细胞系、化学成分明确的无血清培养基和一种高效转染试剂与专用增强剂结合在一起。取15ug重链载体和15ug轻链载体混合后转染expi293f细胞，按照说明书进行操作(thermofisherscientific，a14635)，3天后收获培养液，离心后上清约30ml，使用体积为5ml的预装proteina亲和层析柱，上样前使用20mmpbs平衡，待电导显示到基线后进样，上样结束后，使用20mmpbs洗涤色谱柱至基线平稳，使用0.1mph3.0的甘氨酸缓冲液洗脱目的蛋白，待od280近基线后，停止收集，使用至少3个柱体积的20mm的pbs洗涤色谱柱，至基线平稳后，用20％的乙醇洗涤色谱柱。单抗蛋白含量的测定使用紫外法，公式：蛋白含量＝1.54a280-1.38a260。亲和层析纯化后，取20μl纯化脱盐后的蛋白溶液，分别加入4μl的6×的还原buffer和非还原的buffer，沸水浴5分钟，进行sds-page，然后脱色。sds-page检测结果见图1(泳道1为单抗的非还原sds-page电泳结果，全分子量理论值在150kda左右，由于是糖基化蛋白，实际电泳图在250kda左右，泳道2为分子量标记，泳道3为单抗的还原sds-page电泳结果,重链(heavychain,h)预期50kda，轻链(lightchain,l)预期25kda)。1.11单克隆抗体的western-blotting鉴定1.11.15％的浓缩胶，6％的分离胶。1.11.21μl的1mg/ml抗原进行sds-page，70v浓缩胶，130v分离胶。1.11.3转印到pvdf膜上，转印时间24min。1.11.45％脱脂奶粉，0.1％tween20的tbs封闭2h。1.11.510ml浓度为5μg/ml的一抗，室温孵育2h。1.11.6tbst洗涤5次，5min/次。1.11.7山羊抗人的抗体作为二抗，稀释比例为1:5000，室温孵育1h。1.11.8tbst洗涤5次，5min/次。1.11.9显色。western-blotting鉴定结果见图2，图2中，泳道1为为分子量标记，泳道2为单抗的western-blotting鉴定条带，单抗分子量理论值在150kda左右，由于是糖基化蛋白，实际电泳图在250kda左右。实施例2.抗补体c5单克隆抗体与c5配基相互作用动力学分析抗补体c5单克隆抗体与c5配基相互作用动力学分析用表面细胞质基因组共振(spr)检测系统进行检测。2.1实验仪器与试剂仪器：reichert2spr(reichert公司)，芯片：sam芯片(大分子检测)，(reichertinc公司，partno:13206061)。试剂：1xpbst500ml(过滤，0.22um滤膜过滤)，edc(现用现配)，nhs(现用现配)，1mph8.5乙醇胺(5-10ml)，10mmph2.0hcl(5-10ml)，10mmph2.0甘氨酸(5-10ml)。2.2.实验步骤2.2.1预富集2.2.1.1将蛋白用不同的ph醋酸钠稀释到10μg/ml，200μl。表1.醋酸钠ph值选择表蛋白名称醋酸钠ph值固定通道抗原6.0/5.5/5.0/4.5/4.0某一通道2.2.1.2在某一通道中注射蛋白，25μl/min，2min。2.2.1.3选择合适的ph条件(ph5.0)。2.2.2蛋白固定2.2.2.176.66mgedc和11.52mgnhs溶解在1ml超纯水中，取200μl，活化左右两通道，10μl/min,7min。2.2.2.2将抗原用合适的ph值醋酸钠稀释到50μg/ml，200μl，单独固定在某个通道。10μl/min,7min。2.2.2.3如果一次固定量不够，重复注射抗体。2.2.2.4取200μl1m乙醇胺(ph8.5)，封闭左右两个通道，10μl/min,7min。2.2.3抗体-抗原结合预实验2.2.3.1将抗体用pbst稀释至100nm，25μl/min,结合3min，解离5min。2.2.3.210mmph2.0hcl(或者10mmph2.0甘氨酸)再生2min，解离2min。2.2.4正式实验2.2.4.1将抗体用pbst稀释至100nm，再2倍稀释，7个梯度，25μl/min,结合3min，解离5min。2.2.4.210mmph2.0hcl(或者10mmph2.0甘氨酸)再生2min，解离2min。spr检测结果如表2显示，本发明提供的抗c5单克隆抗体显示了优异的抗原结合效能。表2.抗补体c5单克隆抗体与c5结合的动力学参数实施例3.抗c5全抗的体外抑制补体激活的实验为测定对补体的抑制活性，60％～80％融合的cho细胞用乙二胺四乙酸分开，用dmem洗2次，然后重悬于dmem中，使其终浓度为106个细胞/ml。在细胞悬液中加入100ml/l兔抗cho细胞膜抗血清，4℃作用30min，使细胞致敏。然后弃抗血清，细胞重悬于用dmem稀释的nhs中，终体积为50μl或100μl。37℃作用60min，最后用胎盘兰染色排除法测量细胞成活力(活细胞与死细胞均计数)。单克隆抗体用deme稀释后先加入到nhs中，再加入至cho细胞悬液。终浓度以100g/lnhs可导致大约90％抗体致敏的对照cho细胞溶解为准。补体介导的红细胞溶解抑制实验用抗体致敏的羊红细胞(eas)进行测定。溶血试验在明胶佛罗那缓冲液(gvb )中进行，终体积为300μl，包含有2.5×107eas，nhs按照1∶300稀释。反应混合物在37℃孵育60min，最后加入300μl含10mmol/ledta-pbs溶液终止反应。离心，取上清，在413nm波长下用光谱成像仪对上清中的血红素进行定量检测。单克隆抗体补体抑制物活性检测：补体介导的cho细胞和红细胞溶解实验结果显示，在细胞裂解抑制实验中，抗c5单抗抑制抗体致敏的cho细胞和红细胞溶解效果明显(详见表3)，显示抗c5单抗能够有效抑制补体经典激活途径。表3.能抑制50％细胞发生溶解的补体抑制物浓度实施例4.抗c5单抗在mrl/lpr红斑狼疮小鼠中的治疗作用1.生存率的提高mrl/lpr小鼠从16周到24周抗c5单抗高剂量治疗组(n＝28)、scfv-daf低剂量治疗组(n＝28)和pbs对照组(n＝28)小鼠生存率的对比。mrl/lpr红斑狼疮小鼠模型最早是murphy和roths于1979年建立，由多个品系小鼠历经12代的复杂的杂交过程而成，该模型的小鼠基因的75％来自lg/j、12.6％来自akr/j、12.1％来自c3h/di及0.3％来自c57bl/6品系小鼠。mrl/lpr小鼠含有与细胞自发性程序性死亡有关的fas基因隐性突变，出现淋巴细胞增生基因，导致t细胞增生，全身淋巴结肿大，以及侵蚀性关节炎，抗dna、抗sm、抗su、抗核苷p抗体，高滴度ana，高丙种球蛋白血症以及类风湿因子。该鼠最早发病于8周，此时血清中可检测到自身抗体。12周时可以观察到淋巴结炎。12－16周，mrl/lpr鼠开始产生包括抗双链dna抗体在内的大量自身抗体。近16周龄时多器官受累，以及出现以严重蛋白尿为特征的稳定肾功能退化。16-24周龄鼠出现增殖性免疫复合物介导的肾小球肾炎，血管炎，并最终导致肾衰而死亡，死亡率可以达到50％。本实施例将已经出现肾衰症状的16周的mrl/lpr鼠随机分为三组，第一组(n＝28)为高剂量治疗组，从第16-24周起每周接受0.4mg/w的抗c5单抗，第二组(n＝28)为低剂量治疗组，从第16-24周起每周接受0.1mg/w的抗c5单抗，第三组(n＝28)为对照组，从第16-24周起每周接受等量的pbs。三组的给药途径均为尾静脉注射。根据给药组和对照组的存活率评价抗c5单抗对mrl/lpr红斑狼疮小鼠的保护率。实验结果如图3所示，接受抗c5单抗治疗的小鼠，由于补体激活途径中的c5被抗c5单抗有效抑制，补体激活级联反应难以进入放大环路，自身免疫性炎症损害得到有效抑制，因此，mrl/lpr红斑狼疮小鼠的存活率明显提高，抗c5单抗高剂量治疗组整个治疗过程能够完全保护mrl/lpr红斑狼疮小鼠，存活率为100％，抗c5单抗低剂量治疗组组即使在第24周也能保持在90％以上的存活率，和对照组相比，从18周起治疗组的小鼠生存率明显提高。2.肾功能改善将小鼠置于代谢笼里研究抗c5单抗对mrl/lpr红斑狼疮小鼠尿白蛋白分泌的影响。从16周开始每两周收集一次小鼠的24小时尿液。为防止细菌生长，在收集管中加入氨苄青霉素、庆大霉素(ampicillin,gentamicin；invitrogenlifetechnologies)和氯霉素(sigma-aldrich)。使用已知浓度的小鼠白蛋白样品(bethyllaboratories)通过elisa方法绘制标准曲线，并确定实验小鼠的尿白蛋白分泌情况，并使用生化仪(beckmancoulter)测定小鼠尿液中的肌酐含量。最后的评价结果以每只实验小鼠24小时的尿白蛋白(mg)与肌酐(mg)比值表示。尿白蛋白肌酐比值偏高表示肾脏功能受到损害。如图4所示，mrl/lpr小鼠抗c5单抗治疗组(0.1mg/w，n＝24)和pbs对照组(n＝26)蛋白尿情况对比。在第22-24周时，与对照组相比，治疗组的蛋白尿水平明显降低(p<0.01)，证明本发明提供的抗c5单抗能够显著改善肾功能损伤症状。3.肾脏的炎症反应减轻实验结束后，切除小鼠肾脏纵向解剖为两半，其中一半进行免疫荧光分析，另一半10％中性甲醛固定，固体石蜡包埋切片，以苏木精-伊红染色法和过碘酸雪夫染色法对石蜡处理的肾脏组织切片进行染色，采用盲法分别对自切片观察到的肾小球炎症、增生、新月体形成、坏死症状进行评分，同时对肾间质的变化也进行评分。评分共分为0、1、2、3、4五级，0为无损伤，4为严重损伤。血管周围炎性渗出评价采用半定量方式，由两个独立观察者盲法对每张切片10个以上的血管进行评价。炎症的得分为0-3，0为无炎症，1为低于50％的血管由3层细胞围绕，2为大于50％的血管为3-6层围绕，3为最严重表现，多于6层的细胞环绕。评价结果如表4所示。表4.mrl/lpr小鼠从16周到23周治疗后第24周抗c5单抗治疗组和pbs对照组肾脏损害情况对比和对照组相比，抗c5单抗治疗组(0.1mg/w)比对照组在肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等更加明显降低(p<0.05)。序列表<110>北京康普美特创新医药科技有限责任公司<120>一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>110<212>prt<213>homosapiens<400>1sertyrgluleuthrglnproproservalservalalaproglygln151015thralaargilethrcysserglyaspalaleuglyasplystyrala202530sertrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleuvaliletyr354045gluaspserlysargproserglyileprogluargpheserglyser505560asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalaglu65707580aspglualaasptyrtyrcysseralatrpgluaspaspalagluhis859095glnvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglygln100105110<210>2<211>330<212>dna<213>homosapiens<400>2atggccagctacgaactgacccagccgccgagcgtgtcggtggcgccgggtcagaccgcg60cgtatcacctgctcgggcgatgcgctgggcgataaatacgcgagctggtatcagcagaaa120ccgggtcaggcaccggtgctggtgatttacgaagattctaaacgcccgtctggcatcccg180gaacgctttagcggctcgaattcgggcaacaccgcgaccctgaccattagcggcacccag240gcggaggatgaggcggactattactgctcggcgtgggaggacgacgctgagcatcaggtg300tttggcggtggcaccaaactgaccgtgctg330<210>3<211>105<212>prt<213>homosapiens<400>3prolysalaalaproservalthrleupheproprosersergluglu151015leuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphetyr202530proglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserprovallys354045alaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasnlystyr505560alaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplysserhis65707580argsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulys859095thrvalalaprothrglucysserglx100105<210>4<211>321<212>dna<213>homosapiens<400>4ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaa60gccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtg120gcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaa180caaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaag240tcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtg300gcccctacagaatgttcatag321<210>5<211>120<212>prt<213>homosapiens<400>5gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasnprophetyrvalglyvalpheaspvaltrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserserala115120<210>6<211>360<212>dna<213>homosapiens<400>6gaagtgcaattggtggaaagcggtggcggtctggtgcagccgggtggcagcctgcgtctg60agctgcgcagcgagcggcttcacctttagcagctacgcgatgagctgggtgcgccaggca120ccgggtaaaggtctggaatgggtgagcgcgattagcggtagcggcggcagcacctactat180gcggatagcgtgaaaggccgttttaccatctcgcgtgataactcgaaaaacaccctgtac240ctgcagatgaacagcctgcgtgcggaagataccgcggtgtattattgcgcacgtcattat300cctggtccgtatgctttcgatgtctggggtcagggcactctggtgaccgtgtcgagcgcg360<210>7<211>329<212>prt<213>homosapiens<400>7serthrlysglyproservalpheproleualaproserserlysser151015thrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrphe202530progluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrsergly354045valhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleu505560serservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyr65707580ilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplyslys859095valgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocyspro100105110alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys115120125prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval130135140valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr145150155160valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu165170175glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis180185190glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys195200205alaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglygln210215220proarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleu225230235240thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro245250255seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn260265270tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu275280285tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval290295300phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln305310315320lysserleuserleuserproglylys325<210>8<211>990<212>dna<213>homosapiens<400>8agcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc60acagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg120aactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcagga180ctctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctac240atctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaa300tcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccg360tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag420gtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtac480gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagc540acgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag600tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa660gccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctg720accaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcc780gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg840gactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag900caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag960aagagcctctccctgtccccgggtaaatga990当前第1页1 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技术特征：1.一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seqidno:1第25-35、51-57和90-99位氨基酸序列所示，所述抗体重链可变区cdr1、cdr2和cdr3区氨基酸序列分别如seqidno:5第30-35、50-66和99-108位氨基酸序列所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:1所示，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如seqidno:5所示。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno:3所示，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如seqidno:7所示。
4.一种编码权利要求1-3任一所述单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如seqidno:2所示，编码所述抗体的重链可变区的多核苷酸序列如seqidno:6所示。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno:4所示，编码所述抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如seqidno:8所示。
7.一种表达权利要求6所述编码单克隆抗体重链和/或轻链的多核苷酸的载体。
8.一种含有权利要求7所述载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为expi293f细胞。
9.权利要求1-3任一所述的单克隆抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为红斑狼疮。
技术总结本发明公开了一种抗补体C5分子的全人源单克隆抗体，所述抗体的轻链和重链具有独特的CDR区，使所述抗体具有优异的抗原结合活性，在细胞裂解抑制实验中，所述抗体抑制抗体致敏的CHO细胞和红细胞溶解效果明显。本发明公开的抗C5单克隆抗体在MRL/lpr红斑狼疮小鼠的治疗中，能够明显提升小鼠的存活率，而且治疗组的蛋白尿、肾小球积分、间质炎症、血管炎和新月体/坏死等症状得到明显改善，显示本发明提供的单克隆抗体在制备自身免疫性疾病治疗药物中具有优异的应用前景。
技术研发人员：唐晓敏;杜兰英
受保护的技术使用者：北京康普美特创新医药科技有限责任公司
技术研发日：2020.02.23
技术公布日：2020.06.05
