本发明涉及医药生物学和生物制药技术领域，具体涉及一种抗ctla-4纳米抗体、药物组合物及其应用。
背景技术：
免疫检查点(immunecheckpoint)在机体的特异性免疫过程中，主要调节t细胞介导的免疫反应。机体受到肿瘤侵袭时，肿瘤细胞通过异常上调抑制性共刺激分子及其配体表达，抑制t细胞发挥功能，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。细胞毒t淋巴细胞相关抗原4(cytotoxictlymphocyte-associatedantigen-4,ctla-4)是一种白细胞分化抗原，是t细胞上的一种跨膜抑制性共受体。ctla-4与t细胞刺激协同b7家族分子结合后诱导t细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。而且ctla-4也在调节性t细胞(tregs)中发现并有助于它们的抑制功能。ctla-4的配体在许多实体瘤中存在高度表达的水平。当这些配体与t细胞上的ctla-4结合后下调t细胞的免疫应答，从而使得肿瘤细胞逃逸免疫系统的识别和杀伤作用。因此ctla-4是肿瘤免疫治疗的重要靶点。目前多使用抗ctla-4抗体用于肿瘤治疗，这些抗体都是传统的抗体分子，分子量大，需要在动物细胞中进行表达生产。因而具有生产成本高，在体内可能会导致免疫原性等缺点。
小分子纳米抗体由于具有分子质量小，体积小，无fc段等性质，使它们在很多方面的表现优于传统抗体，免疫原性低，它们不易产生自身免疫反应；有很强的组织渗透性；易于结合隐蔽的抗原表位；可用微生物进行生产，且生产成本低等优势。
然后抗ctla-4纳米抗体还需要进一步改进。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种抗ctl-4纳米抗体及其应用。
我们抽取骆驼外周血构建噬菌体文库，从中筛选获得抗ctla-4纳米抗体，并将其在大肠杆菌和酵母中进行表达。所获得的抗ctla-4纳米抗体分子量小，特异性强，与ctla-4胞外段的结合能力强，因而可以用于ctla-4高表达的肿瘤的诊断和治疗。
为此，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种抗ctla-4纳米抗体，所述纳米抗体选自下列至少之一：(1)具有kyiysnyc所示的cdr1、iytggsnt所示的cdr2和aatsrrwcsslekqvfgy所示的cdr3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。所提供的抗ctla-4纳米抗体分子量小，特异性强，与ctla-4胞外段的结合能力强，可以用于肿瘤的诊断和治疗，尤其是用于ctla-4高表达的肿瘤的诊断和治疗。
根据本发明的实施例，以上所述的纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：(a)seqidno:1所示的氨基酸序列；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含编码本发明第一方面所述的纳米抗体的核酸序列。
根据本发明的实施例，以上所述的核酸还可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述核酸包含如下所示的核酸序列：seqidno:2所示的核酸序列；与seqidno:2所示的核酸序列相比，至少具有95％以上同源性的序列，优选具有98％以上同源性的序列，更优选具有99％以上同源性的序列。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第二方面所述的核酸。
根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包含调节元件，所述调节元件与所述核酸可操作地连接。
根据本发明的实施例，所述调节元件包括选自启动子、增强子和终止子中的至少一种。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本发明第三方面所述的表达载体。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种生产抗ctla-4纳米抗体的方法，包括培养本发明第四方面所述的重组细胞，以便获得所述抗ctla-4纳米抗体。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种纳米抗体在制备治疗肿瘤中的用途，所述纳米抗体为本发明第一方面所述的纳米抗体。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括选自前列腺癌，恶性黑素瘤和肺癌中的至少一种。根据本发明的实施例，肺癌可以是非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的纳米抗体和药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种检测ctla-4的试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的纳米抗体。
在本发明的第九方面，本发明提供了一种car-t细胞，所述car-t细胞包括本发明第一方面所述的纳米抗体。应用所提供的含有抗ctla-4纳米抗体的car-t细胞对病人进行细胞回输，可以用来治疗肿瘤。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的经过三轮淘洗的菌落图。
图2是根据本发明的实施例提供的三种抗ctla-4纳米抗体的表达纯化结果。
图3是根据本发明的实施例提供的三种抗ctla-4纳米抗体的特异性检测结果。
图4是根据本发明的实施例提供的三种抗ctla-4纳米抗体的热稳定性检测结果。
图5是根据本发明的实施例提供的三种抗ctla-4纳米抗体与人恶性黑色素瘤细胞a375细胞上ctla-4结合效率的检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
同时，为了方便本领域技术人员的理解，对于本文中的一些术语进行了解释和说明。这些解释和说明仅用于方便理解，而不应看做是对本发明保护范围的限制。
在本文中，术语“抗体”是指能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。通常抗体结构包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(h链)和轻链(l链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(n端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(v区)，可变区决定抗体的识别以及与抗原的特异性结合；羧基端(c端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(c区)，恒定区通常赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘移动性、补体结合和fc受体结合。重链和轻链的可变区通常称为vh和vl。
在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(hypervariableregion，hvr)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determiningregion，cdr)。重链可变区和轻链可变区上均有三个cdr区。为了表述上的方便，位于重链上的cdr区也称为重链高变区，位于轻链上的cdr区也称为轻链高变区。
肽链可变区内除了高变区之外的氨基酸组成和排列顺序变化相对较小，称为骨架区(fr)。vh和vl内各有4个骨架区，分别以fr1、fr2、fr3和fr4表示。
纳米抗体(nanobody，asingledomainantibody)，也称vhh(variabledomainofheavychainofheavychainantibody)，较早是在骆驼体内存在的天然的缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为vhh。纳米抗体是最小的功能性抗原结合片段，和普通抗体相比，纳米抗体分子量小，结构简单，易于进行基因改造，体积小，抗原特异性好，组织穿透力强，稳定性高，在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。
在没有轻链的情况下，纳米抗体各自具有三个cdr，分别表示为cdr1、cdr2和cdr3，用来表征纳米抗体的抗原识别和结合的特异性。为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种抗ctl-4纳米抗体，所述纳米抗体包括选自下列至少之一：(1)具有kyiysnyc所示的cdr1、iytggsnt所示的cdr2和aatsrrwcsslekqvfgy所示的cdr3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
这些保守氨基酸取代可以发生在cdr1上，也可以发生在cdr2上，或者发生在cdr3上，或者同时发生在cdr1、cdr2或者cdr3上。当然，这些保守氨基酸取代可以是一个氨基酸取代，两个氨基酸取代或者三个氨基酸取代。
本文中，所述“保守氨基酸取代”是指纳米抗体中的某些氨基酸或者某几个氨基酸发生改变，而不会损害纳米抗体的整体构象和功能。这些保守氨基酸取代包括使用具有相似的性质(例如，极性、氢键电位、酸度、碱度、疏水性、芳族基团的存在等)的另一种氨基酸替换一种氨基酸。具有相似性质的氨基酸是本领域技术人员熟知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水-碱性氨基酸并且可以互换。类似地，异亮氨酸(疏水性氨基酸)可以被亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸替换。这种变化对纳米抗体的表观分子量或等电点几乎没有影响或没有影响。再例如一些天然氨基酸可被非天然氨基酸替换，例如d构型的氨基酸、或β或γ氨基酸。
根据本发明的实施例，所提供的纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：(a)seqidno:1所示的氨基酸序列；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
其中seqidno:1所示的氨基酸序列如下：
mkyllptaaagllllaaqpamaqvqlqesgggsvqaggslrlscaatkyiysnycmgwfrqapgkeregvaaiytggsntyyadsvkgrftishddakstvylqmnsakpedtamyycaatsrrwcsslekqvfgywgqgtqvtvssaaaypydvpdygs(seqidno:1)。
本发明所提供的抗ctla-4纳米抗体，其具有热稳定性。例如在37摄氏度条件下处理3小时，其活性至少还保留80％。再例如，在60摄氏度条件下处理3小时，其活性至少还保留40％。本发明所提供的抗ctla-4纳米抗体相较于抗ctla-4单克隆抗体来说，稳定性更好，这就为纳米抗体的保存，运输等提供了便利。而且所提供的抗ctla-4抗体可以用于特殊环境下的检测。另外，所提供的抗ctla-4纳米抗体也可以用于其他非药用方面，例如应用于洗发水中等等。
在本发明的另一方面，本发明还提供了一种核酸，所述核酸包含编码上述所述抗ctl-4纳米抗体的核酸序列。通常所称的核酸可以是dna分子，也可以是rna分子，其可以包含在任何合适的载体中，例如质粒、人工染色体、噬菌体或者病毒载体等。根据本发明的实施例，编码seqidno:1所示序列的核苷酸序列如seqidno:2所示。根据本发明的实施例，所提供的核酸序列还可以为与seqidno:2所示核酸序列相比，至少具有90％以上同源性的序列，例如至少具有95％以上同源性的序列，优选具有98％以上同源性的序列，更优选具有99％以上同源性的序列。
seqidno:2所示核酸序列如下：
atgaaatacctattgcctacggcagccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggagtctggaggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagccactaaatatatctacagtaattactgcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagctatttatactggtggcagtaacacatactatgccgactccgtgaagggccgcttcaccatctcccatgacgacgccaagtctacggtgtatctgcaaatgaacagcgcgaaacctgaagatactgccatgtactactgtgcggcgacgagtaggcgctggtgttcatcactggaaaaacaagtctttggttactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagcggccgcatacccgtacgacgttccggactacggttcctaa(seqidno:2)。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述载体包含上述核酸。本文中所称的表达载体，在本领域也通常被称为克隆载体或者载体，指可以将dna序列或者rna序列引入到宿主细胞的载体，其可以用于转化到宿主细胞中，并促进核酸序列的表达，例如促进转录和翻译。这种表达载体可以包含调节元件，例如启动子、增强子、终止子等，用于引起或指导多肽的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和激活子的实施例包括sv40早期启动子和激活子等。合适的载体可以是质粒，例如一些包含复制起点的质粒或者整合质粒，例如puc、pcdna、pbr等。可用的病毒载体包括但不限于腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和aav载体。此类病毒载体可通过本领域技术人员熟知的技术生产，例如通过病毒的瞬时转染或者稳定转染获得。在进行病毒转染时，可用到的转染细胞可以是pa317细胞、psicrip细胞、gpenv 细胞、293细胞等。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有上述所述的表达载体。所提供的重组细胞可以通过将表达载体转化到宿主细胞中获得。例如可以通过表达载体将外源基因或者dna序列或者rna序列引入到宿主细胞中，以便使得宿主细胞表达所引入的基因或者序列，来产生想要的物质，这些想要的物质通常是由基因或者引入序列所编码的蛋白质。常用的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌宿主细胞(在导入时常用质粒载体)、昆虫宿主细胞(在导入时常用杆状病毒载体)，以及哺乳动物宿主细胞。例如，还可以包括原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的哺乳动物宿主细胞可以为vero细胞、cho细胞、3t3细胞、cos细胞等。
通过在合适的条件下培养上述提供的重组细胞，可以获得所述抗ctla-4纳米抗体。在培养所述重组细胞时，可以采用本领域技术人员已知的任何生产技术，例如任何化学上、生物学上、遗传学上或者酶学技术，这些技术可以单独或者组合应用。所获得的抗ctla-4纳米抗体可以通过常规的蛋白纯化方法进行分离和纯化，例如可以通过羟基磷灰石层析、凝胶电泳、亲和透析或色谱法等常规的蛋白纯化方法进行分离和纯化。
本发明所提供的抗ctla-4纳米抗体可以用来治疗ctla-4过表达为特征的疾病，例如肿瘤，包括但不限于前列腺癌，恶性黑素瘤和肺癌(小细胞和非小细胞)等。例如，还可以为卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴癌、恶性血液病、头颈癌、胃癌、胶质瘤、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤等等。
在本发明的又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述抗ctla-4纳米抗体和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指药学上可用的辅助成药的成分，例如可以包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等等。这些药学上可接受的载体的功能和用途是本领域技术人员公知的。本领域技术人员可以根据这些药学上可接受的载体的功能和用途，与抗ctla-4纳米抗体复配，获得相应的药物组合物，用作制药或者疾病的治疗领域。所提供的药物组合物可以是不同的剂型，例如可以通过口服，通过吸入，肠胃外(特别是通过静脉内注射)等合适的形式施用。当肠胃外途径时，所提供的抗ctla-4纳米抗体可以是以包装在小瓶中以可注射溶质和悬浮液的形式提供。通常可以将抗ctla-4纳米抗体与缓冲剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂等混合来获得肠胃外施用的形式。混合后的各物质进行灭菌，然后以静脉内注射剂的形式包装。可用的缓冲剂可以是有机磷酸盐。可用的悬浮剂可以是甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、阿拉伯树胶和/或羧甲基纤维素钠。此外，可用的稳定剂可以是亚硫酸钠和偏亚硫酸氢钠，可用的防腐剂可以是对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚和氯甲酚等。
本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的抗ctla-4纳米抗体联合至少一种其他的抗肿瘤药物。例如，本发明所提供的抗ctla-4纳米抗体可以与靶向其他肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。所述靶向其他肿瘤特异性抗原的抗体包括但不限于抗egfr抗体、抗her2抗体、抗vegfa抗体等等，这些抗体优选是单克隆抗体。本发明所提供的抗ctla-4纳米抗体还可以与其他肿瘤免疫治疗手段、或者肿瘤靶向性小分子类药物联用。所述其他肿瘤免疫治疗手段包括但不限于针对肿瘤免疫调节分子，例如ox40、pdl1/pd1、cd137等治疗型抗体，或者car-t治疗手段等。
所提供的药物组合物也可以与其他肿瘤治疗手段，例如放化疗、手术治疗等联用使用，或者在放化疗或者手术治疗之前或者之后使用。
药物组合物中的抗ctla-4纳米抗体的剂量范围可以为0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg对象体重。例如，剂量可以为0.2mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、8mg/kg体重、10mg/kg体重、15mg/kg体重、20.2mg/kg体重或者30mg/kg体重，或者是在1-30mg/kg体重范围内。治疗或者用药时，可以采用每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次、每四周一次等等。
当然所提供的抗ctla-4纳米抗体还可以作为试剂盒的一部分，用于检测ctla-4。所提供的试剂盒除了含有抗ctla-4纳米抗体之外，还可以含有本领域常用的用作抗原检测的常规试剂。
在本发明的另一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，所述方法包括给予对象有效量的药物组合物或者有效量的纳米抗体，所述药物组合物上述提供的药物组合物，所述纳米抗体为上述提供的纳米抗体。本文中所提到的“有效量的”优选可以使得对象中细胞生长或者肿瘤生长抑制至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％。有效量的药物组合物或者有效量的纳米抗体能够减少肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状，例如实现或者延长肿瘤患者的无进展生存期等。
需要说明的是，根据上述所提供的抗ctla-4纳米抗体可以应用于生物医药的研发，用作临床诊断，用作肿瘤的研究、治疗以及用作免疫学的研究和治疗上。例如，不仅仅可以应用到上述提到的各个产品，例如药物组合物，试剂盒等等，还可以结合本领域常用的技术，改造成多价抗体或者多特异性纳米抗体的形式。也可以应用于制备car-t细胞。这些car-t细胞可以通过基因工程的常用手段获得，从而可以应用该car-t细胞回输到病人体内，治疗肿瘤。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1噬菌体纳米抗体文库的制备
(1)采取两只未经任何免疫抗原的双峰驼的血液，每只取100ml，将收集的血液与等体积的生理盐水混匀，将稀释后的血液缓慢加入到淋巴细胞分离液的表面，室温2000rpm离心20min。吸取第二层的淋巴细胞，加入五倍体积的pbs，室温2000rpm离心20min，重复三次。将收集下来的淋巴细胞加入1ml的trizol(购于invitrogen，货号为15596026)试剂，重复混匀，于12000rpm、4℃离心15min。再向离心后上清中加入0.2ml的氯仿，充分混匀后静置3min，于12000rpm、4℃离心15min。吸取最上层水相与等体积的异丙醇混匀，静置10min，于12000rpm、4℃离心10min。去上清，再加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀，于12000rpm、4℃离心10min。再加入100μl的depc水溶解。
(2)采用amvfirststrandcdnasynthesiskit(购于neb，货号为e6550s)将上述rna逆转录为dna。
第一步体系条件如下：
第二步体系条件如下：
(3)利用kapahifihotstartreadymixpcrkit(购于kapa，货号为kk2611)通过pcr的方法扩增vhh基因。而且由于骆驼抗体有两种模板，两种模板的c端略有不同，所以使用两个r-primer，来获得更多更全面的抗体。
反应条件：
f-primer:5′
-gaggaggaggaggaggtggcccaggcggcccaggtsmarctgcagsagtcwgg-3′(seqidno:3)。其中s代表碱基g或c，w代表碱基a或t，m代表碱基a或c，r代表碱基g或a。
r-primer1:5′
-gaggaggaggaggaggtggcccaggcggccggagctggggtcttcgctgtggtgcg-3′(seqidno:4)。
r-primer2:5′
-gaggaggaggaggaggtggcccaggcggcctggttgtggttttggtgtcttgggtt-3′(seqidno:5)。
(4)使用sfiⅰ(购于takara，货号为1244a)内切酶对pcomb-3x载体(购于allelebiotechnologyandpharmaceuticals)和vhh基因酶切，反应体系和条件如下：
(5)用t4dnaligase对pcomb-3x载体和vhh基因进行连接。反应体系条件如下：
(6)将0.2μl的上述连接产物与90μltg1感受态菌液中，混匀加入电转杯，1900v电转5ms后，加入1mlsoc培养基(购于sangonbiotech，货号为a507009)，37℃摇床中，250rpm培养1h。再加入10mlsoc培养基，继续培养1h。向其中加入2mlvcsm13辅助噬菌体(购于biovector)的同时，加入含终浓度为10μg/ml氨苄青霉素(amp，购于sangonbiotech，货号为a610028)抗性的200mlsoc培养基，继续培养2h。之后加入终浓度为10μg/ml卡那霉素(kana，购于sangonbiotech，货号为a600286)培养过夜。
(7)将上述培养过夜的tg1菌液于4℃，3000g离心15min。将离心后的上清和peg6000(购于biosharp，货号为by0027)/nacl(购于macklin，货号为s805275)溶液以6:1的比例混匀，冰上静置30min。2200×g离心30min，沉淀再用2mlpbs溶液重悬。再4℃，13200rpm离心5min。再用0.22μm滤膜(购于merckmillipore，货号为slgp033rb)过滤上清以用于淘洗实验。
实施例2噬菌体纳米抗体文库淘洗
对实施例1所获得的噬菌体纳米文库进行淘洗，包括如下步骤：
(1)用nahco3包被液(购于sigma，货号为s6297)稀释ctla-4(购于义翘神州，货号为90213-c08h)蛋白，以每孔20μgctla-4蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置阴性对照。
(2)次日，吸取酶标板中未偶联的目的蛋白，再加入300μl0.1％pbst，静置3min(洗板一次)，再向酶标板中加入含2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，再用300μl0.1％pbst溶液洗板一次，静置3min。
(3)取300μl制备的纳米抗体噬菌体文库于等体积的2％脱脂奶粉混匀，每孔加入100μl的上述混合液，37℃孵育1h。
(8)每孔加入300μl0.1％pbst溶液洗板5至15次，每次静置3min(根据淘洗轮数的递增，洗板次数也相应递增，最后一次淘洗，偶联抗原的浓度减半)，进行三轮淘洗实验。
(4)每孔加入100μl100mm三乙胺(tes，购于aladdin)溶液，放置于室温孵育10min。将上清中解离的噬菌体继续感染tg1菌株，在多轮淘洗的过程中不断富集，以便筛选出特异性好、亲和力高的纳米抗体序列。
图1显示三轮淘洗的菌落图，其中图1中1.9×105cfu代表经过第一轮淘洗所获得的菌落数，3.9×104cfu代表经过第二轮淘洗所获得的菌落数，1.6×106cfu代表经过第三轮淘洗所获得的菌落数。结果表明，经过三轮淘洗后的库容量逐渐增加。
实施例3噬菌体纳米抗体文库筛选抗ctla-4纳米抗体
利用经过淘洗的噬菌体纳米抗体文库筛选抗ctla-4纳米抗体，包括如下步骤：
(1)随机挑选淘洗的最后一轮平板上的不同单菌落接种含1ml/孔2×yt培养基(购于sangonbiotech，货号为a507016)的96孔深孔板(购于nunc，货号为95040452)中，并在平板上做好标记。37℃，150rpm培养3h，之后加入1mmiptg(购于solarbio，货号为i8070)，28℃、150rpm过夜诱导。
(2)用nahco3包被液稀释ctla-4蛋白，以100ngctla-4蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置相应的阴性对照。
(3)次日，用0.1％pbst洗板，静置3min，再向酶标板中加入2％脱脂奶粉，37℃封闭2h，用0.1％pbst溶液洗板一次，同时将过夜诱导的深孔板于4℃，4000rpm，离心30min。吸去上清，每孔的沉淀各用200μltes溶液重悬，4℃，150rpm，孵育2h。
(4)继续向每孔加入300μltes/4溶液，放置于4℃，150rpm孵育2h。再将深孔板放置于4℃，4000rpm，离心30min。将上述上清以100μl分别加入到相应的含有目的蛋白的孔中以及阴性对照孔中，37℃孵育1h。
(5)每孔加入300μl0.1％pbst溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，每孔加入100μl1:5000稀释的anti-ha-hrp(购于gni，gni4310-ha-s)，37℃孵育1h。
(6)每孔加入300μl0.1％pbst溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，以去掉未结合的抗体，每孔再加入100μltmb(购于湖州英创，tmb-s-004)显色剂，37℃避光孵育10min，每孔再加入100μl2.29％硫酸(购于广州化学试剂厂)终止反应。
(7)用酶标仪测od450nm波长处的值，抗原孔是空白孔吸光值的两倍，则视为阳性。
(8)阳性转化子接种到10mllb培养基(购于sangonbiotech，货号为a507002)中，37℃，150rpm培养8h，收集菌液并送测序(sangonbiotech)。
根据测序结果，用blast进行序列比对，将互补决定区序列高度相近的序列视为一株，最终筛选得到一株特异性抗ctla-4纳米抗体。为了表述方便，所筛选获得的纳米抗体命名为e3纳米抗体。经测定，e3纳米抗体的氨基酸序列如seqidno:1所示，编码seqidno:1所示序列的核酸序列如seqidno:2所示。
实施例4抗ctla-4纳米抗体的表达纯化
(1)将上述阳性转化子质粒以1800v的电压电转至wk6菌株(购于biovectorntcc质粒载体菌种细胞基因保藏中心)中，涂布在amp抗性的lb平板上，过夜培养，第二天，挑取平板上的单菌落接种到10ml含有amp抗性的lb培养基中，37℃、220rpm培养8h。
(2)将上述菌液接种到330ml含有amp抗性的tb培养基(购于elite-media，货号为m201-02)中，37℃，220rpm培养至od＝0.7-0.8。再加入终浓度为1mmiptg，28℃、220rpm诱导过夜。
(3)第二天，收集菌体，pbs重悬再离心。最后用菌体质量比tes溶液体积比1：10的比列重悬菌体，利用渗透压法破碎菌体。10000rpm离心30min，收集上清提取物。再用0.45μm滤膜进行过滤除菌体碎片。
(4)使用akta纯化仪(购于ge)进行镍柱亲和层析，首先，用流速为1ml/min的pbs溶液对镍柱(购于ge，货号为10230759)进行平衡，直到uv280值保持不变，再以1ml/min的流速上样，再用流速为1ml/min的pbs溶液对镍柱进行平衡，直到uv280值保持不变，分别用20mm、100mm、150mm、200mm、250mm和500mm咪唑以1ml/min的流速的对杂蛋白以及目的蛋白进行洗脱。
(5)使用预制胶(购于invitrogen，货号为ec6025box)进行电泳，取制备好的样品20μl加入到预制胶中，80v电压30min使样品电泳至分离胶，然后120v电压电泳直到指示剂到底部停止电泳。将胶浸泡在考马斯亮兰溶液(购于solarbio，货号为p1305)中1h，再用脱色液脱色(购于solarbio，货号为p1305)直到可以看到清晰的蛋白条带，最终获得纯化后的e3纳米抗体，经imagej软件分析，其纯度为95％，图2为特异性抗ctla-4纳米抗体的表达纯化结果。
实施例5抗ctla-4纳米抗体与抗原的结合检测
通过下面的步骤对实施例4获得的抗ctla-4纳米抗体进行如下检测：
(1)将ctla-4、pd-1(购于义翘神州，货号为10377-h02h)、pd-l1(购于义翘神州，货号为10084-hnah)、cd28(购于义翘神州，货号为11524-hcch)、cd80(购于义翘神州，货号为10698-hcch)稀释为1μg/ml溶液，加入酶标板中，100ng/孔，4℃孵育过夜。同时设置对照。
(2)用300μl0.1％pbst洗板，洗板一次，静置3min，每孔再加入300μl5％脱脂奶粉，37℃封闭1h。
(3)用300μl0.1％pbst洗板，洗板一次，静置3min，将阳性对照anti-ctla-4mab(购于abcam，货号为ab237712)、空白对照pbs以及实验组实验组纳米抗体nbh3加入到酶标板，每孔100μl，100ng/孔，37℃孵育1h。
(4)每孔加入300μl0.1％pbst溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，再向每孔加入100μl1:5000稀释的mouseanti-hamab(购于proteintech，货号为66006-2-ig)，37℃孵育1h。
(5)每孔加入300μl0.1％pbst溶液洗板，洗板三次，每次静置3min，去掉未结合的抗体，再向每孔加入100μl1：5000稀释的hrp-goatanti-mouseigg(h l)(购于proteintech，货号为sa00001-1)，37℃孵育1h。
(6)每孔加入300μl0.1％pbst溶液洗板，洗板五次，每次静置3min，每孔100μl的tmb溶液加入到酶标板中，37℃避光孵育10min。
(7)再向酶标板中每孔加入100μl2.29％硫酸终止反应，用酶标仪在450nm和630nm处测量od值，计算od450-od630的差值即为所得的od值。
图3为抗ctla-4纳米抗体与抗原的结合能力的分析结果，结果表明e3纳米抗体能特异性地与ctla-4结合。
实施例6抗ctla-4纳米抗体热稳定性检测
应用下述方法对所获得的抗ctla-4纳米抗体的热稳定性进行检测：
(1)用nahco3包被液稀释ctla-4蛋白，以50ng/孔ctla-4蛋白偶联在酶标板中，4℃过夜，并设置相应的阴性对照。
(2)用300μl0.1％pbst洗板，洗板一次，静置3min，每孔再加入300μl5％脱脂奶粉，37℃封闭2h。
(3)将对照组为商购抗ctla-4抗体(购自于百时美施贵宝ipilimumab，货号为477202-00-9)和实验组e3纳米抗体(浓度均为500ng/ml)分别置于25℃、37℃、60℃、90℃下各0min、10min、30min、60min、120min以及180min。随后立即置于冰上。以100μl/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h。
(4)后续步骤与参照实施例5。
图4为抗ctla-4纳米抗体的热稳定性检测结果，实验结果表明e3纳米抗体具有良好的热稳定性。通常来说，一般的蛋白在60摄氏度会马上失去活性，即使在37摄氏度条件下也会很快失去活性，而e3纳米抗体在37摄氏度条件下相较于25摄氏度条件下，活性变化很小。在60摄氏度条件下虽然会丧失一部分活性，但是仍然保留一部分活性，结果表明e3纳米抗体具有良好的热稳定性。
实施例7抗ctla-4纳米抗体与人恶性黑色素瘤细胞a375细胞膜上ctla-4分子结合
(1)取对数生长期的人恶性黑色素瘤细胞a375细胞(购于北京百欧博伟生物技术有限公司，货号为bio-72958)，用0.25％胰蛋白酶(购于gibco，货号为25200-072)消化，再用含有10％fbs(购于gibco，货号为10270106)的dmem培养基(购于gibco，货号为c11995500bt)终止消化，得到单细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清后1×pbs清洗两遍。
(2)再用抗体稀释液稀释上述e3纳米抗体至50μg/ml，实验组每1×106个a375细胞分别加入100μl上述稀释的纳米抗体，阳性对照以1：100的比例稀释anti-ctla-4mab并加入到1×106个a375细胞中，同时设置阴性对照。37℃孵育1h。
(3)1000rpm离心5min，用1mlpbs溶液重悬，重复三次。实验组以1:100的比例稀释mouseanti-hisantibody(该抗体为所提供的e3纳米抗体连接上his标签)，阳性对照组加入1：100的比例稀释的mouseanti-ctla-4mab，以100μl上述抗体分别重悬细胞。37℃孵育45min。
(4)1000rpm离心5min，用1mlpbs溶液重悬，重复三次。以1：100的比例分别稀释流式抗体goatanti-mouseigg(fitc)，每组加入100μl上述稀释的流式抗体，37℃避光30min。1000rpm离心5min，用1mlpbs溶液重悬，重复三次。最后用500μl的pbs的重悬。用流式细胞分析仪(购于bd，facscalibur)检测。结果用flowjo7.6.1分析。
图5为抗ctla-4纳米抗体与a375细胞膜上ctla-4分子结合效率的结果图，结果表明，e3纳米抗体与a375细胞的ctla-4具有强的特异性结合的能力。通过这种特异性结合，所提供的e3纳米抗体可以用来治疗ctla-4过表达为特征的疾病。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
sequencelisting
<110>佛山汉腾生物科技有限公司，暨南大学
<120>抗ctla-4纳米抗体、药物组合物及其应用
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<223>抗ctla-4纳米抗体
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<223>编码抗ctla-4纳米抗体的核酸序列
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gaggaggaggaggaggtggcccaggcggcctggttgtggttttggtgtcttgggtt56
1.一种抗ctla-4纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体选自下列至少之一：
(1)具有kyiysnyc所示的cdr1、iytggsnt所示的cdr2和aatsrrwcsslekqvfgy所示的cdr3；
(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：
(a)seqidno:1所示的氨基酸序列；
(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1所述的纳米抗体的核酸序列；
任选地，所述核酸包含如下所示的核酸序列：
seqidno:2所示的核酸序列；
与seqidno:2所示的核酸序列相比，至少具有95％以上同源性的序列，优选具有98％以上同源性的序列，更优选具有99％以上同源性的序列。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸；
任选地，进一步包含调节元件，所述调节元件与所述核酸可操作地连接；
任选地，所述调节元件包括选自启动子、增强子、终止子中的至少一种。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求4所述的表达载体。
6.一种生产抗ctla-4纳米抗体的方法，其特征在于，包括培养权利要求5所述的重组细胞，以便获得所述抗ctla-4纳米抗体。
7.权利要求1或2所述的纳米抗体在制备治疗肿瘤药物中的用途；
任选地，所述肿瘤包括选自前列腺癌，恶性黑素瘤和肺癌的至少一种；
任选地，所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的纳米抗体和药学上可接受的载体。
9.一种检测ctla-4的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的纳米抗体。
10.一种car-t细胞，其特征在于，所述car-t细胞包括权利要求1或2所述的纳米抗体。
技术总结