本发明属于生物大分子领域，具体涉及一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
：多发性骨髓瘤(mm)一直以骨髓来源的浆细胞增殖失控为特征，伴有异常分泌的免疫球蛋白或游离轻链，在最常见的血液系统恶性肿瘤中居第二位，约占所有血液肿瘤的10％。在美国，每年新诊断的患者超过30000人，死亡人数超过12000人。尽管有了蛋白酶抑制剂(bortezomb)等新的靶向疗法，但人们普遍认为它是无法治愈的，因此需要在药物开发方面做出更多的努力。b细胞成熟抗原(bcma)，又称tnfrsf17或cd269，是一种仅在b细胞谱系，尤其是末端分化的b细胞中表达的特异性抗原。它通常不存在于初始和记忆b细胞，并在多发性骨髓瘤细胞上高度表达。bcma与其配体baff和april相互作用时，可通过nf-kb和jnk通路的信号转导，诱导b细胞成熟、增殖和存活。作为一种i型跨膜蛋白，在体液免疫中起着重要的作用，是抗体衍生免疫治疗的理想靶点。然而现有技术中的抗bcma的抗体存在内化作用弱以及与293t-hubcma细胞结合弱等缺陷，因此亟需一种抗bcma的抗体其既具有足以成药的亲和力又具有优异的内化作用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的已有抗bcma的抗体内化作用弱以及与293t-hubcma细胞结合弱等缺陷，提供一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用。为解决以上技术问题，本发明提供一种bcma结合蛋白，其包括重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，所述的轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述的lcdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示或为其变体，所述的lcdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno:2所示或为其变体，所述的lcdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno:3所示或为其变体；所述的重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述的hcdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno:4所示或为其变体，所述的hcdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno:5所示或为其变体，所述的hcdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno:6所示或为其变体。其中，所述变体为分别在seqidno:1～6所示的氨基酸序列的基础上发生3、2或者1个突变后获得的氨基酸序列。在类似“具有3、2或1个氨基酸突变”中“氨基酸突变”是指相较于原氨基酸序列而言，变体的序列存在氨基酸的突变，包括在原氨基酸序列的基础上发生氨基酸的插入、缺失或替换。示例性的解释是对cdr的突变可以包含3个、2个或1个氨基酸的突变，这些cdr之间可以任选地选择相同或不同数目的氨基酸残基进行突变，例如可以是对cdr1进行1个氨基酸的突变，对cdr2和cdr3不进行氨基酸突变。本发明中所述的突变可以包括目前如本领域技术人员公知的突变，例如在抗体的生产或者应用过程中，可能会对抗体进行的一些突变，例如对可能存在的，特别是cdr区的转录后修饰(potentialpost-translationalmodifications，ptms)的位点进行突变，包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparaginedeamidation，位点(ng、ns和/或nh等)、天冬氨酸异构(dg、dp)敏感位点、n糖基化(n-{p}s/t)敏感位点及氧化敏感位点等相关突变。较佳地，本发明中所述的bcma结合蛋白还包括抗bcma抗体的框架区，所述框架区包括重链框架区(hfwr)和/或轻链框架区(lfwr)；所述的重链框架区优选人源重链框架区，所述的人源重链框架区hfwr1～4优选分别包含分别如序列表中seqidno:13～16所示的氨基酸序列，或者分别为seqidno:13～16所示的氨基酸序列的变体；所述的轻链框架区优选人源轻链框架区，所述的人源轻链框架区lfwr1～4优选分别包含分别如序列表中seqidno:17～20所示的氨基酸序列，或者分别为seqidno:17～20所示的氨基酸序列的变体。在本发明一较佳实施例中，所述的重链可变区包括如序列表中seqidno:11所示的氨基酸序列或其变体，和/或，所述的轻链可变区包括如序列表中seqidno:12所示的氨基酸序列或其变体。所述的变体为基于如seqidno:11或者seqidno:12所示的氨基酸序列发生一个或者多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述vh和/或vl的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述bcma结合蛋白与bcma的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性，更优选为至少95％序列同一性，最优选为至少99％序列同一性。在本发明一更佳的实施例中，所述的重链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno:11所示，且所述的轻链可变区的氨基酸序列如序列表中seqidno:12所示。在本申请中，上述所列cdr的氨基酸序列均是按照kabat定义规则所示出的(本发明的权利要求中也是按照kabat定义规则所示出的序列)。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的cdr，例如基于序列可变性的kabat定义规则(参见，kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的chothia定义规则(参见jmolbiol273:927-48,1997)。在本申请中，还可以使用包含了kabat定义和chothia定义的combined定义规则确定可变结构域序列中的氨基酸残基。其中combined定义规则即是将kabat定义和chothia定义的范围相结合，基于此取了一个更大的范围。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“cdr”及“互补决定区”应了解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明的权利要求中请求保护的范围是基于kabat定义规则所示出的序列，但是根据其他cdr的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。本发明中所述的bcma结合蛋白，较佳地还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区选自higg1、higg2、higg3或higg4或其突变，所述轻链恒定区选自κ链或者λ链或其突变；其中所述κ链或者λ链优选人源抗体轻链κ链或者λ链。在本发明一较佳实施例中，所述的重链恒定区为higg1，且所述轻链恒定区为人源抗体的轻链κ链。本发明中所述的bcma结合蛋白可为全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制，包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等，主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。在本发明一具体实施例中，所述的bcma结合蛋白为全长抗体，所述全长抗体包括重链和轻链，所述重链包括如seqidno:9所示的氨基酸序列，所述轻链包括如seqidno:10所示的氨基酸序列。本发明还提供一种分离的核酸，其编码如上所述的bcma结合蛋白。本发明还提供一种包含如上所述的分离的核酸的表达载体。本发明还提供一种宿主细胞，其包含如上所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述宿主细胞的制备方法可为本领域常规的制备方法，例如为：将上述表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地，所述宿主细胞为e.colitg1或bl21细胞(表达单链抗体或fab抗体)，或者cho-k1细胞(表达全长igg抗体)。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。本发明还提供一种bcma结合蛋白的制备方法，其包含培养如上所述的宿主细胞，从培养物中获得所述bcma结合蛋白。本发明还提供一种免疫偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如上所述的bcma结合蛋白。本发明还提供一种药物组合物，其包含如上所述的bcma结合蛋白或如上所述的免疫偶联物。本发明还提供如上所述的bcma结合蛋白、如上所述的免疫偶联物和如上所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用；优选地，所述癌症为骨髓瘤、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。此外，为解决上述技术问题，本发明还提供一种药盒组合，其包括药盒a和药盒b；所述药盒a包含本发明所述的bcma结合蛋白、所述的宿主细胞、所述的免疫偶联物和所述的药物组合物；所述药盒b包含其它靶向的或相同靶向的抗体、双特异性抗体、基因修饰的细胞或药物组合物。所述药盒a和药盒b的使用不分先后顺序，或先使用药盒a再使用药盒b，或先使用药盒b再使用药盒a。本发明所述的bcma结合蛋白、所述的免疫偶联物和所述的药物组合物或所述的药盒组合可施用于病人，用于治疗相关肿瘤。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或j.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。如本文使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根据上下文的理解，也包括“由……组成”的情况。本发明所述的术语“抗体”包括免疫球蛋白(ig)，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1、igg2、igg3和igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中第每类ig都可以有κ链或λ链。在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源的κ、λ链或其变体。在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源的igg1、2、3、4或其变体。抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(v区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(c区)。每条轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)由3个互补决定区(cdr)和4个框架区(fwr)组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fwr1、cdr1、fwr2、cdr2、fwr3、cdr3、fwr4。轻链的3个cdr指lcdr1、lcdr2和lcdr3；重链的3个cdr指hcdr1、hcdr2和hcdr3。术语“突变”包括氨基酸或核苷酸的取代、添加和/或缺失，“氨基酸的取代”是其中氨基酸残基以另一种氨基酸残基置换和以具有相似侧链的氨基酸残基置换。本文使用的术语“载体”或“表达载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-dna共沉淀、deae-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。所述的免疫偶联物的制备方法可为本领域常规，较佳地采用doronina，2006，bioconjugatechem.17,114-124所记载的制备方法。优选地，所述的制备方法产生具有最低限度的低偶联级分(lcf)小于10％的抗体药物偶联物。所述的免疫偶联物能够以本领域所知的任何物理形态而存在，较佳地为澄清溶液。如本发明所用，术语“癌”、“癌症”、“肿瘤”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明免疫筛选出1种与hbcma具有良好特异性亲合力的全人源抗体，其在肿瘤细胞系上比对照抗体结合更好。抗体具有内化效应且优于对照，因此可以作为adc候选物进一步开发。经elisa试验，抗体都有部分阻断功能，在作为mabs或car-t治疗时可能获得额外的疗效。附图说明图1为重组抗体与表达bcma的细胞系结合强度的测试结果图；a.重组抗体与293t-hubcma细胞系的结合b.重组抗体与293t-cynobcma细胞系的结合，c.重组抗体与nci-h929细胞系的结合。图2为bcma重组抗体阻断baff与bcma结合的测试。图3为重组抗体内化至bcma细胞系的测定。a.重组抗体内化至293t-hubcma细胞系，b.重组抗体内化至nci-h929细胞系。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。以下实施例中所使用的阳性对照(亦称对照抗体)为gsk临床ii期adc药物gsk2857916(即美国专利申请us9273141b2中的ca8j6m0人源化抗体)。对照抗体的各功能区氨基酸序列如下表所示(依据kabat编号规则)：重链氨基酸序列：qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfsnywmhwvrqapgqglewmgatyrghsdtyynqkfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycargaiydgydvldnwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:7)轻链氨基酸序列：diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnylnwyqqkpgkapklliyytsnlhsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyrklpwtfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:8)实施例1抗原制备、小鼠免疫及杂交瘤制备1.抗原制备(acrocat.no:bca-c52h7)供应商名称ncbiidcat#acrobiohubcma-ecd-fcq02223bca-h522yacrobiobcma-hisbca-c52h7acrobiocynobcma-fcg7npn8bca-c5253acrobiocynobcma-hisbca-c5225acrobiobaff-his-avitagq9y275baf-h82q22.免疫从用bcma-ecd-fc蛋白免疫的h2l2小鼠(和铂医药，ep2379727b1)产生的杂交瘤中鉴定出全人源抗bcma抗体。第一次注射50μg上述融合蛋白，以cfa为免疫佐剂进行免疫，然后在第15、29、43、57、71和86天以25μg蛋白和ribi佐剂(sigma-aldrich；sigmaadjuvantsystem；catalognumbers6322)再加强7次。在第50、78和107天采血测试，小鼠血清的结合亲和力通过facs使用表达人bcma的hek293t细胞或肿瘤细胞系(hek293t-bcma，购买自kyinno或capan-2细胞，购自atcc)进行检测，同时平行使用bcma-his蛋白进行elisa检测。根据免疫小鼠血清效价的检测结果，挑选小鼠进行杂交瘤融合，融合前3天，即第132天，以25μg蛋白和ribi佐剂进行最后一次加强。3.融合杂交瘤用常规方法产生和克隆，即通过电融合法，提取小鼠脾脏和淋巴结，研碎提取单细胞，裂红并洗涤后与sp2/0细胞混合。细胞混悬液放入电融合槽电击融合，静置后换20％fbs的ht培养基，之后更换hat培养基培养。将收集的脾脏b细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0按2:1(细胞数量比)的比例混合，混合后的细胞用电融合仪(btxecm2001)进行细胞融合，将融合后的细胞铺在96孔细胞培养板，在二氧化碳培养箱中37℃培养10天后进行杂交瘤的初筛。过夜复原后，将融合细胞以有限稀释法接种到96孔板中，并用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷进行筛选。通过elisa试验和流式细胞术检测杂交瘤培养上清液中抗bcma抗体的存在。实施例2抗体筛选及测序1.elisa筛选在96孔板(corning9018)中加入在pbs中1μg/ml的新制备的hbcmaecd-fc蛋白或hfc，在4℃下涂覆过夜，然后弃去并用pbst清洗3次。在室温下用5％的牛奶封闭平板2小时，并用pbst清洗3次。加入100μl/孔的杂交瘤上清液并在室温下孵育1小时，然后用pbst清洗3次。加入100μl/孔的第二抗体并在室温下孵育1小时，随后清洗。平板中加入100μl/孔的tmb并在室温下孵育15min，然后停止并读取。2.facs筛选对于流式细胞术筛选，v用typle(cat#12605010，gibco)在37℃消化粘附细胞3分钟后，用含10％fbs的完全培养基终止消化。用facs缓冲液(cat#14190250，gibco)清洗细胞并计数，然后稀释至3～5×106/ml密度。将细胞按100μl/孔添加到96孔板(corning3894)。阻断3～4分钟后，加入100μl/孔杂交瘤上清液，在4℃孵育1小时。洗涤后加入二抗，在4℃孵育一个小时。然后洗涤细胞并进行facs分析。3.亚克隆及筛选用有限稀释法用elisa法进行阻断试验。阻断筛选：对于阻断酶联免疫吸附试验(elisa)，用在pbs中2μg/ml的hbcma-ecd-fc涂覆平板过夜，洗涤、封闭和孵育与上述步骤相同。然后在平板中加入6ng/ml的生物素化的baff，在室温下孵育1小时。第二抗体的孵育和检测的后续步骤与以上相同。4.测序挑选阳性单克隆，提取总rna。rt-pcr产生cdna，随后重链和轻链分别用pcr扩增(rt-pcr来自赛默飞的super第一链合成系统，cat#：11904018，具体操作见产品说明书。pcr使用的是neb的高保真dna聚合酶，cat#：m0530l，具体操作见产品说明书)。然后将pcr产物构建到t载体上，并进行测序(北京擎科生物科技有限公司上海分公司)，同时进行抗体亚型测定。5.抗体序列信息测序结果如下所示(根据kabat编号规则)：轻链可变区中的lcdr1～3的氨基酸序列分别如序列表中seqidno:1～3所示；重链可变区中的hcdr1～3的氨基酸序列分别如序列表中seqidno:4～6所示。具体氨基酸序列见下表：功能区氨基酸序列lcdr1rasqsisswlalcdr2kassleslcdr3qqynsylfthcdr1sygmyhcdr2aiwndgsnnyyadsvkghcdr3drlpmaslryfdwlgvmda实施例3.抗体生产、纯化和验证1.重组抗体生产和纯化在得到编码抗体分子的轻、重链可变结构域序列以后，可以采用常规的重组dna技术，将轻、重链可变结构域序列和相应的人的抗体轻、重链恒定结构域序列进行融合表达，得到重组抗体分子。在本实施例中，抗体重链可变结构域序列(vh)通过基因合成并克隆到编码人igg1抗体重链恒定结构域序列的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生igg1抗体的全长重链。抗体轻链可变结构域序列(vl)通过基因合成并克隆到编码人抗体igκ轻链恒定结构域序列的哺乳动物细胞表达质粒载体中，以编码产生抗体的全长轻链。在本实施例中，由于从免疫的harbourh2l2小鼠得到的单克隆抗体分子可变结构域的序列是人源抗体序列，因而本实施例也得到全人源的抗bcma重组igg1抗体。例如，本发明人源化抗体的重链序列为：qvqlvesgggvvqpgrslrlscaatgftfssygmywvrqapgkglewvaaiwndgsnnyyadsvkgrftisrddskntlnlqmnslraedtamyycardrlpmaslryfdwlgvmdawgqgtsvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:9)本发明人源化抗体轻链序列为：diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqtddfatyycqqynsylftfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:10)本发明人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列为：qvqlvesgggvvqpgrslrlscaatgftfssygmywvrqapgkglewvaaiwndgsnnyyadsvkgrftisrddskntlnlqmnslraedtamyycardrlpmaslryfdwlgvmdawgqgtsvtvss(seqidno:11)本发明人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列为：diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliykasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqtddfatyycqqynsylftfgqgtkleik(seqidno:12)将编码抗体重链的质粒(genscriptus)和编码抗体轻链的质粒(genscriptus)同时转染哺乳动物宿主细胞(如人胚肾细胞hek293)，利用常规的重组蛋白表达和纯化技术，可以得到具有轻重链正确配对组装的纯化的重组抗体。具体来说，将hek293细胞在freestyletmf17expressionmedium培养基(thermo，cat#：a1383504)中扩充培养。瞬时转染开始之前，调节细胞浓度至6～8×105细胞/ml，于37℃8％co2摇床中培养24小时，细胞浓度在1.2×106细胞/ml。准备30ml培养的细胞。将上述编码抗体重链的质粒和编码抗体轻链的质粒以2:3(质量比)的比例混合共计30μg质粒溶解于1.5mlopti-mem减血清培养基(thermo，cat#：31985088)，并用0.22μm滤膜过滤除菌。再取1.5mlopti-mem溶入1mg/mlpei(polysciences，cat#：23966-2)120μl，静置5分钟。把pei缓慢加入质粒中，室温孵育10分钟，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒pei混合溶液，于37℃8％co2摇床中培养5天。5天后观测细胞活率。收集培养物，以3300g转速离心10分钟后取上清；然后将上清高速离心去除杂质。用pbs(ph7.4)平衡含有mabselecttm(gehealthcarelifescience，cat#：71-5020-91ae)的重力柱(bio-rad，cat#：7311550)，2-5倍柱体积冲洗。将上清样品过柱；用5-10倍柱体积的pbs冲洗柱子，再用ph3.5的0.1m甘氨酸洗脱目的蛋白，后用ph8.0的tris-hcl调节至中性，最后用超滤管(millipore，cat#：ufc901024)浓缩换液至pbs缓冲液，得到纯化的抗体溶液。最后用nanodrop(thermoscientifictmnanodroptmone)测定浓度，分装、存储备用。取上述纯化的样品适量分别上样至分析型sec柱tskgelg3000swxl(hplc仪器型号:安捷伦1260infinityii)，检测样品的纯度，保证均一样品的纯度在95％以上。该方法流动相为1×pbs，ph7.4(生工，cat#：e607016)，室温，流速1.0ml/min，样品浓度1mg/ml，进样体积20μl，检测波长280nm。采集后用chemstation软件对色谱图进行积分并计算相关数据。2.重组抗体验证facs鉴定：重组抗体依次稀释至9种不同浓度，并在293t-hubcma、293t-cynobcma和nci-h929细胞系上进行1小时孵育，然后第二抗体进行1小时孵育后检测，验证结果如图1所示。在图1a中，pr000892结合293t-hubcma细胞(购自康源博创生物科技(北京)有限公司；货号为：cat#kc-0233)有显著结合，且亲和力要优于对照抗体；图1b中，pr000892结合293t-cynobcma(购自康源博创生物科技(北京)有限公司；货号为：cat#kc-0979)的亲和力与对照抗体相当；在图1c中，pr000892与肿瘤细胞系nci-h929的亲和力与对照抗体相当。阻断：重组抗体被连续稀释至7种不同浓度，在预先涂覆2μg/ml的hubcma-ecd-fc的corning9018板上检测，后续步骤与以上相同。如图2所示，pr000892可以部分阻断baff与bcma在体外条件下的结合。内化：计数293t-hubcma细胞或nci-h929细胞，接种5000或10000个/孔至96孔黑壁透明底的平板(pe6005225)。重组抗体连续稀释至9种不同浓度并加入，最终浓度从100nm开始。加入a-hfc-mmaf使最终浓度为1μg/ml。平板在37℃、5％co2条件下孵育72小时，然后用ctg试剂盒裂解，并用enspire检测发光。如图3a中所示，在293t-hubcma细胞系中，pr000892的内化作用与对照抗体相当；如图3b中所示，pr000892在nci-h929细胞系中的内化作用显著优于对照抗体。另外：经验证，本发明抗体和对照抗体与bcma抗原(cat.bca-h522y)的亲和力相当。sequencelisting<110>和铂医药(苏州)有限公司<120>一种bcma结合蛋白及其制备方法和应用<130>p19012584c<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>11<212>prt<213>musmusculus<400>1argalaserglnserilesersertrpleuala1510<210>2<211>7<212>prt<213>musmusculus<400>2lysalaserserleugluser15<210>3<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>3glnglntyrasnsertyrleuphethr15<210>4<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>4sertyrglymettyr15<210>5<211>17<212>prt<213>musmusculus<400>5alailetrpasnaspglyserasnasntyrtyralaaspservallys151015gly<210>6<211>19<212>prt<213>musmusculus<400>6aspargleuprometalaserleuargtyrpheasptrpleuglyval151015metaspala<210>7<211>451<212>prt<213>artificialsequence<220><223>对照抗体重链氨基酸序列<400>7glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglyglythrpheserasntyr202530trpmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyalathrtyrargglyhisseraspthrtyrtyrasnglnlysphe505560lysglyargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglyalailetyraspglytyraspvalleuaspasntrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproser115120125valpheproleualaproserserlysserthrserglyglythrala130135140alaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrval145150155160sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala165170175valleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrval180185190proserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhis195200205lysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys210215220asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleugly225230235240glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet245250255ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis260265270gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval275280285hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr290295300argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly305310315320lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile325330335glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval340345350tyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalser355360365leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu370375380trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro385390395400valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval405410415asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet420425430hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser435440445proglylys450<210>8<211>214<212>prt<213>artificialsequence<220><223>对照抗体轻链氨基酸序列<400>8aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysseralaserglnaspileserasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrtyrthrserasnleuhisserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrarglysleuprotrp859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser165170175serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr180185190alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser195200205pheasnargglyglucys210<210>9<211>458<212>prt<213>artificialsequence<220><223>本发明人源化抗体的重链氨基酸序列<400>9glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalathrglyphethrphesersertyr202530glymettyrtrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaalailetrpasnaspglyserasnasntyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserar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技术特征：1.一种bcma结合蛋白，其特征在于，其包括重链可变区和轻链可变区，所述的轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述的lcdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示，所述的lcdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno:2所示，所述的lcdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno:3所示；
所述的重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述的hcdr1的氨基酸序列如序列表中seqidno:4所示，所述的hcdr2的氨基酸序列如序列表中seqidno:5所示，所述的hcdr3的氨基酸序列如序列表中seqidno:6所示。
2.如权利要求1所述的bcma结合蛋白，其特征在于，所述的bcma结合蛋白还包括抗bcma抗体的框架区，所述框架区包括重链框架区和/或轻链框架区；
所述的重链框架区优选人源重链框架区，所述的人源重链框架区hfwr1～4包含分别如序列表中seqidno:13～16所示的氨基酸序列；
所述的轻链框架区优选人源轻链框架区，所述的人源轻链框架区lfwr1～4包含分别如序列表中seqidno:17～20所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的bcma结合蛋白，其特征在于，所述的重链可变区包括如序列表中seqidno:11所示的氨基酸序列，且所述的轻链可变区包括如序列表中seqidno:12所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1～3任一项所述的bcma结合蛋白，其特征在于，还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；较佳地，所述重链恒定区选自higg1、higg2、higg3或higg4或其突变，所述轻链恒定区选自κ链或者λ链或其突变。
5.如权利要求1～4任一项所述的bcma结合蛋白，其特征在于，其为全长抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
6.如权利要求5所述的bcma结合蛋白，其特征在于，所述全长抗体包括重链和轻链，所述重链包括如seqidno:9所示的氨基酸序列，所述轻链包括如seqidno:10所示的氨基酸序列。
7.一种分离的核酸，其编码如权利要求1～6任一项所述的bcma结合蛋白。
8.一种包含如权利要求7所述的分离的核酸的表达载体。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
10.一种bcma结合蛋白的制备方法，其包含培养如权利要求9所述的宿主细胞，从培养物中获得所述bcma结合蛋白。
11.一种药物组合物，其包含如权利要求1～6任一项所述的bcma结合蛋白。
12.如权利要求1～6任一项所述的bcma结合蛋白和如权利要求11所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用；优选地，所述癌症为骨髓瘤、结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌。
技术总结本发明公开了一种BCMA结合蛋白及其制备方法和应用。所述BCMA结合蛋白包括重链可变区和可变区，所述的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。所述LCDR1、LCDR2和LCDR3以及所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列详见本发明。本发明的BCMA结合蛋白具有良好特异性亲合力，其在肿瘤细胞系上比对照抗体结合更好，且其内化效应且优于对照，因此可以作为ADC候选物进一步开发。经ELISA试验，抗体都有部分阻断功能，在作为mAbs或CAR‑T治疗时可能获得额外的疗效。
技术研发人员：王正;何云;戎一平
受保护的技术使用者：和铂医药(苏州)有限公司
技术研发日：2020.01.23
技术公布日：2020.06.05
