本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种小细胞肺癌检测试剂盒。
背景技术：
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是致死率最高的肿瘤。2018全球癌症统计，有大约1810万新增癌症病例和960万癌症患者死亡，其中肺癌占所有新发癌症病例的11.6%，占所有癌症总死亡人数的18.4%。从病理分型上，肺癌有可分为小细胞肺癌（smallcelllungcancer，sclc）和非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，nsclc）。其中小细胞肺癌（smallcelllungcancer，sclc）是一种神经内分泌肿瘤，占全部肺恶性肿瘤的15%~20%，其恶性程度高、侵袭性强、易复发和转移的特点限制了患者的长期生存，是一种预后极差的恶性肿瘤。临床中大部分肺癌被确诊时已处于中晚期，错过最佳手术时间，其5年生存率不足20%，所以早期诊断对控制肺癌有非常重要的意义。随着对分子生物学、免疫学及肺癌发病机制的研究进展，血清肿瘤标志物检测以其操作简便、重复性好、创伤小的优点，已被广泛应用于肺癌的早期筛查诊断、疗效检测和预后判断。目前，临床中最常采用的肺癌血清肿瘤标志物包括神经特异性烯醇化酶(nse)、癌胚抗原(cea)、细胞角蛋白19片段(cyfｒa211)、糖类抗原125(ca125)、癌相关糖抗原(ca199)等。
神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase，nse)是烯醇化酶的一种同工酶。烯醇化酶同工酶根据α,β,γ三个亚基的不同，可分为αα，ββ，γγ，αβ和αγ五种二聚体同工酶。α亚基主要存在于肝，肾等组织称其为非神经系统的烯醇化酶（nne）；β亚基主要存在于骨骼肌和心肌称其为肌肉特异性的烯醇化酶（mse）；γ亚基主要存在于神经组织。γγ、αγ组成的同工酶为神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶。nse广泛分布于人类及各种动物的成熟神经元、周围神经的神经内分泌细胞和一些感觉细胞中，正常人脑组织中含量最高，起源于神经内分泌细胞的肿瘤组织也有异常表达。常见于神经母细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌等。因此nse成为肺癌分型中小细胞肺癌（sclc）的肿瘤标志物。
现有技术中也有一些专利中公开了nse抗体，例如：cn105132380a、cn103087193a、cn102435748a，但经过发明人研究后发现，这些抗体在灵敏度上还有待提高。
技术实现要素：
基于上述发现，本发明的首要目的在于提供一种新的nse抗体，具有更高的灵敏度，以解决现有nse抗体灵敏度低的问题。
本发明提供以下技术方案：
一种抗nse抗体，由重链和轻链组成，重链和轻链分别包括可变区和恒定区，其中重链可变区选自seqidno:13和14，轻链可变区选自seqidno:15和16。
本发明抗体重轻链可变区共有6个互补决定区。所述nse抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11。
所述nse抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12。
本发明所述nse抗体的重链和轻链进一步包含恒定区，所述抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述抗体重链恒定区进一步包含鼠源igg1、igg2a、igg2b或igg3或igm或igm序列。
本发明的目的在于提供两种新的nse抗体，所述抗体特异性识别nse的不同表位，用于检测样本中nse蛋白存在及含量的抗体。
本发明的另一目的在于提供一种测定nse的方法，所述方法使用两种以上不同的nse抗体，所述的抗体特异性识别nse的不同表位，所述表位分别位于nse蛋白的89-97aa和285-298aa。所述方法为双抗体夹心elisa检测法。
本发明的又一目的在于提供一种更灵敏的nse抗体试剂盒，其包含上述识别不同nse表位的两种抗体，用于小细胞肺癌的早期筛查诊断、疗效检测和预后判断。
本发明的有益效果主要体现在：采用线性表位及载体蛋白作为抗原制备单克隆抗体的策略，方便快捷地获得新的识别不同表位的nse单克隆抗体；由本发明抗体建立的nse检测试剂盒具有更高的灵敏性，为小细胞肺癌的早期诊断提供帮助。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为单克隆抗体亚型鉴定。
图2为两种抗体使用western-blotting检测nse在a549细胞及hela细胞中的表达。
图3为人nse双抗体夹心elisa试剂盒灵敏度检测图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.制备nse多肽的设计、合成和偶联
利用蛋白质的三维结构预测软件预测nse的线性表位，最终选择kldnlmlel（89-97aa）rdypvvsiedpfdq（285-298aa）这2个多肽序列作为抗原序列。为便于与载体蛋白偶联，合成多肽在c端加入一个半胱氨酸，即：kldnlmlelc、rdypvvsiedpfdqc。多肽由南京金斯瑞生物科技公司合成。化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产牛很弱的免疫反应，因此需要进一步通过偶联载体蛋白的方法增强多肽的免疫原性。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激t辅助细胞，进而诱导b细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白（keyholelimpethemacyanin,klh)，牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa),卵清蛋白(ovalbumin,ova)。klh具有更高的抗原性，因此本次选用klh作为多肽交联载体。采用双功能偶联剂戊二醛进行偶联，将上述nse多肽蛋白与klh(购自sigma)溶解于pbs后，在偶联瓶中混匀，向混合液中缓慢的滴加0.25%戊二醛溶液，与4℃反应4h后，将反应液置于4摄氏度透析pbs,最终获得化学偶联的nse-klh，将含kldnlmlel多肽的抗原命名为nse-e1,将含rdypvvsiedpfdq多肽的抗原命名为nse-e2。
实施例2.抗nse抗体制备及纯化
初次免疫时，将实施例1制备的抗原nse-e1和nse-e2(浓度为1µg/µl)分别与与等体积完全福氏佐剂（cfa）充分混匀形成油包水状，按200µl/只腹腔注射balb/c小鼠。3周后进行第一次加强，将抗原nse-e1和nse-e2抗原(浓度为1µg/µl)分别与不完全福氏佐剂（ifa）等体积混匀乳化，按200µl/只小鼠背部多点注射。以后每隔2周加强免疫一次，每次免疫后第7天取尾血，用elisa法检测抗体效价。当抗体效价达到10-4左右时，将nse-e1和nse-e2抗原(浓度为1µg/µl)与不完全福氏佐剂（ifa）等体积混匀乳化，按200µl/只小鼠背部多点注射加强免疫一次。于第四天取脾，进行细胞融合。取免疫后的balb/c小鼠脾细胞，将其与骨髓瘤sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞加hat铺板，3天之后半换液,一周之后全换液,换hat培养基培养。12天后，取细胞上清，高通量elisa法检测上清中与nse蛋白表现出阳性反应的原代培养物。再将此孔内的杂交瘤细胞进行稀释进行亚克隆，同样以elisa方法进行筛选，最终nse-e1抗原组获得阳性杂交瘤细胞株e1-7e2,nse-e2抗原组获得阳性杂交瘤细胞株e2-4f6。将杂交瘤细胞株e1-7e2、e2-4f6分别扩大培养，收取此杂交瘤细胞，用pbs重悬，配置成107/ml的杂交瘤细胞悬液。用弗氏不完全佐剂作为诱导剂。预先向8周左右的balb/c腹腔注射弗氏不完全佐剂，3天后，向预先处理过的balb/c小鼠腹腔中注射500ul浓度为107/ml的杂交瘤细胞悬液。待小鼠腹部肿胀隆起，采集腹水纯化抗体。经过饱和硫酸铵（ph=7.8）沉淀获得粗提的nse单抗，再经过proteing柱层析获得纯度较高的nse抗体e1-7e2、e2-4f6。
实施例3.抗nse抗体亚型鉴定
采用elisa法鉴定实施例2得到的抗nse单克隆抗体的亚型（试剂盒购自proteintech）。加样：试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠igg1、igg2a、igg2b、igg3、iga、igm、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例2中纯化的抗nse抗体样品e1-7e2、e2-4f6分别加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。孵育酶标抗体：将1x羊抗鼠iga igm igg-hrp加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。洗涤：扣去孔中液体加入1xpbst洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。显色：加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。终止：加入100μl终止液，终止显色反应。读值：通过酶标仪检测450nm处的od值，结果如图1所示，我们得到的抗nse单克隆抗体e1-7e2、e2-4f6的重链亚型均为igg1，轻链均为kappa。
实施例4.western-blotting检测抗体与nse蛋白结合情况
采用western-blotting（wb）法对实施例2制备的抗nse抗体e1-7e2、e2-4f6进行检测分析。将人肺癌细胞a549和宫颈癌细胞hela复苏后传代培养，其中a549细胞中表达nse，作为阳性实验组，hela细胞不表达nse，作为阴性对照组。样品制备：将a549、hela细胞培养24h后消化收取细胞，1000rpm离心3分钟。加入pbs洗一次，离心弃上清。向细胞沉淀中100ulpbs重悬细胞，再加入等量的4xsds裂解液，混匀。沸水煮样10min，12000rpm离心后10min后获得wb样品。sds-page电泳：配制10%分离胶。在电泳槽中灌入tris-甘氨酸电泳缓冲液，按20µl/孔上样。电泳时，浓缩胶上所加电压为80v
，当染料前沿进入分离胶后电压改为120v。半干转膜法：按照滤纸、纤维素膜、凝胶、滤纸的顺序将其叠加后，赶出气泡。打开转模仪，设置电压18v，时间1h。将wb样品中的蛋白转移到pvdf膜上。封闭：用5%的脱脂牛奶室温孵育1h，进行封闭。孵育一抗：分别将抗nse抗体e1-7e2、e2-4f6作为一抗过夜进行孵育。洗涤：加入tbst洗膜液洗涤3次，每次置于40rpm摇床，洗涤5min。孵育二抗：加入hrp缀合的羊抗鼠二抗进行孵育，室温孵育1h。洗涤：以同样的方法洗涤3次，洗去非特异性结合的抗体。显影：加入显色液，放入显影仪中成像。结果如图2所示，抗nse抗体e1-7e2、e2-4f6均能检测出a549细胞中的nse蛋白，而hela细胞中未检测nse蛋白。说明抗nse抗体e1-7e2、e2-4f6能够特异性结合nse蛋白。
实施例5.利用nse检测双抗体夹心elisa试剂盒灵敏度
用实施例2制备的nse抗体，制备双抗体夹心elisa试剂盒，利用nse检测双抗体夹心elisa试剂盒灵敏度。抗体包被：将抗nse抗体e1-7e2作为包被抗体，用包被液稀释至0.5μg/ml，100μl/孔，4℃过夜孵育，将其固定于酶标板上。洗涤：去上清，每孔中加入200μlpbst洗液，静置2min，扣去洗液，重复洗涤3次，每次洗涤尽可能拍干酶标板。封闭：选用2%酪蛋白-水作为封闭液，每孔中加入100μl，室温封闭1h。洗涤：去上清，每孔中加入200μlpbst洗液，静置2min，扣去洗液，重复洗涤3次，每次洗涤尽可能拍干酶标板。孵育抗原：将nse抗原（购自北京博奥森生物技术有限公司）按照800ng/ml，200ng/ml，50ng/ml，12.5ng/ml，3.125ng/ml,0.781ng/ml，0.195ng/ml,0.0488ng/ml的梯度进行稀释。将稀释后的抗原依次加入酶标板中，每孔100μl，37℃孵育30min。洗涤：去上清，每孔中加入200μlpbst洗液，静置2min，扣去洗液，重复洗涤3次，每次洗涤尽可能拍干酶标板。孵育酶标抗体：将辣根过氧化物酶（hrp）标记的抗nse抗体e2-4f6，即e2-4f6-hrp作为检测抗体，将抗体稀释至0.5μg/ml，每孔中加入100μl，室温孵育1h。洗涤：去上清，每孔中加入200μlpbst洗液，静置2min，扣去洗液，重复洗涤3次，每次洗涤尽可能拍干酶标板。显色：每孔中加入100μltmb，室温避光孵育15-30min。终止：每孔中加入50μl终止液，终止显色反应。读值：将酶标板放入酶标仪中，检测450nm波长处的吸光值。最终得到的数据为图3所示，可检测范围为48.8pg/ml-50ng/ml。而根据现有技术例如cn105132380a中灵敏度结果所示，判断其检测到的最低浓度为240pg/ml。因此利用本发明所述的nse抗体制备的双夹心elisa检测试剂盒，其灵敏度明显高于现有技术中的试剂盒。
实施例6.单克隆抗体序列确定
细胞制备：将杂交瘤细胞株e1-7e2、e2-4f6培养至总数量107个细胞，1000rpm离心5min收集细胞。rna提取：向细胞沉淀中加入trnzol-a 裂解，室温静止15min。每mltrnzol-a 加入200μl氯仿，漩涡振荡15秒，放置3分钟。13000rpm4°c离心10分钟，trizol-a 细胞溶液分为三层：上层无色水相、中层和下层黄色有机相，将溶有rna的水相转移至离心管中，向水相中加入等体积异丙醇，混匀，室温静置25分钟。13000rpm4°c离心10分钟，弃去废液得到沉于底部的rna沉淀。用75%乙醇洗涤rna沉淀两次后，用pedc水溶解rna，-80℃保存。反转录：用反转录试剂盒smarterrace合成第一链cdna，以第一链cdna为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区dna序列。扩增：根据实施例3的亚型鉴定结果，获取igg1、igg2b亚型重链，kappa轻链恒定区序列，设计特异性的巢式pcr引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规pcr方法扩增目的基因。测序：将扩增产物测序后，得到杂交瘤克隆e1-7e2分泌的抗nse抗体e1-7e2的重链可变区序列seqidno：13和轻链可变区序列seqidno：15；该抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11。杂交瘤克隆e2-4f6分泌的抗nse抗体e2-4f6的重链可变区序列seqidno：14和轻链可变区序列seqidno：16；该抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12。
序列表
<110>北京瀚梅生物科技有限公司
<120>小细胞肺癌检测试剂盒
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859095
argpheglyglyglythrlysleugluilethr
100105
1.一种小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：包含与nse特异性结合的抗体，所述抗体为如下任意一个：
a）抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11；
b）抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12。
2.一种小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：包含与nse特异性结合的抗体，所述抗体为如下任意一个：
a）抗体的重链可变区序列如seqidno:13所示，和轻链可变区序列如seqidno:15所示；
b）抗体的重链可变区序列如seqidno:14所示，和轻链可变区序列如seqidno:16所示。
3.一种小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒是双抗体夹心elisa试剂盒，包含与nse特异性结合的两个不同抗体，所述两个不同抗体序列分别如下：
a）抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11；
b）抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12。
4.一种小细胞肺癌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒是双抗体夹心elisa试剂盒，包含与nse特异性结合的两个不同抗体，所述两个不同抗体序列分别如下：
a）抗体的重链可变区序列如seqidno:13所示，和轻链可变区序列如seqidno:15所示；
b）抗体的重链可变区序列如seqidno:14所示，和轻链可变区序列如seqidno:16所示。
5.一种特异性结合nse的抗体，其特征在于：其为以下任意一个：
a）抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11；
b）抗体的重链可变区3个cdr序列分别为seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6；轻链可变区3个cdr序列分别为seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12；
c）抗体的重链可变区序列如seqidno:13所示，和轻链可变区序列如seqidno:15所示；
d）抗体的重链可变区序列如seqidno:14所示，和轻链可变区序列如seqidno:16所示。
6.如权利要求5所述的抗体在用于制备检测nse的试剂盒中的应用。
7.如权利要求5所述的抗体在用于制备检测小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
技术总结