交叉引用
本申请要求于2017年7月21日提交的美国临时申请号62/535,659的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景技术：
胰腺或胰岛移植已被用于治疗糖尿病，如i型糖尿病。胰岛移植不需要进行大手术，并且胰岛移植物的功能可以在接受者体内维持数年。然而，胰岛供体的缺乏阻碍了这种疗法的有效实施。人造胰腺或胰岛提供了可移植胰岛的替代来源。因此，需要功能和特征类似于内源性胰岛的胰岛体外重建方法。
技术实现要素：
在一方面，本公开内容提供了体外细胞簇，其包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，其中所述细胞簇是未分选的细胞簇，并且其中所述细胞簇包含：(a)至少约35％的表达nkx6.1和c肽的细胞；(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞；(c)至多约2％的表达sox2的细胞；或者(d)至多约10％的表达sox9的细胞。
在另一方面，本公开内容提供了体外细胞簇，其包含至少一种不包含荧光蛋白的nkx6.1 和c肽 细胞，其中所述细胞簇在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，并且其中所述细胞簇包含：(a)至少约35％的表达nkx6.1和c肽的细胞；(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞；(c)至多约2％的表达sox2的细胞；或者(d)至多约10％的表达sox9的细胞。
在一些情况下，至少一种nkx6.1 和c肽 细胞是非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，细胞簇包含至少约35％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至少约40％或至少约60％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至少约70％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至多约2％的表达sox2的所述细胞簇中的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至多约1.5％、至多约1％或至多约0.5％的表达sox2的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至多约10％的表达sox9的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至多约5％、至多约3％或至多约2％的表达sox9的细胞。在一些情况下，细胞簇包含至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％的表达ki67的细胞。
在一些情况下，体外细胞簇具有约150μm的直径。在一些情况下，体外细胞簇具有约50μm至约250μm的直径。在一些情况下，体外细胞簇具有约100μm至约200μm的直径。在一些情况下，与第二葡萄糖浓度相比，体外细胞簇响应于第一葡萄糖浓度表现出更高的胰岛素分泌，其中第一葡萄糖浓度高于第二葡萄糖浓度。在一些情况下，体外细胞簇进一步包含至少一种表达胰高血糖素的细胞或至少一种表达促生长素抑制素的细胞。在一些情况下，体外细胞簇响应于k 的第一浓度表现出胰岛素分泌。在一些情况下，当移植到受试者体内时，体外细胞簇在移植后28天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，当移植到受试者体内时，第二体外细胞簇在移植后14天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
在一些情况下，(a)至少一种非天然胰腺β细胞包含一个或多个晶体胰岛素颗粒；(b)至少一种非天然胰腺β细胞表达以下基因：ins、pdx1、nkx6-1和znt8；或者(c)至少一种非天然胰腺β细胞不表达促生长素抑制素和胰高血糖素中的至少一种。在一些情况下，当顺序地施加第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷时，至少一种非天然胰腺β细胞对第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，至少一种非天然胰腺β细胞响应于葡萄糖负荷的胰岛素分泌与葡萄糖负荷的葡萄糖浓度成比例。在一些情况下，至少一种非天然胰腺β细胞是基因修饰的。
在一些情况下，所述至少一种非天然胰腺β细胞不包含编码信号多肽的外源性核酸序列，所述信号多肽指示所述至少一种非天然胰腺β细胞中的胰岛素表达。在一些情况下，非天然胰腺β细胞中信号多肽的表达由胰岛素启动子所驱动。在一些情况下，信号多肽包括荧光蛋白。
在又一方面，本公开内容提供了包含在培养基中的至少一种如本文所提供的细胞簇的组合物。
在一些情况下，培养基是无血清的。在一些情况下，重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸。在一些情况下，重聚培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，重聚培养基不包含激活受体样激酶-5(alk5)抑制剂。在一些情况下，培养基不包含rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)的外源性抑制剂。在一些情况下，培养基不包含外源性细胞外基质分子。在一些情况下，细胞簇悬浮在培养基中。在一些情况下，培养基以至少30rpm的预定速度进行搅拌。在一些情况下，培养基以至少60rpm的预定速度进行搅拌。在一些情况下，培养基包括mcdb131基础培养基。在一些情况下，mcdb131基础培养基补充有2％的牛血清白蛋白(bsa)。在一些情况下，培养基包括cmrls培养基。在一些情况下，所述组合物进一步包含含有至少一种细胞簇和培养基的生物反应器。在一些情况下，所述生物反应器包括转瓶。
在又一方面，本公开内容提供了方法，其包括：(a)在培养基中使包含至少一种nkx6.1 细胞的细胞群体分化为包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇，所述培养基包含选自以下的因子：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素(th)信号传导途径激活剂、至少一种音猬(sonic-hedgehog)(shh)途径抑制剂、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子及其任何组合；(b)从第一细胞簇解离多个细胞；以及(c)在重聚培养基中培养来自(b)的多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，其中：(i)至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽；(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a；(iii)至多约2％的细胞表达sox2；或(iv)至多约10％的细胞表达sox9。在一些情况下，至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子包括β细胞素(betacellulin)。
在又一方面，本公开内容提供了方法，其包括：(a)获得包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇；(b)从第一细胞簇解离多个细胞；以及(c)在重聚培养基中培养来自(b)的多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，其中：(i)至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽；(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a；(iii)至多约2％的细胞表达sox2；或(iv)至多约10％的细胞表达sox9的细胞。
在又一方面，本公开内容提供了方法，其包括：(a)获得包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇；(b)从第一细胞簇解离多个细胞，其中所述解离不包括使所述多个细胞经历流式细胞术；以及(c)在无血清重聚培养基中培养来自(b)的多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，其中：(i)与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇包含更高百分比的表达嗜铬粒蛋白a的细胞；(ii)与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇包含更高百分比的表达nkx6.1和c肽的细胞；(iii)与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇包含更低百分比的表达sox2的细胞；或(iv)与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇包含更低百分比的表达sox9的细胞。
在又一方面，本公开内容提供了方法，其包括：(a)获得包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇；(b)从第一细胞簇解离多个细胞，其中所述解离不包括使所述多个细胞经历流式细胞术；以及(c)在重聚培养基中培养来自(b)的多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，其中所述第二体外细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答；并且其中：(i)至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽；(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a；(iii)至多约2％的细胞表达sox2；或(iv)至多约10％的细胞表达sox9。
在一些情况下，第二体外细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，解离包括第一细胞簇的酶促解离。在一些情况下，解离包括使第一细胞簇与胰蛋白酶接触。在一些情况下，重聚培养基是无血清的。在一些情况下，重聚培养基以预定速度搅拌。在一些情况下，预定速度是至少30rpm或至少60rpm。在一些情况下，重聚培养基包括mcdb131基础培养基。在一些情况下，mcdb131基础培养基补充有2％的牛血清白蛋白(bsa)。在一些情况下，重聚培养基包括cmrls培养基。在一些情况下，重聚培养基包括mcdb131基础培养基。
在一些情况下，(a)至少一种非天然胰腺β细胞包含一个或多个晶体胰岛素颗粒；(b)至少一种非天然胰腺β细胞表达以下基因：ins、pdx1、nkx6-1和znt8；或者(c)至少一种非天然胰腺β细胞不表达促生长素抑制素和胰高血糖素中的至少一种。在一些情况下，当顺序地施加第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷时，所述至少一种非天然胰腺β细胞对第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，至少一种非天然胰腺β细胞是基因修饰的。在一些情况下，至少一种非天然胰腺β细胞响应于葡萄糖负荷的胰岛素分泌与葡萄糖负荷的葡萄糖浓度成比例。
在一些情况下，重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸。在一些情况下，重聚培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，重聚培养基不包含激活受体样激酶-5(alk5)抑制剂。在一些情况下，重聚培养基不包含外源性转化生长因子β信号传导途径抑制剂。在一些情况下，重聚培养基不包含rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)的外源性抑制剂。在一些情况下，重聚培养基不包含外源性细胞外基质分子。
在一些情况下，第一细胞簇是从冷冻保存恢复的。在一些情况下，所述方法进一步包括从冷冻保存恢复第一细胞簇。在一些情况下，所述方法进一步包括在培养前将多个细胞冷冻保存一段时间。在一些情况下，所述方法进一步包括在培养前从冷冻保存恢复多个细胞。
在一些情况下，第二体外细胞簇具有第一细胞簇的至多50％的直径。在一些情况下，第二体外细胞簇具有第一细胞簇的至多30％的直径。在一些情况下，第二体外细胞簇具有约150μm的直径。在一些情况下，第二体外细胞簇具有约50μm至约250μm的直径。在一些情况下，第二体外细胞簇具有约100μm至约200μm的直径。在一些情况下，第二体外细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a的细胞的百分比比第一细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a的细胞的百分比高至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。在一些情况下，第二体外细胞簇包含至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。在一些情况下，第二体外细胞簇中表达nkx6.1和c肽的细胞的百分比比第一细胞簇中表达nkx6.1和c肽的细胞的百分比高至少1.5倍、至少1.75倍或至少2倍。在一些情况下，第二体外细胞簇包含至少约35％、至少约40％或至少约60％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，第二体外细胞簇中表达sox2的细胞的百分比比第一细胞簇中表达sox2的细胞的百分比低至少2、至少3倍、至少5倍或至少10倍。在一些情况下，第二体外细胞簇包含至多约2％、至多约1.5％、至多约1％或至多约0.5％的表达sox2的细胞。在一些情况下，第二体外细胞簇中表达sox9的细胞的百分比比第一细胞簇中表达sox9的细胞的百分比低至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。在一些情况下，第二体外细胞簇包含至多约10％、至多约5％、至多约3％或至多约2％的表达sox9的细胞。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇具有较低百分比的表达ki67的细胞。在一些情况下，第二体外细胞簇包含至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％的表达ki67的细胞。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇具有更高的胰岛素含量。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇具有高至少1.1倍、至少1.25倍或至少1.5倍的胰岛素含量。在一些情况下，第二体外细胞簇与第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第二葡萄糖浓度相比所分泌的胰岛素的比率，其中第一葡萄糖浓度高于第二葡萄糖浓度。
在一些情况下，第二体外细胞簇响应于k 的第一浓度表现出胰岛素分泌。在一些情况下，第二体外细胞簇响应于大于10mm的高葡萄糖浓度表现出双相胰岛素分泌。在一些情况下，第二体外细胞簇进一步包含至少一种表达胰高血糖素的细胞或至少一种表达促生长素抑制素的细胞。在一些情况下，第一细胞簇中至少约95％、至少约98％或至少约99％的表达nkx6.1和c肽的细胞保留在第二体外细胞簇中。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇具有更高的耗氧率。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇具有高至少1.1倍、至少1.25倍或至少1.5倍的耗氧率。在一些情况下，当移植到受试者体内时，第二体外细胞簇在移植后28天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些情况下，当移植到受试者体内时，第二体外细胞簇在移植后14天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
在又一方面，本公开内容提供了通过本文提供的方法生成的体外细胞簇。
在又一方面，本公开内容提供了包含如本文公开的体外细胞簇的装置，其中所述装置被配置为当植入受试者体内时产生并释放胰岛素。在一些情况下，所述装置进一步包含半透膜，其中所述半透膜被配置为将细胞簇保留在装置中并允许细胞簇分泌的胰岛素通过。在一些情况下，细胞簇被半透膜封装。在一些情况下，半透膜由多糖或聚阳离子制成。在一些情况下，半透膜由选自下组的材料制成：聚(丙交酯)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚四氟乙烯(ptfe)、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯及其任何组合。在一些情况下，半透膜包含藻酸盐。在一些情况下，细胞簇被封装在微胶囊中，所述微胶囊包含被半透膜包围的藻酸盐核心。
在又一方面，本公开内容提供了治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括将如本文所提供的权利要求中任一项的细胞簇或其部分施用于所述受试者。
在又一方面，本公开内容提供了治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包含将如本文所提供的装置植入到受试者。在一些情况下，受试者患有代谢紊乱或具有增加的患代谢紊乱的风险。在一些情况下，受试者患有选自下组的糖尿病：i型糖尿病、ii型糖尿病和1.5型糖尿病。
在又一方面，本公开内容提供了组合物、方法和试剂盒。所述组合物可包含含有至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇。所述方法可包括获得至少一种非天然胰腺β细胞。所述试剂盒可包含含有至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇。在一些实施方案中，细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，当暴露于葡萄糖负荷时，细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇。在一些实施方案中，细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约30％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约45％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约50％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，当暴露于葡萄糖负荷时，细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇。在一些实施方案中，细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，当移植到受试者体内时，细胞簇对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，细胞簇在移植后28天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约30％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约45％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约50％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，当移植到受试者体内时，细胞簇对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，细胞簇在移植后约28天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，细胞簇中至少约90％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约70％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约30％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约45％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，细胞簇中至少约50％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，当顺序地施加第一和第二葡萄糖负荷时，细胞簇对第一葡萄糖负荷和第二葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，当移植到受试者体内时，细胞簇在移植后14天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，细胞簇具有小于约200μm的直径。在一些实施方案中，细胞簇具有小于约300μm的直径。在一些实施方案中，细胞簇具有小于约400μm的直径。在一些实施方案中，直径小于约100μm。在一些实施方案中，细胞簇中少于约10％的细胞不是活的。在一些实施方案中，当暴露于葡萄糖负荷时，细胞簇表现出葡萄糖刺激的钙通量应答。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约30％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约45％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约50％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，当暴露于葡萄糖负荷时，细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，当移植到受试者体内时，细胞簇在移植后约28天内对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含支架的组合物。在一些实施方案中，所述支架是可生物降解的支架。
在一些方面，本公开内容提供了方法，其包括获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；从所述第一细胞簇解离多个细胞；在包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养多个细胞，从而使用所述多个细胞的至少部分体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些方面，本公开内容提供了方法，其包括获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；从所述第一细胞簇解离多个细胞；在包含血清以及甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂中的一种的培养基中培养来自(a)的多个细胞，从而使用多个细胞的至少部分在体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含非天然胰腺β细胞，并且其中(i)第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，培养基进一步包含甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些实施方案中，培养基进一步包含转化生长因子β信号传导途径抑制剂。在一些实施方案中，甲状腺激素信号传导途径激活剂是三碘甲腺原氨酸。在一些实施方案中，培养基中的三碘甲腺原氨酸的浓度为约0.1μm至约10μm。在一些实施方案中，转化生长因子β信号传导途径抑制剂是激活素受体样激酶-5抑制剂。在一些实施方案中，培养基中的激活素受体样激酶-5抑制剂的浓度为约1μm至约50μm。在一些实施方案中，培养基进一步包含选自人血清、人血小板裂解物、胎牛血清和血清替代物的血清。在一些实施方案中，培养基包含约5％至约15％的血清。在一些实施方案中，培养基包含约10％的血清。在一些实施方案中，培养基进一步包括connought医学研究实验室1066补充胰岛培养基(cmrls)或mcdb131基础培养基。在一些实施方案中，培养基进一步包含细胞外基质分子。在一些实施方案中，细胞外基质分子是肝素。在一些实施方案中，细胞外基质分子是层粘连蛋白。在一些实施方案中，与第一细胞簇相比，第二细胞簇包含较高百分比的表达嗜铬粒蛋白a的细胞，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，与第一细胞簇相比，第二细胞簇包含较高百分比的表达nkx6.1和c肽的细胞，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，与第一细胞簇相比，第二细胞簇包含较少的不成活细胞。在一些实施方案中，多个细胞的部分未能形成第二细胞簇，并且其中未能形成第二细胞簇的多个细胞的部分中少于约10％表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，第二细胞簇的直径小于第一细胞簇的直径。在一些实施方案中，当在体外暴露于葡萄糖负荷时，第二细胞簇与第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第二葡萄糖浓度相比所分泌的胰岛素的比率，其中第一葡萄糖浓度高于第二葡萄糖浓度。在一些实施方案中，当在体内暴露于葡萄糖负荷时，第二细胞簇与第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第二葡萄糖浓度相比所分泌的胰岛素的比率，其中第一葡萄糖浓度高于第二葡萄糖浓度。在一些实施方案中，在转瓶中培养多个细胞。在一些实施方案中，多个细胞在体外由一个或多个干细胞生成。在一些实施方案中，多个细胞由一个或多个诱导多能干细胞生成。在一些实施方案中，多个细胞在培养基中培养至少1天。在一些实施方案中，多个细胞在培养基中培养至少4天。
在一些方面，本公开内容提供了用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本公开内容的任何组合物。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病或具有增加的患糖尿病的风险。在一些实施方案中，糖尿病是i型糖尿病、ii型糖尿病、1.5型糖尿病或前驱糖尿病。在一些实施方案中，施用包括在肾小囊下、在肝中或在胰腺中施用所述组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括冷冻保存第二细胞簇，从而产生冷冻保存的第二细胞簇。在一些实施方案中，所述方法进一步包括解冻冷冻保存的第二细胞簇，从而产生包含至少一种非天然胰腺β细胞的解冻的第二细胞簇。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约30％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约45％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些实施方案中，解冻的第二细胞簇中至少约50％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
在一些方面，本公开内容提供了用于本公开内容的任何方法的系统。在一些实施方案中，所述系统可包含磁力搅拌板、包含来自第一细胞簇的多个细胞的转瓶，其中磁力搅拌板和转瓶被配置用于搅拌来自第一簇的多个细胞，从而使用所述多个细胞的至少部分在体外形成第二细胞簇。
在一些方面，本公开内容提供了用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包含获得包括至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；从所述第一细胞簇解离多个细胞；在包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养来自(a)的多个细胞，从而使用所述多个细胞的至少部分在体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)第二细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的；以及将包含第二细胞簇或其部分的组合物施用于受试者。
在一些方面，本公开内容提供了用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；从所述第一细胞簇解离多个细胞；在包含血清以及甲状腺激素信号传导途径激活剂或转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养多个细胞，从而从所述多个细胞的至少部分体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)第二细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的；以及将包含第二细胞簇或其部分的组合物施用于受试者。
在一些方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含本公开内容的细胞簇和至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物是液体组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物是胶囊。在一些实施方案中，所述胶囊是凝胶胶囊。在一些实施方案中，所述胶囊是脂质体。
在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，并且所述细胞簇通过包含以下的过程制备：获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；从所述第一细胞簇解离多个细胞；在包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养所述多个细胞，从而从所述多个细胞的至少部分体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
在一些方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含(i)包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，以及(ii)缓冲液。在一些方面，本公开内容提供了试剂盒，其包含(i)包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，以及(ii)缓冲液。
在某些实施方案中，本文提供了对于2015年4月10日提交的美国申请号14/684,101和于2015年4月10日提交的美国申请号14/684,129的方法、组合物和系统的改进，所述申请要求于2013年6月11日提交的美国临时申请号61/833,898和于2014年3月28日提交的美国临时申请号61/972,212的优先权，其各自通过引用整体并入本文。
通过以下在其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。将认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和说明书本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，程度如同具体地和个别地指出要通过引用来并入每一个出版物、专利或专利申请。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
本公开内容的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本公开内容原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，在这些附图(也称为“图”)中：
图1示出了使用各种第6阶段细胞培养基对重聚细胞簇的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答的影响。
图2示出了表达lin28的细胞的荧光图像(顶部)和定量(底部)。
图3示出了用于重聚细胞簇的示例性方案的概述以及在重聚期间簇的形态。
图4示出了对dapi(例如，核)、嗜铬粒蛋白a(chga)或胰岛素(ins)进行染色的天然细胞簇(顶部)和重聚细胞簇(底部)的免疫荧光图像。
图5a和图5b示出了在重聚细胞簇中富集表达内源性成熟胰腺β细胞的标志物的细胞的富集。图5a示出了在天然簇、重聚细胞簇和冷冻保存后的重聚细胞簇中表达不同标志物的细胞的流式细胞术表征。图5b量化了在天然簇、重聚细胞簇和冷冻保存后的重聚细胞簇中表达不同标志物的细胞的百分比。
图6示出了与人供体胰岛相比，重聚细胞簇中表达内源性成熟胰腺β细胞标志物的细胞的富集(在顶部示出了人供体胰岛的流式细胞术表征)。
图7示出了在重聚细胞簇和未能重聚的细胞中表达内源性成熟胰腺β细胞的标志物的细胞的分布。
图8示出了在具有和不具有冷冻保存的重聚细胞簇中，表达脱靶细胞群体的标志物的细胞(表达sox2的细胞和表达sox9的细胞)的消耗。
图9示出了对(左)dapi(例如，核)或(右)ki67进行染色的天然细胞簇(顶部)和重聚细胞簇(底部)的免疫荧光图像。
图10示出了天然簇、重聚细胞簇和冷冻保存后的重聚细胞簇的示例性体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。si代表刺激指数，其计算为响应20mm葡萄糖负荷相对于2.8mm葡萄糖负荷的胰岛素分泌的比率。
图11示出了冷冻保存后的重聚细胞簇在葡萄糖浓度的顺序变化之后的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，以及响应于kcl负荷的体外胰岛素分泌。
图12示出了天然簇、重聚细胞簇和冷冻保存后的重聚细胞簇中的胰岛素含量。
图13示出了2周时天然簇和重聚细胞簇的体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
图14示出了4周时天然簇和重聚细胞簇的体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
图15示出了移植后天然细胞簇和重聚细胞簇的外植移植物的脱靶生长。
图16示出了(左)细胞随时间变化的耗氧率(ocr)的样品图，其中顺序添加各种化学物质以测量线粒体功能的参数，以及(右)线粒体膜的图解，示出了各种化学物质如何影响线粒体功能。
图17示出了葡萄糖刺激之前和之后天然细胞簇、重聚细胞簇和人胰岛细胞的耗氧率。
图18示出了人胰岛和使用本公开内容的方法衍生的胰岛在线粒体应激测试中随时间的ocr水平。
图19示出了具有重聚细胞簇的移植物(sc-胰岛移植物)的肾脏组织横截面对chga和人标志物(humit)的组织学染色。
图20示出了具有重聚细胞簇的移植物(sc-胰岛移植物)的肾脏组织横截面对c肽、胰高血糖素和dapi(例如，核)的免疫荧光染色。
图21示出了重聚细胞簇对于(左)胰岛素和hoechst或(右)嗜铬粒蛋白a和hoechst的免疫荧光图像，示出了使用层粘连蛋白332(ln-332)作为细胞外基质蛋白对细胞生长的影响。
图22示出了在天然簇、重聚簇(ra)和使用ln-332基质蛋白生长的细胞中的c肽(左图)、嗜铬粒蛋白a(中图)和sox9(右图)的阳性细胞百分比的柱状图。
图23示出了在铺板后8天，使用3d悬浮培养(左)和使用ln-332的2d培养(右)生长的细胞的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
图24示出了在重聚后的天数里不同搅拌速度对重聚簇大小的影响。
图25示出了由不同细胞标志物的表达所指示的重聚细胞簇的异质组成。
图26a示出了通过流式细胞术(facs)测量的分别在天然和重聚细胞簇中的内分泌细胞和β细胞的百分比的定量。图26b示出了天然和重聚细胞簇的胰岛素刺激指数的定量。
图27示出了另一个实例中的天然簇、重聚细胞簇和冷冻保存后的重聚细胞簇的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。si代表刺激指数，其为响应20mm葡萄糖负荷相对于2.8mm葡萄糖负荷的胰岛素分泌的比率。
图28示出了人供体胰岛、天然和重聚细胞簇响应于一系列动态葡萄糖负荷和kcl负荷随时间的动态葡萄糖刺激的胰岛素分泌(左)以及响应的定量(右)。
图29示出了糖尿病小鼠中重聚细胞簇的长期体内血糖控制。
具体实施方式
虽然本文已示出和描述了本公开内容的各种实施方方案，但对于本领域技术人员将会显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替代。应当理解，可以使用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。
i.概述
本文提供了类似于内源性胰岛的功能和特征的细胞簇。本文还提供了制备和使用此类细胞簇的方法。
本文提供的细胞簇可以类似于内源性胰岛的特征。例如，细胞簇可以具有类似于内源性胰岛的直径，例如，约50μm至约250μm之间、约75μm至约250μm之间或约100μm至约200μm之间。细胞簇可以包含表达内源性成熟胰腺β细胞的标志基因的多个细胞。在一些情况下，细胞簇中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的细胞表达嗜铬粒蛋白a(chga)。在一些情况下，细胞簇中至少约35％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞表达nkx6.1和胰岛素或c肽。
细胞簇还可以类似于内源性胰岛的功能。例如，细胞簇可以表现出对葡萄糖负荷的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。当移植到受试者时，细胞簇也可以对受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，例如，在移植后的14天内。
本公开内容还提供了通过向有需要的受试者施用(例如，移植)类似于内源性胰岛的功能和特征的细胞簇来治疗糖尿病(例如，i型或ii型糖尿病)的方法。细胞簇可以移植到肾小囊下，并具有可生物降解的支架。
本文还提供了用于制备类似于内源性胰岛的功能和特征的细胞簇的方法。所述方法可以包含解离第一细胞簇。然后可以将来自第一细胞簇的细胞接种在转瓶中，并在包含三碘甲腺原氨酸(t3)和激活素受体样激酶5(alk5)抑制剂的培养基中培养。在一些情况下，在不包含血清，例如不包含胎牛血清(fbs)的培养基中培养来自第一细胞簇的细胞。在一些情况下，培养基不包含t3。在一些情况下，培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，培养基不包含alk5抑制剂。在一些情况下，培养基不包含外源性小分子化合物。在一些情况下，培养基不包含rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)的外源抑制剂。在转瓶中，细胞可以重聚为类似于内源性胰岛的功能和特征的第二细胞簇。第二细胞簇可包含至少一种胰腺β细胞(例如，从干细胞分化的非天然β细胞)。
本文进一步提供了用于富集细胞簇中的胰腺β细胞(例如，从干细胞分化的非天然β细胞)的方法。术语“富集”及其语法等同物可意指一种类型的细胞的产量(分数)相对于起始簇或培养物中该类型细胞的分数增加至少约5％。所述方法可包括解离包含至少胰腺β细胞(例如，从干细胞分化的非天然β细胞)的第一细胞簇。然后可以将来自第一细胞的细胞接种在转瓶中，并在包含t3和alk5抑制剂的培养基中培养。在转瓶中，细胞可以重聚成第二细胞簇。与第一细胞簇相比，第二细胞簇可包含更多表达内源性成熟胰腺β细胞的标志物并表现出对葡萄糖负荷的体外和体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答的细胞。
ii.类似于内源性胰岛的功能和特征的细胞簇
本文提供了类似于内源性胰岛功能和特征的细胞簇。这样的细胞簇可以模拟内源性胰岛在调控代谢中的功能，例如，受试者的葡萄糖代谢。因此，可以将细胞簇移植到受试者，以治疗由胰岛功能不足引起的疾病，例如，糖尿病。术语“簇”和“聚集”可以可互换地使用，并指代具有紧密的细胞-细胞接触的细胞组，并且在一些情况下，簇中的细胞可以彼此粘附。
本文的细胞簇可包含至少一种非天然细胞，例如，非天然胰腺β细胞。非天然细胞(例如，非天然胰腺β细胞)可以共享内源性细胞(例如，内源性成熟胰腺β细胞)的特征，但在某些方面(例如，基因表达谱)有所不同。非天然细胞可以是基因修饰细胞。非天然细胞可以是从祖细胞如干细胞分化的细胞。干细胞可以是胚胎干细胞(esc)或诱导多能干细胞(ipsc)。在一些情况下，非天然细胞可以是在体外从祖细胞分化的细胞。在一些情况下，非天然细胞可以是在体内从祖细胞分化的细胞。例如，细胞簇可包含至少一种非天然胰腺β细胞。非天然胰腺β细胞可以是在美国专利申请号14/684,129和14/684,101中描述的细胞，其整体并入本文。细胞簇可包含多个非天然胰腺β细胞。在一些情况下，细胞簇中至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％的细胞是非天然胰腺β细胞。细胞簇可包含一个或多个天然细胞。例如，细胞簇可包含一个或多个原代细胞，例如，来自内源性胰岛的原代细胞。
细胞簇可以包含表达内源性细胞例如内源性成熟胰腺β细胞的至少一种标志物的一个或多个细胞。术语“标志物”可以指可以被观察或检测的分子。例如，标志物可以包括但不限于核酸(如特定基因的转录物)、基因的多肽产物、非基因产物多肽、糖蛋白、碳水化合物、糖脂、脂质、脂蛋白或小分子。在许多情况下，标志物可以指可以是特定细胞类型的特征的分子，因此所述标志物可以称为细胞类型的标志物。例如，胰岛素基因可以称为β细胞的标志物。在一些情况下，标志物是基因。内源性成熟胰腺β细胞的非限制性标志物包括胰岛素、c肽、pdx1、nkx6.1、chga、mafa、znt8、pax6、neurod1、葡糖激酶(gck)、slc2a、pcsk1、kcnj11、abcc8、slc30a8、snap25、rab3a、gad2和ptprn。
细胞簇可以包含表达内源性细胞例如内源性成熟胰腺β细胞的一种或多种标志物的一个或多个细胞。例如，细胞簇可以包含共表达内源性细胞例如内源性成熟胰腺β细胞的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20种标志物的一个或多个细胞。在一些情况下，细胞簇包含表达nkx6.1和c肽的细胞，两者均可以是β细胞的标志物。
细胞簇可以包含表达内源性细胞的至少一种标志物的多个细胞。例如，细胞簇中的至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的细胞可以表达内源性细胞的至少一种标志物。在一些情况下，细胞簇中的所有细胞可以表达内源性细胞的标志物。在一些情况下，内源性细胞可以是胰腺细胞，例如，胰腺β细胞、胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞或胰腺γ细胞。如本文所提供的细胞簇可以包含细胞的异质组，例如，不同类型的细胞。例如，细胞簇可以包含表达胰岛素/c肽(其可以是胰腺β细胞的标志物)的细胞、表达胰高血糖素(其可以是胰腺α细胞的标志物)的细胞、表达促生长素抑制素(其可以是胰腺δ细胞的标志物)的细胞、表达胰腺多肽的细胞或其任何组合。
例如，本文的细胞簇可以包含表达内源性成熟胰腺β细胞的一种或多种标志物的多个细胞。例如，细胞簇中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞可以表达内源性成熟胰腺β细胞的一种或多种标志物。
细胞簇可以包含表达chga的多个细胞。在一些情况下，细胞簇中至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞表达chga。在一些情况下，细胞簇中至少约85％的细胞可以表达chga。在一些情况下，细胞簇可以包含约90％的表达chga的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约95％的表达chga的细胞。在某些情况下，细胞簇中的所有细胞可以表达chga。
细胞簇可以包含表达nkx6.1的多个细胞。例如，细胞簇中至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的细胞可以表达nkx6.1。在一些情况下，细胞簇中至少约50％的细胞可以表达nkx6.1。在一些情况下，细胞簇中的所有细胞可以表达nkx6.1。
细胞簇可以包含表达c肽的多个细胞。例如，细胞簇中至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞可以表达c肽。在一些情况下，细胞簇中至少约60％的细胞可以表达c肽。在一些情况下，细胞簇中的所有细胞可以表达c肽。
细胞簇可以包含表达nkx6.1和c肽两者的多个细胞。例如，细胞簇中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞可以表达c肽。在一些情况下，细胞簇中至少约35％的细胞可以表达nkx6.1和c肽。在一些情况下，细胞簇中至少约40％的细胞可以表达nkx6.1和c肽。在一些情况下，细胞簇中至少约35％的细胞可以表达nkx6.1和c肽。在一些情况下，细胞簇可以包含约60％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约75％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，细胞簇中的所有细胞可以表达nkx6.1和c肽。
细胞簇可以包含很少的或不包含干细胞或祖细胞，例如，胰腺祖细胞。例如，如本文所提供的细胞簇可以包含表达lin28的至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。在一些示例中，如本文所提供的细胞簇可以包含表达ki67的至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。
在一些情况下，细胞簇可以包含表达sox2的至多3％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约1％的表达sox2的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约0.6％的表达sox2的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约0.3％的表达sox2的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约0.1％的表达sox2的细胞。
在一些实例中，细胞簇可以包含表达sox9的至多10％的细胞、至多约8％的细胞、至多约6％的细胞、至多约5％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约2％的表达sox9的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约6％的表达sox9的细胞。在一些情况下，细胞簇可以包含约1.2％的表达sox9的细胞。
当暴露于葡萄糖负荷时，本文的细胞簇可以在体外表现出一种或多种葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)应答。gsis应答可以类似于内源性胰岛的gsis应答。在一些情况下，细胞簇对葡萄糖负荷表现出体外gsis应答。在一些情况下，细胞簇对多次葡萄糖负荷如连续的葡萄糖负荷表现出体外gsis应答。例如，细胞簇可以对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次连续葡萄糖负荷的表现出体外gsis应答。
如本文所提供的细胞簇可以包含表现出体外gsis的至少一种细胞。例如，细胞簇中的至少一种细胞可以被称为成熟胰腺β细胞。在一些情况下，至少一种细胞是非天然胰腺β细胞。在一些情况下，至少一种细胞是类似于天然/内源性β细胞的胰腺β细胞。在一些情况下，细胞表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)应答。在一些情况下，至少一种细胞对至少一次葡萄糖负荷表现出gsis应答。在一些情况下，细胞对至少两次连续的葡萄糖负荷表现出gsis应答。在一些情况下，细胞对至少三次连续的葡萄糖负荷表现出gsis应答。
如本文所提供的，细胞簇可以表现出类似于内源性胰岛的gsis刺激指数。细胞簇或细胞的刺激指数可以通过响应于高葡萄糖浓度而分泌的胰岛素与低葡萄糖浓度相比的比率来表征。例如，如本文所提供的细胞簇或细胞的刺激指数可以计算为响应于20mm葡萄糖刺激而分泌的胰岛素与响应于2.8mm葡萄糖刺激而分泌的胰岛素之比。在一些实例中，如本文所提供的细胞簇或细胞的刺激指数大于或等于1、或者大于或等于1.1、或者大于或等于1.3、或者大于或等于2、或者大于或等于2.3、或者大于或等于2.6。在一些情况下，细胞簇或细胞响应于细胞因子而表现出细胞因子诱导的凋亡。在一些情况下，细胞因子包括白介素-β(il-β)、干扰素-γ(inf-γ)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)或其任何组合。在一些情况下，细胞簇或细胞的胰岛素分泌响应于抗糖尿病剂而增加。在一些情况下，抗糖尿病剂包括选自肠降血糖素模拟物、磺酰脲、美格列奈及其组合的促分泌素。在一些情况下，细胞簇或细胞是单激素的。在一些情况下，细胞簇或细胞表现出类似于内源性成熟胰腺β细胞的形态。在一些情况下，细胞簇或细胞在电子显微镜下表现出封装的晶体胰岛素颗粒，其类似于内源性成熟胰岛β细胞的胰岛素颗粒。在一些情况下，细胞簇或细胞表现出低复制速率。在一些情况下，细胞簇或细胞表现出葡萄糖刺激的ca2 通量(gscf)，其类似于内源性成熟胰腺β细胞的gscf。在一些情况下，细胞簇或细胞对至少一次葡萄糖负荷表现出gscf应答。在一些情况下，细胞簇或细胞对至少两次葡萄糖负荷表现出gscf应答。在一些情况下，细胞簇或细胞对至少三次葡萄糖负荷表现出gscf应答。在一些情况下，细胞簇或细胞表现出增加的钙通量。在一些情况下，增加的钙通量包括增加的流入量或者增加的低葡萄糖浓度相对于高葡萄糖浓度下的流入的比率。
如本文所提供的细胞簇可表现出类似于内源性胰岛例如人胰岛的响应于高葡萄糖浓度刺激的双相胰岛素分泌。双相胰岛素分泌可以是内源性胰岛例如人胰岛的特征性现象。如图28所示，响应于高葡萄糖浓度负荷例如10mm、15mm、20mm或30mm，如本文所提供的细胞簇，例如重聚的胰腺细胞簇，可以表现出胰岛素分泌瞬时增加至峰值，随后迅速降低至相对升高的胰岛素分泌水平，例如，该水平高于响应于较低的葡萄糖浓度例如2.8mm葡萄糖的胰岛素分泌水平。这样的瞬时增加和减少过程可以称为双相胰岛素分泌模式的第一时相。在持续的高葡萄糖负荷下，第一时相随后可以是第二时相，其中细胞簇的胰岛素分泌可以维持在相对较高的水平。第二时相可以持续延长的时间，例如，只要高葡萄糖浓度负荷持续，或者比第一时相相对更长。这种双相胰岛素分泌模式可以是由于内在细胞信号传导变化，这是成熟天然胰腺β细胞的特征。
当移植到受试者时，细胞簇在暴露于葡萄糖负荷时可以表现出一种或多种体内gsis应答。本文的细胞簇可以能够在移植到受试者后的短时间内表现出体内gsis应答。例如，细胞簇可在移植后约6、12或24小时内表现出体内gsis。在一些情况下，细胞簇在移植后约2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、21天、28天、35天或42天内表现出体内gsis。细胞簇分泌的胰岛素的量可以与内源性胰岛相似或更高。通过本申请使用的与参考数值相关的术语“约”可以包括从该值加或减10％的值的范围。例如，“约10”的量包括9到11的量。例如，与参考数值相关的术语“约”也可以包括从该值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。
细胞簇可以在移植入受试者后的一段时间内保持表现出体内gsis应答的能力。例如，在细胞簇移植入受试者(例如，人类)之后，细胞簇的体内gsis应答可以观测多达至少2周、3周、4周、5周、10周、15周、20周、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、20年、30年、40年、60年、80年或100年。
细胞簇的gsis可以通过刺激指数来测量。细胞簇的刺激指数可以等于响应于高葡萄糖浓度而分泌的胰岛素与响应于低葡萄糖浓度而分泌的胰岛素的比率。细胞簇可以具有类似于内源性胰岛的刺激指数。在一些情况下，细胞簇具有至少1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0的刺激指数。
细胞簇响应于葡萄糖负荷(例如，高浓度如20mm的葡萄糖)而分泌的胰岛素的量可以为约0.1μiu/103细胞至约5μiu/103细胞、约0.2μiu/103细胞至约4μiu/103细胞、约0.2μiu/103细胞至约3μiu/103细胞或约0.23μiu/103细胞至约2.7μiu/103细胞。在一些情况下，细胞簇响应于葡萄糖负荷(例如，高浓度如20mm的葡萄糖)而分泌的胰岛素的量为至少0.05、0.1、0.15、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3μiu/103细胞。
细胞簇可以分泌胰岛素原和胰岛素两者。例如，细胞簇可以以与内源性胰岛分泌的胰岛素原与胰岛素之比基本上相同的胰岛素原与胰岛素之比分泌胰岛素原和胰岛素。在一些情况下，细胞簇以约0.01至约0.05、约0.02至约0.04、约0.02至约0.03或0.029至约0.031的胰岛素原与胰岛素之比分泌胰岛素原和胰岛素。在一些情况下，细胞簇以约0.02、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.03、0.031、0.032、0.033、0.034、0.035、0.036、0.037、0.038、0.039或0.04的胰岛素原与胰岛素之比分泌胰岛素原和胰岛素。
细胞簇的大小可以与内源性胰岛相似。例如，细胞簇可以具有内源性胰岛相似的直径。细胞簇的直径可以指细胞簇表面上的两点之间的最大直线距离。在一些情况下，细胞簇的直径为至多300μm、200μm、150μm、100μm、90μm、80μm、70μm、60μm、50μm或40μm。细胞簇的直径可以为约75μm至约250μm。细胞簇的直径可以为至多100μm。
细胞簇可以包含很少或不包含死亡细胞。细胞簇的大小可以允许分子(例如，营养物和气体)从周围环境有效扩散至细胞簇的核心。扩散分子对核心中细胞的存活和功能可能很重要。在一些情况下，细胞簇可以具有少于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％的死亡细胞，例如，其核心中的死亡细胞。在一些情况下，细胞簇可以不具有死亡细胞。死亡细胞可以是凋亡细胞、麻醉细胞或其任何组合。
细胞簇可以包含一种或多种类型的细胞。在一些情况下，细胞簇包含一种或多种类型的胰腺细胞。例如，细胞簇可以包含一个或多个胰腺β细胞、胰腺α细胞、胰腺δ细胞、胰腺γ细胞及其任何组合。在一些情况下，胰腺细胞可以是非天然胰腺细胞，例如，衍生自干细胞如esc和/或ipsc的细胞。在一些情况下，细胞簇还可以包含成熟胰腺细胞的一种或多种祖细胞，包括ipsc、esc、定形内胚层细胞、原始肠管细胞、pdx1阳性胰腺祖细胞、pdx1阳性/nkx6.1阳性胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞及其任何组合。
细胞簇可以响应于细胞因子而表现出细胞因子诱导的凋亡。例如，细胞簇可以响应于细胞因子如白介素-1β(il-β)、干扰素-γ(inf-γ)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)及其组合而表现出细胞因子诱导的凋亡。
来自本文细胞簇的胰岛素分泌可以通过抗糖尿病药物(例如，在离体、体外和/或体内作用于胰腺β细胞的抗糖尿病药物)得到增强。本公开内容可以考虑任何已知的抗糖尿病药物。在一些情况下，可以通过促分泌素增强来自细胞簇的胰岛素分泌。促分泌素可以是肠降血糖素模拟物、磺酰脲、美格列奈及其组合。
细胞簇可以包括单激素的。例如，细胞簇可以包含单激素的胰腺细胞(例如，胰腺β细胞、胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞或胰腺γ细胞)。在一些情况下，细胞簇包含单激素的胰岛素分泌性非天然胰腺细胞。细胞簇可以包括多激素的。在一些情况下，细胞簇包含单激素细胞和多激素细胞。
细胞簇可以包含具有与内源性成熟胰腺β细胞的形态类似的形态的细胞(例如，非天然胰腺细胞)。在一些情况下，细胞簇可以包含细胞封装的晶体胰岛素颗粒，其类似于内源性成熟胰腺β细胞的胰岛素颗粒，例如，如通过电子显微镜检测的。细胞簇可以包含具有与内源性成熟胰腺β细胞的形态类似的形态的多个细胞。例如，细胞簇中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的细胞可以封装晶体胰岛素颗粒，其类似于内源性成熟胰腺β细胞的胰岛素颗粒。在一些情况下，细胞簇中100％的细胞封装晶体胰岛素颗粒，其类似于内源性成熟胰岛β细胞的胰岛素颗粒。
细胞簇对于一次或多次葡萄糖负荷可以表现出葡萄糖刺激的钙(ca2 )通量。在一些情况下，细胞簇表现出葡萄糖刺激的ca2 通量(gscf)，其类似于内源性胰岛的gscf。在一些情况下，细胞簇以类似于内源性胰岛对多次葡萄糖负荷的gscf应答的方式对至少1、2、3、4、5、6、8或10次连续葡萄糖负荷表现出gscf应答。当暴露于葡萄糖负荷时，细胞簇可以表现出体外和/或体内gscf应答。
细胞簇可以包含源自任何物种的细胞。例如，细胞簇可以包含来自哺乳动物物种的细胞，非限制性实例包括鼠、牛、猿、猪、马、绵羊或人细胞。在一些情况下，细胞簇中的至少一种细胞是人细胞。
本文还提供了包含通过本申请公开的细胞簇的组合物。除了细胞簇以外，所述组合物可以进一步包含可用于将细胞簇移植到受试者的支架或基质。支架可以提供细胞簇与之粘附的结构。细胞簇可以伴随支架移植到受试者。支架可以是生物可降解的。在一些情况下，支架包含可生物降解的聚合物。可生物降解的聚合物可以是合成聚合物，诸如聚(丙交酯)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯和可生物降解的聚氨酯。可生物降解的聚合物也可以是天然聚合物，如白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白和多糖(例如，藻酸盐、肝素和其他天然存在的糖单元的可生物降解的聚合物)。或者，支架可以是不可生物降解的。例如，支架可以包含不可生物降解的聚合物，诸如聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃和聚氧化乙烯。
iii药物组合物
在一些情况下，本公开内容提供了可以在用于治疗疾病(例如，糖尿病)的各种方法中利用非天然胰腺β细胞群体以及细胞组分和产物的药物组合物。某些情况包括包含活细胞(例如，单独的非天然胰腺β细胞或与其他细胞类型混合)的药物组合物。其他情况包括包含非天然胰腺β细胞组分(例如，细胞裂解物、可溶性细胞部分、条件培养基、ecm或上述任一种的组分)或产物(例如，通过非天然胰腺β细胞或者通过遗传修饰产生的营养和其他生物学因子、来自非天然胰腺β细胞培养的条件培养基)的药物组合物。在任一种情况下，药物组合物可进一步包含其他活性剂，诸如抗炎剂、外源性小分子激动剂、外源性小分子拮抗剂、抗凋亡剂、抗氧化剂和/或本领域技术人员已知的生长因子。
本公开内容的药物组合物可以包含与药学上可接受的载体(例如，培养基或赋形剂)一起配制的非天然胰腺β细胞或其组分或产物。可与术语“生物相容性载体或培养基”互换使用的术语“药学上可接受的载体(或培养基)”是指这样的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与待治疗性施用的细胞和其他药剂相容，而且还适合于与人类和动物的组织接触使用而无过度的毒性、刺激、变态反应或其他并发症。合适的药学上可接受的载体可以包括水、盐溶液(如林格氏液)、醇、油、明胶和碳水化合物，诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。这样的制剂可以是灭菌的，并且在期望的情况下可以与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液和着色剂等辅助剂混合。包含细胞组分或产物但不包含活细胞的药物组合物可以配制成液体。包含活的非天然胰腺β细胞的药物组合物可以配制成液体、半固体(例如，凝胶、凝胶胶囊或脂质体)或固体(例如，基质、支架等)。
药物组合物可以包含本领域技术人员将会熟悉的辅助组分。例如，它们可以包含抗氧化剂，其范围取决于所使用的抗氧化剂的种类而改变。常用抗氧化剂的合理范围是约0.01％至约0.15％体积重量的edta、约0.01％至约2.0％体积重量的亚硫酸钠和约0.01％至约2.0％体积重量的焦亚硫酸钠。对于上述每一种，本领域技术人员可以使用约0.1％体积重量的浓度。其他代表性的化合物包括巯基丙酰甘氨酸、n-乙酰半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽和类似物质，但还可以使用其他适合于肾脏施用的抗氧化剂，例如，抗坏血酸及其盐或亚硫酸盐或焦亚硫酸钠。
缓冲剂可用于将制剂的ph维持在约4.0至约8.0的范围内；以使对靶组织的刺激最小化。对于直接腹膜内注射，制剂应在ph7.2-7.5，优选在ph7.35-7.45。所述组合物还可以包含适合于向肾脏施用的张度剂。其中合适的是氯化钠以使制剂与血液近似等渗。
在某些情况下，药物组合物与粘度增强剂一起配制。示例性试剂是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。在必要时，药物组合物可以添加助溶剂。合适的助溶剂可以包括甘油、聚乙二醇(peg)、聚山梨酯、丙二醇和聚乙烯醇。还可以包含防腐剂，例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、乙酸苯汞或硝酸苯汞、硫柳汞或者对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。
包含细胞、细胞组分或细胞产物的药物组合物可以以本领域已知的几种递送方法中的一种或多种递送至患者肾脏。在一些情况下，将组合物递送至肾脏(例如，在肾小囊上和/或在肾小囊下)。在另一个实施方案中，可以通过周期性的腹膜内或肾内注射将组合物递送至肾脏内的各个位置。或者，所述组合物可以以本领域技术人员已知的其他剂型如预成形或原位成形的凝胶或脂质体来施加。
在半固体或固体载体中包含活细胞的药物组合物可以被配制用于在肾小囊上或肾小囊下方进行手术植入。应当理解，液体组合物还可以通过手术程序来施用。在特定情况下，半固体或固体药物组合物可以包含半渗透性凝胶、晶格、细胞支架等，其可以是不可生物降解或可生物降解的。例如，在某些情况下，将外源性细胞与其周围环境隔绝，但仍使细胞能够分泌生物分子(例如，胰岛素)并将其递送至周围细胞或血流可以是期望的或适当的。在这些情况下，细胞可以配制成包含活的非天然胰腺β细胞或细胞群的自主植入物，该细胞或细胞群包含被非降解的选择性渗透屏障包围的非天然胰腺β细胞，所述屏障将移植细胞与宿主组织物理分离。这样的植入物有时被称为“免疫保护性的”，因为它们具有在没有药理学诱导的免疫抑制的情况下防止免疫细胞和大分子杀死移植细胞的能力。
在其他情况下，可以将各种可降解的凝胶和网络用于本公开内容的药物组合物。例如，特别适合于缓释制剂的可降解材料包括生物相容性聚合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。
在其他情况下，将细胞递送到可生物降解的，优选可生物再吸收的或可生物吸收的支架或基质之上或之内可能是期望的或适当的。这些典型的三维生物材料包含附着于支架、分散在支架内或在并入支架中截留的细胞外基质中的活细胞。一旦植入身体的靶区域，这些植入物就会与宿主组织整合，其中移植的细胞逐渐确立。
可以在本公开内容中使用的支架或基质(有时统称为“框架”)材料的实例包括非织造垫、多孔泡沫或自组装肽。例如，非织造垫可以使用包含乙醇酸和乳酸(pga/pla)的合成可吸收共聚物、泡沫以及/或者聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(pcl/pga)共聚物的纤维来形成。
在另一个实施方案中，框架是毡，其可以由通过可生物吸收的材料，例如，pga、pla、pcl共聚物或共混物或者透明质酸制成的复丝纱线组成。使用由卷曲、切割、梳理和针刺组成的标准纺织加工技术将纱线制成毡。在另一个实施方案中，将细胞接种到泡沫支架上，该泡沫支架可以是复合结构。在上述许多情况下，框架可以模塑成有用的形状。此外，应当理解，非天然胰腺β细胞可以在预先成形的不可降解的手术或植入装置上培养。
基质、支架或装置可以在细胞接种前进行处理，以增强细胞附着。例如，在接种前，可以用0.1摩尔乙酸处理尼龙基质，并在聚赖氨酸、pbs和/或胶原蛋白中温育以包覆尼龙。可以用硫酸对聚苯乙烯进行类似处理。框架的外表面也可以进行修饰，以改善细胞的附着或生长以及组织的分化，诸如通过等离子包覆框架或者添加一种或多种蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白)、细胞基质和/或其他材料，诸如但不限于，明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
在一方面，本公开内容提供了包含细胞簇的装置，所述细胞簇包含至少一种胰腺β细胞。本文提供的装置可以被配置为当植入受试者体内时产生和释放胰岛素。装置可以包含细胞簇，所述细胞簇包含至少一种胰腺β细胞，例如，非天然胰腺β细胞。装置中的细胞簇可以表现出体外gsis。装置可以进一步包含半透膜。半透膜可以被配置用于将细胞簇保留在装置中，并允许细胞簇分泌的胰岛素通过。在装置的一些情况下，细胞簇可以被半透膜封装。封装可以通过本领域技术人员可用的任何技术进行。半透膜也可以由本领域技术人员将理解和验证的任何合适的材料制成。例如，半透膜可以由多糖或聚阳离子制成。在一些情况下，半透膜可以由聚(丙交酯)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)和其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物及其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯或其任何组合。在一些情况下，半透膜包含藻酸盐。在一些情况下，细胞簇被封装在微胶囊中，所述微胶囊包含被半透膜包围的藻酸盐核心。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如以产生包含藻酸盐核心的支架，所述藻酸盐核心具有与rgd序列(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)共价缀合的寡肽。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如，以产生具有稳定性增强的化学酶促工程化的藻酸盐的共价加强的微胶囊。在一些情况下，对藻酸盐核心进行修饰，例如以产生通过丙烯酸酯官能化磷脂的原位聚合而组装的模拟膜的薄层。在一些情况下，微胶囊使用差向异构酶由酶促修饰的藻酸盐组成。在一些情况下，微胶囊包含微胶囊膜的相邻层之间的共价连接。在一些实施方案中，微胶囊包含亚筛粒度的胶囊，其包含与酚部分偶联的藻酸盐。在一些情况下，微胶囊包含支架，所述支架包含藻酸盐-琼脂糖。在一些情况下，sc-β细胞被peg修饰，然后封装在藻酸盐中。在一些情况下，分离的细胞群，例如，sc-β细胞被封装在光反应性脂质体和藻酸盐中。应当理解，微胶囊中使用的藻酸盐可以用其他合适的生物材料代替，包括但不限于，聚乙二醇(peg)、壳聚糖、聚酯中空纤维、胶原蛋白、透明质酸、右旋糖酐与rod、bhd和聚乙二醇-二丙烯酸酯(pegda)、聚(mpc-共-甲基丙烯酸正丁酯-共-4-乙烯基苯基硼酸)(pmbv)和聚(乙烯醇)(pva)、琼脂糖、琼脂糖与明胶以及这些的多层情况。
iv用于制备细胞簇的方法
本文进一步公开了用于制备类似于内源性组织或细胞簇例如内源性胰岛的功能和特征的细胞簇的方法。所述方法可以包含将第一细胞簇解离并将解离的细胞重聚为第二细胞簇，其中与第一细胞簇相比，第二细胞簇更接近地类似于内源性组织或细胞簇例如内源性胰岛的功能和特征。如本文所用，术语“重聚”及其语法等同物可以指当簇被解离成较小的簇或单个细胞时，解离的细胞随后形成新的细胞-细胞接触并形成新的簇。所述方法可用于通过以下过程体外产生细胞簇：a)从第一细胞簇解离多个细胞；和b)在培养基中培养来自a)的多个细胞，从而允许该多个细胞形成第二细胞簇。在一些情况下，第二细胞簇是体外细胞簇。第一细胞簇可以是体外细胞簇，例如，通过将单个细胞体外悬浮在培养基中形成的簇。在一些情况下，第一细胞簇可以是离体细胞簇，例如，在活的生物体的体内形成并从所述生物体分离的细胞簇。例如，本文提供的方法适用的第一细胞簇可以是人胰岛。在一些情况下，第一细胞簇可以是尸体胰岛。
本文提供的方法可以富集细胞簇中的胰腺细胞，例如，胰腺β细胞、内分泌细胞或内分泌祖细胞。在一些示例中，所述方法可以从细胞簇减少或消除干细胞或胰腺祖细胞。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二细胞簇包含较高百分比的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二细胞簇包含较高百分比的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二细胞簇包含较低百分比的表达sox2的细胞。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二体外细胞簇包含较低百分比的表达sox9的细胞。
在一些情况下，培养基包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂。在一些情况下，培养基包含a)血清，和b)甲状腺激素信号传导途径激活剂和tgf-β信号传导途径抑制剂中的一者或两者。在一些情况下，如本文所提供的用于重聚的培养基(重聚培养基)可以不包含小分子化合物。例如，重聚培养基可以不包含甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸(t3)，或仅包含痕量的t3。重聚培养基可以不包含tgfβ信号传导途径抑制剂。在一些情况下，重聚培养基不包含alk5抑制剂(alk5i)，或仅包含痕量的alk5i。
第一细胞簇的解离可以使用本领域已知的方法进行。用于解离细胞簇的非限制性示例性方法包括物理力(例如，机械解离，如细胞刮棒、通过窄孔移液管的研磨、细针抽吸、涡旋解聚以及通过细尼龙或不锈钢网的压力过滤)、使用诸如胰蛋白酶、胶原酶、trypletm等酶的酶促解离、或其组合。解离后，来自第一细胞簇的细胞可以在细胞悬浮液例如单细胞悬浮液中。如本文所用，术语“悬浮液”可以指其中细胞未附着于固体支持物的细胞培养条件。可以在使用本领域技术人员公知的设备进行增殖的同时搅拌悬浮液中增殖的细胞。
在一些情况下，本文提供的方法不包括活性细胞分选过程，例如，流式细胞术。在一些情况下，如本文所述的细胞簇可以是未分选的细胞簇。在一些情况下，本文提供的方法不依赖于活性细胞分选来富集或消除第一细胞簇中特定类型的细胞。在一些情况下，方法仅需要解离第一细胞簇，并在培养基中培养从第一细胞簇解离的多个细胞，从而允许形成第二细胞簇。
在一些情况下，可以应用本文提供的方法以多次解离细胞簇并重聚成新的簇。例如，第一细胞簇可以根据本文提供的方法解离和重聚以形成第二细胞簇，并且第二细胞簇可以进一步解离和重聚以形成第三细胞簇，以此类推。如本文所提供的重聚可以对细胞簇顺序地进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
如本文所述的细胞分选可以指通过依赖于细胞大小、形状(形态)、表面蛋白质表达、内源性信号蛋白表达或其任何组合的差异，从多个细胞分离一组细胞的过程。在一些情况下，细胞分选包括使细胞经历流式细胞术。流式细胞术可以是基于激光或阻抗的生物物理学技术。在流式细胞术中，可以将细胞悬浮在流体流中，并使它们通过电子检测设备。在一种类型的流式细胞术，即基于细胞光学性质(例如，激光激发后的发射波长)的一个或多个参数的荧光激活细胞分选(facs)中，可以使用流式细胞术物理分离并由此纯化感兴趣的细胞。如本文所述，未分选的细胞簇可以是由尚未经历活性细胞分选过程例如流式细胞术的多个细胞形成的细胞簇。未分选的细胞簇在一些情况下被称为“重聚细胞簇”，可以由从现有细胞簇解离的多个细胞形成，并且在它们重聚成新的细胞簇之前，可能没有活性细胞分选过程例如流式细胞术或其他方法来分离一种或多种特定细胞类型以进行如本文所提供的重聚。在一些情况下，本文讨论的流式细胞术可以基于细胞中表达的一种或多种信号肽。例如，细胞簇可以包含表达信号肽(例如，荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(gfp)或tdtomato)的细胞。在一些情况下，信号肽被表达为细胞中胰岛素表达的指示物。例如，细胞簇可以包含携带在胰岛素启动子的控制下的编码gfp的外源性核酸序列的细胞。胰岛素启动子可以是内源性或外源性启动子。在一些情况下，这些细胞中gfp的表达可以指示所述细胞中胰岛素的表达。因此，gfp信号可以是胰腺β细胞的标志物。在一些情况下，如本文所述的细胞分选可以包括磁激活流式细胞术，其中使用磁性抗体或其他配体来标记不同类型的细胞，并且磁性性质的差异可以用于细胞分选。
从第一细胞簇解离的细胞可以在培养基中培养，以重聚成第二细胞簇。所述培养基可以包括connought医学研究实验室1066补充胰岛培养基(cmrls)。在一些情况下，合适的培养基包含cmrls的组分(例如，补充锌)。cmrls可以补充有例如血清(例如，人血清、人血小板裂解物、胎牛血清或血清替代物，如knockout血清替代物)。
培养基可以包含调控细胞中某些信号传导途径的一种或多种化合物。例如，培养基可以包含甲状腺激素信号传导途径激活剂、转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂或两者。
本文使用的培养基中的甲状腺激素信号传导途径激活剂可以是三碘甲腺原氨酸(t3)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂可以是t3的类似物或衍生物。t3的非限制性示例性类似物包括选择性和非选择性拟甲状腺素药(thyromimetic)、trβ选择性激动剂-gc-1、gc-24,4-羟基-pcb106、mb07811、mb07344、3,5-二碘代甲状腺丙酸(ditpa)；选择性tr-β激动剂gc-1；3-碘类甲腺质(3-iodothyronamine)(t(1)am)和3,3',5-三碘甲状腺乙酸(triac)(激素甲状腺素的生物活性代谢物(t(4))；kb-2115和kb-141；类甲腺质；skfl-94901；dibit；3'-ac-t2；四碘甲状腺乙酸(tetrac)和三碘甲状腺乙酸(triac)(通过甲状腺素(t4)和三碘甲腺原氨酸(t3)丙氨酸链的氧化脱氨和脱羧)、3,3',5'-三碘甲腺原氨酸(rt3)(通过t4和t3脱碘)、3,3'-二碘甲腺原氨酸(3,3'-t2)和3,5-二碘甲腺原氨酸(t2)(通过t4、t3和rt3脱碘)以及3-碘类甲腺质(t1am)和类甲腺质(t0am)(通过t4和t3脱碘和氨基酸脱羧)，以及th结构类似物，如3,5,3'-三碘甲状腺丙酸(triprop)、3,5-二溴-3-哒嗪酮-1-甲腺原氨酸(l-940901)、n-[3,5-二甲基-4-(4'-羟基-3'-异丙基苯氧基)-苯基]-草氨酸(cgs23425)、3,5-二甲基-4-[(4'-羟基-3'-异丙基苄基)-苯氧基]乙酸(gc-1)、3,5-二氯-4-[(4-羟基-3-异丙基苯氧基)苯基]乙酸(kb-141)和3,5-二碘甲状腺丙酸(ditpa)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂是t3的前药或激素原，如t4甲状腺激素(例如，甲状腺素或l-3,5,3',5'-四碘甲腺原氨酸)。甲状腺激素信号传导途径激活剂还可以是美国专利号7,163,918中所述的碘甲腺原氨酸组合物，其通过引用整体并入本文。
培养基中甲状腺激素信号传导途径激活剂的浓度可以在适合于细胞聚集的范围内。在一些情况下，培养基中甲状腺激素信号传导途径激活剂的浓度为约0.1μm至约10μm，诸如约0.5μm至约2μm、约0.8μm至约1.5μm、约0.9μm至约1.5μm、约0.9μm至约1.2μm或约0.9μm至约1.2μm。在一些情况下，培养基中甲状腺激素信号传导途径激活剂的浓度为至少约0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm。在一些情况下，培养基中甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，t3)的浓度为约1μm。
在本文的培养基中使用的tgf-β信号传导途径抑制剂可以是tgf-β受体i型激酶(tgf-βri)信号传导的抑制剂。tgf-β信号传导途径抑制剂可以是激活素受体样激酶5(alk5)抑制剂，例如，alk5抑制剂ii(cas446859-33-2，一种tgf-βri激酶的atp竞争性抑制剂，也称为repsox，iupac名称：2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶)。在一些情况下，tgf-β信号传导途径抑制剂是alk5抑制剂ii的类似物或衍生物，包括在美国专利公开号2012/0021519、2010/0267731、2009/0186076和2007/0142376中所述的那些，其通过引用整体并入本文。在一些情况下，可以在本文的培养基中使用的tgf-β信号传导途径抑制剂的实例还包括d4476、sb431542、a-83-01，也称为3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代酰胺；2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基)-1,5-萘啶、wnt3a/bio、bmp4、gw788388(4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1h-吡唑-4-基]吡啶-2-基}-n-(四氢-2h-吡喃-4-基)苯甲酰胺)、smi6、γν-1130(3-((5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(喹喔啉-6-基)-1h-咪唑-2-基)甲基)苯甲酰胺)、gw6604(2-苯基-4-(3-吡啶-2-基-1h-吡唑-4-基)吡啶)、sb-505124(2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烷-5-基-2-叔丁基-3h-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐)、su5416、lerdelimumb(cat-152)、美替木单抗(cat-192)、gc-1008、id11、ap-12009、ap-11014、ly550410、ly580276、ly364947、ly2109761、sd-208、sm16、npc-30345、
培养基中tgf-β信号传导途径抑制剂的浓度可以在适合于细胞聚集的范围内。在一些情况下，培养基中tgf-β信号传导途径抑制剂的浓度为约1μm至约50μm，诸如约5μm至约15μm、约8μm至约12μm或约9μm至约11μm。在一些情况下，培养基中tgf-β信号传导途径抑制剂的浓度为至少约1μm、5μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm。在一些情况下，培养基中tgf-β信号传导途径抑制剂(例如，alk5抑制剂ii)的浓度为约10μm。
用于培养从第一细胞簇解离的细胞的培养基可以是无异源物质的(xeno-free)。用于培养源自动物的细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以不具有来自其他动物的产物。在一些情况下，用于培养人细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以不具有来自任何非人动物的产物。例如，用于培养人细胞和/或细胞簇的无异源物质培养基可以包含人血小板裂解物(plt)而不是胎牛血清(fbs)。例如，培养基可以包含约1％至约20％、约5％至约15％、约8％至约12％、约9％至约11％的血清。在一些情况下，培养基可以包含约10％的血清。在一些情况下，培养基可能没有小分子和/或fbs。例如，培养基可以包括补充有2％bsa的mcdb131基础培养基。在一些情况下，所述培养基是无血清的。在一些实例中，培养基可以不包含外源性小分子或者信号传导途径激动剂或拮抗剂，诸如来自成纤维细胞生长因子家族(fgf，诸如fgf2、fgf8b、fgf10或fgf21)的生长因子、音猬拮抗剂(诸如sant1、sant2、sant4、sant4、cur61414、毛喉素、番茄碱、ay9944、曲帕拉醇、环巴胺或其衍生物)、视黄酸信号传导激动剂(例如，视黄酸、cd1530、am580、ττhρβ、cd437、ch55、bms961、ac261066、ac55649、am80、bms753、他扎罗汀、阿达帕林或cd2314)、rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)的抑制剂(例如，thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077或14-1152)、蛋白激酶c(pkc)的激活剂(例如，佛波醇12,13-二丁酯(pdbu)、tpb、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯、苔藓抑制素1或其衍生物)、tgfβ超家族的拮抗剂(例如，alk5抑制剂ii(cas446859-33-2)、a83-01、sb431542、d4476、gw788388、ly364947、ly580276、sb505124、gw6604、sb-525334、sd-208、sb-505124或其衍生物)、骨形态发生蛋白(bmp)1型受体的抑制剂(例如，ldn193189或其衍生物)、甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，t3或其衍生物)、γ-分泌酶抑制剂(例如，xxi、dapt或其衍生物)、来自表皮生长因子(egf)家族的tgf-β信号传导途径(例如，wnt3a或激活素a)生长因子的激活剂(例如，β细胞素或egf)、广泛激酶(例如，星形孢菌素(staurosporine)或其衍生物)、非必需氨基酸、维生素或抗氧化剂(例如，环巴胺、维生素d、维生素c、维生素a或其衍生物)、或者其他添加剂，如n-乙酰半胱氨酸、硫酸锌或肝素。在一些情况下，重聚培养基可以不包含外源细胞外基质分子。在一些情况下，重聚培养基不包含matrigeltm。在一些情况下，重聚培养基不包含其他细胞外基质分子或物质，诸如胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、plo层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和retronectin及其混合物，例如，裂解的细胞膜制剂。
本领域普通技术人员将理解，补充到培养基的bsa浓度可以有所变化。例如，培养基(例如，mcdb131)可以包含约0.01％、0.05％、0.1％、1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％或约15％的bsa。所使用的培养基(例如，mcdb131培养基)可以包含传统基础培养基中未发现的组分，诸如微量元素、腐胺、腺嘌呤、胸苷以及更高含量的一些氨基酸和维生素。这些添加可以允许培养基补充非常低水平的血清或确定的组分。培养基可以不含蛋白质和/或生长因子，并且可以补充egf、氢化可的松和/或谷氨酰胺。在一些情况下，可以由经验确定培养基的组成。例如，如图1所示，基于细胞在体外的葡萄糖刺激的胰岛素应答来确定第6阶段培养基。将细胞暴露于各种浓度的葡萄糖或kcl(作为阳性对照)，并确定具有和不具有小分子的培养基组成的胰岛素分泌。与在cmrls 10％fbs alk5i t3中培养的细胞相比，在mcdb131 2％bsa中培养的细胞表现出更强的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。在一些情况下，细胞培养基的组成可以通过用细胞特异性标志物对在不同培养基中培养的细胞进行染色来确定。通常，可以使用与最终群体中期望的细胞或最终群体中不期望的细胞相对应的任何标志物作为标志物来经验性地确定培养细胞的最佳培养基。在一个实例中，如图2所示，对细胞进行lin28染色，并使用高通量成像技术(例如，图像细胞计量术)来计数。lin28是未分化干细胞的标志物，并且可增强从成纤维细胞形成诱导多能干细胞(ips)的效率。与在cmrls培养基中培养的天然细胞相比，在mcdb131培养基中培养天然细胞和重聚细胞导致lin28阳性细胞(例如，未分化的细胞)大致90％的减少。本领域的普通技术人员将理解，可以使用任何细胞标志物(例如，sox2、sox9和/或ki67)。
培养基可以包含一种或多种细胞外基质分子(例如，细胞外蛋白)。培养基中使用的非限制性示例性细胞外基质分子可以包括胶原蛋白、胎盘基质、纤连蛋白、层粘连蛋白、分区蛋白、生腱蛋白、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、聚集蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、血小板反应蛋白、玻连蛋白和饰胶蛋白聚糖。在一些情况下，培养基包含层粘连蛋白，诸如ln-332。在一些情况下，培养基包含肝素。
培养基可以在培养物中定期更换，例如，以向培养基中的细胞提供最佳环境。当培养从第一细胞簇解离的细胞以进行重聚时，培养基可以至少或约每4小时、12小时、24小时、48小时、3天或4天更换。例如，培养基可以约每48小时更换。
从第一细胞簇解离的细胞可以接种在容器中以进行重聚。接种密度可以与重聚的第二细胞簇的大小相关。可以控制接种密度，使得第二细胞簇的大小可以类似于内源性胰岛。在一些情况下，控制接种密度，使得第二细胞簇的大小可以为约75μm至约250μm。从第一细胞簇解离的细胞可以以约10万个细胞/ml至约1000万个细胞/ml，例如约50万个细胞/ml至约150万个细胞/ml、约80万个细胞/ml至约120万个细胞/ml、约90万个细胞/ml至约110万个细胞/ml、约200万个细胞/ml至约300万个细胞/ml的密度接种。在一些情况下，从第一细胞簇解离的细胞可以以约100万个细胞/ml的密度接种。在一些情况下，从第一细胞簇解离的细胞可以以约150万个细胞/ml的密度接种。在一些情况下，从第一细胞簇解离的细胞可以以约200万个细胞/ml的密度接种。在一些情况下，从第一细胞簇解离的细胞可以以约250万个细胞/ml的密度接种。在一些情况下，从第一细胞簇解离的细胞可以以约300万个细胞/ml的密度接种。
从第一细胞簇解离的细胞可以在培养器皿中培养。培养器皿可以适合于培养细胞培养物的悬浮液。用于培养本文的细胞或细胞簇的培养器皿可以包括但不限于：烧瓶，用于组织培养的烧瓶、培养皿、平皿、用于组织培养的培养皿、多重皿、微板、微孔板、多重板、多孔板、微型载玻片、腔室载玻片、管、托盘、培养袋和滚瓶、搅拌罐生物反应器或者聚合物(例如，生物聚合物或凝胶)封装，只要能够在其中培养细胞。取决于培养的需要，细胞和/或细胞簇可以在至少或约0.2ml、0.5ml、1ml、5ml、10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml、2000ml、3000ml的体积或其中可衍生的任何范围内培养。
在一些情况下，细胞可以在动态条件下(例如，在其中细胞在悬浮培养的同时经历持续的移动或搅拌的条件下)培养。对于细胞的动态培养，细胞可以在容器(例如，非粘性容器，诸如转瓶(例如，200ml至3000ml，例如250ml的转瓶；100ml的转瓶；或125ml锥形瓶)中培养，该容器可以连接至控制单元，从而呈现受控的培养系统。在一些情况下，可以在非动态条件(例如，静态培养)下培养细胞，同时保持其增殖能力。对于细胞的非动态培养，细胞可以在粘附培养器皿中培养。粘附培养器皿可以涂覆有任何用于细胞粘附的基底如细胞外基质(ecm)以改善器皿表面与细胞的粘附性。用于细胞粘附的基底可以是任何旨在粘附干细胞或饲养细胞(若使用)的物质。用于细胞粘附的基底包括胶原蛋白、明胶、聚-l-赖氨酸、聚-d-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、plo层粘连蛋白、纤维蛋白、凝血酶和retronectin及其混合物，例如，matrigeltm和裂解的细胞膜制剂。
可以搅拌动态细胞培养器皿(例如，转瓶)中的培养基(例如，通过搅拌器)。旋转速度可以与重聚的第二细胞簇的大小相关。可以控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以类似于内源性胰岛。在一些情况下，控制旋转速度以使得第二细胞簇的大小可以为约75μm至约250μm。动态细胞培养器皿(例如，转瓶)的旋转速度可以是约20转/分钟(rpm)至约100rpm，例如，约30rpm至约90rpm、约40rpm至约60rpm、约45rpm至约50rpm。在一些情况下，旋转速度可以为约50rpm。
从第一细胞簇解离的细胞可以培养一段时间以允许它们重聚。从第一细胞簇解离的细胞可以培养至少12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天或30天。在一些情况下，从第一细胞簇解离的细胞可以培养至少4天。
本文的方法还可用于富集类似于内源性细胞的细胞，例如，细胞簇中的内源性成熟胰腺β细胞。所述方法可以包括解离第一细胞簇并且将来自第一簇的细胞重聚成第二簇。与第一簇相比，第二簇可以包含更多类似于内源性成熟胰腺β细胞的细胞。解离和重聚可以使用通过本申请公开的任何方法和试剂进行。
重聚后，与第一细胞簇相比，第二细胞簇可以包含更多表达内源性细胞的一种或多种标志物的细胞。例如，与第一细胞簇相比，第二簇可以包含更多表达内源性成熟胰岛β细胞的一种或多种标志物的细胞，这些标志物包括胰岛素、c肽、pdx1、nkx6.1、chga、mafa、znt8、pax6、neurod1、葡糖激酶(gck)、slc2a、pcsk1、kcnj11、abcc8、slc30a8、snap25、rab3a、gad2和ptprn。在一些情况下，第二簇可以包含更多表达chga的细胞。在一些情况下，第二簇可以包含更多表达nkx6.1的细胞。在一些情况下，第二簇可以包含更多表达c肽的细胞。在一些情况下，第二簇可以包含更多表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，第二簇可以包含更多表达chga、nkx6.1和c肽的细胞。
重聚后，与第一细胞簇相比，第二细胞簇可以具有更小的大小(例如，更小的直径)。例如，如图4所示，对内分泌细胞标志物(例如，chga、ins和dapi)进行染色的天然细胞簇(顶部)和重聚(ra)细胞簇(底部)的免疫荧光图像显示，与天然细胞簇相比，ra细胞的簇直径减小。较小的大小可以允许细胞簇与周围环境之间更好的分子交换。例如，较小的大小可以允许分子(例如，试剂、气体和/或营养物)更好地从培养基扩散到细胞簇中的细胞。因此，与第一细胞簇相比，大小较小的第二细胞簇可以以更有效的方式与周围环境交换分子。因此，与第一细胞簇相比，第二细胞簇可以具有更少的死亡细胞(例如，由于营养物和/或气体不足而死亡的细胞)。
本文提供的方法可以富集内分泌细胞，例如，表达嗜铬粒蛋白a(chga)的细胞。例如，第二细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a的细胞的百分比比第一细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a的细胞的百分比高至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。在一些情况下，第二细胞簇包含至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的表达chga的细胞。在一些情况下，第二细胞簇中至少约85％的细胞可以表达chga。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约90％的表达chga的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约95％的表达chga的细胞。在某些情况下，第二细胞簇中的所有细胞都可以表达chga。
本文提供的方法可以生成或富集胰腺β细胞。例如，第二细胞簇包含至少一种胰腺β细胞，例如，至少一种非天然胰腺β细胞。例如，第二细胞簇中表达nkx6.1和c肽两者的细胞的百分比比第一细胞簇中表达nkx6.1和c肽两者的细胞的百分比高至少1.5倍、至少1.75倍或至少2倍。在一些情况下，第二细胞簇包含至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，第二细胞簇中至少约35％的细胞可以表达nkx6.1和c肽。在一些情况下，细胞簇可以包含约60％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约75％的表达nkx6.1和c肽的细胞。在一些情况下，第二细胞簇中的所有细胞都可以表达nkx6.1和c肽。在一些情况下，第二细胞簇中的至少一种非天然胰腺β细胞中的至少约70％表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的。在一些情况下，第二细胞簇中的至少一种非天然胰腺β细胞中的至少约25％表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
本文提供的方法可以减少或消除胰腺内分泌细胞的干细胞或前体细胞。在一些情况下，第二细胞簇中表达sox2的细胞的百分比比第一细胞簇中表达lin28、ki67、sox2或sox9的细胞的百分比低至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。例如，第二细胞簇可以包含表达lin28的至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。在一些实例中，如本文所提供的第二细胞簇可以包含表达ki67的至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约5％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。例如，第二细胞簇可以包含表达sox2的至多3％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约1％的表达sox2的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约0.6％的表达sox2的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约0.3％的表达sox2的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约0.1％的表达sox2的细胞。例如，第二细胞簇可以包含表达sox9的至多10％的细胞、至多约8％的细胞、至多约6％的细胞、至多约5％的细胞、至多约2％的细胞、至多约1％的细胞、至多约0.5％的细胞、至多约0.1％的细胞、至多约0.05％的细胞、至多约0.01％的细胞或无细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约2％的表达sox9的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约6％的表达sox9的细胞。在一些情况下，第二细胞簇可以包含约1.2％的表达sox9的细胞。
与第一细胞簇相比，第二细胞簇还可以更类似于内源性胰岛起作用。第二细胞簇可以具有比第一细胞簇更高的胰岛素含量，例如，与第一细胞簇相比，高至少1.1倍、至少1.25倍或至少1.5倍的胰岛素含量。第二簇可以表现出比第一细胞簇更强的体外gsis，如通过刺激指数所测量的。第二簇还可以表现出比第一细胞簇更强的体内gsis，如通过刺激指数所测量的。在一些情况下，与第一细胞簇相比，第二簇可以表现出更强的体外gsis和更强的体内gsis，如通过刺激指数所测量的。例如，在相同的刺激条件下，第二细胞簇可以比第一细胞簇分泌更多的胰岛素。第二细胞簇还可以表现出对钾负荷(k )，例如kcl的浓度，例如30mmkcl的胰岛素分泌应答。
在一些情况下，本文提供的方法可以在第二细胞簇中保留来自第一细胞簇的较大百分比的细胞，例如，胰腺β细胞或内分泌细胞。例如，第一细胞簇中表达nkx6.1和c肽的细胞中的至少约95％、至少约98％或至少约99％可以保留在第二体外细胞簇中。在一些情况下，第一细胞簇中表达nkx6.1和c肽的细胞中的至多约5％、至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％在解离和重聚过程中丢失。
在一些情况下，如本文所述的细胞簇从任何起始细胞群体外生成。例如，起始细胞可以包括但不限于，胰岛素阳性内分泌细胞(例如，嗜铬粒蛋白a阳性细胞)或其任何前体，诸如nkx6.1阳性胰腺祖细胞、pdx1阳性胰腺祖细胞以及多能干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞。在一些情况下，所述方法包括对重编程的细胞、部分重编程的细胞(例如，体细胞，例如，已经被部分重编程，使得其处于诱导多能细胞与其衍生自的体细胞之间的中间态的成纤维细胞)、转分化的细胞的分化。在一些情况下，包含本文公开的胰腺β细胞的细胞簇可以在体外从胰岛素阳性内分泌细胞或其前体分化。在一些情况下，包含胰腺β细胞的细胞簇在体外从选自nkx6.1阳性胰腺祖细胞、pdx1阳性胰腺祖细胞和多能干细胞的前体分化。在一些情况下，多能干细胞选自胚胎干细胞和诱导多能干细胞。如上所述，非天然胰腺β细胞还可以称为干细胞衍生的β细胞(sc-β细胞)，因为它们可以体外衍生自干细胞。在一些情况下，sc-β细胞或sc-β细胞所衍生自的多能干细胞是人类的。在一些情况下，sc-β细胞是人类的。
本公开内容的一个方面提供了生成非天然胰腺β细胞的方法。在一些情况下，所述方法可以是任何当前可用的方案，诸如在美国专利申请号14/684,129和14/684,101中所述的那些，其各自整体并入本文。本公开内容的方面涉及定形内胚层细胞。本文中使用的定形内胚层细胞可以衍生自任何来源或根据任何合适的方案生成。在一些方面，多能干细胞(例如，ipsc或hesc)分化为内胚层细胞。在一些方面，内胚层细胞(第1阶段)进一步分化为例如，原始肠管细胞(第2阶段)、pdx1阳性胰腺祖细胞(第3阶段)、nkx6.1阳性胰腺祖细胞(第4阶段)或者ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞(第5阶段)，随后诱导或成熟为sc-β细胞(第6阶段)。
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞来获得定形内胚层细胞，例如，通过使多能细胞群体与i)至少一种来自tgf-β超家族的生长因子和ii)wnt信号传导途径激活剂接触，以诱导至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一个定形内胚层特征性的标志物。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的来自tgf-β超家族的生长因子(例如，单独地或与wnt信号传导途径激活剂组合)。在一些情况下，至少一种来自tgf-β超家族的生长因子包括激活素a。在一些情况下，至少一种来自tgf-β超家族的生长因子包括生长分化因子8(gdf8)。可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导多能干细胞分化为定形内胚层细胞的wnt信号传导途径激活剂(例如，单独地或与来自tgf-β超家族的生长因子组合)。在一些情况下，wnt信号传导途径激活剂包括chir99q21。在一些情况下，wnt信号传导途径激活剂包括wnt3a重组蛋白。
在一些情况下，通过使多能细胞群体与i)激活素a和ii)chir99021接触3天的时间，以诱导所述群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞的过程，从而使群体中的至少一些多能细胞分化为定形内胚层细胞，其中定形内胚层细胞表达至少一种定形内胚层特征性的标志物。
在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞表达选自下组的至少一种标志物：nodal、tmprss2、tmem30b、st14、spink3、sh3gl2、ripk4、rabls、npnt、clic6、cldns、cacnalb、bnipl、anxa4、emb、foxal、soxl7和rbm35a，其中相对于其衍生自的多能干细胞，定形内胚层细胞中至少一种标志物的表达上调了统计上显著的量。在一些情况下，相对于其衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞不表达统计上显著量的选自下组的至少一种标志物：gata4、sparc、afp和dab2。在一些情况下，相对于其衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞不表达统计上显著量的选自下组的至少一种标志物：zicl、pax6、flk1和cd31。在一些情况下，相对于其衍生自的多能干细胞，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有统计上显著量的较高水平的smad2磷酸化。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞具有在体内形成肠管的能力。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以分化为具有肠细胞特征性的形态的细胞，并且其中具有肠细胞特征性的形态的细胞表达foxa2和/或claudin6。在一些情况下，通过本文公开的方法产生的定形内胚层细胞可以进一步分化为内胚层来源的细胞。
在一些情况下，在任何分化之前或在分化的第一阶段，在至少一种β细胞成熟因子的存在下培养多能干细胞群体。可以使用任何多能干细胞，诸如人多能干细胞，或人ips细胞或本文讨论的任何多能干细胞或其他合适的多能干细胞。在一些情况下，如本文所述的β细胞成熟因子可以存在于多能干细胞群体的培养基中，或者可以在多能干细胞群体的生长(例如，复制或繁殖)期间以单次剂量或定期添加。在某些实例中，多能干细胞群体可以在任何分化之前暴露于至少一种β细胞成熟因子。在其他实例中，多能干细胞群体可以在分化的第一阶段期间暴露于至少一种β细胞成熟因子。
本公开内容的方面涉及原始肠管细胞。本文使用的原始肠管细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。在一些方面，原始肠管细胞进一步分化为例如pdx1阳性胰腺祖细胞、nkx6.1阳性胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为sc-β细胞。
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得原始肠管细胞，例如，通过使定形内胚层细胞与至少一个来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子接触，以诱导至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞，其中原始肠管细胞表达至少一种原始肠管细胞特征性的标志物。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞的来自fgf家族的生长因子(例如，单独地或与其他因子组合)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf2。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf8b。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf10。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括fgf21。
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞来获得原始肠管细胞，例如，通过使定形内胚层细胞与kgf接触2天，以诱导至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞。
本公开内容的方面涉及pdxl阳性胰腺祖细胞。本文使用的pdx1阳性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，原始肠管细胞分化为pdx1阳性胰腺祖细胞。在一些方面，pdxl阳性胰腺祖细胞进一步分化为例如nkx6.1阳性胰腺祖细胞、ngn3阳性内分泌祖细胞、胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为sc-β细胞，
在一些方面，可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞来获得pdxl阳性胰腺祖细胞，例如，通过使原始肠管细胞与以下接触i)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂，ii)至少一种来自fgf家族的生长因子，iii)至少一种shh途径抑制剂，iv)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂；以及v)至少一种蛋白激酶c激活剂，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞，其中pdxl阳性胰腺祖细胞表达pdxl。在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞来获得pdxl阳性胰腺祖细胞，例如，通过使原始肠管细胞与i)至少一种来自fgf家族的生长因子和ii)至少一种视黄酸(ra)信号传导途径激活剂接触，以诱导至少一些原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞，其中pdxl阳性胰腺祖细胞表达pdxl。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞的bmp信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂和至少一种蛋白激酶c激活剂进行任何组合)。在一些情况下，bmp信号传导途径抑制剂包括ldn193189。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞的来自fgf家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种shh途径抑制剂、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂和至少一种蛋白激酶c激活剂进行任何组合)。在一些情况下，来自fgf家族的至少一种生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。在一些情况下，来自fgf家族的至少一种生长因子选自fgf2、fgf8b、fgf10和fgf21。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞的shh途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂和至少一种蛋白激酶c激活剂进行任何组合)。在一些情况下，shh途径抑制剂包括sant1。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞的ra信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂和至少一种蛋白激酶c激活剂进行任何组合)。在一些情况下，ra信号传导途径激活剂包括视黄酸。
可以使用任何能够诱导原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞的pkc激活剂(例如，单独地，或与至少一种bmp信号传导途径抑制剂、至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂和至少一种ra信号传导途径激活剂进行任何组合)。在一些情况下，pkc激活剂包括pdbu。在一些情况下，pkc激活剂包括tpb。
在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞来获得pdxl阳性胰腺祖细胞，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸、kgf、sant1、ldn193189、pdbu接触2天的时间。在一些情况下，可以通过使群体中的至少一些原始肠管细胞分化为pdxl阳性胰腺祖细胞来获得pdxl阳性胰腺祖细胞，例如，通过使原始肠管细胞与视黄酸和kgf接触2天的时间。在一些情况下，可以通过使至少一些原始肠管细胞在s3培养基中分化来获得pdxl阳性胰腺祖细胞。
本公开内容的方面涉及nkx6.1阳性胰腺祖细胞。本文使用的nkx6.1阳性胰腺祖细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，pdxl阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞。在一些方面，nkx6.1阳性胰腺祖细胞进一步分化为例如ngn3阳性内分泌祖细胞或胰岛素阳性内分泌细胞，随后被诱导或成熟为sc-β细胞。
在一些方面，由pdxl阳性胰腺祖细胞产生nkx6.1阳性胰腺祖细胞的方法包括使包含pdx1阳性胰腺祖细胞的细胞群体(例如，在促进细胞簇集的条件下)与包含以下的至少两种β细胞成熟因子接触：a)至少一种来自成纤维细胞生长因子(fgf)家族的生长因子，b)音猬途径抑制剂，和任选的c)低浓度的视黄酸(ra)信号传导途径激活剂，以诱导群体中至少一种pdxl阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞，其中该nkx6.1阳性胰腺祖细胞表达nkx6.1。
在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性胰腺祖细胞与以下接触：i)至少一种来自fgf家族的生长因子，ii)至少一种shh途径抑制剂，以及任选的iii)低浓度的ra信号传导途径激活剂，以诱导至少一些pdxl阳性胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞，从而获得pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞，其中该pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞表达pdxl和nkx6.1。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性胰腺祖细胞与以下接触：i)至少一种来自fgf家族的生长因子；ii)至少一种shh途径抑制剂，以及任选的iii)低浓度的ra信号传导途径激活剂，iv)rock抑制剂和v)至少一种来自tgf-β超家族的生长因子接触，以诱导至少一些pdxl阳性胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞，从而获得pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性胰腺祖细胞与至少一种来自fgf家族的生长因子接触，从而获得pdx1阳性的nkx6.1阳性胰腺祖细胞。
在一些情况下，pdxl阳性胰腺祖细胞由多能细胞群体产生。在一些情况下，pdxl阳性胰腺祖细胞由ips细胞群体产生。在一些情况下，pdxl阳性胰腺祖细胞由esc细胞群体产生。在一些情况下，pdxl阳性胰腺祖细胞由定形内胚层细胞群体产生。在一些情况下，pdxl阳性胰腺祖细胞由原始肠管细胞群体产生。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导pdxl阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞的来自fgf家族的生长因子(例如，单独地，或与至少一种shh途径抑制剂或任选的至少一种视黄酸信号传导途径激活剂进行任何组合)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子包括角质形成细胞生长因子(kgf)。在一些情况下，至少一种来自fgf家族的生长因子选自fgf2、fgf8b、fgf10和fgf21。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导pdxl阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞的shh途径抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种视黄酸信号传导途径激活剂、rock抑制剂和至少一种来自tgf-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，shh途径抑制剂包括sant1。
可以使用任何能够诱导pdx1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞的ra信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、rock抑制剂和至少一种来自tgf-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，ra信号传导途径激活剂包括视黄酸。
可以使用任何能够诱导pdx1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞的rock抑制剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、ra信号传导途径激活剂和至少一种来自tgf-β超家族的生长因子进行任何组合)。在一些情况下，rock抑制剂包括thiazovivin、y-27632、法舒地尔/ha1077或14-1152。
可以使用任何能够诱导pdx1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性胰腺祖细胞的来自tgf-β超家族的激活剂(例如，单独地，或与至少一种来自fgf家族的生长因子、至少一种shh途径抑制剂、ra信号传导途径激活剂和rock抑制剂进行任何组合)。在一些情况下，来自tgf-β超家族的激活剂包括激活素a或gdf8。
在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性胰腺祖细胞与kgf、sant1和ra接触5天的时间来获得pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性胰腺祖细胞与kgf、sant1、ra、y27632和激活素a接触5天的时间来获得pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞。在一些情况下，通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性胰腺祖细胞与kgf接触5天的时间来获得pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞。在一些情况下，通过使pdxl阳性胰腺祖细胞在s3培养基中接触来获得pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞。
本公开内容的方面涉及胰岛素阳性内分泌细胞。本文使用的胰岛素阳性内分泌细胞可以衍生自任何来源或者根据任何合适的方案产生。在一些方面，nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些方面，胰岛素阳性内分泌细胞进一步分化，例如，通过诱导或成熟为sc-β细胞。
在一些方面，从nkx6.1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法包括使包含nkx6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群体(例如，在促进细胞簇集的条件下)与a)tgf-β信号传导途径抑制剂，和b)甲状腺激素信号传导途径激活剂的祖细胞接触，以诱导群体中的至少一种nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，该胰岛素阳性内分泌细胞表达pdxl、nkx6.1、nkx2.2、mafb、glis3、surl、kir6.2、znt8、slc2a1、slc2a3和/或胰岛素。
可以使用任何能够诱导nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的tgf-β信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与其他β细胞成熟因子例如甲状腺激素信号传导途径激活剂进行组合)。在一些情况下，tgf-β信号传导途径包括tgf-β受体i型激酶信号传导。在一些情况下，tgf-β信号传导途径抑制剂包括alk5抑制剂ii。
可以使用任何能够诱导nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的甲状腺激素信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与其他β细胞成熟因子例如tgf-β信号传导途径抑制剂进行组合)。在一些情况下，甲状腺激素信号传导途径激活剂包括三碘甲腺原氨酸(t3)。
在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，所述方法包括使pdx1阳性nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下至少一种接触：i)shh途径抑制剂，ii)ra信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子，和任选的v)蛋白激酶抑制剂。
在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与至少一种另外的因子接触。在一些情况下，所述方法包括使pdx1阳性nkx6.1阳性胰腺祖细胞与以下至少一种接触：i)shh途径抑制剂，ii)ra信号传导途径激活剂，iii)γ-分泌酶抑制剂，iv)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子，和v)至少一种骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂。
任何能够诱导群体中的nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的γ-分泌酶抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括xxi。在一些情况下，γ-分泌酶抑制剂包括dapt。
可以使用任何能够诱导群体中的nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的来自egf家族的生长因子(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，至少一种来自egf家族的生长因子包括β细胞素。在一些情况下，至少一种来自egf家族的生长因子包括egf。
可以使用任何能够诱导nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的ra信号传导途径激活剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，ra信号传导途径激活剂包括ra。
可以在本文提供的方法中使用任何能够诱导nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的shh途径抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，shh途径抑制剂包括santl。
可以使用任何能够诱导nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的bmp信号传导途径抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，bmp信号传导途径抑制剂包括ldn193189。
在一些情况下，细胞群体任选地与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞群体不与蛋白激酶抑制剂接触。在一些情况下，细胞群体与蛋白激酶抑制剂接触。任何能够诱导群体中的nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞的蛋白激酶抑制剂(例如，单独地，或与tgf-β信号传导途径抑制剂和/或甲状腺激素信号传导途径激活剂中的任一种进行组合)。在一些情况下，蛋白激酶抑制剂包括星形孢菌素。
在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与xxi、alk5i、t3、ra、sant1和β细胞素接触7天的时间，以诱导群体中的至少一种nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。在一些情况下，所述方法包括使细胞群体(例如，nkx6.1阳性胰腺祖细胞)与xxi、alk5i、t3、ra、sant1、β细胞素和ldn193189接触7天的时间，以诱导群体中的至少一种nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。
在一些情况下，所述方法包括在be5培养基中培养细胞群体(例如，nkx6.1阳性胰腺祖细胞)，以诱导群体中的至少一种nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为胰岛素阳性内分泌细胞，其中该胰岛素阳性内分泌细胞表达胰岛素。
本公开内容的方面涉及生成非天然胰腺β细胞，其在形式和功能方面类似于内源性成熟β细胞，但与天然β细胞不同。
在一些情况下，使用本文提供的方法生成的胰岛素阳性胰腺内分泌细胞可以单独地或与其他类型的细胞(例如，其前体，例如干细胞、定形内胚层细胞，原始肠管细胞、pdx1阳性胰腺祖细胞或nkx6.1阳性胰腺祖细胞(例如，图1所示的第6阶段细胞))一起形成细胞簇。在一些情况下，包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞簇可以使用本文提供的方法重聚。细胞簇的重聚可以富集胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，细胞簇中的胰岛素阳性内分泌细胞可以进一步成熟为胰腺β细胞。例如，在重聚后，第二细胞簇可以表现出体外gsis，其类似于天然胰岛。例如，在重聚后，第二细胞簇可以包含表现出体外gsis的非天然胰腺β细胞。
如本文所提供的第6阶段细胞可以经历或可以不经历如本文所述的解离和重聚过程。在一些情况下，包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体可以被直接诱导成熟为sc-β细胞。在一些情况下，成熟因子可以包括至少一种本文所述的tgf-β信号传导途径抑制剂和甲状腺激素信号传导途径激活剂。在一些情况下，可以通过使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体与alk5i和t3接触来获得sc-β细胞。在一些情况下，可以在补充有10％fbs的cmrls培养基中使胰岛素阳性内分泌细胞成熟。在其他情况下，可以通过在可补充2％bsa的mcdb131培养基中培养含有胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体来获得sc-β细胞。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为sc-β细胞的具有2％bsa的mcdb131培养基可以不包含如本文所述的小分子因子。在一些情况下，用于使胰岛素阳性内分泌细胞成熟为sc-β细胞的具有2％bsa的mcdb131培养基可以不包含血清(例如，无fbs)。
本公开内容的一个方面提供了冷冻保存的方法。如本文所提供的，包含非天然胰腺β细胞的细胞群体可以通过冷冻保存来储存。例如，可以使包含非天然β细胞，例如，在一些情况下为第6阶段细胞的细胞群体解离到细胞悬浮液，例如单细胞悬浮液中，并可以将细胞悬浮液冷冻保存，例如，冷冻在冷冻保存溶液中。细胞的解离可以通过本文提供的任何技术进行，例如，通过酶处理。细胞可以在最高-20℃、最高-30℃、最高-40℃、最高-50℃、最高-60℃、最高-70℃、最高-80℃、最高-90℃、最高-100℃、最高-110℃、最高-120℃、最高-130℃、最高-140℃、最高-150℃、最高-160℃、最高-170℃、最高-180℃、最高-190℃或最高-200℃的温度下冷冻。在一些情况下，细胞在约-80℃的温度下冷冻。在一些情况下，细胞在约-195℃的温度下冷冻。可以使用任何冷却方法来提供冷冻保存所需的低温，诸如但不限于，电冰冻器、固体二氧化碳和液氮。在一些情况下，可以使用本领域技术人员可获得的任何冷冻保存溶液来温育用于在低温下保存的细胞，包括定制和商业溶液。例如，可以使用含有冷冻保护剂的溶液。冷冻保护剂可以是被配置为保护细胞免受冷冻伤害的试剂。例如，冷冻保护剂可以是能够降低冷冻保存溶液的玻璃化转变温度的物质。可以使用的示例性冷冻保护剂包括dmso(二甲基亚砜)、二醇(例如，乙二醇、丙二醇和甘油)、右旋糖酐(例如，右旋糖酐-40)和海藻糖。可以将其他试剂添加至冷冻保存溶液用于其他效果。在一些情况下，可以在本文提供的方法中使用市售的冷冻保存溶液，例如，frostalifetm、pzervetm、
在一些情况下，可以使用本文提供的方法使细胞簇冷冻保存然后经历重聚。在一些情况下，可以使细胞簇解离到如本文所提供的细胞悬浮液中，然后冷冻保存。在冷冻保存一段时间后，可以使用如本文所提供的方法将冷冻保存的细胞解冻并培养以供重聚。如本文所提供的冷冻保存可以延长胰腺β细胞或其前体的可用性。在一些情况下，在使非天然胰腺β细胞从其前体或干细胞分化的过程中，中间细胞群体可以按照本文提供的方法保存，直至需要非天然胰腺β细胞，例如，用于移植到人类患者体内。在一些情况下，细胞可以在其进一步使用或进一步处理细胞例如重聚之前冷冻保存任何期望的时间段。例如，细胞可以冷冻保存至少1天、至少5天、至少10天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少10年。
sc-β细胞可以表现出对至少一次葡萄糖负荷的应答。在一些情况下，sc-β细胞表现出对至少两次顺序的葡萄糖负荷的应答。在一些情况下，sc-β细胞表现出对至少三次顺序的葡萄糖负荷的应答。在一些情况下，sc-β细胞表现出对多次(例如，顺序的)葡萄糖负荷的应答，其类似于内源性人胰岛对多次葡萄糖负荷的应答。在一些情况下，sc-β细胞能够响应于两次连续的葡萄糖负荷而释放或分泌胰岛素。在一些情况下，sc-β细胞能够响应于三次连续的葡萄糖负荷而释放或分泌胰岛素。在一些情况下，sc-β细胞能够响应于四次连续的葡萄糖负荷而释放或分泌胰岛素。在一些情况下，sc-β细胞能够响应于五次连续的葡萄糖负荷而释放或分泌胰岛素。在一些情况下，sc-β细胞响应于连续不断的葡萄负荷而释放或分泌胰岛素。在一些情况下，可以对细胞进行测定，以通过确定它们是否反复增加细胞内ca2 来确定它们是否对连续的葡萄糖负荷做出响应，如本文的实例所述。
在一些情况下，如本文所提供的方法可以从包含nkx6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体开始。通过使nkx6.1阳性细胞与至少一种来自egf超家族的因子(例如，β细胞素)接触，可以使nkx6.1阳性细胞分化为nkx6.1阳性和c肽阳性内分泌细胞。在一些情况下，nkx6.1阳性和c肽阳性内分泌细胞也可以称为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，胰岛素阳性内分泌细胞的一个特征可以是嗜铬粒蛋白a的表达。在一些情况下，包含胰岛素-内分泌细胞的群体可以如上所述被解离并重聚为细胞簇。
在一些情况下，促进细胞簇集的条件包括悬浮培养。在一些情况下，时间段包括足以使共表达c肽和nkx6-1的细胞的数目最大化的时间段。在一些情况下，所述时间段为至少5天。在一些情况下，所述时间段为5天至7天。在一些情况下，所述时间段为至少7天。在一些情况下，悬浮培养每天重新补充(例如，重新补充β细胞成熟因子)。在一些情况下，5天至7天的时间段使共表达c肽和nkx6.1的细胞的数目最大化。
在一些情况下，群体中至少15％的nkx6.1阳性胰腺祖细胞被诱导以分化为胰岛素阳性内分泌细胞。在一些情况下，群体中至少99％的nkx6.1阳性胰腺祖细胞被诱导以分化为胰岛素阳性内分泌细胞。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成sc-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂，ii)至少一种来自fgf家族的因子，iii)shh途径抑制剂，iv)bmp信号传导途径抑制剂，v)pkc激活剂，和任选的vi)rock抑制剂接触2天的时间的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使pdx1阳性胰腺祖细胞与i)至少一种来自fgf家族的生长因子，ii)至少一种shh途径抑制剂，和任选地iii)ra信号传导途径激活剂，和任选的iv)rock抑制剂，和v)至少一种来自tgfβ超家族的因子每隔一天接触一次，持续5天的时间的过程，使至少一些pdx1阳性胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞，其中该nkx6.1阳性胰腺祖细胞表达pdx1和nkx6.1；e)通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞与i)tgf-β信号传导途径抑制剂，ii)th信号传导途径激活剂，iii)至少一种shh途径抑制剂，iv)ra信号传导途径激活剂，v)γ-分泌酶抑制剂，和vi)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子每隔一天接触一次，持续5至7天的时间的过程，使至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞，其中该pdxl阳性、nkx6.1、胰岛素阳性的内分泌细胞表达pdx1、nkx6.1、nkx2.2、mafb、glis3、surl、kir6.2、znt8、slc2a1、slc2a3和/或胰岛素；以及f)通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞与i)转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂，ii)甲状腺激素信号传导途径激活剂，和任选的iii)蛋白激酶抑制剂每隔一天接触一次，持续7至14天的时间的过程，以诱导至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞在体外成熟为sc-β细胞，从而使至少一些pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞分化为sc-β细胞，其中sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis应答。在一些情况下，gsis应答类似于内源性成熟β细胞的gsis应答。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成sc-β细胞的方法，所述方法包括：a)通过使多能干细胞与至少一种来自tgfβ超家族的因子和wnt信号传导途径激活剂接触3天的时间，使群体中的多能干细胞分化为定形内胚层细胞；b)通过使定形内胚层细胞与至少一种来自fgf家族的因子接触3天的时间的过程，使至少一些定形内胚层细胞分化为原始肠管细胞；c)通过使原始肠管细胞与i)视黄酸信号传导途径激活剂和ii)至少一种来自fgf家族的因子接触2天的时间的过程，使至少一些原始肠管细胞分化为pdx1阳性胰腺祖细胞；d)通过在促进细胞簇集的条件下，使pdx1阳性胰腺祖细胞与至少一种来自fgf家族的生长因子每隔一天接触一次，持续5天的时间的过程，使至少一些pdx1阳性胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞，其中该nkx6.1阳性胰腺祖细胞表达pdx1和nkx6.1；e)通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞与i)tgf-β信号传导途径抑制剂，ii)th信号传导途径激活剂，iii)至少一种shh途径抑制剂，iv)ra信号传导途径激活剂，v)γ-分泌酶抑制剂，vi)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子，和vii)bmp信号传导途径抑制剂每隔一天接触一次，持续5至7天的时间的过程，使至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞，其中该pdxl阳性、nkx6.1、胰岛素阳性的内分泌细胞表达pdx1、nkx6.1、nkx2.2、mafb、glis3、surl、kir6.2、znt8、slc2a1、slc2a3和/或胰岛素；以及f)通过在补充有2％bsa的mcbd131培养基中培养pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞以诱导至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞体外成熟为sc-β细胞，从而使至少一些pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞分化为sc-β细胞，其中sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis应答。在一些情况下，gsis应答类似于内源性成熟β细胞的gsis应答。
在一些方面，本公开内容提供了从多能细胞生成sc-β细胞的方法，所述方法包括：a)在合适的条件下，使群体中的多能干细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞；b)通过在促进细胞簇集的条件下，使pdxl阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞与i)tgf-β信号传导途径抑制剂，ii)th信号传导途径激活剂，iii)至少一种shh途径抑制剂，iv)ra信号传导途径激活剂，v)γ-分泌酶抑制剂，vi)至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子，和vii)bmp信号传导途径抑制剂每隔一天接触一次，持续5至7天的时间的过程，使至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性的胰腺祖细胞分化为pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞，其中该pdxl阳性、nkx6.1、胰岛素阳性的内分泌细胞表达pdx1、nkx6.1、nkx2.2、mafb、glis3、surl、kir6.2、znt8、slc2a1、slc2a3和/或胰岛素；以及c)通过在补充有2％bsa的mcbd131培养基中培养pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞以诱导至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞体外成熟为sc-β细胞，从而使至少一些pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞分化为sc-β细胞，其中sc-β细胞在体外和/或体内表现出gsis应答。在一些情况下，gsis应答类似于内源性成熟β细胞的gsis应答。
在一些方面，本公开内容提供了生成含有胰腺β细胞的细胞簇的方法，所述方法包括：a)获得包含nkx6.1阳性胰腺祖细胞的细胞群体；b)通过使nkx6.1阳性胰腺祖细胞与至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子接触的过程，使至少一些nkx6.1阳性胰腺祖细胞分化为nkx6.1阳性、胰岛素阳性(或c肽阳性)的内分泌细胞，其中pdxl阳性、nkx6.1、胰岛素阳性的内分泌细胞表达pdx1、nkx6.1、nkx2.2、mafb、glis3、surl、kir6.2、znt8、slc2a1、slc2a3和/或胰岛素；以及c)通过在补充有2％bsa的mcbd131培养基中培养pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞以诱导至少一些pdx1阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞体外成熟为胰腺β细胞，从而使至少一些pdxl阳性、nkx6.1阳性、胰岛素阳性的内分泌细胞分化为sc-β细胞，其中胰腺β细胞在体外和/或体内表现出gsis应答。在一些情况下，gsis应答类似于内源性成熟β细胞的gsis应答。
v治疗方法
本文进一步提供了用于治疗或预防受试者种的疾病的方法。可以将包含类似于内源性胰岛的细胞簇的组合物施用于受试者体内，以恢复受试者体内一定程度的胰腺功能。例如，类似于内源性胰岛的细胞簇可以移植到受试者以治疗糖尿病。
所述方法可以包括将本申请中公开的细胞簇移植到受试者，例如，有需要的受试者。术语“移植”和“施用”可以互换使用，并且可以指通过导致引入的细胞或细胞簇至少部分地定位在期望部位的方法或途径，将细胞或细胞簇、细胞或其细胞簇的任何部分、或者包含细胞、细胞簇或其任何部分的任何组合物置于受试者体内。细胞或细胞簇可以直接植入胰腺，或替代地通过任何适当的途径施用，所述途径导致递送至受试者体内的期望位置，在该处至少一部分植入的细胞或细胞保持存活。在施用于受试者后，细胞或细胞簇具有活力的时间可以短至几小时(例如，二十四小时)至几天，至长达数年。在一些情况下，细胞或细胞簇，或者其细胞或细胞簇的任何部分，还可以在非胰腺位置诸如在肝脏中或皮下横跨施用(transadminister)，例如，在胶囊(例如，微胶囊)中施用以使植入的细胞或细胞簇维持在植入位置，并避免迁移。
可以通过本文的方法治疗的受试者可以是人类或非人类动物。在一些情况下，受试者可以是哺乳动物。受试者的实例包括但不限于灵长类动物，例如，猴子、黑猩猩、狒狒或人类。在一些情况下，受试者是人类。受试者可以是非灵长类动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、兔等。在一些情况下，接受治疗的受试者是有需要的受试者，例如，有需要的人类。
如本文所用，术语“治疗”可以指向受试者施用有效量的组合物(例如，细胞簇或其部分)，以使得受试者具有疾病的至少一种症状的减少或疾病的改善，例如，有益或期望的临床结果。为了本公开内容的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的减少、疾病的状态稳定(例如，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(例如，部分的或总体的)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。因此，本领域技术人员意识到，治疗可以改善疾病状况，但可能不完全治愈所述疾病。如本文所用，术语“治疗”包括预防。
本文提供的方法和组合物可以用于治疗患有疾病或有患病风险(例如，增加的风险)的受试者。在一些情况下，所述疾病是糖尿病，包括但不限于，i型糖尿病、ii型糖尿病、1.5型糖尿病、前驱糖尿病、囊性纤维化相关的糖尿病、手术糖尿病、妊娠糖尿病和线粒体糖尿病。所述疾病也可以是糖尿病并发症，包括心脏和血管疾病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病变、足部损伤和听力损伤。
所述方法可以包括使用本领域中的任何手段将细胞簇移植到受试者。例如，所述方法可以包含经由腹膜内间隙、肾小囊下、肾小囊、网膜、皮下间隙或经由胰床输注来移植细胞簇。例如，移植可以是囊下移植、肌肉内移植或门静脉内移植，例如，门静脉内输注。可以实施免疫保护性封装以对细胞簇提供免疫保护。
实施例
实施例1.重聚包含非天然β细胞的细胞簇的方法。
本实施例示出了用于重聚从包含使用美国专利申请号14/684,129和14/684,101中所述的方法生成的第6阶段细胞的细胞簇中公开的细胞的示例性方法，，所述申请整体并入本文。在整个实施例中，起始簇被称为天然簇。与天然簇相比，重聚细胞簇包含更高百分比的表达内源性成熟胰腺β细胞的标志物的细胞，并且在体外和体内均表现出更强的葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
解离天然簇
从温育器取出在500ml转瓶中培养的天然簇，并使其在3-5分钟沉降到烧瓶底部沉降。所述瓶以45°的角度倾斜，并使用附接到真空阱的抽吸头，通过烧瓶的两臂之一上的盖子尽可能多地抽吸瓶内的液体。
使用血清移液管将沉积细胞簇转移至50ml锥形管。通过添加10mlpbs洗涤转瓶。将剩余的簇转移至50ml锥形管。重复进行转移直至基本所有簇都收集在50ml锥形管中。使转移的簇在2-4分钟沉降至50ml锥形管的底部，然后用抽吸头吸去pbs。
将20ml预热(至37℃)的trypletm(约5亿个细胞)添加至锥形管中的细胞，并在37℃的水浴中温育15分钟。锥形管以3分钟的间隔旋转，以搅拌簇-trypletm混合物。
在trypletm中温育15分钟后，通过p1000移液管头剧烈上下吸取细胞，直到基本看不到簇为止。在此阶段，大多数细胞处于单细胞悬浮液中。然后将trypletm-细胞混合物通过20ml的猝灭培养基(trypletm:猝灭培养基为1:1的比例)猝灭。
使细胞悬浮液穿过20μm网状过滤器，以除去任何未解离的簇。网上只有几个小簇，因为它们中的大多数已被解离为单细胞并穿过了过滤器。
将单细胞悬浮液以200g离心4分钟。去除上清液，并将细胞沉淀重悬于30ml预热(至37℃)的mcdb培养基中，并充分混合直至观察到均匀的单细胞悬浮液。
将解离的细胞接种至转瓶中
取0.5ml的单细胞悬浮液。用vi-cell测量细胞活力(膜完整性测定)和浓度。将细胞以1x106细胞/ml(或更高的密度，取决于期望的簇大小和实验目的)接种到转瓶中。
在转瓶中培养细胞以重聚
将具有接种细胞的烧瓶放入具有5％co2的37℃温育器中的50rpm下的磁力搅拌板上。将烧瓶直接放置于搅拌器上方，使搅拌桨均匀旋转。如果使用30mlbiott，则将biott置于指定的磁力搅拌系统上，并以60rpm搅拌。
使细胞重聚48小时。培养基每48小时进行更换。对于第一次培养基更换，将重聚簇转移至50ml锥形管，并以300g快递离心(spindown)3分钟。将沉淀重悬在新鲜的mcdb培养基中。对于随后的培养基更换(每48小时)，将重聚簇用20μm网状过滤器过滤。非聚集的细胞穿过过滤器，而重聚的簇被网格捕获。将过滤器翻转，并使用新鲜的mcdb培养基将簇冲洗至烧瓶中。培养4-7天后，重聚簇变成圆形和球形。重聚过程期间细胞的形态如图3所示。
细胞的冷冻保存
用于自体植入和异源移植和研究的活组织和细胞的供应在一定程度上受到组织或器官可以维持在存活状态的时间的限制。增加组织或器官保持存活的时间的长度可能会大大增加特定组织以存活状态到达接受者或研究人员的可能性。在本公开内容的一些情况下，如下所述进行细胞的冷冻保存，以在分化完成后冷冻并储存scβ细胞，从而确保功能性细胞得以保存。
为了冷冻保存scβ细胞，可以将tryple、pbs和第6阶段培养基预热至37℃。此外，prime-xv冷冻保存溶液可以保存在冰上，以保持用于冷冻保存的寒冷。可以在分散过程之前进行标准qc，以确定烧瓶内细胞数目的估计值。从温育器移取目标转瓶，并移入细胞培养罩，以使细胞沉降3至5分钟。从烧瓶的一个臂取下盖子，以从烧瓶抽吸所有旧培养基。对于装满0.05％hsa培养基的烧瓶，用抽吸头去除培养基，直至水平到达烧瓶底部的边缘。在移除移液管并将盖子重新放置到臂上后，将主盖从转瓶旋下。准备25ml血清移液管，并且每当烧瓶倾斜就小心去除剩余的培养基。用5ml血清移液管收集天然细胞簇沉淀物(5ml血清移液管内没有边缘，因此不会捕获任何簇)并转移至50ml锥形管。用10ml预热的pbs洗涤转瓶，以收集剩余的天然簇，并将其转移至50ml锥形管。洗涤过程再重复三遍。使簇静置2至4分钟，然后从50ml锥形管抽吸pbs，剩余5ml。将40ml预热的pbs添加至锥形管以再次洗涤细胞，并且使天然簇静置2至4分钟，然后吸出尽可能多的pbs。向每300m细胞添加20ml温热的tryple，并将锥形管在温育器中温育20分钟。在最初的10分钟之后，打开温育器门，使锥形管中的细胞旋转，以确保tryple均匀分布至所有细胞。将细胞再温育10分钟。温育后，将锥形管转移至罩中，而不搅动沉淀。从锥形管抽吸tryple，并将10ml温热的第6阶段培养基添加至锥形管。使用p1000移液管头将溶液上下吸移10到15次，以打散簇。用温热的第6阶段培养基将锥形管装满至40ml。在预润湿40um过滤器后，将细胞通过过滤器转移，以从溶液去除所有未解离的簇。用10ml的第6阶段培养基冲洗锥形管，以洗涤该管，并通过40um网进行过滤，最终体积为50ml。将样品拿到vicell细胞计数器进行细胞计数和浓度测量。在确定细胞数后，使锥形管以300xg快速离心3分钟。将锥形管放回罩，并抽吸所有第6阶段培养基。将细胞重悬于冷的prime-xv中至浓度为100m细胞/毫升，并相应地在标志物的冷冻小瓶中等分。最后，将充满的冷冻小瓶放置在coolcells中，在-80冷冻器中放置过夜，并在24小时后转移至液氮储存。冷冻小瓶还可以使用controlratefreezer快速冷冻，然后立即转移至液氮。
实施例2.解冻和培养冷冻保存的重聚细胞簇的方法
解冻细胞
用于自体植入和异源移植和研究的活组织和细胞的供应在一定程度上受到组织或器官可以维持在存活状态的时间的限制。增加组织或器官保持存活的时间的长度可能大大增加特定组织以存活状态到达接受者或研究人员的可能性。在本公开内容的一些情况下，如下所述进行冷冻保存的细胞的解冻以获得功能性scβ细胞。
为了解冻和培养冷冻保存的scβ细胞，取出冷冻保存的小瓶，并在37℃的水浴中快速解冻2-3分钟。当小瓶解冻且留下少量冰晶时，将小瓶从水浴中取出，并用乙醇擦拭小瓶后将其转移到细胞培养罩。准备15ml的锥形管，其含有与冷冻小瓶内容物至少相同体积的预热的第6阶段培养基。例如，如果每个冷冻小瓶含有2ml，如果解冻1个小瓶，则确保锥形管中有至少2ml培养基。对于解冻1个小瓶，使用5ml血清移液管吸取3ml的第6阶段培养基，然后使用相同的移液管吸取2ml冷冻小瓶的内容物。将全部5ml细胞 培养基在血清移液管中分配至15ml含有细胞与第6阶段培养基的锥形管中，在旋转的同时逐滴加入。将细胞快速添加到锥形管(而不是逐滴添加)可能引起渗透压休克，并可能损害细胞。再吸取1或2ml的第6阶段培养基以洗涤含有细胞的小瓶，然后将其添加至该15ml锥形管。培养基和细胞用加热的第6阶段培养基加满至14或15ml。这是为了稀释冷冻培养基，并确保在离心过程中冲洗下粘附至锥形管壁的任何细胞。
随后通过将细胞以100g离心3分钟来进行三次快速离心。收集上清液，转移至另一个15ml锥形管，并再次以200g离心3分钟。收集上清液，转移至另一个15ml锥形管，并再次以300g离心3分钟。如果上清液仍然混浊，可以进行额外的快速离心。当所有旋转完成后，将上清液从锥形管吸出。通过将来自所有快速离心的细胞沉淀重悬在15ml锥形管之一中的10ml第6阶段培养基中来对其进行收集。获取单细胞悬浮液的较小样品以使用血细胞计数器或vi-cell计数器进行细胞计数。将细胞以2x106个活细胞/ml的密度(或更高的密度，这取决于期望的簇大小和实验目的)接种到biott中。例如，如果10ml溶液的总活细胞计数为6000万个细胞，则将10ml细胞转移到biott中，然后使用20ml第6阶段培养基冲洗锥形管，并将其加回到烧瓶中，使得最终体积为30ml。当以2×106个细胞/ml接种时，在st6d4时重聚簇的直径小于120um。小型biott能够容纳至多40ml培养基(8000万个活细胞)。其他方案的描述使用500ml转瓶，然而解冻细胞在其中可能并未很好地簇集。将细胞接种的烧瓶放入具有5％co2的37℃温育器中的在60rpm下的磁力搅拌板上。确保烧瓶位于搅拌器的正上方，以使搅拌桨均匀旋转，否则簇的形成可能较差。使细胞重聚24小时。解冻后24小时更换培养基。
更换培养基
培养基可以在24小时(第2天)进行更换，并且需要对重聚簇进行三次快速离心。将细胞转移至50ml锥形瓶，并以100g离心3分钟。收集上清液，并使用血清移液管转移至另一个50ml锥形管。将细胞沉淀重悬于新鲜的5ml第6阶段培养基中，然后将其转移回旋转器biott中。将上清液以200g再次快速离心3分钟。将细胞沉淀重悬于新鲜的第6阶段培养基中，然后转移回转瓶/biott中。再次收集上清液，并使用血清移液管转移到另一个锥形管，并以300g离心3分钟。吸出上清液。将细胞沉淀重悬于新鲜的第6阶段培养基中，并将其转移回转瓶/biott中。用需要填满biott/烧瓶的体积的剩余的培养基冲洗锥形管中任何剩余的细胞。使用用于洗涤锥形管的第6阶段培养基将烧瓶/biott的其余部分装满至原始体积(其中细胞密度为2×106个细胞/ml)。第一次快速离心仅使用100g以避免新重聚的簇凝结在一起。随后两次上清液的离心是为了收集所有未簇集在一起的单个细胞。这是为了给予期望的细胞足够的时间来簇集在一起成为聚集体。24小时后对其进行过滤将导致许多良好细胞的损失，并导致较低的产率。可以在第4天(初始接种后72小时)通过20μm网状过滤器过滤所有重聚簇来对培养基进行第二次更换。在使用前，网状过滤器已用培养基进行预湿。非聚集的细胞穿过网状过滤器，而重聚簇被网捕获。将过滤器直接翻转在biott上，并使用新鲜的第6阶段培养基将簇冲洗到biott中。当将细胞从过滤器冲洗回biott时，使用25ml血清移液管并将其压在网上。当分配培养基时，血清移液管在整个网上移动。使用过滤器完成培养基更换以去除未聚集的不需要的细胞。在所有细胞都有足够的时间重聚后，那些在4天后仍为单个细胞的细胞可能不会形成簇。随后在s6d6、s6d8(例如，每48小时)时类似地进行培养基更换。所有重聚簇都通过20μm网状过滤器进行过滤。在使用前，网状过滤器已使用培养基进行预湿。非簇集的细胞穿过过滤器，而重聚簇被网捕获。翻转过滤器，并使用新鲜的第6阶段培养基将簇冲洗到烧瓶中。重聚簇在第三次培养基更换时通常是紧凑的和球形的。其他方案建议将细胞离心以进行培养基更换。然而，当细胞进行离心时存在较大的细胞损失。此外，离心可导致细胞在一起结块，使簇的大小更大。重要的是，确保通过移动压在网上的血清移液管冲洗掉网上的簇而收集网上的所有簇。细胞产率基于接种的活细胞(而不是总数)。例如，解冻后立即在s6d1接种了6000万个活细胞。在s6d10，将非重聚的单个细胞滤出后，获取样品，在tryple中解离并计数。如果计算出biott剩余3000万个细胞，这相当于50％的产率。在解冻后立即观察到～70％的活力是常见的。在s6d4，细胞产率可以在30-50％之间。sc-胰岛对于gsis是最佳的，并在s6d7-s6d12之间进行测试。在s6d12之后，可观察到细胞产率的下降和簇大小的增加。
实施例3.表征重聚细胞簇
对实施例1中生成的重聚细胞簇进行表征，以确定它们是否具有内源性胰岛的功能和特征。将重聚细胞簇的功能和特征与天然簇的功能和特征进行了比较。比较显示，与天然簇相比，重聚细胞簇与内源性胰岛更加相似。
流式细胞术
通过流式细胞术检测重聚簇和天然簇中表达内源性成熟胰腺β细胞的标志物的细胞的百分比并进行比较。
通过在trypletmexpress温育，将天然簇和重聚簇分散到单细胞悬浮液中。细胞通常为100-200万个，在pbs(1ml)中洗涤一次，然后转移至1.7ml微离心管(bioscience；11510)。将细胞重悬浮于4％pfa中，并在冰上温育30分钟。然后将细胞在pbs中洗涤一次，随后在冰上在封闭缓冲液(pbs 0.1％tritonx-100 5％驴血清)中温育1小时。
然后将细胞重悬于具有一抗的封闭缓冲液中，并在4℃下温育过夜。将抗人nkx6.1、人chga和人c肽的一抗稀释并与细胞一起温育。细胞在封闭缓冲液中洗涤两次，然后在封闭缓冲液中用二抗在冰上温育2小时。使用与alexafluor488或647(lifetechnologies)偶联的二抗使一抗可视化。
然后将细胞在分选缓冲液(pbs 0.5％bsa(sigma；a8412)中洗涤3次，并最后重悬于500-700ml的分选缓冲液中，通过40mm尼龙网过滤到流式细胞术管(bdfalcon；352235)中，并使用lsr-ii流式细胞仪(bdbiosciences)进行分析，记录了至少30,000个事件。使用flowjo软件进行结果分析。图5显示，与天然簇相比，在有和没有冷冻保存的重聚簇中，表达chga、nkx6.1和c肽的细胞得到富集。特别地，分别有约95.5％的ra细胞和94.6％的cryora细胞表达chga，相比之下天然细胞为61.6％。同样，分别有约94.4％的ra细胞和89.8％的cryora细胞表达nkx6.1和chga，相比之下天然细胞为57.8％。最后，使用本公开内容的方法，分别有约75.4％的ra细胞和62.1％的cryora细胞表达nkx6.1和c肽，相比之下天然细胞为32.4％。此外，如图6所示，与人尸体胰岛相比，在具有和不具有冷冻保存的重聚细胞簇中，表达chga、nkx6.1和c肽的细胞得到富集。特别地，仅18.8％、19.2％和56.6％的人尸体胰岛分别表达nkx6.1和c肽、nkx6.1和chga或者chga的标志物。
如上所述，未聚集的细胞穿过过滤器，而重聚簇被网捕获。未能重聚的细胞(例如，穿过过滤器的细胞)的流式细胞术表征证实，重聚捕获了所有nkx6.1和c肽阳性β细胞，并且未显著影响细胞产率。如图7所示，重聚导致98％以上的表达β细胞特异性标志物(例如，nkx6.1和c肽)的细胞被网捕获，少于2％的细胞丢失(例如，穿过网)。通常，在未能形成细胞簇的细胞(例如，未能重聚的细胞和/或穿过网的细胞)中，少于约10％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。在一些情况下，在未能形成细胞簇的细胞(例如，未能重聚的细胞和/或穿过网的细胞)中，少于约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。同样，细胞的重聚还导致sox9阳性和sox-2阳性脱靶细胞群体的减少。如图8所示，与天然簇相比，在具有和不具有冷冻保存的重聚簇中，表达sox2和sox9的细胞被消耗。特别地，分别有约0.3％的ra细胞和0.6％的cryora细胞表达sox2，相比之下天然细胞为3.1％。同样，分别有约1.2％的ra细胞和6.4％的cryora细胞表达sox9，相比之下天然细胞为11.9％。sox2和/或sox9阳性细胞可以代表脱靶细胞群体(例如，非β细胞)，诸如增殖性或部分分化的细胞。
本领域普通技术人员将理解，还可以使用除流式细胞术以外的技术来表征重聚后的细胞。细胞表征方法的非限制性实例包括基因测序、显微镜技术(荧光显微镜、原子力显微镜)、核型分析、同工酶分析、dna性质、病毒敏感性。在一个实例中，如图9所示，用(左)dapi(例如，指示细胞核)和(右)ki67(例如，增殖的细胞标志物)对天然细胞(顶部)和重聚细胞(底部)进行免疫染色。如图所示，细胞的重聚导致ki67阳性细胞数目的减少，表明增殖(例如，脱靶)细胞群体数目的减少。本领域普通技术人员将理解，可以使用任何细胞标志物来检测脱靶细胞群体(例如，sox2、sox9、lin28)。
体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌
krebs缓冲液(krb)制备如下：在去离子水中添加128mmnacl、5mmkcl、2.7mmcacl2、1.2mmmgcl2、1mmna2hpo4、1.2mmkh2po4、5mmnahco3、10mmhepes(lifetechnologies；15630080)、0.1％bsa(proliant；68700)。制备含有2mm葡萄糖(低葡萄糖)、20mm葡萄糖(高葡萄糖)或2mm葡萄糖和30mmkcl(kcl极化负荷)的krb溶液，并平衡至37℃。
将天然的重聚簇和冷冻保存的重聚簇用1mlkrb缓冲液洗涤两次，然后在3ml低葡萄糖krb中预温育2小时，以去除残留的胰岛素。将簇在krb中洗涤2次，然后在1ml低葡萄糖krb中温育30分钟。温育后收集200ul上清液样品用于elisa分析(低葡萄糖样品)。将簇在krb中洗涤两次，然后在高葡萄糖krb中温育30分钟，温育后收集200ul上清液(高葡萄糖样品)。最后，将簇在krb中洗涤两次，然后在含有2mm葡萄糖和30mmkcl(极化负荷)的krb中温育30分钟。温育后收集200ul上清液样品用于elisa分析(kcl极化负荷样品)。
使用人超敏胰岛素elisa(alpcodiagnostics；80-inshuu-e01.1)处理含有分泌的胰岛素的上清液样品，并通过fluostaroptima分光光度计(bmglantech)在450nm下测量样品。在天然细胞、重聚细胞和冷冻保存的重聚细胞中响应于葡萄糖和kcl(作为阳性对照)而分泌的胰岛素的水平如图10所示。图27示出了天然细胞、重聚细胞和冷冻保存的重聚细胞的胰岛素应答的另一实例。此外，还用递增或递减浓度的葡萄糖的连续剂量处理细胞(例如，每1小时改变葡萄糖浓度)，以确定细胞是否能够进行急性时间应答。如图11所示，重聚的sc-胰岛响应于连续增加和减少浓度的葡萄糖(例如，重聚细胞中的胰岛素分泌与葡萄糖浓度成比例)。
还测量了体外葡萄糖刺激的胰岛素含量。细胞裂解后，在天然细胞裂解物、重聚细胞裂解物和冷冻保存的重聚细胞裂解物中测量胰岛素含量(例如，细胞内胰岛素的量)。如图12所示，与天然细胞相比，具有冷冻保存(cryora)和不具有冷冻保存(ra)的重聚细胞显示出增加的细胞内胰岛素含量。
在天然和重聚细胞簇中还测试了体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌刺激指数。如图26a所示，重聚显著增加了嗜铬粒蛋白a(chga)阳性细胞的百分比，从天然细胞簇中的约50％至重聚细胞簇(ra)中的接近100％，并且重聚还增加了胰腺β细胞(nkx6.1和c肽双阳性)的百分比。如通过刺激指数所证实的，重聚细胞簇中内分泌细胞和胰腺β细胞的富集与胰腺功能的增强相关，因为图26b表明重聚细胞簇的刺激指数也显著高于天然细胞簇。
体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌
为了比较天然簇和重聚簇的体内gsis应答，使用具有高血糖的nrg-akita小鼠。在未禁食的小鼠进入实验之前确定其血糖水平，以确认细胞移植前是否存在高血糖。对于移植，使小鼠禁食16小时，测定禁食的血糖水平，并向小鼠移植天然簇或重聚簇。
接受者小鼠通过腹膜内注射5ml/g的15mg/ml氯胺酮和2mg/ml赛拉嗪的混合物来麻醉。所有手术均在无菌条件下在无菌罩中使用无菌技术进行，并使用无菌纱布垫作为手术单。沿着皮肤切开约2.0cm的切口，然后穿过下方的肌肉组织，并通过切口空间轻轻拉动肾脏。用16号套管针将含有细胞的血块植入肾小囊下，并将携带移植物的肾放回腹膜腔内。使用间断缝合的4-0涂层的vicryl缝线(ethiconvicrylj464g)被用于缝合肌肉组织，然后使用外科伤口夹(bd427631)闭合皮肤部位。
动物在从手术恢复的过程中保持温暖，并给予2.4mg/kg丁丙诺啡sr-lab的单次腹膜内(i.p.)剂量，以在72小时缓解疼痛(zoopharmbz8069317)。每周三次对小鼠进行监测，十四天后，去除外科伤口夹。
在选定的时间，使动物禁食至少16小时，确定基线血糖，并使小鼠负荷腹膜内注射的2g/kgd-( )-葡萄糖。在葡萄糖负荷后三十分钟测定血糖水平，并使用刺血针通过面部静脉穿刺获得150ml血液，使血液凝固60分钟，并重新获得血清以通过elisa测定人胰岛素，与体外gsis实验中相同。2周(参见例如，图13)和4周(参见例如，图14)的结果显示，与天然簇相比，重聚簇表现出更好的体内gsis应答。
细胞代谢活性线粒体功能和糖酵解在包括细胞活化、增殖、分化、细胞死亡和疾病进展在内的多种细胞过程中起关键作用。通过顺序注射寡霉素、fccp(碳酰氰对三氟甲氧基苯腙)和抗霉素a/鱼藤酮来测量细胞的线粒体功能，从而确定基础ocr、atp关联的ocr、质子漏(protonleak)、最大呼吸容量、储备呼吸容量和非线粒体氧气消耗(参见例如，图16)。在用任何化学物质处理细胞之前，第一记录对应于基础呼吸。可以向细胞添加各种化学物质，以确定所述化学物质对细胞的耗氧量(例如，线粒体功能)的影响。在一个实例中，细胞可用葡萄糖处理，以确定耗氧率的葡萄糖刺激的应答。寡霉素a通过阻断质子通道来抑制atp合酶，并显著减少通过电子传递链的电子流，对于adp氧化磷酸化为atp是必需的。为了确定atp的产生，将寡霉素添加到培养基中。atp的产生可以通过基础呼吸的下降来测量。atp的产生无法解释的基础呼吸所剩余的差异称为质子漏。质子漏可以是线粒体损伤的迹象，然而其也可以用作调节线粒体atp产生的机制，或者可以是细胞的正常过程。质子漏的增加量可以表明损伤。fccp是一种质子载体(h 离子载体)，并且是线粒体中氧化磷酸化的解偶联剂，能够使质膜和线粒体膜去极化。在添加fccp后，流经电子传递链(etc)的电子不受抑制，并且复合物iv最大限度地消耗氧。备用容量是根据ocr曲线的顶部(添加fccp后)与基础呼吸之间的差异来测量的，它是细胞在压力条件下可以完成的多少“工作”(细胞响应于增加的能量需求的能力)。鱼藤酮是一种nadh:泛醌氧化还原酶中的线粒体电子传递的抑制剂，其抑制电子从复合物i中的铁硫中心传递至泛醌，并干扰nadh。如图17所示，测量成年人胰岛、天然细胞和重聚细胞中响应于葡萄糖处理的耗氧率，以确定线粒体功能。重聚细胞表现出约75％的ocr增加，相比之下天然细胞表现出约25％的ocr增加。此外，顺序添加寡霉素a、fccp和鱼藤酮/抗霉素a在成年人胰岛和重聚细胞(semmasc-胰岛)之间显示出相似的ocr谱，这表明重聚细胞中的线粒体功能类似于成年人胰岛(图18)。
体内移植物表征
在使用重聚细胞进行移植物的移植后，获得组织切片并对chga和humit(例如，人标志物)染色。如图19所示，在移植后6个月，组织切片在具有重聚簇的移植的移植物中表现出内分泌细胞的均匀分布。此外，在移植后6个月，组织切片表现出增加的α和β细胞的数目，如c肽和胰高血糖素的免疫荧光染色所指示的(图20)。
图29示出了其中将示例性细胞簇移植到糖尿病小鼠模型的肾小囊中的实验。在这些实验中，向stz糖尿病nsg小鼠移植了重聚细胞簇，并在植入的细胞簇的植入物前后以及外植物之后监测其血糖水平。如图所示，所有测试的4只小鼠在植入后显示改善的血糖控制(降低和稳定的血糖水平)，并且在外植物后显示恶化的血糖控制。
与搅拌速度的相关性
图24证明了在重聚过程中培养基的搅拌速度与细胞簇大小之间的示例性相关性。针对重聚方案测试了不同的搅拌速度方案：在整个10天的重聚期间为40rpm；在整个10天的重聚期间为60rpm；在前48小时为60rpm，随后在剩余天数为90rpm；在前48小时为60rpm，之后48小时为90rpm，随后在剩余天数为110rpm。如图所示，将搅拌速度从40rpm增加到60rpm显著减小了细胞簇的大小，60rpm和90rpm的方案产生最小的簇的大小。
异质组分
图25示出了在重聚细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a、胰岛素或胰高血糖素的细胞的免疫染色图，证明了在重聚细胞簇中的均质组分。
双相胰岛素应答
还测试了响应于葡萄糖负荷的动态胰岛素分泌。如图28所示，响应于高葡萄糖浓度20mm的负荷，示例性的天然细胞簇、重聚的胰腺细胞簇均表现出双相胰岛素应答模式。双相应答模式的特征在于胰岛素分泌瞬时增加至峰值，然后迅速下降至相对较高的胰岛素分泌水平(约25分钟至35分钟)。这种第一时相应答之后是第二时相，在第二时相中细胞簇的胰岛素分泌维持在相对较高的水平持续较长的时间段(约35分钟至约60分钟)。
此外，图28还证明，示例性的天然细胞簇、重聚的胰腺细胞簇均响应于30mmkcl负荷表现出胰岛素分泌。
尽管已经在本文中示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。说明书中提供的具体示例不意在限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本公开内容，但本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制性的意义进行解释。在不背离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本公开内容的所有方面不限于本文阐述的特定描述、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，本文所述的本公开内容的实施方案的各种替代方案可以用于实施本公开内容。因此，考虑到本公开内容还将涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。意图是以下权利要求限定本公开内容的范围，并且由此涵盖落入这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。
1.一种体外细胞簇，其包含至少一种非天然胰腺β细胞，所述非天然胰腺β细胞在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，其中所述细胞簇是未分选的细胞簇，并且其中所述细胞簇包含：
(a)至少约35％的表达nkx6.1和c肽的细胞；
(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞；
(c)至多约2％的表达sox2的细胞；或者
(d)至多约10％的表达sox9的细胞。
2.一种体外细胞簇，其包含至少一种不包含荧光蛋白的nkx6.1 和c肽 细胞，其中所述细胞簇在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，并且其中所述细胞簇包含：
(a)至少约35％的表达nkx6.1和c肽的细胞；
(b)至少约70％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞；
(c)至多约2％的表达sox2的细胞；或者
(d)至多约10％的表达sox9的细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞簇，其中所述至少一种nkx6.1 和c肽 细胞是非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞簇，其包含至少约35％的表达nkx6.1和c肽的细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞簇，其包含至少约40％或至少约60％的表达nkx6.1和c肽的细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞簇，其包含至少约70％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞簇，其包含至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞簇，其包含至多约2％的表达sox2的所述细胞簇中的细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞簇，其包含至多约1.5％、至多约1％或至多约0.5％的表达sox2的细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的细胞簇，其包含至多约10％的表达sox9的细胞。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞簇，其包含至多约5％、至多约3％或至多约2％的表达sox9的细胞。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞簇，其包含至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％的表达ki67的细胞。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇具有约150μm的直径。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇具有约50μm至约250μm的直径。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇具有约100μm至约200μm的直径。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞簇，其中与第二葡萄糖浓度相比，所述体外细胞簇响应于第一葡萄糖浓度表现出更高的胰岛素分泌，其中所述第一葡萄糖浓度高于所述第二葡萄糖浓度。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇进一步包含至少一种表达胰高血糖素的细胞或至少一种表达促生长素抑制素的细胞。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞簇，其中所述体外细胞簇响应于k 的第一浓度表现出胰岛素分泌。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞簇，其中当移植到受试者体内时，所述体外细胞簇在移植后28天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞簇，其中当移植到受试者体内时，所述第二体外细胞簇在移植后14天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
21.根据权利要求1或3-20中任一项所述的细胞簇，其中：
(a)所述至少一种非天然胰腺β细胞包含一个或多个晶体胰岛素颗粒；
(b)所述至少一种非天然胰腺β细胞表达以下基因：ins、pdx1、nkx6-1和znt8；或者
(c)所述至少一种非天然胰腺β细胞不表达促生长素抑制素和胰高血糖素中的至少一种。
22.根据权利要求1或3-21中任一项所述的细胞簇，其中当顺序地施加第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷时，所述至少一种非天然胰腺β细胞对所述第一葡萄糖负荷、所述第二葡萄糖负荷和所述第三葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
23.根据权利要求1或3-22中任一项所述的细胞簇，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞响应于葡萄糖负荷的胰岛素分泌与所述葡萄糖负荷的葡萄糖浓度成比例。
24.根据权利要求1或3-23中任一项所述的细胞簇，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞是基因修饰的。
25.根据权利要求1或3-24中任一项所述的细胞簇，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞不包含编码信号多肽的外源性核酸序列，所述信号多肽指示所述至少一种非天然胰腺β细胞中的胰岛素表达。
26.根据权利要求25所述的细胞簇，其中所述非天然胰腺β细胞中所述信号多肽的表达由胰岛素启动子所驱动。
27.根据权利要求25所述的细胞簇，其中所述信号多肽包括荧光蛋白。
28.一种组合物，其包含在培养基中的根据权利要求1-27中任一项所述的至少一种细胞簇。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述培养基是无血清的。
30.根据权利要求28或29所述的组合物，其中重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中所述重聚培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的组合物，其中所述重聚培养基不包含激活受体样激酶-5(alk5)抑制剂。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的组合物，其中所述培养基不包含rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)的外源性抑制剂。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的组合物，其中所述培养基不包含外源性细胞外基质分子。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的组合物，其中所述细胞簇悬浮在所述培养基中。
36.根据权利要求28-35中任一项所述的组合物，其中所述培养基以至少30rpm的预定速度进行搅拌。
37.根据权利要求28-36中任一项所述的组合物，其中所述培养基以至少60rpm的预定速度进行搅拌。
38.根据权利要求28-37中任一项所述的组合物，其中所述培养基包括mcdb131基础培养基。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述mcdb131基础培养基补充有2％的牛血清白蛋白(bsa)。
40.根据权利要求28-39中任一项所述的组合物，其中所述培养基包括cmrls培养基。
41.根据权利要求28-40中任一项所述的组合物，进一步包含含有所述至少一种细胞簇和所述培养基的生物反应器。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述生物反应器包括转瓶。
43.一种方法，其包括：
(a)在培养基中使包含至少一种nkx6.1 细胞的细胞群体分化为包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇，所述培养基包含选自以下的因子：转化生长因子β(tgf-β)信号传导途径抑制剂、甲状腺激素(th)信号传导途径激活剂、至少一种音猬(shh)途径抑制剂、视黄酸(ra)信号传导途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、骨形态发生蛋白(bmp)信号传导途径抑制剂、至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子及其任何组合；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；以及
(c)在重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中：
(i)至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽；
(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a；
(iii)至多约2％的细胞表达sox2；或
(iv)至多约10％的细胞表达sox9。
44.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；以及
(c)在重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中：
(i)至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽；
(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a；
(iii)至多约2％的细胞表达sox2；或
(iv)至多约10％的细胞表达sox9。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述至少一种来自表皮生长因子(egf)家族的生长因子包括β细胞素。
46.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞，其中所述解离不包括使所述多个细胞经历流式细胞术；以及
(c)在无血清重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中：
(i)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更高百分比的表达嗜铬粒蛋白a的细胞；
(ii)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更高百分比的表达nkx6.1和c肽的细胞；
(iii)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更低百分比的表达sox2的细胞；或
(iv)与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇包含更低百分比的表达sox9的细胞。
47.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种nkx6.1 和c肽 细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞，其中所述解离不包括使所述多个细胞经历流式细胞术；以及
(c)在重聚培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，并允许所述多个细胞的至少部分形成第二体外细胞簇，
其中所述第二体外细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答；并且
其中：
(i)至少约35％的细胞表达nkx6.1和c肽；
(ii)至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a；
(iii)至多约2％的细胞表达sox2；或
(iv)至多约10％的细胞表达sox9。
48.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，其在暴露于葡萄糖负荷时表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法，其中所述解离包括所述第一细胞簇的酶促解离。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述解离包括使所述第一细胞簇与胰蛋白酶接触。
51.根据权利要求43-45或47-50中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基是无血清的。
52.根据权利要求43-51中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基以预定速度搅拌。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述预定速度是至少30rpm或至少60rpm。
54.根据权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基包括mcdb131基础培养基。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述mcdb131基础培养基补充有2％的牛血清白蛋白(bsa)。
56.根据权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基包括cmrls培养基。
57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基包括mcdb131基础培养基。
58.根据权利要求47-57中任一项所述的方法，其中：
(a)所述至少一种非天然胰腺β细胞包含一个或多个晶体胰岛素颗粒；
(b)所述至少一种非天然胰腺β细胞表达以下基因：ins、pdx1、nkx6-1和znt8；或者
(c)所述至少一种非天然胰腺β细胞不表达促生长素抑制素和胰高血糖素中的至少一种。
59.根据权利要求47-58中任一项所述的方法，其中当顺序地施加第一葡萄糖负荷、第二葡萄糖负荷和第三葡萄糖负荷时，所述至少一种非天然胰腺β细胞对所述第一葡萄糖负荷、所述第二葡萄糖负荷和所述第三葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
60.根据权利要求47-59中任一项所述的方法，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞是基因修饰的。
61.根据权利要求47-60中任一项所述的方法，其中所述至少一种非天然胰腺β细胞响应于葡萄糖负荷的胰岛素分泌与所述葡萄糖负荷的葡萄糖浓度成比例。
62.根据权利要求43-61中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含三碘甲腺原氨酸。
63.根据权利要求43-62中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性甲状腺激素信号传导途径激活剂。
64.根据权利要求43-63中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含激活受体样激酶-5(alk5)抑制剂。
65.根据权利要求43-64中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性转化生长因子β信号传导途径抑制剂。
66.根据权利要求43-65中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)的外源性抑制剂。
67.根据权利要求43-66中任一项所述的方法，其中所述重聚培养基不包含外源性细胞外基质分子。
68.根据权利要求43-67中任一项所述的方法，其中所述第一细胞簇是从冷冻保存恢复的。
69.根据权利要求43-68中任一项所述的方法，进一步包括从冷冻保存恢复所述第一细胞簇。
70.根据权利要求43-69中任一项所述的方法，进一步包括在所述培养前将所述多个细胞冷冻保存一段时间。
71.根据权利要求70所述的方法，进一步包括在所述培养前从所述冷冻保存恢复所述多个细胞。
72.根据权利要求43-71中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有所述第一细胞簇的至多50％的直径。
73.根据权利要求43-72中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有所述第一细胞簇的至多30％的直径。
74.根据权利要求43-73中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有约150μm的直径。
75.根据权利要求43-73中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有约50μm至约250μm的直径。
76.根据权利要求43-75中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇具有约100μm至约200μm的直径。
77.根据权利要求43-76中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达嗜铬粒蛋白a的细胞的百分比高至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍或至少1.5倍。
78.根据权利要求43-77中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％的表达嗜铬粒蛋白a的细胞。
79.根据权利要求43-78中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达nkx6.1和c肽的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达nkx6.1和c肽的细胞的百分比高至少1.5倍、至少1.75倍或至少2倍。
80.根据权利要求43-79中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至少约35％、至少约40％或至少约60％的表达nkx6.1和c肽的细胞。
81.根据权利要求43-80中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达sox2的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达sox2的细胞的百分比低至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。
82.根据权利要求43-81中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至多约2％、至多约1.5％、至多约1％或至多约0.5％的表达sox2的细胞。
83.根据权利要求43-82中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇中表达sox9的细胞的百分比比所述第一细胞簇中表达sox9的细胞的百分比低至少2倍、至少3倍、至少5倍或至少10倍。
84.根据权利要求43-83中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至多约10％、至多约5％、至多约3％或至多约2％的表达sox9的细胞。
85.根据权利要求43-84中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有较低百分比的表达ki67的细胞。
86.根据权利要求43-85中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇包含至多约2％、至多约1％、至多约0.5％或至多约0.1％的表达ki67的细胞。
87.根据权利要求43-86中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有更高的胰岛素含量。
88.根据权利要求43-87中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有高至少1.1倍、至少1.25倍或至少1.5倍的胰岛素含量。
89.根据权利要求43-88中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇与所述第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第二葡萄糖浓度相比所分泌的胰岛素的比率，其中所述第一葡萄糖浓度高于所述第二葡萄糖浓度。
90.根据权利要求43-89中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇响应于k 的第一浓度表现出胰岛素分泌。
91.根据权利要求43-90中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇响应于大于10mm的高葡萄糖浓度表现出双相胰岛素分泌。
92.根据权利要求43-91中任一项所述的方法，其中所述第二体外细胞簇进一步包含至少一种表达胰高血糖素的细胞或至少一种表达促生长素抑制素的细胞。
93.根据权利要求43-92中任一项所述的方法，其中所述第一细胞簇中至少约95％、至少约98％或至少约99％的表达nkx6.1和c肽的细胞被保留在所述第二体外细胞簇中。
94.根据权利要求43-93中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有更高的耗氧率。
95.根据权利要求43-94中任一项所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二体外细胞簇具有高至少1.1倍、至少1.25倍或至少1.5倍的耗氧率。
96.根据权利要求43-95中任一项所述的方法，其中当移植到受试者体内时，所述第二体外细胞簇在移植后28天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
97.根据权利要求43-96中任一项所述的方法，其中当移植到受试者体内时，所述第二体外细胞簇在移植后14天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
98.一种根据权利要求43-97中任一项所述的方法生成的体外细胞簇。
99.一种装置，其包含根据权利要求1-27或98中任一项所述的体外细胞簇，其中所述装置被配置为当植入受试者体内时产生并释放胰岛素。
100.根据权利要求99所述的装置，进一步包含半透膜，其中所述半透膜被配置为将所述细胞簇保留在所述装置中并允许所述细胞簇分泌的胰岛素通过。
101.根据权利要求100所述的装置，其中所述细胞簇被所述半透膜封装。
102.根据权利要求100或101所述的装置，其中所述半透膜由多糖或聚阳离子制成。
103.根据权利要求100-102中任一项所述的装置，其中所述半透膜由选自下组的材料制成：聚(丙交酯)(pla)、聚(乙醇酸)(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)、其他聚羟基酸、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚磷腈、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚四氟乙烯(ptfe)、可生物降解的聚氨酯、白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、聚氨基酸、谷醇溶蛋白、藻酸盐、琼脂糖、琼脂糖与明胶、右旋糖酐、聚丙烯酸酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物和其他酰基取代的乙酸纤维素及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯及其任何组合。
104.根据权利要求100-103中任一项所述的装置，其中所述半透膜包含藻酸盐。
105.根据权利要求100-104中任一项所述的装置，其中所述细胞簇被封装在微胶囊中，所述微胶囊包含被所述半透膜包围的藻酸盐核心。
106.一种治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求1-27或98中任一项所述的细胞簇或其部分施用于所述受试者。
107.一种治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求99-105中任一项所述的装置植入到所述受试者。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述受试者患有代谢紊乱或具有增加的患代谢紊乱的风险。
109.根据权利要求106-108中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自下组的糖尿病：i型糖尿病、ii型糖尿病和1.5型糖尿病。
110.一种包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
111.一种包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
112.一种包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当移植到受试者体内时，所述细胞簇在所述移植后28天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
113.一种包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当移植到受试者体内时，所述细胞簇在所述移植后约28天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
114.根据权利要求110或112所述的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约90％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的。
115.根据权利要求111或113所述的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
116.根据权利要求110或112所述的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
117.根据权利要求111或113所述的细胞簇，其中当顺序地施加第一和第二葡萄糖负荷时，所述细胞簇对所述第一葡萄糖负荷和所述第二葡萄糖负荷表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
118.根据权利要求112或113所述的细胞簇，其中当移植到所述受试者体内时，所述细胞簇在所述移植后14天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
119.根据权利要求110-118中的一项所述的细胞簇，其中所述细胞簇具有小于约300μm的直径。
120.根据权利要求119所述的细胞簇，其中所述直径小于约100μm。
121.根据权利要求110-120中的一项所述的细胞簇，其中所述细胞簇中少于约10％的细胞不是活的。
122.根据权利要求110-121中的一项所述的细胞簇，其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出葡萄糖刺激的钙通量应答。
123.一种包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，并且所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，并且其中当移植到受试者体内时，所述细胞簇在所述移植后约28天内对所述受试者中的葡萄糖负荷表现出体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答。
124.一种包含根据权利要求110-118中的一项所述的细胞簇和支架的组合物。
125.根据权利要求124所述的组合物，其中所述支架是可生物降解的支架。
126.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；
(c)在包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，从而使用所述多个细胞的至少部分在体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)所述第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)所述第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
127.一种方法，其包括：
(a)获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；
(c)在培养基中培养来自(a)的所述多个细胞，所述培养基包含
(i)血清；以及
(ii)甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂中的一种，
从而使用所述多个细胞的至少部分在体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含非天然胰腺β细胞，并且其中(i)所述第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)所述第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述培养基进一步包含甲状腺激素信号传导途径激活剂。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述培养基进一步包含转化生长因子β信号传导途径抑制剂。
130.根据权利要求126或128所述的方法，其中所述甲状腺激素信号传导途径激活剂是三碘甲腺原氨酸。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述培养基中的所述三碘甲腺原氨酸的浓度为约0.1μm至约10μm。
132.根据权利要求126或129所述的方法，其中所述转化生长因子β信号传导途径抑制剂是激活素受体样激酶-5抑制剂。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述培养基中的所述激活素受体样激酶-5抑制剂的浓度为约1μm至约50μm。
134.根据权利要求126所述的方法，其中所述培养基进一步包含选自人血清、人血小板裂解物、胎牛血清和血清替代物的血清。
135.根据权利要求127或134所述的方法，其中所述培养基包含约5％至约15％的血清。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述培养基包含约10％的血清。
137.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述培养基进一步包括connought医学研究实验室1066补充胰岛培养基(cmrls)或mcdb131基础培养基。
138.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述培养基进一步包含细胞外基质分子。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述细胞外基质分子是肝素。
140.根据权利要求138所述的方法，其中所述细胞外基质分子是层粘连蛋白。
141.根据权利要求126或127所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二细胞簇包含较高百分比的表达嗜铬粒蛋白a的细胞，如通过流式细胞术所测量的。
142.根据权利要求126或127所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二细胞簇包含较高百分比的表达nkx6.1和c肽的细胞，如通过流式细胞术所测量的。
143.根据权利要求126或127所述的方法，其中与所述第一细胞簇相比，所述第二细胞簇包含较少的不成活细胞。
144.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述多个细胞的部分未能形成所述第二细胞簇，并且未能形成所述第二细胞簇的所述多个细胞的部分中少于约10％表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
145.根据权利要求126或127所述的方法，其中所述第二细胞簇的直径小于所述第一细胞簇的直径。
146.根据权利要求126或127所述的方法，其中当在体外暴露于葡萄糖负荷时，所述第二细胞簇与所述第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第二葡萄糖浓度相比所分泌的胰岛素的比率，其中所述第一葡萄糖浓度高于所述第二葡萄糖浓度。
147.根据权利要求126或127所述的方法，其中当在体内暴露于葡萄糖负荷时，所述第二细胞簇与所述第一细胞簇相比表现出更高的刺激指数，其中所述刺激指数等于响应于第一葡萄糖浓度与第二葡萄糖浓度相比所分泌的胰岛素的比率，其中所述第一葡萄糖浓度高于所述第二葡萄糖浓度。
148.根据权利要求126或127所述的方法，其中在转瓶中培养来自(b)的所述多个细胞。
149.根据权利要求126或127所述的方法，其中来自(b)的所述多个细胞在体外由一个或多个干细胞生成。
150.根据权利要求149所述的方法，其中来自(b)的所述多个细胞由一个或多个诱导多能干细胞生成。
151.根据权利要求126或127所述的方法，其中来自(b)的所述多个细胞在所述培养基中培养至少1天。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述多个细胞在所述培养基中培养至少4天。
153.一种用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含根据权利要求1、2、3、4中任一项所述的细胞簇或其部分的组合物。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述受试者是人类。
155.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病或具有增加的患糖尿病的风险。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述糖尿病是i型糖尿病、ii型糖尿病、1.5型糖尿病或前驱糖尿病。
157.根据权利要求153所述的方法，其中所述施用包括在肾小囊下、在肝中或在胰腺中施用所述组合物。
158.根据权利要求153或154所述的方法，进一步包括冷冻保存所述第二细胞簇，从而产生冷冻保存的第二细胞簇。
159.根据权利要求158所述的方法，进一步包括解冻所述冷冻保存的第二细胞簇，从而产生包含至少一种非天然胰腺β细胞的解冻的第二细胞簇。
160.根据权利要求159所述的方法，其中(i)所述解冻的第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)所述解冻的第二细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
161.一种用于根据权利要求126-160中任一项所述的方法的系统，所述系统包含磁力搅拌板、包含来自所述第一细胞簇的多个细胞的转瓶，其中所述磁力搅拌板和所述转瓶被配置用于搅拌来自所述第一簇的所述多个细胞，从而使用所述多个细胞的至少部分在体外形成所述第二细胞簇。
162.一种用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括：
(a)获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；
(c)在包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养来自(a)的所述多个细胞，从而使用所述多个细胞的至少部分在体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)所述第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)所述第二细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的；以及
(d)将包含所述第二细胞簇或其部分的组合物施用于所述受试者。
163.一种用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病的方法，所述方法包括：
(a)获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；
(c)在培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，所述培养基包含
(i)血清；以及
(ii)甲状腺激素信号传导途径激活剂或转化生长因子β信号传导途径抑制剂，
从而从所述多个细胞的至少部分体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)所述第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)所述第二细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的；以及
(d)将包含所述第二细胞簇或其部分的组合物施用于所述受试者。
164.一种药物组合物，其包含根据前述细胞簇权利要求中任一项所述的细胞簇或其部分以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
165.根据权利要求164所述的药物组合物，其中所述药物组合物是液体组合物。
166.根据权利要求165所述的药物组合物，其中所述药物组合物是胶囊。
167.根据权利要求166所述的药物组合物，其中所述胶囊是凝胶胶囊。
168.根据权利要求166所述的药物组合物，其中所述胶囊是脂质体。
169.一种包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇通过包含以下的过程制备：
(a)获得包含至少一种非天然胰腺β细胞的第一细胞簇；
(b)从所述第一细胞簇解离多个细胞；
(c)在包含甲状腺激素信号传导途径激活剂和转化生长因子β信号传导途径抑制剂的培养基中培养来自(b)的所述多个细胞，从而从所述多个细胞的至少部分体外形成第二细胞簇，其中所述第二细胞簇包含至少一种非天然胰腺β细胞，并且其中(i)所述第二细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，和/或(ii)所述第二细胞簇中至少约40％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的。
170.一种试剂盒，其包含(i)包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约70％的细胞表达嗜铬粒蛋白a，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，以及(ii)缓冲液。
171.一种试剂盒，其包含(i)包含至少一种非天然胰腺β细胞的细胞簇，其中所述细胞簇中至少约25％的细胞表达nkx6.1和c肽，如通过流式细胞术所测量的，并且其中当暴露于葡萄糖负荷时，所述细胞簇表现出体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌应答，以及(ii)缓冲液。
技术总结