本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种鼠源性抗人fa单克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
：叶酸(folate，fa)是1941年由米切尔(h.k.mitchell)从菠菜中提取纯化的，其是一种水溶性维生素，因绿叶中含量十分丰富而得名，又名喋酰谷氨酸。在自然界中有几种存在形式，其母体化合物是由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸3种成分结合而成，其分子式为c19h19n7o6，化学结构式如下所示：叶酸作为机体细胞生长和繁殖必不可少的维生素之一，缺乏会对人体正常的生理活动产生影响。许多文献报道，缺乏叶酸与神经管畸形、巨幼细胞贫血、唇腭裂、抑郁症、肿瘤等疾病有直接关系。神经管畸形：神经管畸形(ntds)是胚胎在发育过程中神经管闭合不全而引起的一组缺陷，包括无脑儿、脑膨出、脊柱裂等，是最常见的新生儿缺陷疾病之一。世界范围内ntds发病率约为千分之零点五至千分之二。我国是ntds的高发国家，每年有较多的ntds患儿出生，ntds给家庭和社会带来沉重的压力和负担。ntds的发病主要由基因与环境的相互作用导致。1991年，英国医学研究委员会才首次证实了妊娠前后补充叶酸可预防ntds的发生，降低50-70％的发病率。叶酸对ntds的预防作用已被认为是20世纪后期最令人激动的医学发现之一。1995，我国卫生局提倡新婚和准备生育的妇女服用叶酸增补剂，使“九五”期间我国ntds的发生率下降50％。2000年，中国营养协会建议育龄妇女毎日膳食中叶酸的推荐摄入量为400微克，各阶段的产妇为每天600微克，叶酸的每日最高允许摄入量均为1000微克。巨幼红细胞贫血：巨幼细胞贫血(ma)是由于缺乏叶酸或维生素b12而引起的脱氧核糖核酸合成障碍而导致的一种贫血，以婴孩与孕妇多见。正常发育的胎儿要求母亲体内有大量的叶酸储备，如果在临产或产后早期叶酸储备耗尽，导致胎儿和母亲巨幼细胞贫血，补充叶酸后，本病可迅速恢复和治愈。叶酸与唇腭裂：唇腭裂(clp)是最常见的先天性出生缺陷畸形之一，唇腭裂的发病原因还不明确，事实证明母孕早期补充叶酸可预防唇腭裂儿的出生。有学者研究了179例唇腭裂家庭和204例对照家庭，发现未补充叶酸或者低叶酸饮食的母亲，生出唇腭裂孩子的风险比正常补充叶酸的家庭大约高6倍。其他疾病：叶酸缺乏会给母亲和孩子带来很大伤害，例如，习惯性流产、早产、婴儿出生体重过低、胎儿消化不良及生长迟缓等。许多文献报道，老年期痴呆症、抑郁症及新生儿的神经系统发生异常等有关脑病变疾病，都与叶酸的缺乏有着一定的关联。另外，缺乏叶酸还可能引起肿瘤(子宫癌、支气管癌、食道癌、大肠癌等)、慢性萎缩性胃炎、结肠炎、冠心病和脑血管疾病等多种疾病，以及其他如舌炎、生长不良、智力退化等症状。成年人若缺乏叶酸又饮酒过量可能会改变其肠黏膜的结构。叶酸对以上疾病均有预防的治疗作用，除了ntds外，补充叶酸即可使机体恢复健康，这种叶酸与疾病间的可逆关系在临床上非常重要。因此，如果能够快速准确地检测叶酸在样本(例如人体)中的含量，则必将有效地解决上述现象，例如提供一种能够与叶酸特异性结合效果好、灵敏度高的抗体并将其应用于试纸条等易携带、易操作的检测技术，则可有望有效地、快捷地甚至家庭化的实时检测。现有技术中已有用于制备上述特定抗体的免疫原包括fa(叶酸)-bsa(牛血清白蛋白)、fa(叶酸)-aca(氨基己酸)-bsa(牛血清白蛋白)等，而制备上述免疫原的方法主要包括如下几种：1、在edc/nhs存在下，将fa与bsa按照一定摩尔比混合，4度反应过夜，10mmol/lph7.4pbs透析得到fa-bsa；2、用戊二醛将fa进行活化，并偶联至惰性蛋白(bsa)上，得到fa-bsa；3、文献《antibodytofolicacid》报道：首先制备aca-bsa，500mgbsa溶于10ml纯化水中，加入1gaca和300mgedc，室温反应4小时，10mmol/lph7.4pbs透析得到aca-bsa；制备fa-aca-bsa，25mgfa、10mgnhs、23mgdcc，与100mgaca-bsa直接反应，4度过夜，10mmol/lph7.4pbs透析得到fa-aca-bsa；然而此些方法制备的免疫原用于制备抗体尤其是单抗时，却存在免疫原性差，同时制备的抗体尤其是单抗(目前基本为多抗)用于检测叶酸时存在特异性较差、灵敏度不足等缺陷，而且还存在生产效率低、收率低、耗时长等缺陷。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种制备新型鼠源性抗人fa单克隆抗体的方法，其制备的鼠源性抗人fa单克隆抗体在人体叶酸检测中具有灵敏度高以及特异性好等优点。本发明同时还提供一种上述方法制备的新型鼠源性抗人fa单克隆抗体。为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：一种鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(1)制备叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物(fa-aca-klh)(a)使氨基己酸(aca)与血蓝蛋白(klh)在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)存在下、在水中反应，透析，分离，获得含有氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的上清液；(b)将溶解在碳酸盐缓冲液中的叶酸(fa)以及分别溶解在有机溶剂中的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和二环己基碳二亚胺(dcc)混合反应，获得反应混合液，再将所述反应混合液加入步骤(a)所获得的上清液中，室温搅拌过夜，制得所述叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物；(2)将步骤(1)制备的叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物作为免疫原，免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，单克隆化获得可表达抗叶酸抗体且可分泌鼠源性抗人叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用所述杂交瘤细胞株于小鼠体内培养，分离，即可制得所述鼠源性抗人fa单克隆抗体。根据本发明的一些优选方面，步骤(a)中，所述氨基己酸、所述血蓝蛋白和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的投料质量比为1∶0.4-0.6∶0.2-0.4。根据本发明的一些优选方面，步骤(a)中，所述反应在室温下进行。根据本发明，步骤(a)中，所述反应的反应时间为3-5小时。根据本发明的一些优选且具体的方面，步骤(a)中，所述透析采用的透析液为ph值为7.4-7.6的磷酸缓冲盐溶液。根据本发明的一些优选方面，步骤(b)中，所述有机溶剂为二甲基亚砜。根据本发明的一些优选方面，步骤(b)中，所述混合反应在室温下进行。根据本发明的一些优选方面，步骤(b)中，控制溶解在碳酸盐缓冲液中的叶酸的浓度以及溶解在有机溶剂中的n-羟基琥珀酰亚胺的浓度和二环己基碳二亚胺的浓度分别为1-30mg/ml。根据本发明的一些优选方面，步骤(b)中，控制所述叶酸与所述氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的投料摩尔比为20-100∶1。根据本发明，步骤(b)中，所述混合反应的时间为1-3小时。根据本发明的一些具体方面，步骤(b)中，所述制备方法还包括在所述室温搅拌过夜之后的后处理步骤，所述后处理步骤包括透析步骤以及离心分离步骤。根据本发明的一些具体方面，步骤(2)中，所述小鼠为balb/c小鼠。根据本发明的一些具体方面，步骤(2)中，所述单克隆化采用有限稀释法进行。根据本发明的一些具体方面，步骤(2)中，所述免疫注射小鼠的次数为多次，注射剂量一般为10-200微克/只。在本发明的方法中，细胞融合的方法不受限制，可以采用本领域中公知的方法和流程。在本发明的方法中，单克隆化的方法不受限制，可以采用本领域中公知的方法和流程。在本发明的方法中，在小鼠体内培育杂交瘤细胞株并分泌抗体的方法不受限制，可以采用本领域中公知的方法和流程。本发明提供的又一技术方案：一种上述所述的制备方法制备的鼠源性抗人fa单克隆抗体。由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明创新地提供一种采用新的免疫原叶酸偶联物，此新型的免疫原叶酸偶联物活性好，能引起的免疫应答更强，用其制备的抗体尤其是单克隆抗体对于人体叶酸检测而言灵敏度高、特异性好；此外，上述方法在制备本发明特定的免疫原叶酸偶联物时，收率高，偶联产物单一，纯度好，且制备方法简单，易操作，因而可广泛地用于制备抗人fa单克隆抗体。附图说明图1为本发明应用实施例1制备的抗体并采用sds-pgage电泳初步鉴定图；图2为本发明应用实施例1竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标准图；图3为本发明应用实施例1竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标识值与检测值的关系曲线；图4为本发明应用实施例2制备的抗体并采用sds-pgage电泳初步鉴定图；图5为本发明应用实施例2竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标准图；图6为本发明应用实施例2竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标识值与检测值的关系曲线；图7为本发明应用实施例3制备的抗体并采用sds-pgage电泳初步鉴定图；图8为本发明应用实施例3竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标准图；图9为本发明应用实施例3竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标识值与检测值的关系曲线；图10为本发明应用对比例1竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标准图；图11为本发明应用对比例1竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标识值与检测值的关系曲线；图12为本发明应用对比例2竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标准图；图13为本发明应用对比例2竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试标识值与检测值的关系曲线。具体实施方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明；应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。下述中，如无特殊说明，所有的原料均来自于商购或者通过本领域的常规方法制备而得。碳酸盐缓冲液(cbs)购自碳酸氢钠试剂购自国药化学试剂有限公司，碳酸钠购自天津市鼎盛鑫化工有限公司，所需的碳酸盐缓冲液(cbs)，ph值为9±0.5；磷酸缓冲盐溶液(pbs)购自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均购自国药化学试剂有限公司，ph值为7.5或7.4。实施例1本实施例提供一种叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物，其制备方法具体包括如下步骤：(1)使1g氨基己酸与500mg血蓝蛋白在300mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺存在下、在室温下、在10ml水中反应4小时，然后采用ph值7.5的pbs透析，离心分离5000rpm×3min，获得含有氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的上清液，测od浓度od280＝12.5mg/ml；(2)将23mg叶酸溶解在碳酸盐缓冲液中，控制浓度为22mg/ml；将8mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在二甲基亚砜中，控制浓度为7.6mg/ml；将24mg二环己基碳二亚胺(dcc)溶解在二甲基亚砜中，控制浓度为23mg/ml；然后将三者混合，室温反应2小时，获得反应混合液，再将所述反应混合液加入步骤(1)所获得的上清液中，室温搅拌过夜，采用ph值7.4的pbs透析，离心分离5000rpm×30min，可用sephadexg25凝胶层析分离偶联物，再重复采用ph值7.4的pbs透析，离心分离5000rpm×30min，制得所述叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物，76.5mg；其中控制控制所述叶酸与所述氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的投料摩尔比为60∶1，偶联物收率为95％(所的偶联物质量/总投料量)，纯度95％。实施例2本实施例提供一种叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物，其制备方法具体包括如下步骤：(1)使1g氨基己酸与500mg血蓝蛋白在300mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺存在下、在室温下、在10ml水中反应4小时，然后采用ph值7.5的pbs透析，离心分离5000rpm×3min，获得含有氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的上清液，测od浓度od280＝12.5mg/ml；(2)将25mg叶酸溶解在碳酸盐缓冲液中，控制浓度为17mg/ml；将10mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在二甲基亚砜中，控制浓度为7mg/ml；将23mg二环己基碳二亚胺(dcc)溶解在二甲基亚砜中，控制浓度为16mg/ml；然后将三者混合，室温反应2小时，获得反应混合液，再将所述反应混合液加入步骤(1)所获得的上清液中，室温搅拌过夜，采用ph值7.4的pbs透析，离心分离5000rpm×30min，可用sephadexg25凝胶层析分离偶联物，再重复采用ph值7.4的pbs透析，离心分离5000rpm×30min，制得所述叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物,127mg；其中控制控制所述叶酸与所述氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的投料摩尔比为30∶1，偶联物收率为85％，纯度85％。实施例3本实施例提供一种叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物，其制备方法具体包括如下步骤：(1)使1g氨基己酸与500mg血蓝蛋白在300mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺存在下、在室温下、在10ml水中反应4小时，然后采用ph值7.5的pbs透析，离心分离5000rpm×3min，获得含有氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的上清液，测od浓度od280＝12.5mg/ml；(2)将30mg叶酸溶解在碳酸盐缓冲液中，控制浓度为10mg/ml；将10mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在二甲基亚砜中，控制浓度为3.5mg/ml；将35mg二环己基碳二亚胺(dcc)溶解在二甲基亚砜中，控制浓度为12mg/ml；然后将三者混合，室温反应2小时，获得反应混合液，再将所述反应混合液加入步骤(1)所获得的上清液中，室温搅拌过夜，采用ph值7.4的pbs透析，离心分离5000rpm×30min，可用sephadexg25凝胶层析分离偶联物，再重复采用ph值7.4的pbs透析，离心分离5000rpm×30min，制得所述叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物，94mg；其中控制控制所述叶酸与所述氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的投料摩尔比为60∶1，偶联物收率为90％，纯度88％。对比例1-2本些对比例分别提供按照
背景技术：
方法制备的偶联物fa(叶酸)-bsa(牛血清白蛋白)和fa-aca-bsa。应用实施例1本例提供一种鼠源性抗人fa单克隆抗体，其具体制备方法包括如下步骤：1.免疫原以实施例1制备的叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物作为免疫原。2.免疫动物本发明所用免疫动物为balb/c小鼠，为spf级别，由上海实验动物中心提供。免疫佐剂为quickantibody，购自北京康碧泉公司。免疫流程参照quickantibody说明书进行。具体如表1所示：表1、免疫途径与周期方法途径剂量(μg/只)佐剂时间间隔(单位：周)首次免疫皮下多点注射100完全佐剂0再免肌肉注射50不完全佐剂2再免肌肉注射50不完全佐剂2加强免疫肌肉注射20不完全佐剂23.细胞融合1)细胞准备a.饲养层细胞于融合前一天取balb/c小鼠(为spf级别，由上海实验动物中心提供)腹腔巨噬细胞，重悬于hat培养液(购自gibco公司，含有黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)。接种于96孔板，置37℃，5％co2培养箱中培养24h。b.骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞株sp20-ag14(本实验室保存)不合成和分泌任何一种小鼠免疫球蛋白重链和轻链，此细胞对8-氮杂鸟嘌呤具有抗性，而在hat选择性培养基不能生长。融合前一个星期，用普通的dmem完全培养基(含15％fbs，购自gibco公司)分瓶培养杂交瘤细胞，以使细胞能生长良好。每一个融合准备250ml生长密度为2×l06cells/m1处于对数生长中期的健康细胞。c.免疫小鼠脾脏细胞处死免疫的小鼠，用酒精浸润后取出脾脏。预先准备好10cm2无菌培养皿，放入细胞筛网，并加入10ml无血清dmem培养基。把脾脏置于细胞筛网上，并用无菌手术剪将脾脏剪成碎片。注射器内芯挤压研磨脾脏后，用5mldmem不完全培养基冲洗，使细胞通过过筛网进入50ml离心管中。收集脾脏细胞悬液，用于融合。2)融合a.准备20ml无血清的dmem培养基和1mlpeg2000(购自sigma公司)放于37℃保温。b.收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，常温下1500rpm离心5min，用无血清培养基洗两次，然后将其悬浮于10ml无血清培养基中。将5×108脾细胞和1×108骨髓瘤细胞充分混合，1500rpm离心5min，弃上清。轻轻敲击管子底部使细胞松散。c.取出在37℃预热的培养基和peg，把细胞置于37℃水浴中，1min内匀速缓慢逐滴加1mlpeg，加完后及时用无血清的培养基终止。离心弃上清并用50mlhat培养液重悬细胞，轻轻混匀。d.将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中，每孔100μl。置37℃，5％co2培养箱中培养4天。根据细胞生长状态，在筛选前用hat培养液半换液1～3次，避免孔内培养基变黄。e.融合后7天后，改用含有ht培养液全换液。24h后，吸取细胞培养上清，间接elisa检测筛选阳性克隆。3)杂交瘤的单克隆化挑选阳性值较高的克隆孔，采用有限稀释法将孔中的细胞分别稀释至每毫升含5、10和50个细胞，然后接种于96孔板中，每孔接种100μl。37℃、5％co2湿润培养7～10天，出现肉眼可见的克隆即可检测细胞培养上清。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。4)鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备和纯化1.腹水收集提前一周用0.5ml石蜡油(购自sigma公司)注射小鼠腹腔。致敏一周后，将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用pbs或者不完全培养基重悬，调整细胞浓度至2×106cells/ml，注射0.5ml细胞悬液至小鼠腹腔中。7～10天后小鼠腹腔明显肿大，此时采集腹水。4℃，5000g离心20min，去除腹水中细胞碎片与油脂，然后加入等体积甘油保存于﹣20℃。2.纯化采用proteing亲和层析柱纯化抗体。具体步骤如下：a.用10倍柱体积水清洗proteing亲和层析柱。b.用10倍柱体积20mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)冲洗proteing亲和层析柱。c.将所需纯化样品泵入层析柱。d.用100mm甘氨酸缓冲液(ph3.5，ph2.7)洗脱，收集洗脱峰；并用1mtris缓冲液(ph9.0)中和收集物。e.10mmph7.2缓冲液透析脱盐。f.用sds-pgage电泳初步鉴定抗体，图1结果显示50kd及25kd处出现目的条带。3.鼠源性抗人fa单克隆抗体的特征分析1)间接elisa测定抗体滴度采用间接elisa测定抗体滴度的方法，设计抗原结合抗体实验测定抗体滴度。固定自产fa-bsa抗原浓度为0.125-2ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔100ul，4℃包被过夜。10％大牛血清在37℃封闭2小时。将所纯化抗体用高压pbs稀释至1mg/ml，每个样品设定三个平行，a1-a12孔以1/100比例加入抗体，然后以3倍的比例进行倍比稀释，37℃孵育40min，pbst(磷酸盐吐温缓冲液，ph值7.4)和pbs(磷酸盐缓冲液，ph值7.4)分别洗3次。加入1∶1000稀释hrp标记的山羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，pbst洗板6次。tmb显色液显色，室温显色10min，每孔加入1mol·l-1h2so450μl终止反应。采用单波长法于酶标仪上读取数据,该单克隆抗体a450nm值，具体如下表所示。上表可见，包被抗原浓度为0.5ug/ml，抗体稀释倍数为900时的光密度值为1.0048，最接近于1.0，因此选择包被抗原浓度为0.5ug/ml,抗体稀释倍为900为最佳工作条件。2)竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试按方阵滴定法所确定的最佳包被浓度进行包被，以确定的最佳稀释浓度对抗体进行，叶酸标准品的稀释浓度分别600、150、60、15、6、1.5ng/ml。实验结果如图2所示。按照上述最佳实验条件进行小样本(鼠源性抗人fa单克隆抗体)的临床测试，检测结果如下样本号标识值(ng/ml)检测值(ng/ml)样本号标识值(ng/ml)检测值(ng/ml)11.51.43113.43.2522.32.31123.13.0832.12.08132.92.7841.81.95142.132.2152.22.18151.71.7561.41.56162.22.2272.52.35171.41.4581.81.78182.452.3891.71.74191.81.84102.42.33202.12.15制作关系曲线如图3所示，获得相关系数r2为0.983，证明了本发明的鼠源性抗人fa单克隆抗体用于检测叶酸时的准确性优异。应用实施例2基本同应用实施例1，其区别仅在于：将实施例2制备的叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物作为免疫原。其中，4)鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备和纯化2.纯化f.用sds-pgage电泳初步鉴定抗体，图4结果显示50kd及25kd处出现目的条带。3.鼠源性抗人fa单克隆抗体的特征分析1)间接elisa测定抗体亲和力滴度采用间接elisa测定抗体滴度的方法，设计抗原结合抗体实验测定抗体滴度。固定自产fa-bsa抗原浓度为0.125-2ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔100ul，4℃包被过夜。10％大牛血清在37℃封闭2小时。将所纯化抗体用高压pbs稀释至1mg/ml，每个样品设定三个平行，a1-a12孔以1/100比例加入抗体，然后以3倍的比例进行倍比稀释，37℃孵育40min，pbst和pbs分别洗3次。加入1∶1000稀释hrp标记的山羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，pbst洗板6次。tmb显色液显色，室温显色10min，每孔加入1mol·l-1h2so450μl终止反应。采用单波长法于酶标仪上读取数据,该单克隆抗体a450nm值。上表可见，包被抗原浓度为0.5ug/ml，抗体稀释倍数为900时的光密度值为0.9948，最接近于1.0，因此选择包被抗原浓度为0.5ug/ml,抗体稀释倍为900为最佳工作条件。2)竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试按方阵滴定法所确定的最佳包被浓度进行包被，以确定的最佳稀释浓度对抗体进行，叶酸标准品的稀释浓度分别600、150、60、15、6、1.5ng/ml。实验结果如图5所示。按照上述最佳实验条件进行小样本(鼠源性抗人fa单克隆抗体)的临床测试，检测结果如下：制作关系曲线如图6所示，获得相关系数r2为0.980，证明了本发明的鼠源性抗人fa单克隆抗体用于检测叶酸时的准确性优异。应用实施例3基本同应用实施例1，其区别仅在于：将实施例3制备的叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物作为免疫原。其中，4)鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备和纯化2.纯化f.用sds-pgage电泳初步鉴定抗体，图7结果显示50kd及25kd处出现目的条带。3.鼠源性抗人fa单克隆抗体的特征分析1)间接elisa测定抗体滴度采用间接elisa测定抗体滴度的方法，设计抗原结合抗体实验测定抗体滴度。固定自产fa-bsa抗原浓度为0.125-2ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔100ul，4℃包被过夜。10％大牛血清在37℃封闭2小时。将所纯化抗体用高压pbs稀释至1mg/ml，每个样品设定三个平行，a1-a12孔以1/100比例加入抗体，然后以3倍的比例进行倍比稀释，37℃孵育40min，pbst和pbs分别洗3次。加入1∶1000稀释hrp标记的山羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，pbst洗板6次。tmb显色液显色，室温显色10min，每孔加入1mol·l-1h2so450μl终止反应。采用单波长法于酶标仪上读取数据,该单克隆抗体a450nm值。上表可见，包被抗原浓度为0.5ug/ml，抗体稀释倍数为900时的光密度值为1.0048，最接近于1.0，因此选择包被抗原浓度为0.5ug/ml,抗体稀释倍为900为最佳工作条件。2)竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试按方阵滴定法所确定的最佳包被浓度进行包被，以确定的最佳稀释浓度对抗体进行，叶酸标准品的稀释浓度分别600、150、60、15、6、1.5ng/ml。实验结果如图8所示。按照上述最佳实验条件进行小样本(鼠源性抗人fa单克隆抗体)的临床测试，检测结果如下：样本号检测值(ng/ml)标识值(ng/ml)样本号检测值(ng/ml)标识值(ng/ml)11.451.5113.243.422.152.3123.053.132.052.1132.712.941.911.8142.082.1352.152.2151.611.761.331.4161.992.272.432.5171.291.481.691.8182.312.4591.591.7191.681.8102.322.4202.192.1制作关系曲线如图9所示，获得相关系数r2为0.979，证明了本发明的鼠源性抗人fa单克隆抗体用于检测叶酸时的准确性优异。应用对比例1基本同应用实施例1，其区别仅在于：将对比例1的fa(叶酸)-bsa(牛血清白蛋白)作为免疫原。其中，3.鼠源性抗人fa单克隆抗体的特征分析1)间接elisa测定抗体滴度采用间接elisa测定抗体滴度的方法，设计抗原结合抗体实验测定抗体滴度。固定自产fa-aca-klh抗原浓度为0.125-2ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔100ul，4℃包被过夜。10％大牛血清在37℃封闭2小时。将所纯化抗体用高压pbs稀释至1mg/ml，每个样品设定三个平行，a1-a12孔以1/100比例加入抗体，然后以3倍的比例进行倍比稀释，37℃孵育40min，pbst和pbs分别洗3次。加入1∶1000稀释hrp标记的山羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，pbst洗板6次。tmb显色液显色，室温显色10min，每孔加入1mol·l-1h2so450μl终止反应。采用单波长法于酶标仪上读取数据,该单克隆抗体a450nm值。上表可见，包被抗原浓度为2ug/ml，抗体稀释倍数为300时的光密度值为1.0185，最接近于1.0，因此选择包被抗原浓度为2ug/ml,抗体稀释倍为300为最佳工作条件。2)竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试按方阵滴定法所确定的最佳包被浓度进行包被，以确定的最佳稀释浓度对抗体进行，叶酸标准品的稀释浓度分别600、150、60、15、6、1.5ng/ml。实验结果如图10所示。按照上述最佳实验条件进行小样本(fa(叶酸)-bsa(牛血清白蛋白)制备的抗体)的临床测试，检测结果如下：制作关系曲线如图11所示，获得相关系数r2仅为0.889，小于0.9，表明采用fa(叶酸)-bsa(牛血清白蛋白)制备的抗体用于检测叶酸时的准确性相对较差。应用对比例2基本同应用实施例1，其区别仅在于：将对比例2的fa-aca-bsa作为免疫原。外购其中，3.鼠源性抗人fa单克隆抗体的特征分析1)间接elisa测定抗体滴度采用间接elisa测定抗体滴度的方法，设计抗原结合抗体实验测定抗体滴度。固定自产fa-aca-klh抗原浓度为0.125-2ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔100ul，4℃包被过夜。10％大牛血清在37℃封闭2小时。将所纯化抗体用高压pbs稀释至1mg/ml，每个样品设定三个平行，a1-a12孔以1/100比例加入抗体，然后以3倍的比例进行倍比稀释，37℃孵育40min，pbst和pbs分别洗3次。加入1∶1000稀释hrp标记的山羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，pbst洗板6次。tmb显色液显色，室温显色10min，每孔加入1mol·l-1h2so450μl终止反应。采用单波长法于酶标仪上读取数据,该单克隆抗体a450nm值。上表可见，包被抗原浓度为1ug/ml，抗体稀释倍数为900时的光密度值为0.9917，最接近于1.0，因此选择包被抗原浓度为1ug/ml,抗体稀释倍为900为最佳工作条件。2)竞争性elisa测定抗体的小样本临床测试按方阵滴定法所确定的最佳包被浓度进行包被，以确定的最佳稀释浓度对抗体进行，叶酸标准品的稀释浓度分别600、150、60、15、6、1.5ng/ml。实验结果如图12所示。按照上述最佳实验条件进行小样本(fa-aca-bsa制备的抗体)的临床测试，检测结果如下：制作关系曲线如图13所示，获得相关系数r2仅为0.914，其值远小于本发明，表明采用fa-aca-bsa制备的抗体用于检测叶酸时的准确性相对较差。应用对比例3用实施例1、实施例2、实施例3中的偶联物fa-aca-klh，以及外购的fa-klh作为检测抗原，检测外购fa-bsa抗体的效价。间接法检测：采用间接elisa测定抗体滴度的方法，设计抗原结合抗体实验测定抗体滴度。分别固定实施例1、实施例2、实施例3中fa-aca-klh抗原，以及外购的fa-klh抗原，浓度为1ug/ml，加到96孔酶标板中，每孔100ul，4℃包被过夜。10％大牛血清在37℃封闭2小时。将外购的fa-bsa抗体用高压pbs稀释至1mg/ml，每个样品设定三个平行，a1-a12孔以1/100比例加入抗体，然后以3倍的比例进行倍比稀释，37℃孵育40min，pbst和pbs分别洗3次。加入1∶1000稀释hrp标记的山羊抗鼠抗体，37℃孵育40min，pbst洗板6次。tmb显色液显色，室温显色10min，每孔加入1mol·l-1h2so450μl终止反应。采用单波长法于酶标仪上读取数据,该单克隆抗体a450nm值。实验结果如下：抗原来源实施例1实施例2实施例3外购抗原1/1002.21242.08332.10011.74601/3002.08571.84201.77901.37801/9001.57241.55731.33940.78751/27000.92480.85100.77750.32491/81000.43910.43500.43340.10931/243000.23710.23050.22820.09771/729000.13010.12640.10110.0708pbs0.04320.04760.04370.0467由上表的实验数据可知，本专利实施例1-3所得偶联物作为检测抗原的检出率优于外购抗原。从而说明了fa-aca-klh偶联物对该项目抗体的亲和力更高。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物
(a)使氨基己酸与血蓝蛋白在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺存在下、在水中反应，透析，分离，获得含有氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的上清液；
(b)将溶解在碳酸盐缓冲液中的叶酸以及分别溶解在有机溶剂中的n-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺混合反应，获得反应混合液，再将所述反应混合液加入步骤(a)所获得的上清液中，室温搅拌过夜，制得所述叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物；
(2)将步骤(1)制备的叶酸-氨基己酸-血蓝蛋白偶联物作为免疫原，免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，单克隆化获得可表达抗叶酸抗体且可分泌鼠源性抗人叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用所述杂交瘤细胞株于小鼠体内培养，分离，即可制得所述鼠源性抗人fa单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述氨基己酸、所述血蓝蛋白和所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的投料质量比为1∶0.4-0.6∶0.2-0.4。
3.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述反应在室温下进行；和/或，步骤(a)中，所述反应的反应时间为3-5小时；和/或，步骤(a)中，所述透析采用的透析液为ph值为7.4-7.6的磷酸缓冲盐溶液。
4.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述有机溶剂为二甲基亚砜；和/或，步骤(b)中，所述混合反应在室温下进行。
5.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，控制溶解在碳酸盐缓冲液中的叶酸的浓度以及溶解在有机溶剂中的n-羟基琥珀酰亚胺的浓度和二环己基碳二亚胺的浓度分别为1-30mg/ml。
6.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，控制所述叶酸与所述氨基己酸-血蓝蛋白偶联物的投料摩尔比为20-100∶1。
7.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述混合反应的时间为1-3小时。
8.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述小鼠为balb/c小鼠。
9.根据权利要求1所述的鼠源性抗人fa单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述单克隆化采用有限稀释法进行。
10.一种权利要求1-9中任一项权利要求所述的制备方法制备的鼠源性抗人fa单克隆抗体。
技术总结本发明公开了一种鼠源性抗人FA单克隆抗体及其制备方法，制备方法包括：1)制备FA‑ACA‑KLH：a)使ACA与KLH在EDC存在下及水中反应，透析分离，得含有ACA‑KLH的上清液；b)将溶解在CBS中的FA以及分别溶解在有机溶剂中的NHS和DCC混合反应获得反应混合液，加入上清液中，室温搅拌过夜制得；2)将FA‑ACA‑KLH作为免疫原，免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，单克隆化获得可表达抗叶酸抗体且可分泌鼠源性抗人叶酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用杂交瘤细胞株于小鼠体内培养，分离，制得；本发明的鼠源性抗人FA单克隆抗体在人体叶酸检测中具有灵敏度高以及特异性好等优点。
技术研发人员：罗朝领;茅柳娟;尹文偲;曹雪姣
受保护的技术使用者：上海领潮生物新材料有限公司
技术研发日：2020.01.17
技术公布日：2020.06.05
