本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是涉及一种抗右旋氧氟沙星抗体的fab片段及其制备与应用。
背景技术：
氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones,fqs)，是临床上一类广谱抗生素。其中氧氟沙星(ofloxacin，ofl)作为第三代氟喹诺酮类抗菌药，是水生环境中最常检测到的氟喹诺酮药物之一。为保障动物食品质量安全和公共卫生安全，农业部第2292号公告规定禁止在食品动物中使用氧氟沙星等4种兽药。氧氟沙星是一种手性药物，包括左旋氧氟沙星(s-ofloxacin，s-ofl)和右旋氧氟沙星(r-ofloxacin，r-ofl)两种旋光活性对映异构体，其中左旋氧氟沙星比右旋氧氟沙星抑菌效力高两个数量级。氧氟沙星对映体具有完全相同的化学组成以及极为相似的理化性质，但由于旋光性的不同，导致对映体之间具有明显不同的生物活性。因此，有必要研究其由于光学活性差异导致的生物活性差异的机制。
基于抗原抗体的免疫分析方法，如酶联免疫检测方法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，可对小分子物质进行快速、高灵敏的检测筛查。利用手性分子可诱导产生具有对映选择性识别能力的抗体，在此基础上可实现手性小分子的特异性检测与分离，同时可开展手性分子与大分子抗体之间相互作用机制的研究。而在免疫分析方法中，经常会出现抗体的恒定区常与待测物发生非特异性相互作用的现象，而缺少恒定区的抗原结合片段(antigen-bindingfragments，fab)很好地规避了这一现象。同时，fab片段由轻链和重链fd片段(vh-ch1结构域)组成，完全保留了抗体的抗原结合部位，在免疫分析方法建立及活性机制研究中有广泛应用价值。
目前制备天然抗体fab片段的方法主要为酶解法，工艺简便，得率高。通过蛋白酶水解全抗igg铰链区上方肽键，将igg水解成抗原结合区fab片段和恒定区fc片段，随后对酶解产物进行纯化，得到较为纯净的目标fab片段。纯化fab片段通常是亲和层析法，常用的亲和配体有蛋白a、蛋白g以及蛋白l。蛋白l配体特异性结合kappa型轻链抗体，但其结合部位尚不清楚；蛋白g配体结合部位较为广谱，对fab及fc都有结合，常用来进行抗体初步纯化；蛋白a特异性结合fc片段，三种亲和配体各具特点，在实际纯化中需根据抗体的特性进行选择。仅依靠亲和层析纯化fab片段较难达到理想的纯度，后续往往需要使用离子交换、疏水层析、凝胶过滤等手段进行两步甚至三步纯化，找到最优的组合纯化策略。纯化步骤的增加和策略不当会降低蛋白得率以及活性，所以，对fab片段高效制备纯化策略进行研究具有重要意义。
目前的研究大多都集中在左旋氧氟沙星或消旋氧氟沙星上，尚无针对右旋氧氟沙星抗体fab片段的纯化方法报道，也没有基于fab片段特异性检测右旋氧氟沙星的报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中的不足，提供一种蛋白酶酶解和两步纯化制备抗右旋氧氟沙星抗体fab片段的方法。本发明运用一种木瓜蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析与蛋白a亲和层析结合的两步纯化工艺，首次获得抗右旋氧氟沙星抗体fab片段，采用本发明纯化工艺制备得到的抗体fab片段同时具备高灵敏度的性能，为建立抗右旋氧氟沙星的免疫检测方法提供了核心原材料，具有广阔的发展前景。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种抗右旋氧氟沙星抗体的fab片段，其包含重链，所述重链含有如seqidno:2所示氨基酸序列或与seqidno:2具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链的氨基酸序列如seqidno:2所示。
本文所用的术语“同源性”是指：经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比，如果需要，达到最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。本文所述的“至少80％同源性”是指同源性为80％至100％任一值，包括但不限于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等。
可选地，其还包含轻链，所述轻链含有如seqidno:1所示氨基酸序列或与seqidno:1具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述轻链的氨基酸序列如seqidno:1所示。
可选地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素。
可选地，所述喹诺酮类抗生素包括右旋氧氟沙星。
本发明还提供一种抗体，其含有上述fab片段，该抗体可以为单克隆抗体。
优选地，所述抗体为单克隆抗体。
本发明还提供核苷酸分子，其编码上述fab片段。
可选地，其重链含有如seqidno:4所示核苷酸序列或与seqidno:4具有至少80％同源性的核苷酸序列，或者所述重链的核苷酸序列如seqidno:4所示。
可选地，其轻链含有如seqidno:3所示核苷酸序列或与seqidno:3具有至少80％
同源性的核苷酸序列，或者所述轻链的核苷酸序列如seqidno:3所示。
本发明还提供表达载体，其包含上述核苷酸分子。
本发明还提供宿主细胞，其包含上述核苷酸分子或上述表达载体。
本发明还提供上述fab片段的制备方法，包括：提供抗右旋氧氟沙星抗体，采用蛋白酶酶解所述抗右旋氧氟沙星抗体，将所述酶解产物纯化，得到所述fab片段。
可选地，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶中的至少一种。
可选地，纯化所述酶解产物时，纯化方法包括凝胶过滤层析、亲和层析。
优选地，先进性凝胶过滤层析，再进行亲和层析。
可选地，凝胶过滤层析时，采用的填料选自superdex200、superdex75中的任一种。
可选地，亲和层析时，采用的蛋白选自蛋白a、蛋白l、蛋白g中的任一种。
本发明还提供上述fab片段在检测抗生素或解析蛋白质三维结构中的应用。
可选地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素。
可选地，所述喹诺酮类抗生素包括但不限于氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星等。
本发明具有以下有益效果：
本发明运用一种木瓜蛋白酶酶解的策略和凝胶过滤层析与蛋白a亲和层析结合的两步纯化工艺，首次获得抗右旋氧氟沙星抗体fab片段，采用本发明纯化工艺制备得到的抗体fab片段同时具备高灵敏度的性能，为建立抗右旋氧氟沙星的免疫检测方法提供了核心原材料，具有广阔的发展前景。本发明的fab片段纯化流程简洁，操作简单，高产出，制得的抗右旋氧氟沙星fab片段用于elisa检测时，灵敏度高。
附图说明
图1显示为实施例3的纯化色谱结果图。
图2显示为实施例3的sds-page电泳图。
图3显示为实施例4的亲和纯化色谱结果图。
图4显示为实施例4的sds-page电泳图。
图5显示为抗右旋氧氟沙星抗体fab片段对右旋氧氟沙星的间接竞争elisa标准曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
对右旋氧氟沙星的研究有助于阐明氧氟沙星手性结构与生物活性之间的构效关系，同时为氧氟沙星对映体的特异性检测与分离提供核心原材料。
以下实施例包括抗右旋氧氟沙星抗体酶切，酶切产物经层析和凝胶过滤和亲和层析，以及制备得到的抗右旋氧氟沙星抗体fab片段的间接竞争elisa工作曲线的建立。
以下实施例中，pbs缓冲液的ph均为7.4。
以下实施例中，活化液的组成如下：20mmna2hpo4·12h2o，20mmedta，ph＝10。
实施例1
本实施例提供抗右旋氧氟沙星抗体igg的制备及测序。
1、实验操作
1.1、腹水制备
1.1.1、复苏能分泌抗右旋氧氟沙星抗体的杂交瘤细胞株(华南农业大学，食品学院，广东省重点实验室制备)，使用完全培养基(sigma基础培养基添加10％谷氨酰胺二肽)培养，提取rna。
1.1.2、当细胞生长至充满培养皿底部时，去掉完全培养基，使用sigma基础培养基将细胞悬浮，用1ml注射器吸取悬浮细胞。
1.1.3、选用8～12周大小的雌性小白鼠作为实验用鼠，在腹腔注射细胞前7天，每只小鼠腹腔注射500微升液体石蜡。
1.1.4、每只小鼠腹腔注射500微升细胞悬浮液，以制备腹水。
1.1.5、腹腔注射7～14天，密切关注小鼠腹部隆起，在小鼠濒死之际，短颈处置，解剖小鼠腹腔，取出腹水，于4℃，10000rpm离心10min，取上清于-20℃冻存。
1.2、抗右旋氧氟沙星igg制备
1.2.1、取抗右旋氧氟沙星腹水，于20℃解冻，用pbs缓冲液等倍稀释后，用0.22μm滤膜过滤。
1.2.2、使用5ml蛋白g预装柱(购自ge公司)，对过滤后腹水进行纯化，用pbs上样及平衡柱子，用ph2.7glycine-hcl进行洗脱，收集流穿组分即杂蛋白和洗脱组分即igg，并用bio-rad公司tgxtmfastcasttmacrylamidekit,12％试剂盒，配制浓度为12％的分离胶，进行sds-pagea进行验证。
1.2.3、将洗脱组分收集后，立刻调节ph至中性，用pbs透析9次。
1.2.4、将透析好的igg进行超滤浓缩，并以10mg/ml于-20℃冻存。
2、鉴定结果
将所提取的rna反转录成cdna，用通用引物进行序列扩增，并送广州擎科生物技术有限公司公司测序，得到编码抗右旋氧氟沙星抗体的轻链的核苷酸序列，如seqidno:3所示；以及编码重链的核苷酸序列，如seqidno:4所示。翻译得到的轻链氨基酸如seqidno:1所示，重链氨基酸如seqidno:2所示。表明本实施例测得制得了抗右旋氧氟沙星单克隆抗体的dna序列并制备了高纯度抗右旋氧氟沙星igg。
实施例2
本实施例提供抗右旋氧氟沙星抗体的酶切。
1、实验操作
1.1、取浓度为10mg/mligg1ml，快速解冻。
1.2、取0.125mg固定化木瓜蛋白酶(购自thermol公司)，于离心柱中，4000rpm离心2min，去除保存液。
1.3、取2ml活化液，加入7mg半胱氨酸，使其在活化液中终浓度为20mm，调节ph至7，并与木瓜蛋白酶混合于37℃摇床，活化15min。
1.4、活化完毕后，将酶与活化液混合物于离心柱4000rpm离心2min，留下酶。
1.5、称量3.5mg半胱氨酸加入1ml浓度为10mg/ml的igg中，调节ph至7，使抗体溶液中半胱氨酸终浓度为20mm。
1.6、将上述抗体与活化后的酶混合，于37℃摇床，250r/min，10h。
1.7、将酶解混合液取出，于离心柱4000rpm离心2min，收集滤液，将固定化酶与酶解产物分离，以结束酶解过程。
1.8、酶切反应产物与原单克隆抗体反应产物，参照实施例1中的sds-page电泳方法进行sds-page电泳鉴定。
实施例3
本实施例提供抗右旋氧氟沙星抗体fab片段的亲和纯化(凝胶过滤层析)。
1、实验操作
1.1、将酶解产物回收后，4000rpm离心2min。
1.2、将离心后酶解产物直接用superdex200(16/600)层析柱进行纯化。
1.3、样品上柱后用结合缓冲液(20mmpb 300mmnacl)冲洗1柱体积，用超纯水冲洗1柱体积，设置流速0.8ml/min，系统压力0.3mpa。
1.4、根据紫外检测器监控280nm蛋白吸收峰，设置按峰收集方式收集样品，以每管1ml体积收集流穿的蛋白组分。
1.5、参照实施例1中的sds-page电泳方法，sds-page电泳鉴定收集到的每管蛋白峰。
2、实验结果
图1显示为纯化色谱结果图，可以看出，酶解产物流经superdex200(16/600)层析柱后主要出现两个峰，且分离度较高；如图2所示，非还原电泳结果表明，峰1向峰2迁移时分子量随着峰的迁移发生了变化，还原电泳结果表明，峰1组分分子量大小在30kd附近，且为一条带，峰2组分分子量大小在25kd附近，且为两条带，这分别符合fc和fab的特征，因此认为，峰2主要为fab片段但成分不够单一，因此，选用亲和层析，进一步纯化峰2组分。
实施例4
本实施例提供抗右旋氧氟沙星抗体fab片段的亲和纯化(亲和层析)。
1、实验操作
1.1、使用pbs平衡5ml蛋白a预装柱，设置流速为1ml/min，系统压力0.5mpa，平衡5个柱体积。
1.2、将所述峰2组分收集后，使用5ml上样环上样，结合缓冲液淋洗柱子，经紫外检测器监控280nm的蛋白吸收峰，收集流穿的蛋白组分，即为fab组分。
1.3、待紫外稳定后，使用洗脱缓冲液淋洗柱子，经紫外检测器监控收集洗脱下的蛋白组分，即凝胶过滤未能完全分离的fc组分。
2、实验结果
如图3和图4所示，亲和色谱结果和电泳结果结合蛋白a结合fc原理可以看出，纯化结果中峰3峰4为流穿组分，峰5为洗脱组分。各峰对应组分的电泳结果显示，非还原电泳中峰3及峰4组分对应ft8及ft10泳道条带集中在50kd分子量，非还原条带在25-30kd有两条带，分别为轻链和重链，以此判断，峰3及峰4中组分为fab。峰5组分对应e15说明蛋白a可以有效分离fab，fab片段的纯度可达95％以上。
实施例5
本实施例提供抗右旋氧氟沙星抗体fab片段的elisa检测。
1、elisa检测方法
1.1、将右旋氧氟沙星-ova人工抗原用包被液稀释至0.25μg/ml的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃温育12h。
1.2、弃去包被液，洗涤2次。
1.3、每孔加入120μl封闭液(1％鱼胶)，37℃封闭3h。
1.4、弃去封闭液，拍板，37℃烘干2h。
1.5、采用pbst缓冲液，按照1：2000倍体积稀释抗右旋氧氟沙星抗体fab片段，并将右旋氧氟沙星稀释至1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001ng/ml。
1.6、每行加50μl右旋氧氟沙星稀释液(三组平行)，再加50μl抗体fab片段稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次。
1.7、加入羊抗鼠二抗-hrp(4000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板。
1.8、加入显色液显色10min。
1.9、加入50μl10％h2so4终止反应，并在450nm处读取od值。
2、实验结果
抗右旋氧氟沙星抗体fab片段的间接竞争elisa标准曲线如图5所示，抗右旋氧氟沙星抗体fab片段对右旋氧氟沙星的ic50＝5.02ng/ml，检测线性范围为1.25-1.17ng/ml，检测限为1.04ng/ml。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种抗右旋氧氟沙星抗体fab片段，其纯化工艺简单，仅需两步纯化，即可得到纯度达95％以上的抗体fab片段；
(2)本发明制得的抗右旋氧氟沙星抗体fab片段应用于elisa方法检测时，灵敏度高，对右旋氧氟沙星的ic50＝5.02ng/ml，检测线性范围为1.25-1.17ng/ml，检测限为1.04ng/ml。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>抗右旋氧氟沙星抗体的fab片段及其制备与应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>213
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
aspilevalmetthrglnserthrserserleuseralaserleugly
151015
aspargvalthrilesercysargalaserglnaspilethrasntyr
202530
leuasntrptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuile
354045
tyrtyrthrserthrleuhisserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuglugln
65707580
gluaspilealathrtyrphecysglnglnserlysthrleuprotyr
859095
thrpheglyglyglythrlysleugluilelysalaaspalaalapro
100105110
thrvalserilepheproprosersergluglnleuthrserglygly
115120125
alaservalvalcyspheleuasnasnphetyrprolysaspileasn
130135140
vallystrplysileaspglysergluargglnasnglyvalleuasn
145150155160
sertrpthraspglnaspserlysaspserthrtyrsermetserser
165170175
thrleuthrleuthrlysaspglutyrgluarghisasnsertyrthr
180185190
cysglualathrhislysthrserthrserproilevallysserphe
195200205
asnargasnglucys
210
<210>2
<211>446
<212>prt
<213>人工序列
<400>2
gluvalglnleuglnglnserglyglyglyleuvallysproglygly
151015
serleulysleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr
202530
alametsertrppheargglnthrproglulysserleuglutrpval
354045
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505560
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65707580
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859095
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100105110
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115120125
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130135140
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145150155160
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165170175
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180185190
proserserproargprosergluthrvalthrcysasnvalalahis
195200205
proalaserserthrlysvalasplyslysilevalproargaspcys
210215220
glycyslysprocysilecysthrvalprogluvalserservalphe
225230235240
ilepheproprolysprolysaspvalleuthrilethrleuthrpro
245250255
lysvalthrcysvalvalvalaspileserlysaspaspprogluval
260265270
glnphesertrpphevalaspaspvalgluvalhisthralaglnthr
275280285
glnproargglugluglnpheasnserthrpheargservalserglu
290295300
leuproilemethisglnasptrpleuasnglylysgluphelyscys
305310315320
argvalasnseralaalapheproalaproileglulysthrileser
325330335
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prolysgluglnmetalalysasplysvalserleuthrcysmetile
355360365
thraspphepheprogluaspilethrvalglutrpglntrpasngly
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glnproalagluasntyrlysasnthrglnproilemetasnthrasn
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glysertyrphevaltyrserlysleuasnvalglnlysserasntrp
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glualaglyasnthrphethrcysservalleuhisgluglyleuhis
420425430
asnhishisthrglulysserleuserhisserproglylys
435440445
<210>3
<211>639
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gatattgtgatgacacagtctacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcacc60
atcagttgcagggcaagtcaggacattaccaattatttaaactggtatcagcagaaacca120
gatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaaccttacactcaggagtcccatca180
aggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaa240
gaagatattgccacttacttttgccaacagagtaagactcttccgtacacgttcggaggg300
gggaccaaactggaaatcaaagctgacgccgctcctaccgtgtccatctttccacctagc360
agcgagcagctgacaagcggcggagctagcgtcgtgtgcttcctgaacaacttctacccc420
aaggacatcaacgtgaagtggaagatcgacggcagcgagagacagaacggcgtgctgaat480
agctggaccgaccaggacagcaaggactccacctacagcatgtccagcacactgaccctg540
accaaggacgagtacgagcggcacaacagctacacatgcgaggccacacacaagaccagc600
acaagccccatcgtgaagtccttcaaccggaacgagtgc639
<210>4
<211>1338
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gaggtccagcttcagcaatctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactc60
tcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttggtttcgccagact120
ccagagaagagcctggagtgggtcgcatccattagtagtggtggtagaacgtactatcca180
gacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagattatgccaggaacatcctgtacctg240
caaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattattgtgtaagaccgttcgcc300
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tcctcagccaaaaccacacctcctagcgtgtaccctctggctcctggatctgccgctcag420
accaatagcatggtcacactgggctgcctggtcaagggctatttccctgagcctgtgacc480
gtgacctggaactctggctctctgtctagcggcgtgcacacctttccagccgtgctgcag540
agcgatctgtacaccctgtccagcagcgtgaccgtgcctagctctcctagacctagcgag600
acagtgacctgcaacgtggcccatcctgccagcagcaccaaggtggacaagaaaatcgtg660
cccagagactgcggctgcaagccctgcatctgtaccgtgcctgaagtgtccagcgtgttc720
attttcccacctaagcctaaggacgtgctgaccatcacactgacccctaaagtgacatgc780
gtggtggtggacatcagcaaggacgaccctgaggtgcagttcagttggttcgtggacgac840
gtggaagtgcacacagcccagacacagcctagagaggaacagttcaacagcaccttcaga900
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agagtgaacagcgccgcctttcctgctcctatcgagaaaaccatctccaagacaaagggc1020
agacccaaggctccccaggtgtacacaatccctccacctaaagaacagatggccaaggac1080
aaggtgtccctgacctgcatgatcaccgatttcttcccagaggacatcaccgtggaatgg1140
cagtggaatggacagcccgccgagaactacaagaacacccagcctatcatgaacaccaac1200
ggcagctacttcgtgtacagcaagctgaacgtgcagaagtccaactgggaggccggcaac1260
acctttacctgtagcgtgctgcacgagggcctgcacaatcaccacaccgagaagtccctg1320
tctcacagccctggaaag1338
1.一种抗右旋氧氟沙星抗体的fab片段，其特征在于：其包含重链，所述重链含有如seqidno:2所示氨基酸序列或与seqidno:2具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述重链的氨基酸序列如seqidno:2所示。
2.根据权利要求1所述的fab片段，其特征在于：其还包含轻链，所述轻链含有如seqidno:1所示氨基酸序列或与seqidno:1具有至少80％同源性的氨基酸序列，或者所述轻链的氨基酸序列如seqidno:1所示。
3.根据权利要求1所述的fab片段，其特征在于：所述抗生素包括喹诺酮类抗生素，优选地，所述喹诺酮类抗生素包括右旋氧氟沙星。
4.一种抗体，其含有权利要求1-3任意一项所述的fab片段，优选地，所述抗体为单克隆抗体。
5.核苷酸分子，其编码权利要求1-3任意一项所述的fab片段。
6.根据权利要求5所述的核苷酸分子，其特征在于：其含有编码所述fab片段重链的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如seqidno:4所示核苷酸序列或与seqidno:4具有至少80％同源性的核苷酸序列，或者所述重链的核苷酸序列如seqidno:4所示；
和/或，其含有编码所述fab片段轻链的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如seqidno:3所示核苷酸序列或与seqidno:3具有至少80％同源性的核苷酸序列，或者所述轻链的核苷酸序列如seqidno:3所示。
7.一种表达载体，其含有权利要求5或6所述的核苷酸分子。
8.一种宿主细胞，其含有权利要求5或6所述的核苷酸分子，或含有权利要求7所述表达载体。
9.根据权利要求1-3任意一项所述fab片段的制备方法，包括：提供抗右旋氧氟沙星抗体，采用蛋白酶酶解所述抗右旋氧氟沙星抗体，将所述酶解产物纯化，得到所述fab片段。
10.根据权利要求1-3任意一项所述fab片段在检测抗生素或解析蛋白质三维结构中的应用，优选地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素，更优选地，所述喹诺酮类抗生素包括氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星。
技术总结