本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种特异性结合脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体及其在分枝杆菌检测中的应用。
背景技术：
分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(lam)是其细胞壁上的一种重要糖脂组分，分子量为17.5kda。在结核分枝杆菌(mtb)感染期间，可溶性的脂阿拉伯甘露聚糖(lam)可以通过细菌代谢或细菌降解释放出来，并在体液(如痰、血和尿)中被检测到，但局限于活动性结核病患者中。依据该特征，lam已被用作诊断活动性结核病的靶点。酶联免疫吸附实验和lam侧流尿检测已被开发用于测定lam。低成本、快速的lam侧流尿检测试剂盒(lf-lam；determinetb-lam；alere,usa)已经被who批准用于cd4阳性t淋巴细胞计数低于200cells/μl的艾滋病患者中结核病筛查，该试剂盒应用兔抗lam多克隆抗体检测该抗原。尽管该方法在结核分枝杆菌lam抗原检测方面具有很高特异性，具有低成本和快速便捷的突出特点。但该方法也存在不足之处，其检测敏感性局限于1ng/ml，此法并未被推介用于非艾滋病的结核病筛查，而这部分人群占据了结核病人群的绝大多数(85％)，限制了其在全球范围内的应用。
目前存在三种假说解释无hiv感染的结核病患者中lam检测的低敏感性：假说一认为hiv感染期间，当存在hiv相关肾病时，肾小球膜受损，lam通过肾脏滤过至尿液；假说二认为当活动性结核病累及肾脏时，lam释放到患者尿液；假说三认为活动性结核病患者尿液或血液中lam丰度较低，超出了当前检测方法的界值，或其与尿液或血液中的其他蛋白结合掩盖其检测。近期研究发现，当lam存在时，预先浓缩尿液会使其更容易被测到，结果支持假说三。
以上这些为尿液lam检测辅助诊断活动性结核病提供依据，具有更高检测敏感性和亲和力抗体的应用将进一步优化该检测方法。因此，设计利用高亲和力的抗体用于尿液中lam的捕获和检测可能提高lam检测的敏感性。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种特异性结合脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体及其在分枝杆菌检测中的应用。本发明提供的抗体具有高敏感性、高特异性和高亲和力的特点，可以用于检测lam和分枝杆菌感染(尤其是结核分枝杆菌)，有助于提高检测结果的准确性。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种特异性结合脂阿拉伯甘露聚糖的抗体或其功能性片段，其轻链和重链的互补决定区具有如下(1)-(3)任一项所示的序列：
(1)：
轻链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示；
重链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.13-15所示；
(2)：
轻链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.1以及seqidno.4-5所示；
重链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.13-15所示；
(3)：
轻链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.6-8所示；
重链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.16-18所示。
本发明提供的抗体或其功能性片段，具有如上(1)-(3)任一项所示的cdr序列，本发明的研究显示，具有上述cdr序列的抗体或其功能性片段能够特异性结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖(lam)，且具有较高的亲和力和敏感性；本发明提供的抗体或其功能性片段可以用于分枝杆菌的检测尤其是结核分枝杆菌的特异性检测，可以提高检测结果的准确性；本发明为lam和分枝杆菌的检测提供更多的抗体选择方案，同时也为结核病的准确诊断提供了抗体基础制剂。
术语″抗体″是指包含至少一个并优选两个重链(h)可变区(此处缩写vh)、至少一个并优选两个轻链(l)可变区(此处缩写vl)以及至少一个并优选两个重链恒定区的蛋白质。vh和vl区可进一步细分为高变区，称为″互补决定区″(complementaritydeterminingregions，cdr)，与称为″框架区″(frameworkregions，fr)的更保守区域相间。每一vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按下列顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3以及fr4。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(1)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.9所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.19所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(2)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.10所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.20所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段具有上述第(3)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.11所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.21所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体或其功能性片段的轻链恒定区为κ型或λ型轻链恒定区；述抗体或其功能性片段的重链恒定区选自：igd、ige、igm、iga和igg中任意一种抗体的重链恒定区。
优选的，所述轻链恒定区为κ型，氨基酸序列如seqidno.12所示。
优选的，所述重链恒定区选自igg，氨基酸序列如seqidno.22所示。
在本发明的一些实施方案中，所述功能性片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。
在本发明的一些实施方案中，所述抗体是兔单克隆抗体。
在本发明公开了上述lam的单克隆抗体或其功能性片段的氨基酸序列上，本领域技术人员容易利用本领域常规的技术例如基因工程技术获得上述lam的单克隆抗体或其功能性片段，无论其以什么方式获得上述lam的单克隆抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明实施例提供编码如前述实施方式任一项所述的抗体或其功能性片段的核苷酸分子。
基于本发明公开的氨基酸序列上，本领域技术人员容易获取编码这些抗体的核苷酸序列，无论其核苷酸分子序列如何变化，其只要是编码上述抗lam的单克隆抗体或其功能性片段，即属于本发明的保护范围。
在本发明的一些实施方案中，本发明实施例提供含有上述核苷酸分子的载体。
在本发明的一些实施方案中，本发明实施例提供含有上述载体的宿主细胞。
第三方面，实施例提供前述实施方式任一项所述的抗体或其功能性片段在制备检测分枝杆菌的试剂或试剂盒中的应用。
在本发明公开的抗体的基础上，本领域技术人员容易地将上述单克隆抗体或其功能性片段用于制备检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，无论试剂或试剂盒是基于何种检测原理例如免疫沉淀、elisa等，只要其利用了本发明的抗体或其功能性片段，即属于本发明的保护范围。
在本发明的一些实施方案中，所述分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌。
第四方面，本发明实施例提供一种抗体偶联物，其包括前述实施方式任一项所述的抗体或其功能性片段。
第五方面，本发明实施例提供一种检测组合物，其包括前述实施方式任一项所述的抗体或其功能性片段、或者前述实施方式任一项所述的抗体偶联物。
第六方面，本发明实施例提供一种检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的抗体或其功能性片段、前述实施方式任一项所述的抗体偶联物、或者前述实施方式任一项所述的检测组合物。
在本发明的一些实施方案中，所述分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1：lam抗体纯度的sds-page鉴定；图中，a：非还原条件；b：还原条件。m:marker；1:bjrbl20；2:bjrbl52；3：bjrbl76。
图2：lam抗体对lam敏感性的elisa检测。
图3：lam抗体识别lam和结核分枝杆菌重组蛋白特异性的elisa检测。
图4：lam抗体识别结核分枝杆菌各组分特异性的westernblotting检测。图中，a：丽春红染色的代表性结果；b：westernblotting检测结果；m:marker；1:纯化的lam；2:提取的结核分枝杆菌h37rv细胞壁；3：h37rv细菌培养上清。
图5：lam抗体亲和力的鉴定；图中曲线从下往上依次是：0/31.3/62.5/125/250nm。
图6：lam抗体检测分枝杆菌培养上清中lam的elisa鉴定。
图7：lam抗体检测分枝杆菌细胞灭活上清中lam的dotblots检测。图中，a：丽春红染色结果；b：dotblots检测结果；a1-b5为慢速生长型分枝杆菌灭活上清液；c1-d6为快速生长型分枝杆菌灭活上清液；e2-f6为倍比稀释的lam(0.1ng-100ng)；b6和e1为空白对照。
图8：lam抗体识别分枝杆菌细胞壁表面lam的流式细胞术鉴定。
图9：lam抗体识别分枝杆菌临床分离菌株灭活悬液中lam的elisa鉴定。
图10：lam抗体检测分枝杆菌临床分离菌株性能的roc曲线分析。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1兔抗lam单克隆抗体制备
(1)结核分枝杆菌h37rv细胞壁的制备和鉴定。
在middlebrook7h9培养基中，将结核分枝杆菌h37rv培养培养至对数生长期，离心，收集菌体，使用磷酸盐缓冲液洗涤2遍，然后用pbs重悬，约2g/l，80℃，2h灭活细菌。4℃条件下用细胞破碎仪破碎细菌，165w，超生破碎30min，未破碎细菌低速离心(3000×g，30min)去除，上清高速离心(15000×g，1h)收集细胞壁成分，沉淀用pbs洗2遍，最后将沉淀悬于pbs溶液，紫外分光光度计测定浓度，分装为500μg/支。提取的细胞壁成分利用国际认可的鼠抗lam抗体cs35(beiresource，nr-13811)通过elisa和westernblotting方法进行鉴定，以纯化lam(beiresource，nr-14848)作为阳性检测对照。鉴定正确后用于免疫。
h37rv细菌提取细胞壁免疫种兔。选用2.0-2.5kg(3-4月龄)普通级日本大耳白兔2只，饲养一周无异常后对动物进行编号，经耳缘静脉采血0.5ml，室温静置1小时后4℃过夜，经1500g离心后取上层血清，-20℃保存备检。基础免疫用200μg细胞壁成分与等体积弗式完全佐剂乳化混匀，经足底注射进行免疫。间隔2-3周进行加强免疫，应用等量细胞壁成分与弗式不完全佐剂乳化混匀，经腘窝淋巴结注射进行免疫，共免疫四次，分别于第三次和第四次免疫一周后耳缘静脉采血测定血清效价。末次免疫后第9天经耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉动物后，经腹主动脉放血处死动物，采集脾脏和胫骨骨髓，迅速转移至液氮冻存备用；采血血液，室温静置1小时后4℃过夜，经1500g离心后取上层血清，-20℃冻存备用。
免疫兔血清效价检测。lam用包被缓冲液稀释成0.1μg/ml及1μg/ml，包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。洗涤液洗涤3次，pbst-5％脱脂奶粉37℃封闭2h。加入pbst-5％脱脂奶粉梯度稀释的样品及样品稀释剂，100μl/孔，37℃反应2h。洗涤液洗涤2次，加入1:5000稀释山羊抗兔-hrp抗体，100μl/孔，37℃反应1h。洗涤液洗涤3次，加入显色液100μl/孔，室温反应10min。显色完成加入终止液，50μl/孔。酶标仪波长450nm读数。选取免疫后血清1：25000倍稀释，od450值减去空白对照od450值大于0.3的兔子进行噬菌体抗体库的构建以及抗体筛选。
兔单克隆抗体scfv噬菌体抗体库构建和抗体筛选。取兔组织(脾或骨髓)，进行rna提取。通过rt-pcr对抗体可变区(v)基因进行扩增，之后将重链、轻链可变区(vh和vl)片段拼接，获得融合的scfv片段并插入到表达载体，电转感受态细胞，获得噬菌体抗体库，库容不低于109。将待筛选噬菌体抗体与包被抗原共同孵育，经过多轮淘洗和洗脱，得到富集的特异性结合噬菌体并将其扩增培养，取上清elisa检测，挑选不同带型的克隆进行elisa复检，确定仍为阳性者进行抗体序列测定。
完整兔抗lam-igg抗体序列构建和表达。经测序获得抗体可变区序列，兔igg抗体恒定区序列是已知的，储备有含兔抗体恒定区的载体，通过重叠pcr技术，利用筛选克隆和包含抗体恒定区序列的载体为模板扩增重链和轻链全长序列，构建igg抗体重链(pcmv3-h)和轻链(pcmv3-l)表达载体。表达载体共同瞬时转染hek293细胞，转染后6-7天取上清通过蛋白a纯化，获得纯化抗体，对纯化抗体鉴定后进行后续研究。
实施例2兔抗lam抗体氨基酸序列分析及完整抗体表达鉴定
通过scfv实施噬菌体抗体库筛选确证五个lam单克隆抗体，命名为bjrbl01、bjrbl03、bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76。依据可变区氨基酸序列和潜在结合lam抗原表位差异，将其分为两组，其中，bjrbl01和bjrbl03在与本申请同日提交的另一份申请文件描述，本文主要描述bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76。阳性克隆通过测序获得轻链和重链可变区序列。通过igblast软件分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，发现scfv抗体属于vh类别和vκ型；abodybuilder软件(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/abodybuilder/)在kabat模式下进一步分析每个抗体vh(重链可变区)和vl(轻链可变区)的三个cdr区位置。
bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76三个抗体轻链可变区cdr序列如下表1所示。
表1
各抗体轻链可变区的氨基酸序列如下(下划线为cdr区)：
bjrbl20-vl(seqidno.9)：
dpvltqtassvsaavggtvtincqasqsvygnnelswfqqkpgqppklliyyastlasgvpsrfkgsgsgtqftltisdlecddaaiyycqggylgnrafgggtevvvk；
bjrbl52-vl(seqidno.10)：
dpvltqtassvsaavggtvtincqasqsvygnnelswyqqksgqppklliykastlasgvpsrfkasgsgtqftltisdlecddaaiyycqggywgnrafgggtevvvk；
bjrbl76-vl(seqidno.11)：
dvvmtqtpssksvpvgdtvtincqasqsvwgnkwlswyqqkpgqppklliyqasklasgvpsrfsgsgsgtqftltisdvvcddaatyycgghgtgnndnplgggtmveik；
三个抗体轻链恒定区的氨基酸序列相同(seqidno.12)：
gdpvaptvlifppaadqvatgtvtivcvankyfpdvtvtwevdgttqttgiensktpqnsadctynlsstltltstqynshkeytckvtqgttsvvqsfnrgdc；
bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76三个抗体的重链可变区cdr区序列如下表2所示。
表2
三个抗体的重链可变区氨基酸序列如下(下划线为cdr区)：
bjrbl20-vh(seqidno.19)：
qsveesggrlvtpggsltltctvsgidlssydmgwvrqapgkglewigniwsngftdyaswvngrftiskssstkmdlkmtslttedtatyfcargssgyvgdiwgpgtlvtvss；
bjrbl52-vh(seqidno.20)：
qsveesggrlvtpgtsltltctvsgfslssydmgwvrqapgkglewigniwsngftdyaswvngrftiskssstkmdlkmtslttedtatyfcargssgyvgdiwgpgtlvtvss；
bjrbl76-vh(seqidno.21)：
qsveesggrlvtpgtpltltctvsgfslstyaitwvrqapgkglewigyiwgggntdyaswakgrftisktsttvdlkitsptiedtatyfcgrndlgygsdiwgpgtlvtvss；
三个抗体的重链恒定区氨基酸序列相同(seqidno.22)：
gqpkapsvfplapccgdtpsstvtlgclvkgylpepvtvtwnsgtltngvrtfpsvrqssglyslssvvsvtsssqpvtcnvahpatntkvdktvapstcskptcpppellggpsvfifppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqddpevqftwyinneqvrtarpplreqqfnstirvvstlpiahqdwlrgkefkckvhnkalpapiektiskargqplepkvytmgppreelssrsvsltcmingfypsdisvewekngkaednykttpavldsdgsyflysklsvptsewqrgdvftcsvmhealhnhytqksisrspgk。
此外，编码抗体的核苷酸序列如下(下划线为信号肽编码序列)：
编码抗体轻链可变区的核苷酸序列：
bjrbl20-vl核苷酸序列(seqidno.23)：
atgggctggtcctgtatcatcctgttcctggtggctacagccacaggagtgcatagtgaccctgtgctgacccagactgcatcgtccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccaggccagtcagagcgtttatggtaataacgaattatcctggtttcagcagaaaccagggcagcctcccaaactcctgatctattatgcatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacctggagtgtgacgatgctgccatttattactgtcaaggcggttatctaggtaatagggctttcggcggagggaccgaggtggtcgtcaaa；
bjrbl52-vl核苷酸序列(seqidno.24)：
atgggctggtcctgtatcatcctgttcctggtggctacagccacaggagtgcatagtgaccctgtgctgacccagactgcatcctccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaactgccaggccagtcagagcgtttatggtaacaacgaattatcctggtatcagcagaaatcagggcagcctcccaagctcctgatctacaaggcttccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaggccagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacctggagtgtgacgatgctgccatttattactgtcaaggcggttattggggcaatagggctttcggcggagggaccgaggtggtcgtcaaa；
bjrbl76-vl核苷酸序列(seqidno.25)：
atgggctggtcctgtatcatcctgttcctggtggctacagccacaggagtgcatagtgatgttgtgatgacccagactccatcttccaagtctgtccctgtgggagacacagtcaccatcaattgccaggccagtcagagtgtttggggtaataagtggttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctaccaggcatccaaactggcatctggggtcccatcgcggttcagcggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgatgtggtgtgtgacgatgctgccacttattactgtggaggacatggaactgggaataatgacaatcccctcggcggagggaccatggtggagatcaaa；
编码各抗体轻链恒定区的核苷酸序列相同(seqidno.26)：
ggggatccagttgcacctactgtcctcatcttcccaccagctgctgatcaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcaataggggtgactgttaa；
编码抗体重链可变区的核苷酸序列：
bjrbl20-vh核苷酸序列(seqidno.27)：
atgggctggtccctgattctgctgttcctggtggctgtggctaccagggtgctgagtcagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtaacgcctggaggatccctgacactcacctgcacagtctctggaatcgacctcagtagctacgacatgggctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcggaaacatttggagtaatggtttcacggactacgcgagctgggtgaatggtcgattcaccatctccaaaagctcgtcgaccaagatggatctgaaaatgaccagtctgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagaggtagttctggttatgtcggagacatctggggcccaggtaccctggtcacagtgagctct；
bjrbl52-vh核苷酸序列(seqidno.28)：
atgggctggtccctgattctgctgttcctggtggctgtggctaccagggtgctgagtcagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacatccctgacactcacctgcacagtctctggattctccctcagtagctacgacatgggctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcggaaacatttggagtaatggtttcacggactacgcgagctgggtgaatggtcgattcaccatctccaaaagctcgtcgaccaagatggatctgaaaatgaccagtctgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagaggtagttctggttatgtcggagacatctggggcccaggtaccctggtcacagtgagctct；
bjrbl76-vh核苷酸序列(seqidno.29)：
atgggctggtccctgattctgctgttcctggtggctgtggctaccagggtgctgagtcagtcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgcacagtctctggattctccctcagtacctatgcaataacttgggtccgccaggctccagggaaggggctggaatggatcggatacatttggggtggtggtaacactgactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgaccacggtggatctgaaaatcaccagtccgacaatcgaggacacggccacctatttctgtggcagaaatgatcttggttatggtagtgacatctggggcccaggtaccctggtcacagtgagctct；
编码各抗体重链恒定区的核苷酸序列(seqidno.30)：ggtcaacctaaggctccgtcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacacccagctccacggtgaccctgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaataa。
bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76三个抗体的轻链预测分子量约为23kda；重链预测分子量约为48kda；完整igg抗体预测分子量约为140ka。表达纯化的完整bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76抗体，通过sds-page胶在非还原(图1中a)和还原条件(图1中b)下进行鉴定，抗体纯度大于90％(图1)，可用于后续检测。图中，m：marker；1：bjrbl20；2：bjrbl52：3：bjrbl76。
实施例3lam抗体的敏感性、特异性和亲和力鉴定
lam抗体对lam敏感性的elisa检测。
通过间接elisa法进行测定，将纯化的lam抗原10倍梯度稀释包被酶标板(1000-0.001ng/ml)，100μl/孔加入到elisa-96孔酶标板中；盖上盖子或者保护膜，4℃过夜。用1×washbuffer洗3次，加入200μl/孔5％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，37℃反应2小时。洗涤3次后加入5％脱脂奶粉稀释bjrbl20、bjrbl52或bjrbl76成1μg/ml，100μl/孔，于37℃反应2h。洗涤5次后，加入1:5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg(h l)37℃反应1h。洗涤5次后，加入tmb底物溶液，100μl/孔，37℃反应30min。加入终止液，100μl/孔。利用酶标仪测定od450值。graphpad软件分析检测结果。
lam抗体对lam敏感性的elisa检测结果(图2)：bjrbl20和bjrbl52抗体检测lam的敏感性为100pg/ml，bjrbl76抗体的敏感性为1ng/ml，bjrbl20和bjrbl52的敏感性稍高于bjrbl76。总体来说，三个抗体具有较高的敏感性。
elisa实验主要试剂来源和配制：
包被液(bdopteiacoatingbuffer，51-2713kc)：ph9.5的0.1m碳酸钠
洗液(bdopteiawashbuffer，51-9003739)：20×浓缩洗液，用去离子水或者蒸馏水稀释成1×工作液。
5％脱脂奶粉封闭液：5克脱脂奶粉加入100ml的1×pbs溶液中。
显色液a(bdopteiasubstratereagenta，51-2606kz)：含有过氧化氢的缓冲液；显色液b(bdopteiasubstratereagentb，51-2607kz)：含有3,3'，5,5'四甲基联苯胺(tmb)的有机溶剂。显色液a与显色液b按照1：1比例混匀后作为工作液。
终止液(bdopteiastopsolution，51-2608kz)：1m硫酸。
lam抗体特异性鉴定。
elisa法检lam抗体与结核分枝杆菌组分lam和多种重组蛋白反应性。包被用的纯化lam抗原为1μg/ml，结核分枝杆菌特异性重组蛋白38kd、mpt32、mpt64、mtb81、cfp10和espc分别为5μg/ml，100μl/孔，分别加入到96孔酶标板中，盖上盖子或者保护膜，4℃过夜。其余步骤参同所述elisa操作流程。
lam抗体识别lam和结核分枝杆菌重组蛋白特异性的elisa检测结果(图3)：三个lam抗体仅与lam结合，而不与结核分枝杆菌重组蛋白38kd、mpt32、mpt64、mtb81、cfp10和espc结合，特异性良好。
lam抗体识别结核分枝杆菌各组分特异性的westernblotting检测。纯化lam、提取的细胞壁和h37rv细菌培养上清分别与上样缓冲液混匀，煮沸5min。利用10％sds-page胶进行电泳分离，150v，电泳1h。将目的片段从page胶电转移至硝酸纤维素膜上，300ma，1h。膜用丽春红染液染10min，拍照记录染色结果(图4中a)。去离子水洗涤后用5％脱脂奶粉封闭2h。加入0.3μg/ml的bjrbl20、bjrbl52或bjrbl76抗体，4℃过夜；对照加入1:20稀释的鼠抗lam单克隆抗体cs35杂交瘤培养上清。pbst洗3遍，每次5min。加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔igg室温反应1h。洗膜后加入化学发光底物，利用凝胶成像仪记录结果。
lam抗体识别结核分枝杆菌各组分特异性的westernblotting检测结果(图4)：通过westernblotting法，bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76抗体可与纯化lam、结核分枝杆菌h37rv细胞壁成分和h37rv细菌养上清结合，以国际上认可的鼠抗lam特异性抗体cs35作为对照，结果显示仅有一个条带，与lam标准品大小一致(35-45kda范围内)，无非特异性结合条带。以上结果均提示bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76抗体可特异性识别结核分枝杆菌lam。图中，a：丽春红染色的代表性结果；b：westernblotting检测结果；m:marker；1:纯化的lam；2:提取的结核分枝杆菌h37rv细胞壁：3：h37rv细菌培养上清。
lam抗体亲和力的鉴定。
亲和力检测流程：aminopropylsilane传感器(美国pall公司)在平衡液中(0.1％bsa 0.02％tween20的pbs溶液)预湿10分钟，将lam用平衡液稀释为5μg/ml，加到避光96孔板第二列中，200μl/孔将bjrbl20、bjrbl52或bjrbl76从250nm起始倍比稀释至31.3nm，加入避光96孔板的第四列中，200μl/孔，孔h4为空白对照，加入200μl平衡液。将平衡液加入第一列与第三列中，200μl/孔。fortebiooctet分子相互作用仪检测，将传感器在第一列中平衡60s获得基础平衡曲线，然后在第二列中进行抗体固化300s。在第三列中进行封闭10min，在第四列中结合抗体180s获得结合曲线，回到第一列中解离300s，获得解离曲线。fortebiooctet分析软件对曲线进行拟合分析，获得亲和力数值。
lam抗体亲和力的鉴定结果(图5)：通过fortebiooctet系统对抗体亲和力进行测定，以不添加lam的缓冲盐溶液作为对照。数据分析后，bjrbl20和bjrbl52抗体的亲和力kd值分别为1.16×10-9m和1.73×10-9m，可见，bjrbl20和bjrbl52抗体对lam具有较好的亲和力。相同检测条件下，bjrbl76的亲和力未测得。
实施例4抗lam抗体与多种分枝杆菌结合特性的鉴定
lam抗体检测分枝杆菌培养上清中lam的elisa鉴定。用23种分枝杆菌鉴定lam抗体对不同菌种lam结合的特异性，包含12种快速生长型分枝杆菌和11种慢速生长型分枝杆菌。收集细菌培养上清，1:50稀释培养上清包被酶标板，间接elisa法检测lam抗体对培养上清中lam的识别，设置空白包被孔作为空白对照。其他操作流程参见所述elisa流程。
lam抗体检测分枝杆菌培养上清中lam的elisa鉴定结果(图6)：bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76抗体均不与快速生长型分枝杆菌(n＝12)培养上清反应，其中bjrbl20、bjrbl52与检测的全部慢速生长型分枝杆菌(n＝11)培养上清反应，bjrbl76可检测到81.8％(9/11)慢速生长型分枝杆菌。elisa结果以空白对照组的od450均值乘以2.1作为临界值。
其中，11种慢速生长型分枝杆菌包括：结核分枝杆菌(m.tb.h37rv)、牛分枝杆菌(m.bovis)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansasii)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、戈登分枝杆菌(m.gordonae)、海分枝杆菌(m.marinum)、鸟分枝杆菌(m.avium)、瘰疬分枝杆菌(m.scrofulaceum)、胃分枝杆菌(m.gastri)、蟾蜍分枝杆菌(m.xenopi)和玛尔摩分枝杆菌(m.malmoense)。
其中，12种快速生长型分枝杆菌包括：脓肿分枝杆菌(m.abscessus)、偶发分枝杆菌(m.fortuitum)、金色分枝杆菌(m.aurum)、新金色分枝杆菌(m.neoaurum)、耻垢分枝杆菌(m.smegmatis)，副偶发分枝杆菌(m.parafortuitum)、嗜鲑鱼分枝杆菌(m.salmoniphilum)、无色分枝杆菌(m.nonchromogenicum)、母牛分枝杆菌(m.vaccae)、草分枝杆菌(m.phlei)、汇合分枝杆菌(m.confluentis)和微黄分枝杆菌(m.gilvum)。
lam抗体检测分枝杆菌细胞灭活上清中lam的dotblots检测。dotblots法用23种分枝杆菌细菌菌体灭活上清液鉴定bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76结合不同分枝杆菌菌株的特异性。同时设置倍比稀释的h37rv-lam(100ng-0.1ng；f6-e2)作为对照。样本点到硝酸纤维素膜，室温干燥后利用丽春红进行染色，拍照记录结果(图7中a)，洗膜后进行封闭、抗体反应和化学发光等检测，参见westernblotting流程。
lam抗体检测分枝杆菌细胞灭活上清中lam的dotblots检测结果(图7)：bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76抗体均可与11种慢速生长型分枝杆菌灭活上清液结合(a1-b5)，而不与12种快速生长型分枝杆菌灭活上清液结合(c1-d6)。bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76均可检测到0.1ng的lam(e2)。图中，a：丽春红染色结果；b：dotblots检测结果；a1-b5：慢速生长型分枝杆菌灭活上清液；c1-d6：快速生长型分枝杆菌灭活上清液；e2-f6：倍比稀释的lam(0.1ng-100ng)；b6和e1：空白对照。
实施例5lam抗体识别分枝杆菌细胞壁表面lam的流式细胞术鉴定
流式细胞术检测：取50μl灭活细菌悬液转移至1.5mleppendorf管中。pbs(0.01m，ph7.4)洗涤2遍，12,000rpm，2min离心沉淀细菌，弃去上清，沉淀重选于100μl的pbs中。每管加入0.5μg兔抗lam抗体混匀，室温反应30min。pbs溶液洗涤2遍，加入2μg/mlaf488标记的山羊抗兔igg(h l)superclonaltm重组二抗，室温避光反应30min。pbs洗涤2遍，重悬于200μlpbs溶液。利用bdlsrfortessatm流式细胞仪进行检测，通过bdfacsdiva软件分析结果。
lam抗体识别分枝杆菌细胞壁表面lam的流式细胞术鉴定结果(图8)：抗lam抗体bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76可通过流式细胞术与慢速生长型分枝杆菌细胞表面的lam结合，与快速生长型分枝杆菌对照不结合。
实施例6lam抗体对临床分离分枝杆菌菌株的识别特性
elisa法鉴定lam抗体检测临床分离菌株的敏感性和特异性。
分枝杆菌临床分离株：分枝杆菌临床株从固体培养基上用无菌小勺刮下后悬于500μl的pbs中，80℃灭活后用于后续检测。检测中应用了90个分枝杆菌临床分离株，包括50个结核分枝杆菌分离株(mtbisolates，mtb组)、20个鸟-胞内分枝杆菌分离株(m.avium-intracellulareisolates，mai组；10个鸟分枝杆菌分离株和10个胞内分枝杆菌分离株)和20个脓肿-偶发分枝杆菌分离株(m.abscessus-m.fortuitumisolates，ma-mf组；10个脓肿分枝杆菌分离株和10个偶发分枝杆菌分离株)。
elisa检测：1:100稀释结核分枝杆菌分离株灭活悬液包被酶标板，间接elisa法检测抗lam抗体与分支杆菌临床分离株的结合特性。其余步骤同所述elisa操作流程。
lam抗体识别分枝杆菌临床分离菌株灭活悬液中lam的elisa鉴定结果(图9)：在mtb组，bjrbl20和bjrbl52可检测到96％(48/50)的结核分枝杆菌分离株，bjrbl76可检测到90％(45/50)的mtb分离株；在mai组，bjrbl20可检测到85％(17/20)的mai分离株，bjrbl52可检测到90％(18/20)的mai分离株，bjrbl76可检测到25％(5/20)的mai分离株；在ma-mf组(快速生长型分枝杆菌对照组)，bjrbl20可检测到10％(2/20)的ma-mf分离株，bjrbl52可检测到5％(1/20)的ma-mf分离株，bjrbl76不能检测到ma-mf分离株。该结果表明抗lam抗体对于识别结核分枝杆菌和鸟-胞内分枝杆菌临床分离株具有较好的敏感性，尤其是bjrbl20和bjrbl52抗体，三种抗体与快速生长型分枝杆菌ma-mf分离株基本不反应，因此对于鉴定慢速生长型分枝杆菌具有良好特异性。该结果分析以ma-mf组检测的od450均值加两倍标准差值作为elisa检测临界值，或者当该方法计算值低于0.1时，以ma-mf组检测的od450均值乘以2.1作为临界值。
(2)lam抗体检测分枝杆菌临床分离菌株性能的roc曲线分析。应用roc曲线评估lam抗体对结核分枝杆菌分离株和鸟-胞内分枝杆菌分离株的检测性能(mtbvsma-mf和maivsma-mf)，以ma-mf组作为检测对照组。
lam抗体检测分枝杆菌临床分离菌株性能的roc曲线分析结果(图10)：以ma-mf组作为对照进行分析，bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76对mtb检测的曲线下面积(auc)分别为0.9790、0.9740和0.9630。bjrbl20、bjrbl52和bjrbl76对mai检测的曲线下面积(auc)分别为0.9775、0.9850和0.8875。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110>首都医科大学附属北京胸科医院
北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120>特异性结合脂阿拉伯甘露聚糖的单克隆抗体及其在分枝杆菌检测中的应用
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agtctgacaaccgaggacacggccacctatttctgtgccagaggtagttctggttatgtc360
ggagacatctggggcccaggtaccctggtcacagtgagctct402
<210>29
<211>399
<212>dna
<213>人工序列
<400>29
atgggctggtccctgattctgctgttcctggtggctgtggctaccagggtgctgagtcag60
tcggtggaggagtccgggggtcgcctggtcacgcctgggacacccctgacactcacctgc120
acagtctctggattctccctcagtacctatgcaataacttgggtccgccaggctccaggg180
aaggggctggaatggatcggatacatttggggtggtggtaacactgactacgcgagctgg240
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ccgacaatcgaggacacggccacctatttctgtggcagaaatgatcttggttatggtagt360
gacatctggggcccaggtaccctggtcacagtgagctct399
<210>30
<211>972
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<213>人工序列
<400>30
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agcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttcccc360
ccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtg420
gacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtg480
cgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagc540
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aacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctg660
gagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagc720
ctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaac780
gggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctac840
ttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacc900
tgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctct960
ccgggtaaataa972
1.一种特异性结合脂阿拉伯甘露聚糖的抗体或其功能性片段，其特征在于，其轻链和重链的互补决定区具有如下(1)-(3)任一项所示的序列：
(1)：
轻链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.1-3所示；
重链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.13-15所示；
(2)：
轻链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.1以及seqidno.4-5所示；
重链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.13-15所示；
(3)：
轻链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.6-8所示；
重链的cdr1-3的氨基酸序列分别如seqidno.16-18所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段具有上述第(1)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.9所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.19所示。
3.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段具有上述第(2)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.10所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.20所示。
4.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段具有上述第(3)项所示的互补决定区序列，所述抗体或其功能性片段的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.11所示，所述抗体或其功能性片段的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.21所示。
5.根据权利要求2-4任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段的轻链恒定区为κ型或λ型轻链恒定区；所述抗体或其功能性片段的重链恒定区选自：igd、ige、igm、iga和igg中任意一种抗体的重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如seqidno.12所示；
优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如seqidno.22所示；
优选地，所述功能性片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。
6.编码如权利要求1-5任一项所述的抗体或其功能性片段的核苷酸分子。
7.含有如权利要求6所述的核苷酸分子的载体。
8.含有如权利要求7所述的载体的宿主细胞。
9.权利要求1-5任一项所述的抗体或其功能性片段在制备检测分枝杆菌的试剂或试剂盒中的应用；
优选地，所述分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌。
10.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的抗体或其功能性片段。
11.一种检测组合物，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的抗体或其功能性片段。
12.一种检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的抗体或其功能性片段、权利要求10所述的抗体偶联物、或者权利要求11所述的检测组合物；
优选地，所述分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌。
技术总结