本公开涉及如腺病毒等溶瘤病毒、包括本公开的溶瘤病毒的组合物、制备所述溶瘤病毒和组合物的方法以及溶瘤病毒或组合物用于治疗尤其是用于治疗癌症的用途。还提供了用根据本公开的疗法来治疗表征为具有表达cd40的癌症尤其是过表达cd40的癌症的患者人群。
背景技术：
：cd40是b细胞和t细胞的激活子，例如抗原呈递细胞上的cd40结合t细胞上的cd40l(也称为cd154)以活化所述细胞。cd40还出现在许多肿瘤细胞上，所述肿瘤细胞使用cd40从周围细胞中获得细胞因子和生长因子，以支持癌症的生长和扩张。体内激动性抗cd40抗体由于对免疫细胞的作用可以能够刺激抗肿瘤免疫应答。这可能是由于cd40具有例如活化巨噬细胞并“预处理”树突细胞的能力，从而允许其启动有效的细胞毒性t细胞应答。当前，对免疫肿瘤学疗法和/或涉及肿瘤相关巨噬细胞(tam)的疗法有极大的兴趣。这些肿瘤相关巨噬细胞包围肿瘤并促使产生允许肿瘤生长和发展的微环境。该微环境常常含氧量低并且可以中和被发送以附着并消除肿瘤的免疫细胞。因此，微环境物理地保护肿瘤。此外，微环境供应能量和营养素来支持肿瘤生长。然而，为了产生效果，需要将疗法真正指向该环境以重新活跃、释放、募集并重新活化例如已经陷入微环境中的免疫细胞。对微环境的该指向不容易进行，因为有时肿瘤具有保护发展机制，如将疗法移出肿瘤环境的主动传输机制。这是例如抗性中涉及的机制之一。可以利用如b组溶瘤腺病毒等归巢到肿瘤细胞并选择性地感染癌细胞的溶瘤病毒来将抗cd40抗体递送到肿瘤的微环境。溶瘤病毒具有抗癌症性质，所述抗癌症性质导致癌细胞死亡并将所述细胞的内容物释放。细胞的内容物包含由溶瘤病毒制成的抗cd40抗体。因此，癌细胞的死亡将抗体释放到肿瘤的微环境中。令人惊讶的是，本发明的诸位发明人已经发现，通过将对抗cd40抗体进行编码的转基因并入此类病毒中，例如通过用本公开的转基因盒来转导病毒，可以由各种不同的溶瘤病毒有效地递送抗cd40抗体。另外，因为肿瘤已经发展了多种保护机制，所以目前开始认为将来最有效的癌症疗法将需要通过两种或更多种生物机制来攻克癌症。采用激动性抗cd40抗体可以具有另外的益处：一旦抗体在肿瘤微环境中处于适合的浓度，其就可以与cd40表达性癌细胞竞争以与cd40l结合。这最终意味着癌细胞与t细胞上的cd40l结合的机会更少。进而，这可能意味着可用于肿瘤的能量和营养素的量可能减少。本发明的诸位发明人已经设计了可以用于制备稳定病毒的对抗cd40抗体或其结合片段进行编码的转基因盒。技术实现要素：本公开提供了：1.一种溶瘤病毒(例如有复制能力的病毒)，其包括对抗cd40抗体或其结合片段进行编码的转基因盒，尤其是seqidno:12的盒，其中所述转基因盒包括seqidno:12中给出的氨基酸序列或与其至少95％相同(如与其96％、97％、98％或99％相同，尤其是在序列的全部长度上)的序列。(替代性)段落1：一种溶瘤腺病毒(例如有复制能力的溶瘤腺病毒)，其对抗cd40抗体或其结合片段进行编码，其中所述腺病毒包括seqidno:1或与其至少95％相同(如与其96％、97％、98％或99％相同)的序列。2.根据段落1所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自腺病毒、单纯性疱疹病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、塞内加谷病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、echo肠道病毒、柯萨奇病毒和牛痘病毒，尤其是腺病毒。3.根据段落1或2所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自由以下组成的组：enadenotucirev、talimogenelaherparepvec、rigvir、ad5-ycd/muttksr39rep-hil12、cavataktm、cg0070、dnx-2401、g207、hf10、jx-594、mg1-ma3、mv-nis、obp-301、toca511，尤其是enadenotucirev。4.根据段落1到3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述病毒包括seqidno:1。5.根据段落4所述的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒由seqidno:1组成。6.一种药物组合物，其包括根据段落1到5中任一项所述的病毒和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。7.一种根据权利要求1到5中任一项所述的溶瘤病毒或根据段落6所述的药物组合物，其用于治疗。8.根据段落1到5中任一项所述的溶瘤病毒或根据段落6所述的药物组合物，其用于治疗癌症、胰岛素抵抗、肥胖和/或免疫缺陷。9.一种根据段落6所述的用途，其中所述病毒或组合物用于治疗癌症，例如用于治疗表达cd40的癌症(如具有上调的cd40表达的癌症)。10.一种组合疗法(例如用于治疗癌症)，其包括根据段落1到5中任一项所述的病毒或根据段落6所述的组合物以及另外的抗癌疗法。11.根据段落10所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是化学疗法。12.根据段落10或11所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是检查点抑制剂。13.根据段落12所述的组合疗法，其中所述抗癌疗法选自包括以下的组：pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tim-3抑制剂、lag-3抑制剂、tigit抑制剂、b7-h3(cd276)抑制剂、b7-h4(b7s1)抑制剂、b7h7(hhla2)抑制剂、cd96抑制剂、vista抑制剂和其中两种或更多种的组合。14.根据段落13所述的组合疗法，其中所述抑制剂是抗体或其结合片段。15.根据段落10到14中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是共刺激途径激动剂。16.根据段落15所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法选自包括以下的组：cd27激动剂、cd28激动剂、icos激动剂、tmigd2(igpr-1/cd28h)激动剂、cd226激动剂、ox40激动剂、4-1bb激动剂和其中两种或更多种的组合。17.根据段落16所述的组合疗法，其中所述疗法是抗体或其结合片段。18.根据段落10到17中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法活化例如选自il-10、tgfβ、ido抑制剂或其中两种或更多种的组合的免疫应答或免疫应答反向抑制。19.根据段落10到18中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的癌症疗法是溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)，例如有复制能力的溶瘤病毒，如腺病毒，尤其是b组腺病毒。20.根据段落19所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)对治疗性基因编码材料进行编码，所述治疗性基因编码材料选自由以下组成的组：rnai序列、抗体或其结合片段、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂和酶。21.根据段落20所述的组合疗法，其中所述抗体或其结合片段对以下具有特异性：0x40、0x40配体、cd27、cd28、cd30、cd40、cd40配体、cd70、cd137、gitr、4-1bb、icos、icos配体、ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、vista、b7-h3、b7-h4、hvem、ilt-2、ilt-3、ilt-4、tim-3、lag-3、btla、light、cd160、ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、cd40、cd40配体和其中两种或更多种的组合。22.根据段落20或21所述的组合疗法，其中所述细胞因子独立地选自包括以下的组：il-1α、il-1β、il-6、il-9、il-12、il-13、il-17、il-18、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-33、il-35、il-2、il-4、il-5、il-7、il-10、il-15、il-21、il-25、il-1ra、ifnα、ifnβ、ifnγ、tnfα、tgfβ、淋巴毒素α(lta)和gm-csf，例如il-12、il-18、il-22、il-7、il-15、il-21、ifnγ、tnfα、tgfβ和淋巴毒素α(lta)以及其中两种或更多种的组合。23.根据段落20到22中任一项所述的组合疗法，其中所述趋化因子独立地选自包括以下的组：il-8、ccl3、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19、ccl21、cxcr2、ccr2、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、cxcr3、cxcr4、cxcr5和crth2，例如ccl5、cxcl9、cxcl12、ccl2、ccl19、ccl21、cxcr2、ccr2、ccr4和cxcr4、其中任何一种的受体以及其中两种或更多种的组合。24.根据段落19到23中任一项所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)对b7蛋白例如b7-1或b7-2的跨膜锚定形式进行编码。25.根据段落19到24中任一项所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)对选自包括以下的组的检查点抑制剂进行编码：pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tim-3抑制剂、lag-3抑制剂、tigit抑制剂、b7-h3(cd276)抑制剂、b7-h4(b7s1)抑制剂、b7h7(hhla2)抑制剂、cd96抑制剂、vista抑制剂和其中两种或更多种的组合。26.根据段落25所述的组合疗法，其中所述抑制剂是抗体或其结合片段。27.根据段落19到26中任一项所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)对共刺激途径激动剂进行编码。28.根据段落27所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)对选自包括以下的组的共刺激途径激动剂进行编码：cd27激动剂、cd28激动剂、icos激动剂、tmigd2(igpr-1/cd28h)激动剂、cd226激动剂、ox40激动剂、4-1bb激动剂和其中两种或更多种的组合。29.根据段落19到28中任一项所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒(另外的溶瘤病毒)对活化例如选自il-10、tgfβ、ido抑制剂或其中两种或更多种的组合的免疫应答或免疫应答反向抑制的分子进行编码。30.一种药物调配物，其包括如段落1到5中任一项所定义的溶瘤腺病毒并且包括如权利要求19到29中任一项所定义的另外的溶瘤病毒。31.一种如段落19到29中任一项所定义的组合疗法或如权利要求30所定义的药物组合物，其用于治疗。32.一种根据段落1到5中任一项所述的溶瘤病毒或根据权利要求6或30所述的药物组合物，其用于制造用于治疗癌症、胰岛素抵抗、肥胖和/或免疫缺陷的药物。33.一种根据段落32所述的用途，其中所述腺病毒或组合物用于制造用于治疗癌症的药物。34.根据段落33所述的用途，其中要治疗的目标患者人群患有表达cd40的癌症，如所述癌症中cd40上调的人群。35.一种用于制造用于治疗癌症的药物的组合疗法，其包括根据段落1到5中任一项所述的病毒或根据段落6或30所述的组合物以及另外的抗癌疗法，例如其中要治疗的目标患者人群患有表达cd40的癌症，如所述癌症中cd40上调的人群。36.根据段落35所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是化学疗法。37.根据段落35或36所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是检查点抑制剂。38.根据段落37所述的组合疗法，其中所述抗癌疗法选自包括以下的组：pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tim-3抑制剂、lag-3抑制剂、tigit抑制剂、b7-h3(cd276)抑制剂、b7-h4(b7s1)抑制剂、b7h7(hhla2)抑制剂、cd96抑制剂、vista抑制剂和其中两种或更多种的组合。39.根据段落35到38中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的癌症疗法是溶瘤病毒，例如有复制能力的溶瘤病毒，诸如权利要求19到29中任一项所定义的。40.一种治疗方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据段落1到5中任一项所述的溶瘤腺病毒或根据段落6或30所述的药物组合物。41.根据段落40所述的方法，其用于治疗癌症、胰岛素抵抗、肥胖和/或免疫缺陷。42.根据段落41所述的方法，其用于治疗癌症，例如表达cd40的癌症(如具有上调的cd40表达的癌症)。43.根据段落37到42中任一项所述的方法，其中治疗进一步包括另外的抗癌疗法。44.一种根据段落43所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是化学疗法。45.根据段落42或44所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是检查点抑制剂。46.根据段落45所述的组合疗法，其中所述抗癌疗法选自包括以下的组：pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tim-3抑制剂、lag-3抑制剂、tigit抑制剂、b7-h3(cd276)抑制剂、b7-h4(b7s1)抑制剂、b7h7(hhla2)抑制剂、cd96抑制剂、vista抑制剂和其中两种或更多种的组合。47.根据段落42到46中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的癌症疗法是溶瘤病毒，例如有复制能力的溶瘤病毒，例如权利要求19到29中任一项所定义的病毒。附图说明图1示出了抗cd40转基因盒的示意图。图2a和b示出了ng-350病毒在总颗粒产生(a)和细胞上清液中的病毒颗粒产生(b)方面的活性。图2c示出了使用elisa测量的分泌igg2抗cd40抗体的浓度。图3示出了使用组合ecorv/nhei(a)或单独的酶ncoi或fspi(b)对对照物与ng-350dna进行限制性消化的结果。图4示出了引物结合在ng-350转基因盒中的位置。图5示出了使用凝胶电泳分离pcr产物。图6示出了使用引物组d(a)和引物组k(b)分离pcr产物。图7a示出了在不同感染密度下对enad和ng-350a(seqidno:1的病毒)的％细胞存活率进行的定量。图7和8示出了对ng-350a和enad的每个细胞检测到的病毒基因组的数量的定量。图9a和b示出了使用板读取器(biotek)测量的在板的每个孔中在450nm处的吸光度以及分泌igg2抗cd40抗体的浓度。图9c示出了enad、ng-350a和阳性对照物在450nm处的吸光度(图4c)以及通过存在于ng-350a感染的细胞的上清液中的分泌抗cd40抗体与cd40的特异性结合。图10示出了使用针对ng-350a、enad或ng-165感染的细胞的板读取器测量每个样品在620nm处的吸光度。图11a和b示出了使用板读取器(biotek)测量的在板的每个孔中在450nm处的吸光度以及分泌igg2抗cd40抗体的浓度。图12示出了使用elisa测定的分泌igg2抗cd40抗体的浓度。图13示出了表达cd86(a)、cd54(b)和hla-dr(c)活化标志物的modc的百分比。图14示出了在存在或不存在enad病毒或仅存在enad病毒的情况下通过用由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的经过纯化的抗cd40抗体培养的modc分泌il12p40。图15示出了表达cd86(a)、cd54(b)、mfihla-dr(c)和cd80(d)的cd19 细胞的百分比。图16示出了与单独的抗体或病毒处理相比，在用由ng-350a感染的肿瘤细胞和enad病毒产生的经过纯化的抗cd40抗体处理后分裂b细胞的百分比。图17示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的病毒耗尽的抗体制剂与人modc表面上的cd40结合。图18示出了作为实例(a)的由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的病毒耗尽的抗cd40ab对人modc上的细胞表面标志物上调的影响和4种不同的modc供体在24小时和48小时的给药应答(b-e)。图19示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的病毒耗尽的抗cd40ab对通过人modc产生的细胞因子分泌的影响和4种不同的modc供体在24和48小时的给药应答(b-d)。图20示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的未耗尽病毒的抗体制备与人modc表面上的cd40结合。图21示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的未耗尽病毒的抗cd40ab对来自2种不同供体的人modc上的细胞表面标志物上调在24和48小时的影响。图22示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的未耗尽病毒的抗cd40ab对通过人modc产生的针对2种不同供体的作为给药应答的细胞因子分泌在24和48小时的影响。图23示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的病毒耗尽的抗cd40ab对人b细胞上的针对3种不同b细胞供体的作为给药应答的细胞表面标志物上调在24和48小时的影响。图24示出了由ng-350a感染的肿瘤细胞产生的未耗尽病毒的抗cd40ab对来自3种不同供体的人b细胞上的细胞表面标志物上调在24和48小时细胞的影响。图25示出了与enad相比，通过用ng-350a感染的10种不同肿瘤细胞系进行的病毒基因组复制(qpcr)的时间进程。图26示出了与enad相比，用ng-350a感染的四个实例肿瘤细胞系中的病毒诱导的溶瘤(xcelligence测定)的时间进程。图27示出了通过用ng-350a感染的10种不同肿瘤细胞系进行的抗cd40抗体mrna表达的时间进程。图28示出了通过igg2elisa对不同肿瘤细胞系的抗cd40转基因蛋白表达的检测。图29示出了与enad相比，用ng-350a颗粒iv给药后急性血浆细胞因子应答的时间进程；mcp-1(a)、il-6(b)和tnfα(c)图30示出了单次静脉内给药enad或ng-350a后血浆中丙氨酸转氨酶(alt)浓度的时间进程。图31示出了与enad相比，在用ng-350a颗粒进行第一剂量和第三剂量的重复iv给药方案后急性血浆细胞因子应答；mcp-1(a)、il-6(b)图32示出了在三次静脉内给药enad或ng-350a中的每次静脉内给药后外周血中的病毒药代动力学。图33示出了在单次静脉内给药ng-350a病毒颗粒后从鼠类组织中回收活病毒。图34示出了在三次iv注射或单次分级it给药ng-350a或enad后皮下a549(a和b)和hct116(c和d)肿瘤中的病毒基因组复制。图35示出了在三次iv注射或单次分级it给药ng-350a或enad后皮下a549(a和b)或hct-116(c和d)肿瘤中的病毒e3mrna表达。图36示出了在三次iv注射或单次分级it给药ng-350a或enad后皮下a549(a和b)和hct-116(c和d)肿瘤中的抗cd40激动剂抗体转基因mrna表达。图37示出了在三次iv注射或单次分级it给药ng-350a或enad后皮下a549肿瘤中的抗cd40抗体蛋白。具体实施方式cd40是例如发现于抗原呈递细胞上的共刺激蛋白。cd40也称为bp50、cdw40、tnfrsf5、p50、cd40蛋白、cd40分子。人蛋白的uniprot编号为p25942。鼠蛋白的uniprot编号为p27512。对如本文采用的癌症病毒具有选择性的溶瘤病毒是指优先杀死癌细胞的病毒，例如因为其优先感染癌细胞和/或病毒生命周期取决于如失调(例如在癌细胞中过表达)的p53等基因。在一个实施例中，溶瘤病毒优先感染癌细胞并且继续复制其基因组并产生衣壳蛋白来例如根据enad生成新的病毒颗粒。可以如通过引用的方式并入本文的w02005/118825中描述的测试对于癌细胞的选择性(治疗指数)。在一个实施例中，溶瘤病毒是选自以下的病毒：腺病毒、单纯性疱疹病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、塞内加谷病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、echo肠道病毒、柯萨奇病毒和牛痘病毒，尤其是腺病毒。在一个实施例中，腺病毒选自由以下组成的组：enadenotucirev、talimogenelaherparepvec、rigvir、ad5-ycd/muttksr39rep-hil12、cavataktm、cg0070、dnx-2401、g207、hf10、jx-594、mg1-ma3、mv-nis、obp-301、toca511，尤其是enadenotucirev。在一个实施例中，本公开的组合疗法中采用的溶瘤腺病毒有复制能力。在一个实施例中，本公开的组合疗法中采用的溶瘤腺病毒有复制缺陷。在一个实施例中，本公开的病毒用于组合疗法。在一个实施例中，本公开所采用的或在本公开的组合疗法中作为第二组分采用的溶瘤腺病毒例如具有式(i)：5'itr-b1-ba-b2-bx-bb-by-b3-3'itr(i)其中：b1是键或包括：e1a、e1b或e1a-e1b(尤其是e1a、e1b或e1a-e1b)；ba是e2b-l1-l2-l3-e2a-l4；b2是键或包括例如内源性启动子或外源性启动子下的e3或转基因；bx是键或dna序列，所述dna序列包括：限制性位点、一个或多个转基因或两者；bb包括l5；by包括对治疗蛋白或其活性片段进行编码(尤其是包括seqidno:12)的转基因盒；并且b3是键或包括e4。在一个实施例中，溶瘤腺病毒具有式(ia)：5'itr-b1-ba-b2-bb-by-b3-3'itr(ia)其中：b1是键或包括：e1a、e1b或e1a-e1b(尤其是e1a、e1b或e1a-e1b)；ba是e2b-l1-l2-l3-e2a-l4；b2是键或包括e3；bb包括l5；by包括对治疗蛋白或其活性片段进行编码(具体地说，包括seqidno:12)的转基因盒；并且b3是键或包括e4。在一个实施例中，式(i)和/或(ia)的构建体中的病毒基因来自ad11或enad，尤其是enad。在一个实施例中，转基因盒处于外源性启动子例如主要晚期启动子的控制下。治疗蛋白包含抗体或结合片段(例如选自包括对以下具有特异性的抗体或片段的组：ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2、vista、b7-h3、b7-h4、hvem、ilt-2、ilt-3、ilt-4、tim-3、lag-3、btla、light或cd160，例如ctla-4、pd-1、pd-l1和/或pd-l2)、b-7蛋白(如b7-1和/或b7-2)、细胞因子(例如选自il-1α、il-1β、il-6、il-9、il-12、il-13、il-17、il-18、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-33、il-35、白细胞介素-2(il-2)、il-4、il-5、il-7、il-10、il-15、il-21、il-25、il-1ra、ifnα、ifnβ、ifnγ、tnfα、tgfβ、淋巴毒素α(lta)和gm-csf)和趋化因子(例如il-8、ccl3、ccl5、ccl17、ccl20、ccl22、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl13、cxcl12、ccl2、ccl19、ccl21、cxcr2、ccr2、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、cxcr3、cxcr4、cxcr5和/或crth2)以及其中两种或更多种的组合。本公开的疗法可以包括两种或更多种溶瘤病毒。调控元件在一个实施例中，by包括根据本公开的转基因盒，所述盒进一步包括：对检查点抑制剂进行编码的转基因，例如抗ctla-4抗体、抗pd-1和抗-pd-l1抗体或其中任何一种的结合片段；以及调控元件，如调控元件的组合。在一个实施例中，调控元件是剪接受体序列。在一个实施例中，调控元件是kozak序列。在例如转基因对多顺反子rna分子进行编码的一个实施例中，调控元件是ires序列。在一个实施例中，调节序列是如p2a、t2a、f2a、e2a等高效可自切割肽序列。在一个实施例中，调控元件是polya尾。在一个实施例中，存在至少两种调控序列，例如剪接受体和kozak序列、或剪接受体和polya尾、或剪接受体和ires序列或剪接受体和p2a序列。在一个实施例中，存在至少三种调控子序列，例如剪接受体序列、kozak序列和polya尾或者剪接受体序列、ires或2a序列和polya尾、或者剪接受体序列、kozak序列和ires或2a序列。在一个实施例中，存在至少四种调节序列，例如剪接受体序列、kozak序列、ires或2a序列和polya尾，具体地说是按照剪接受体序列、kozak序列、ires或2a序列和polya尾的顺序位于l5与e4之间。在一个实施例中，转基因对包括ires和2a调控序列两者的多顺反子rna分子进行编码。在一个实施例中，编码在转基因盒中以用于细胞膜表达的一种或多种蛋白质还可以包括在跨膜结构域或gpi锚与细胞外配体结合结构域之间的肽连接子或间隔子。此类连接子或间隔子可以为细胞表面表达的蛋白质增加灵活性，所述细胞表面表达的蛋白增强了蛋白质与其靶分子例如在相邻细胞上相互作用的能力。此类连接子或间隔子还可以被设计或选择，以通过二硫键形成或蛋白质-蛋白质相互作用来促进蛋白质在细胞表面处的二聚作用或三聚作用。例如，可以采用免疫球蛋白分子或cd8的铰链区来增强灵活性和二聚作用两者。在一个实施例中，编码在转基因盒中的一种或多种蛋白质还可以包括肽标签。肽标签可以包含c-myc、聚组氨酸、v5或flag标签并且可以例如在细胞内或在细胞外位于多肽的n端或c端，或者可以编码在蛋白质内例如在细胞外环中或在跨膜结构域与细胞外结构域之间。肽标签可以用作不同的蛋白结构域(例如跨膜结构域与细胞外结构域)之间的间隔子或连接子，并且可以用于检测或纯化或检测蛋白质或表达蛋白质的细胞。在一个实施例中，例如式(i)或(ia)的病毒中的一种或多种另外的转基因处于外源性启动子或内源性启动子(例如内源性启动子)的控制下。在一个实施例中，e3区中的转基因(b2)处于外源性启动子的控制下。在一个实施例中，所述一种或多种另外的转基因处于e3区与腺病毒基因组中的纤维l5之间，例如位于式(i)的构建体中的位置bx处，具体地说是处于外源性启动子的控制下。因此，在一个实施例中，bx中的转基因处于外源性启动子的控制下。在一个实施例中，所述一种或多种另外的转基因基因处于e4区与腺病毒基因组中的纤维l5之间，例如位于式(i)或(ia)的构建体中的位置by处，具体地说是处于如主要晚期启动子等内源性启动子的控制下。这可能是除了编码在区by中的治疗蛋白或其活性片段之外额外的。如本文所采用的，转基因是指已经插入腺病毒的基因组序列中的基因，其中所述基因对病毒而言是非天然的(外源的)或并非正常出现在病毒中的所述特定位置。本文给出了转基因的实例。如本文所采用的，转基因还包含基因的功能片段，所述功能片段是基因的一部分，所述部分在插入时适合于执行全长基因的功能或大部分功能，例如50％的功能或更多。除非上下文另有指示，否则转基因和编码序列在插入病毒基因组中的上下文中可互换使用。如本文所采用的，编码序列意指例如对功能性rna、肽、多肽或蛋白质进行编码的dna序列。通常，编码序列是对感兴趣的功能性rna、肽、多肽或蛋白质进行编码的转基因的cdna。感兴趣的功能性rna、肽、多肽和蛋白质描述如下。在一个实施例中，如本文所采用的，转基因是指dna的片段，所述片段含有已经从一种生物体中分离并且被引入不同的生物体即本公开的病毒中的基因或cdna序列。在一个实施例中，dna的这一非原生区段将总体上保留产生功能性rna、肽、多肽或蛋白质的能力。所采用的转基因可以例如对单个蛋白质或其活性片段、嵌合蛋白或融合蛋白进行编码。显然，病毒基因组含有dna的编码序列。在本说明书的上下文中，除非之后通过重组技术进行修饰，否则病毒的基因组序列中的内源(天然存在的基因)不被看作是转基因，如其处于非天然位置或在非天然环境中。因此，在一个实施例中，插入的一种或多种转基因对人或人源化蛋白、多肽或肽进行编码。例如，所述一种或多种转基因可以位于转基因盒内。如本文所采用的，gpi锚是指可以在转译后修饰期间与蛋白质的c端附接的糖脂。糖脂由通过含碳水化合物的连接子(糖苷地结合到肌醇滤渣的葡糖胺和甘露糖)并且经由乙胺醇磷酸(etnp)桥与成熟蛋白质的c端氨基酸连接的磷脂酰肌醇基构成。疏水性磷脂酰肌醇基内的两种脂肪酸将蛋白质锚定到细胞膜。经过糖基磷脂酰肌醇化的(gpi连接的)蛋白质通常含有单个肽，从而将蛋白质引导到内质网(er)中。c端由保持插入er膜中的疏水性氨基酸构成。然后，疏水端被gpi锚切割并替换。随着蛋白质行进通过分泌途径，蛋白质经由囊泡被转移到高尔基体并且最后到达细胞外空间，在所述细胞外空间中，蛋白质仍然与细胞膜的外部小叶附接。由于糖基磷脂酰肌醇化是将此类蛋白质与膜附接的唯一方式，因此通过磷脂酶切断基团将导致蛋白质从膜中控制释放。后一种机制在体外使用；即，在酶测定中从膜中释放的膜蛋白是糖基磷脂酰肌醇化蛋白。磷脂酶c(plc)是已知用于切断在gpi锚定的蛋白质中发现的磷酸-甘油键的酶。用plc进行处理将导致从外部细胞膜中释放gpi连接的蛋白质。已知t细胞标记thy-1和乙酰胆碱酯酶以及肠碱性磷酸酶和胎盘碱性磷酸酶两者是经过gpi连接的并且通过用plc进行处理来进行释放。认为gpi连接的蛋白质优先地位于脂筏中，这表明质膜微结构域中具有高组织水平。ferguson、kinoshita和hart编写的gpi锚综述可在《糖生物学基础(essentialsofglycobiology)》第2版第11章中获得。病毒在本说明书的上下文中有复制能力是指具有用于在体外和体内在细胞中复制的所有必需机制的病毒，即无需包装细胞系的辅助。例如至少在e1a区有缺失、能够在互补包装细胞系中复制的病毒载体不是这个上下文中的有复制能力的病毒。病毒载体是有复制缺陷的病毒，所述有复制缺陷的病毒需要包装细胞系(包括互补转基因)来进行复制。如本文所采用的，能够复制的病毒是指有复制能力的病毒或其复制取决于癌细胞中的因子例如上调因子(如p53或类似因子)的病毒。在一个实施例中，腺病毒是人腺病毒。如本文所采用的，“腺病毒”、“血清型”或“腺病毒血清型”是指可以指定为被分类到亚组a-f的50多种目前已知的腺病毒血清型中的任何一种并且进一步扩展到任何至今仍未鉴别出或尚未分类的腺病毒血清型的任何腺病毒。参见例如strauss,“人类腺病毒感染(adenovirusinfectionsinhumans)”,《腺病毒(theadenoviruses)》,ginsberg,ea.,纽约州纽约市普莱南出版社(plenumpress,newyork,ny),第451-596页(1984)以及shenk,“腺病毒科：病毒和其复制(adenoviridae:thevirusesandtheirreplication)”,《病毒学领域(fieldsvirology)》,第2卷,第四版,knipe,35ea.,利平科特-威廉姆斯-威尔金斯出版公司(lippincottwilliams&wilkins),第2265-2267页(2001)，如下所示：腺病毒是基于其衣壳分组的。在一个实施例中，腺病毒是例如独立地选自包括以下或由以下组成的组的b亚组：ad3、ad7、ad11、ad14、ad16、ad21、ad34和ad51，如ad11，尤其ad11p(slobitski菌株)。在一个实施例中，本发明的腺病毒具有衣壳，如b亚组腺病毒的六邻体和/或纤维，如ad11，尤其是ad11p。在一个实施例中，腺病毒是ad11或具有ad11的纤维和/或六邻体和/或五邻体，如ad11p。在一个实施例中，本公开的病毒不是a组病毒。在一个实施例中，本公开的病毒不包括腺病毒死亡蛋白(adp)。在一个实施例中，本公开的病毒不是c组病毒。在一个实施例中，本公开的病毒不包括ad5病毒的一个或多个片段。在一个实施例中，本公开的病毒不是ad5。enadenotucirev(enad)是具有来自ad11p的纤维、五邻体和六邻体的之前被称为coload1(wo2005/118825)的嵌合溶瘤腺病毒，因此enadenotucirev是b亚组病毒。其具有包括来自ad11p和ad3的dna的嵌合e2b区。enad中缺失e3区的几乎全部和e4区的一部分。因此，enadenotucirev在基因组中具有显著的空间以在保持活力的同时容纳另外的遗传物质。此外，因为enad是b亚组腺病毒，所以人体中预先存在的免疫力与例如ad5相比不太常见。具有ad11纤维、五邻体和六邻体的嵌合溶瘤病毒的其它实例包含ovad1和ovad2(参见wo2006/060314)。enad似乎优先感染肿瘤细胞，在这些细胞中迅速复制并且导致细胞裂解。这样进而可以生成炎症性免疫应答，从而刺激身体也来对抗癌症。假设enad的成功部分地与病毒在体内的快速复制有关。重要的是，临床上已经证明，enad可以全身施用(例如，通过静脉内或腹膜内注射或输注)并且然后随后选择性地感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞内表达蛋白质。enad的可以由ad11p和其它b组腺病毒尤其是表达ad11p的衣壳蛋白的那些(如本文描述的那些)共享的这种性质使得可以在肿瘤和/或肿瘤微环境中表达经过编码的蛋白质。虽然enad选择性地裂解肿瘤细胞，但是可以引入另外的有益性质，例如通过用转基因武装病毒来增加病毒的治疗活性或减少病毒的副作用，所述转基因如对细胞信号传导蛋白或抗体进行编码的转基因或对刺激一个或多个细胞信号传导蛋白的实体进行编码的转基因。有利地，用对可以在癌细胞内表达的某些蛋白质进行编码的dna来武装病毒可以例如通过使细胞对于免疫系统更加可见或通过优先向靶肿瘤细胞递送治疗基因/蛋白质，实现利用身体自身的防御来更有效地对抗肿瘤细胞。在一个实施例中，本公开的溶瘤腺病毒例如通过减少癌症抑制免疫应答的能力来刺激患者的免疫系统对抗肿瘤。在一个实施例中，由本公开的病毒编码的抗cd40抗体或结合片段具有活化肿瘤微环境中和/或肿瘤附近的免疫细胞例如t细胞的能力。在一个实施例中，溶瘤病毒的纤维、六邻体和五邻体蛋白来自同一血清型，例如ad11，尤其是ad11p，例如发现于后者的基因组序列的位置30812-31789、18254-21100和13682-15367处，其中核苷酸位置相对于genbankid217307399(登录号：gc689208)。在一个实施例中，腺病毒是enadenotucirev(也称为enad并且以前称为coload1)。如本文所采用的，enadenotucirev是指公开于wo2016/174200中并且通过引用的方式并入的seqidno:21的嵌合腺病毒。嵌合腺病毒是具有复制能力的溶瘤嵌合腺病毒，所述溶瘤嵌合腺病毒具有与野生型腺病毒相比增强的治疗性质(参见wo2005/118825)。enad具有以来自adllp和ad3的dna为特征的嵌合e2b区和在e3/e4中的缺失。enadenotucirev的结构变化导致基因组比ad11p小约3.5kb，从而为转基因的插入提供了另外的“空间”。在一个实施例中，根据本公开的盒位于如b组腺病毒等腺病毒中的l5与e4区之间，具体地说是处于主要晚期启动子的控制下。在一个实施例中，所采用的病毒不是enad。可以在本发明中采用的其它病毒包含单纯性疱疹病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、塞内加谷病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、echo肠道病毒、柯萨奇病毒和牛痘病毒，尤其是腺病毒，所述腺病毒例如选自由以下组成的组：talimogenelaherparepvec、rigvir、ad5-ycd/muttksr39rep-hil12、cavataktm、cg0070、dnx-2401、g207、hf10、jx-594、mg1-ma3、mv-nis、obp-301、toca511。抗体或抗体片段在一个实施例中，本公开的病毒对全长抗cd40抗体进行编码。如本文所使用的术语抗体是指能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点(本文也称为结合位点)与如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽、肽等靶抗原特异性地结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，抗体分子包含抗体和其结合片段以及包括其中一种或多种的分子。如本文所采用的，抗原结合位点是指分子的一部分，所述部分包括一对可变区，具体地说是与靶抗原特异性地相互作用的同源对。如本文所采用的，抗体结合片段是指小于整个抗体，所述抗体结合片段仍能够与靶抗原特异性地结合。具体地说，如本文所采用的，旨在指代仅识别对其具有特异性的抗原的结合位点或与对其不具有特异性的抗原的亲和力相比与对其具有特异性的抗原具有显著更高的结合亲和力，例如5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍高的结合亲和力的结合位点。所采用的抗体分子可以包括具有全长重链和轻链的完整抗体分子、包括全长抗体的双特异性抗体格式或其中任何一种的片段，包含但不限于fab、经过修饰的fab、fab'、经过修饰的fab'、f(ab')2、fv、单结构域抗体(例如vh或vl或vhh)、scfv、二价抗体、三价抗体或四价抗体、双scfv、双抗体、三抗体、四抗体和其中任何一种的表位结合片段(参见例如holliger和hudson,2005,《自然生物技术(naturebiotech.)》23(9):1126-1136；adair和lawson,2005,《线上药物设计综述(drugdesignreviews-online)》2(3),209-217)。用于生产和制造这些抗体片段的方法在本领域是已知的(参见例如verma等人,1998,《免疫学方法期刊(journalofimmunologicalmethods)》,216,165-181)。本发明中使用的其它抗体片段包含国际专利申请wo2005/003169、wo2005/003170和wo2005/003171中描述的fab片段和fab'片段。多价抗体可以包括多种特异性例如双特异性或者可以是单特异性的(参见例如wo92/22853、wo05/113605、wo2009/040562和wo2010/035012)。在一个实施例中，本公开的病毒中采用的抗体分子是人源化的、嵌合的或非人的。如本文所采用的，人源化(其包含cdr嫁接的抗体)是指具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(cdr)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的分子(参见例如us5,585,089；wo91/09967)。应当理解，可能仅需要转移cdr的特异性决定残基而不是整个cdr(参见例如，kashmiri等人,2005,《方法(methods)》,36，25-34)。人源化抗体可以任选地进一步包括源自非人类物种的一个或多个框架残基，cdr源自所述一个或多个框架残基。当cdr或特异性决定残基被嫁接时，考虑到cdr所源自的供体抗体的种类/类型，可以使用任何适当的受体可变区框架序列，包含小鼠、灵长类动物和人类框架区。适当地，根据本公开的人源化抗体具有包括人类受体框架区以及本文提供的cdr中的一个或多个cdr的可变结构域。可以用于本公开的人类框架的实例是kol、newm、rei、eu、tur、tei、lay和pom(kabat等人,同上)。例如，kol和newm可以用于重链，rei可以用于轻链并且eu、lay和pom可以用于重链和轻链两者。可替代地，可以使用人类生殖系序列；这些可以在以下获得：http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/在本公开的人源化抗体中，受体重链和受体轻链不一定需要源自同一抗体并且可以(如果期望的话)包括具有源自不同链的框架区的合成链。框架区不需要具有与受体抗体的序列完全相同的序列。例如，可以将不常见的残基变成所述受体链种类或类型的更经常存在的残基。可替代地，可以改变受体框架区中的所选残基，使得其对应于在供体抗体中的同一位置处发现的残基(参见reichmann等人,1998,《自然(nature)》,332,323-324)。应当将这些改变保持在恢复供体抗体的亲和力所需的最小程度。wo91/09967中阐述了用于在受体框架区中选择残基的方案，所述残基可能需要改变。嵌合抗体通常含有非人类可变区和人类恒定区。在一个实施例中，本公开的抗体分子是完全人的，具体地说，可变结构域中的一个或多个可变结构域是完全人的。完全人分子是重链和轻链两者的可变区和恒定区(当存在时)均为人类来源或与人类来源的序列基本上相同但不一定来自同一抗体的那些分子。完全人抗体的实例可以包含例如通过上文描述的噬菌体展示方法产生的抗体和由鼠类免疫球蛋白的可变区基因以及任选地恒定区基因已经被其人类对应物替换的小鼠产生的抗体，例如，如ep0546073、us5,545,806、us5,569,825、us5,625,126、us5,633,425、us5,661,016、us5,770,429、ep0438474和ep0463151中概括性地描述的。与式(i)和(ia)相关的定义键是指将一个dna序列与另一个dna序列连接的共价键，例如将病毒基因组的一个区段与另一个区段连接。因此，当本文的式(i)和(ia)中的变量表示键时，由键表示的特征或元件不存在，即缺失。由于腺病毒的结构通常是类似的，因此在结构元件和提及结构元件的常用术语方面讨论了下文的元件，所述元件是技术人员已知的。当在本文中提及元件时，我们指的是对元件进行编码的dna序列或对腺病毒中元件的同一结构蛋白进行编码的dna序列。因为dna代码的冗余，所以后者是相关的。可能需要考虑病毒对密码子使用的偏好以获得优化结果。来自本公开的病毒中采用的腺病毒的任何结构元件可以包括天然序列或由天然序列组成，或者可以在给定长度上具有至少95％的相似性，如96％、97％、98％、99％或100％。可以改变或修饰原始序列以省略遗传物质的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。然而，在一个实施例中，至少95％类似或相同的dna序列对同一基因产物即rna和/或蛋白质进行编码。技术人员知道，当进行改变时，不得破坏病毒的阅读框，从而使得结构蛋白的表达遭到破坏。本公开还扩展到在严格条件下与本文所公开的序列杂交的多核苷酸序列。在一个实施例中，给定元件是全长序列，即全长基因。如本文所采用的，全长基因是指基因的编码序列的至少全部，但是可以包含任何关联非编码区，尤其是如果所述关联非编码区与基因的功能相关的话。在一个实施例中，给定元件小于全长序列并且保留与全长序列相同或相对应的功能。在一个实施例中，对于在本公开的构建体中任选的给定元件，dna序列可以小于全长并且不具有功能性，例如，e3区可以全部地或部分地缺失。然而，缺失基本上全部e3区可能是有用的，因为这样优化了插入转基因时可用的空间。对腺病毒的结构蛋白或功能蛋白进行编码的结构基因通常通过dna的非编码区连接。因此，关于在哪里“切割”感兴趣的结构元件的基因组序列(尤其是其非编码区)以将转基因插入本公开的病毒中存在一定的灵活性。因此，出于本说明书的目的，元件将被认为是参考的结构元件，其程度为所述所述结构元件适于目的并且不对外来材料进行编码。因此，在适当情况下，基因将与适合的非编码区缔合，例如如在病毒的天然结构中发现的。因此，在一个实施例中，将插入物(如对转基因进行编码的dna)插入到基因组病毒dna的非编码区如内含子或基因间序列中。如此，腺病毒的一些非编码区可以具有例如替代性剪接、转录调控或转译调控的功能，并且这一点可能需要考虑在内。本文鉴别出的与l5区缔合的位点适合于容纳对如rnai、细胞因子、单链或多聚体蛋白(如抗体)等复合实体进行编码的各种dna序列，尤其是seqidno:12。如本文所采用的基因是指与其缔合的任何编码序列和非编码序列，例如内含子和关联外显子。在一个实施例中，基因包括仅基本结构组分或仅由基本结构组分组成，所述基本结构组分例如编码区。下文进行了关于腺病毒的具体结构元件的讨论。反向末端重复(itr)序列对于所有已知的腺病毒是共有的(因其对称性而这样命名)并且是病毒染色体复制起点。这些序列的另一个性质是能够形成发夹。如本文所采用的，5'itr是指从腺病毒的5'端开始的itr的一部分或全部，所述部分或全部当在适合的位置并入腺病毒中时保留itr的功能。在一个实施例中，5'itr包括以下或由以下组成：是wo2016/174200的seqidno:21(所述序列通过引用的方式并入本文)的约1bp到138bp的序列或沿整个长度与其90％、95％、96％、97％、98或99％相同的序列，尤其是由wo2016/174200中公开的seqidno:17(所述序列通过引用的方式并入本文)的约1bp到138bp组成的序列。如本文所采用的，3'itr是指从腺病毒的3'端开始的itr的一部分或全部，所述部分或全部当在适合的位置并入腺病毒中时保留itr的功能。在一个实施例中，3'itr包括以下或由以下组成：是wo2016/174200中公开的seqidno:17的约32189bp到32326bp的序列或沿整个长度与其90％、95％、96％、97％、98或99％相同的序列，尤其是由wo2016/174200中公开的seqidno:17的约32189bp到32326bp组成的序列。如本文所采用的，b1是指对以下进行编码的dna序列：来自腺病毒的e1a的一部分或全部、腺病毒的e1b区的一部分或全部以及独立地腺病毒的e1a区和e1b区的一部分或全部。当b1是键时，e1a序列和e1b序列将从病毒中省略。在一个实施例中，b1是键并且因此病毒是载体。在一个实施例中，b1进一步包括转基因。本领域已知e1区可以容纳可以以破坏性方式插入e1区中(即位于序列的“中间”)的转基因或者e1区的一部分或全部可以缺失以提供更多的空间来容纳遗传物质。如本文所采用的，e1a是指对腺病毒e1a区的一部分或全部进行编码的dna序列。后者在本文中是指多肽/蛋白质e1a。e1a基因可以发生突变，使得由其编码的蛋白质具有保守或非保守氨基酸变化(例如在整个长度上有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化、添加和/或缺失)，从而使得其具有：与野生型(即对应的未突变蛋白)相同的功能；与野生型蛋白相比增加的功能；与野生型蛋白相比减少的功能，如无功能；或者与野生型蛋白相比具有新功能、或其组合，视情况而定。如本文所采用的，e1b是指对腺病毒e1b区(即多肽或蛋白质)的一部分或全部进行编码的dna序列，其可以发生突变，使得由e1b基因/区编码的蛋白质具有保守或非保守氨基酸变化(例如在整个长度上有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化、添加和/或缺失)，从而使得其具有：与野生型(即对应的未突变蛋白)相同的功能；与野生型蛋白相比增加的功能；与野生型蛋白相比减少的功能，如无功能；或者与野生型蛋白相比具有新功能、或其组合，视情况而定。因此，相对于如野生型e1a和/或e1b等野生型e1区，b1可以是经过修饰的或未修饰的。技术人员可以容易地鉴别出e1a和/或e1b是否存在或(部分)缺失或突变。如本文所采用的，野生型是指已知的腺病毒或来自已知的腺病毒的序列。已知的腺病毒是已经鉴别出并命名的腺病毒，无论序列信息是否可用。在一个实施例中，b1的序列是wo2016/174200中公开的seqidno:17的139bp到3932bp。如本文所采用的，ba是指视情况而定包含任何非编码序列的对e2b-l1-l2-l3-e2a-l4区进行编码的dna序列(具体地说，对应于来自腺病毒的天然序列)。通常，此序列将不包括转基因。在一个实施例中，所述序列与来自已知腺病毒(例如表1所示的血清型)尤其是b组病毒(例如ad3、ad7、ad11、ad14、ad16、ad21、ad34、ad35、ad51或其组合，如ad3、ad11或其组合)的连续序列基本上类似或相同。在一个实施例中，e2b-l1-l2-l3-e2a-l4是指包括这些元件和与所述区缔合的其它结构元件，例如ba通常将包含对蛋白质iv2a进行编码的序列，例如如下：iv2aiv2a-e2b-ll-l2-l3-e2a-l4。在一个实施例中，e2b区是嵌合的。也就是说，包括来自两种或更多种不同腺病毒血清型的dna序列，例如来自ad3和ad11，如ad22p。在一个实施例中，e2b区具有是wo2016/174200中公开的seqidno:17的5068bp到10355bp的序列或在整个长度上与其95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个实施例中，组分ba中的e2b包括wo2016/174200中公开的seqidno:18(所述序列通过引用的方式并入本文)中示出的序列。在一个实施例中，ba的序列是wo2016/174200中公开的seqidno:18的3933bp到27184bp。如本文所采用的，e3是指对腺病毒e3区(即蛋白质/多肽)的一部分或全部进行编码的dna序列，其可以发生突变，使得由e3基因编码的蛋白质具有保守或非保守氨基酸变化(例如在整个长度上有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化、添加和/或缺失)，从而使得其具有：与野生型(对应的未突变蛋白)相同的功能；与野生型蛋白相比增加的功能；与野生型蛋白相比减少的功能，如无功能；或者与野生型蛋白相比具有新功能、或其组合，视情况而定。在一个实施例中，e3区形成表1中给出的腺病毒血清型或其组合、尤其是b组血清型，例如ad3、ad7、ad11(尤其是ad11p)、ad14、ad16、ad21、ad34、ad35、ad51或其组合，如ad3、ad11(尤其是ad11p)或其组合。在一个实施例中，e3区具有wo2016/174200中公开的seqidno:19中示出的序列。在一个实施例中，e3区部分地缺失，例如缺失95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％。在一个实施例中，b2是键，其中不存在对e3区进行编码的dna。在一个实施例中，对e3区进行编码的dna可以被转基因替换或打断。如本文所采用的，“被转基因替换的e3区”包含e3区的一部分或全部用转基因替换。在一个实施例中，b2区包括是wo2016/174200中公开的seqidno:98(所述序列通过引用的方式并入本文)的27185bp到28165bp的序列。在一个实施例中，b2由是wo2016/174200中公开的seqidno:98的27185bp到28165bp的序列组成。如本文所采用的，bx是指在bb中的l5基因的5'端附近的dna序列。如本文所采用的，在l5基因的5'端附近或近端是指：邻近(邻接)l5基因或与其固有地缔合的非编码区的5'端，即紧靠或邻接l5基因或与其固有地缔合的非编码区的5'主端。可替代地，在附近或近端可以指靠近l5基因，使得在bx区与l5基因的5'端之间不存在编码序列。因此，在一个实施例中，bx直接与l5的表示例如l5基因的编码序列的开始的碱基连接。因此，在一个实施例中，bx直接与l5的表示例如非编码序列的开始的碱基连接，或直接与和l5天然地缔合的非编码区连接。如本文所采用的，与l5天然地缔合的非编码区是指是l5基因的一部分或与其邻接但不是另一个基因的一部分的非编码区的一部分或全部。在一个实施例中，bx包括wo2016/174200中公开的seqidno:98的序列。此序列是人工非编码序列，其中可以在所述人工非编码序列中插入例如包括转基因(或转基因盒)、限制性位点或其组合的dna序列。这个序列因为充当缓冲剂而有利的地方在于其在最小化对病毒稳定性和活力的破坏性影响的同时允许在转基因的确切位置上具有一定的灵活性。一个或多个插入物可以从5'端、3'端或在bp1到bp201之间例如在以下碱基对之间的任何点处出现在wo2016/174200中公开的seqidno:98中：1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34、34/35、35/36、36/37、37/38、38/39、39/40、40/41、41/42、42/43、43/44、44/45、45/46、46/47、47/48、48/49、49/50、50/51、51/52、52/53、53/54、54/55、55/56、56/57、57/58、58/59、59/60、60/61、61/62、62/63、63/64、64/65、65/66、66/67、67/68、68/69、69/70、70/71、71/72、72/73、73/74、74/75、75/76、76/77、77/78、78/79、79/80、80/81、81/82、82/83、83/84、84/85、85/86、86/87、87/88、88/89、89/90、90/91、91/92、92/93、93/94、94/95、95/96、96/97、97/98、98/99、99/100、100/101、101/102、102/103、103/104、104/105、105/106、106/107、107/108、108/109、109/110、110/111、111/112、112/113、113/114、114/115、115/116、116/117、117/118、118/119、119/120、120/121、121/122、122/123、123/124、124/125、125/126、126/127、127/128、128/129、129/130、130/131、131/132、132/133、133/134、134/135、135/136、136/137、137/138、138/139、139/140、140/141、141/142、142/143、143/144、144/145、145/146、146/147、147/148、148/149、150/151、151/152、152/153、153/154、154/155、155/156、156/157、157/158、158/159、159/160、160/161、161/162、162/163、163/164、164/165、165/166、166/167、167/168、168/169、169/170、170/171、171/172、172/173、173/174、174/175、175/176、176/177、177/178、178/179、179/180、180/181、181/182、182/183、183/184、184/185、185/186、186/187、187/188、189/190、190/191、191/192、192/193、193/194、194/195、195/196、196/197、197/198、198/199、199/200或200/201。在一个实施例中，bx包括wo2016/174200中公开的seqidno:98，其dna序列插入在bp27与bp28之间或对应于wo2016/174200中公开的seqidno:98的位置28192bp与28193bp之间的位置。在一个实施例中，bx的序列是wo2016/174200中公开的seqidno:21(所述序列通过引用的方式并入本文)的28166bp到28366bp。在一个实施例中，bx是键。如本文所采用的，bb是指对l5区进行编码的dna序列。如本文所采用的，l5区是指含有对纤维多肽/蛋白质进行编码的基因的dna序列，在上下文中视情况而定。纤维基因/区对作为腺病毒的主要衣壳组分的纤维蛋白进行编码。纤维在受体识别中起作用并且促使腺病毒能够选择性地结合和感染细胞。在本公开的病毒中，纤维可以来自任何腺病毒血清型，并且通过本公开还设想了由于改变不同血清型中的一种血清型的纤维而嵌合的腺病毒。在一个实施例中，纤维来自b组病毒，尤其是ad11，如ad11p。在一个实施例中，bb的序列是wo2016/174200中公开的seqidno:17(所述序列通过引用的方式并入本文)的28367bp到29344bp。如本文所采用的，与by有关的dna序列是指在bb的l5基因的3'端附近的dna序列。如本文所采用的，在l5基因的3'端附近或近端是指：邻近(邻接)l5基因的3'端或与其固有地缔合的非编码区，即紧靠或邻接l5基因的3'主要端或与其固有地缔合的非编码区(即对l5而言内源的非编码序列的全部或一部分)。可替代地，在附近或近端可以指靠近l5基因，使得在by区与l5基因的3'端之间不存在编码序列。因此，在一个实施例中，by直接与l5的表示编码序列的“端”的碱基连接。因此，在一个实施例中，by直接与l5的代表非编码序列的“端”的碱基连接，或者直接与和l5天然地缔合的非编码区连接。固有地和天然地在本文中可互换使用。在一个实施例中，by包括wo2016/174200中公开的seqidno:99(所述序列通过引用的方式并入本文)的序列。此序列是非编码序列，其中可以插入例如包括转基因(或转基因盒)、限制性位点或其组合的dna序列。此序列因为充当缓冲剂而有利的是其在最小化对病毒稳定性和活力的破坏性影响的同时允许在转基因的确切位置上具有一定的灵活性。一个或多个插入物可以从5'端、3'端或在bp1到bp35之间例如在以下碱基对之间的任何点处出现在wo2016/174200中公开的seqidno:18(所述序列通过引用的方式并入本文)内的任何位置：1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34或34/35。在一个实施例中，by包括wo2016/174200中公开的seqidno:99(所述序列通过引用的方式并入本文)，其dna序列插入在位置bp12和bp13之间或对应于wo2016/174200中公开的seqidno:17(所述序列通过引用的方式并入本文)中的29356bp和29357bp的位置。在一个实施例中，插入物是限制性位点插入物。在一个实施例中，限制性位点插入物包括一个或两个限制性位点。在一个实施例中，限制性位点是包括2个限制性位点的19bp限制性位点插入物。在一个实施例中，限制性位点插入物是包括1个限制性位点的9bp限制性位点插入物。在一个实施例中，限制性位点插入物包括一个或两个限制性位点和至少一个转基因，例如一个或两个或三个转基因，如一个或两个转基因。在一个实施例中，限制性位点是包括2个限制性位点和至少一个转基因例如一个或两个转基因的19bp限制性位点插入物。在一个实施例中，限制性位点插入物是包括1个限制性位点和至少一个转基因例如一个或两个转基因的9bp限制性位点插入物。在一个实施例中，两个限制性位点夹置在一个或多个如两个转基因中(例如在转基因盒中)。在一个实施例中，当by包括两个限制性位点时，所述限制性位点彼此不同。在一个实施例中，by中的所述一个或多个限制性位点在其已经插入的特定腺病毒基因组中是非天然存在的(如唯一的)。在一个实施例中，by中的所述一个或多个限制性位点不同于位于腺病毒基因组中的其它位置的其它限制性位点，例如不同于天然存在的限制性位点或引入如bx等基因组的其它部分中的限制性位点。因此，在一个实施例中，所述一个或多个限制性位点允许区段中的dna被特异性切割。在一个实施例中，by的序列是wo2016/174200中公开的seqidno:17的29345bp到29379bp。在一个实施例中，by是键。在一个实施例中，插入物在wo2016/174200中公开的seqidno:99中的bp12之后。在一个实施例中，插入物在wo2016/174200中公开的seqidno:17的约位置29356bp处。在一个实施例中，插入物是包括一个或多个转基因(例如1个、2个或3个，如1个或2个)的转基因盒。如本文所采用的，e4是指对腺病毒e4区(即多肽/蛋白区)的一部分或全部进行编码的dna序列，其可以发生突变，使得由e4基因编码的蛋白质具有保守或非保守氨基酸变化(例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化、添加和/或缺失)并且具有：与野生型(对应的未突变蛋白)相同的功能；与野生型蛋白相比增加的功能；与野生型蛋白相比减少的功能，如无功能；或者与野生型蛋白相比具有新功能、或其组合，视情况而定。在一个实施例中，e4区部分地缺失，例如缺失95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一个实施例中，e4区的序列是wo2016/174200中公开的seqidno:17的32188bp到29380bp。在一个实施例中，除了缺失的e4或f4区外，e4是存在的。在一个实施例中，b3是键，即，其中不存在e4。在一个实施例中，b3的序列由wo2016/174200中公开的seqidno:17的32188bp到29380bp组成。如本文所采用的，数字范围包含端点。技术人员将理解，本文的式(如式(i)、(ia))中的元件是连续的并且可以体现非编码dna序列以及本文提及的基因和编码dna序列(结构特征)。在一个或多个实施例中，本公开的式试图描述腺病毒基因组中的天然存在的序列。在此上下文中，技术人员将清楚，所述式是指表征基因组相关区段的主要元件并且不旨在成为对dna的基因组延伸的详尽描述。如本文所采用的，e1a、e1b、e3和e4各自独立地指代野生型和其等同物、如本文所描述的每个区的突变或部分缺失形式，尤其是来自已知腺病毒的野生型序列。如本文所采用的，“插入物”是指在5'端、3'端或在给定dna序列参考片段内并入使得其打断参考序列的dna序列。参考序列用作的参考点，插入物相对于所述参考点进行定位。在本公开的上下文中，插入物通常出现在均公开于wo2016/174200中的seqidno:98或seqidno:99中。插入物通常将包含转基因盒。当序列被打断时，病毒仍将包括原始序列，但通常其将作为两个片段夹置在插入物中。在一个实施例中，转基因或转基因盒不包括未偏置插入转座子，如tn7转座子或其一部分。如本文所采用的，tn7转座子是指如wo2008/080003中描述的未偏置插入转座子。在一个实施例中，转基因或转基因盒进一步包括调控元件或序列。启动子如本文所采用的，启动子意指dna的启动对一个或多个特定基因的转录的区。启动子通常位于其转录的基因近端、在同一链上并且在dna上游(即5')。如在此上下文中所采用的，近端意指足够靠近以充当启动子。在一个实施例中，启动子在转录开始位点的100bp内。因此，如本文所采用的，内源性启动子是指天然存在于(即原生于)转基因所插入的腺病毒(或构建体)中的启动子。在一个或多个实施例中，所采用的内源性启动子是病毒中处于其在病毒基因组中的原始位置处的天然存在的启动子，具体地说，内源性启动子是用于表达一个或多个转基因的主要或唯一启动子。在一个实施例中，用于促进转基因的转译以及任选地转录的内源性启动子是驻留的启动子，即，是整合在腺病毒的基因组中并且先前并未通过重组技术引入的启动子。在如本文所采用的，处于内源性启动子的控制下是指转基因/转基因盒以适当的朝向插入以处于所述内源性启动子的控制下的情况。也就是说，当启动子通常在反义链上时，盒例如以反义朝向插入。如此，可以以两种朝向中的一种朝向来表达基因。然而，对于给定(特定)转基因，一个朝向通常提供与另一个朝向相比增加的表达水平。在一个实施例中，盒处于有义朝向。也就是在5'到3'的方向上转录。在一个实施例中，盒处于反义朝向。也就是在3'到5'的朝向上转录。例如，可以通过采用对转基因进行编码的基因以及剪接受体序列来利用病毒中的内源性启动子。因此，在一个实施例中，盒将包括促进转基因利用内源性启动子的剪接受体序列。因此，在一个实施例中，编码序列，例如对抗体或抗体结合片段进行编码的序列进一步包括剪接受体序列。在一个实施例中，一个或多个转基因、或转基因盒处于e4启动子或主要晚期启动子(如主要晚期启动子(ml启动子))的控制下。如本文所采用的，处于……的控制下意指转基因在特定启动子支配时被活化，即转录。如本文所采用的，主要晚期启动子(ml启动子或mlp)是指控制如l5基因等“晚期表达”基因的表达的腺病毒启动子。mlp是“有义链”启动子。也就是说，启动子影响在5'-3'方向上在启动子下游的基因。如本文所采用的，主要晚期启动子是指位于病毒基因组中的原始主要晚期启动子。如本文所采用的，e4启动子是指e4区的腺病毒启动子。e4区是反义区；因此，启动子是反义启动子。也就是说，启动子在3'-5'方向上在e4区上游。因此，处于e4启动子的控制下的任何转基因盒可能需要适当地被朝向。在一个实施例中，处于e4启动子的控制下的盒处于反义朝向。在一个实施例中，盒在有义朝向上处于e4启动子的控制下。如本文所采用的，e4启动子是指位于病毒基因组中的原始e4启动子。因此，在一个实施例中，提供了有复制能力的溶瘤腺病毒血清型11(如ad11p)或其病毒衍生物，其中纤维、六邻体和衣壳是血清型11(如ad11p)，其中病毒基因组包括对治疗性抗体或抗体结合片段进行编码的dna序列，其中所述dna序列处于对腺病毒而言内源性的选自由e4和主要晚期启动子组成的启动子(即，e4启动子或主要晚期启动子)的控制下，使得转基因不会干扰病毒复制，例如与l5区缔合(即，在所述区之前或之后)，如位于病毒基因组中的l5之后。在一个实施例中，通过重组技术在期望的位置处将内源性启动子引入病毒基因组中，例如引入转基因盒中。然而，在本说明书的上下文中，此布置通常称为外源性启动子。在一个实施例中，转基因盒包括外源性启动子。如本文所采用的，外源性启动子是未天然存在于转基因所插入的腺病毒中的启动子。外源性启动子通常来自其它病毒或者是哺乳动物启动子。如本文所采用的，外源性启动子意指通常位于感兴趣基因上游的调控对基因的转录的dna元件。在一个实施例中，基因表达的调控器(regulator)是外源性启动子，例如cmv(巨细胞病毒启动子)、cba(鸡β肌动蛋白启动子)或pgk(磷酸甘油酸激酶1个启动子)，如cmv启动子。在一个实施例中，外源性启动子是可诱导的。在一个实施例中，提供了有复制能力的溶瘤腺病毒血清型11(如ad11p)或其病毒衍生物，其中纤维、六邻体和衣壳是血清型11(如ad11p)，其中病毒基因组包括对位于病毒基因组的一部分中的治疗性抗体或抗体结合片段进行编码的dna序列，所述部分在在病毒复制周期中晚期表达并且使得转基因不会干扰病毒复制，其中所述dna序列处于对腺病毒而言外源性的启动子(例如cmv启动子)的控制下。在一个实施例中，对抗体或片段进行编码的dna序列与如本文的其它地方所描述的l5区缔合。其它调控序列如本文所采用的，“基因表达调控器”(或调控器/调控元件)是指遗传元件，如通常通过启动或增强转录或转译在基因表达中起作用的启动子、增强子或剪接受体序列。如本文所采用的，“剪接受体序列”、“剪接受体”或“剪接位点”是指确定mrna分子将在何时被剪接体复合物的小核核糖核蛋白识别的调控序列。一旦组装，剪接体就催化mrna分子的剪接受体位点到上游剪接供体位点之间的剪接，从而产生可以被转译以产生单个多肽或蛋白质的成熟mrna分子。在本发明中可以采用不同大小的剪接受体序列，并且这些序列可以被描述为短剪接受体(小)、剪接受体(中等)和分支剪接受体(大)。如本文所采用的，ssa是指通常仅包括剪接位点的短剪接受体，例如4bp。如本文所采用的，sa是指通常包括短剪接受体和多聚嘧啶区(polypyrimidinetract)的剪接受体，例如16bp。如本文所采用的，bsa是指通常包括短剪接受体、多聚嘧啶区和分支点的分支剪接受体，例如26bp。在一个实施例中，本公开的构建体中采用的剪接受体是cagg或者seqidno:15或16(两者在wo2016/174200中被公开为其中的seqidno:10和11，所述序列通过引用的方式并入本文)。在一个实施例中，ssa具有核苷酸序列cagg。在一个实施例中，sa具有核苷酸序列seqidno:15。在一个实施例中，bsa具有核苷酸序列cagg。在一个实施例中，剪接受体序列独立地选自包括以下的组：tgctaatcttcctttctctcttcagg(seqidno:15)、tttctctcttcagg(seqidno:16)和cagg。在一个实施例中，包括ccacc的共有kozak序列紧跟着剪接位点(即在5'到3'的方向上在剪接位点之后)。在一个实施例中，剪接位点和kozak序列通过多达100个或更少bp散置(分开)。在一个实施例中，kozak序列具有核苷酸序列ccacc。通常，当编码序列处于内源性启动子或外源性启动子(如内源性启动子)的控制下时，kozak序列紧跟着编码序列。编码区的开始由起始密码子(aug)指示，例如处于序列(gcc)gccrccaugg(seqidno:8)的上下文中，编码序列的开始的开始由粗体形式的碱基指示。小写字母表示此位置处的共有碱基(但是所述共有碱基可以变化)，并且大写字母指示高度保守的碱基，即，‘augg’序列是恒定的或很少(如果有的话)改变；‘r’指示通常在此位置处观察到嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，并且带括号的序列(gcc)的意义不确定。因此，在一个实施例中，将起始密码子aug并入kozak序列中。如本文所采用的，内部核糖体进入dna序列是指对内部核糖体进入序列(ires)进行编码的dna序列。如本文所采用的，ires意指允许启动信使rna(mrna)序列的转译(包含在mrna序列内开始的启动)的核苷酸序列。这在盒对多顺反子mrna进行编码时特别有用。使用ires产生了被转译成多个单独的蛋白质或肽的多顺反子mrna。在一个实施例中，内部核糖体进入dna序列具有在wo2016/174200被公开为其中的seqidno:6(所述序列通过引用并入本文)的核苷酸序列。在一个实施例中，特定的ires仅在基因组中使用一次。这可能对基因组的稳定性有益。如本文所采用的，“高自切割效率2a肽”或“2a肽”是指在转译后被有效切割的肽。适合的2a肽包含p2a、f2a、e2a和t2a。本发明的诸位发明人已经注意到，一旦使用对给定2a肽进行编码的特异性dna序列一次，就可能不再次使用同一特异性dna序列。然而，可以利用dna代码中的冗余来生成转译成同一2a肽的dna序列。当盒对多顺反子mrna进行编码时，使用2a肽特别有用。使用2a肽导致单个多肽链被转译，所述单个多肽链在转译后被修饰以生成多个单独的蛋白质或肽。在一个实施例中，所采用的经过编码的p2a肽具有氨基酸序列seqidno:24。在一个实施例中，所采用的经过编码的f2a肽具有氨基酸序列seqidno:25。在一个实施例中，所采用的经过编码的e2a肽具有氨基酸序列seqidno:26。在一个实施例中，所采用的经过编码的t2a肽具有氨基酸序列seqidno:27。在一个实施例中，由转基因编码的mrna或每个mrna包括多聚腺苷酸化信号序列，如通常处于mrna序列末端的序列，例如采用如seqidno:10所示的序列。因此，在一个实施例中，转基因或转基因盒包括对多聚腺苷酸化信号序列进行编码的至少一个序列。如本文所采用的，“polya”、“多聚腺苷酸化信号”或“多聚腺苷酸化序列”意指通常含有aataaa位点的dna序列，所述dna序列一旦被转录就可以被切割并且多聚腺苷酸化新生mrna分子的多蛋白复合物识别。在一个实施例中，多聚腺苷酸化序列具有w02016/174200中公开的核苷酸序列seqidno:6(所述序列通过引用的方式并入本文)。在一个实施例中，构建体不包含多聚腺苷酸化序列。在一个实施例中，基因表达调控器是剪接受体序列。在一个实施例中，对如抗体或抗体结合片段等蛋白质/多肽/肽进行编码的序列进一步包括多聚腺苷酸化信号。调配物本公开涉及并且还扩展到如本文所描述的病毒的药物调配物。在一个实施例中，提供了根据本公开的能够复制的溶瘤病毒的例如用于输注或注射的液体胃肠外调配物，其中所述调配物提供的剂量范围为每剂量体积1x1010个到1x1014个病毒颗粒。肠胃外调配物意指被设计成不通过gi道递送的调配物。典型的肠胃外递送途径包含注射、植入或输注。在一个实施例中，调配物以用于推注递送的形式提供。在一个实施例中，肠胃外调配物呈注射形式。注射包含静脉内、皮下、肿瘤内或肌内注射。如本文所采用的，注射意指通过注射器将液体注入体内。在一个实施例中，本公开的方法不涉及肿瘤内注射。在一个实施例中，肠胃外调配物呈输注形式。如本文所采用的，输注意指通过滴注、输注泵、注射器驱动器或等效装置以较慢的速率施用流体。在一个实施例中，在1.5分钟到120分钟的范围内施用输注，如约3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、65分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟或115分钟。在一个实施例中，如通过注射器驱动器施用的一个剂量的调配物小于100ml，例如30ml。在一个实施例中，注射以缓慢注射施用，例如在1.5分钟到30分钟的时间内施用。在一个实施例中，调配物用于静脉内(i.v.)施用。此途径对于递送溶瘤病毒特别有效，因为其允许快速进入大多数器官和组织并且对于治疗转移瘤，例如已确立的转移瘤，尤其是位于如肝脏和肺等高度血管化区的那些转移瘤特别有用。治疗性调配物在制造和储存条件下通常将是无菌且稳定的。所述组合物可以被调配成适合于向人类施用的溶液、微乳液、脂质体或其它肠胃外调配物并且可以被调配成如注射器或小瓶等预填充装置，尤其是作为单个剂量。调配物通常将包括药学上可接受的稀释剂或载剂，例如与病毒相容的无毒等渗载剂，并且在所述载剂中，病毒在规定的时间段内是稳定的。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用分散剂或表面活性剂(如卵磷脂)或者非离子表面活性剂(如聚山梨醇酯80或40)，可以维持适当的流动性。在分散剂中，可以通过表面活性剂的存在来辅助维持所需的粒度。在组合物中，等渗剂的实例包含糖、如甘露醇等多元醇、山梨糖醇或氯化钠。在一个实施例中，所采用的肠胃外调配物可以包括以下中的一种或多种：缓冲剂，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、磷酸盐缓冲剂和/或tris缓冲剂；糖，例如右旋糖、甘露糖、蔗糖或类似物；盐，如氯化钠、氯化镁或氯化钾；洗涤剂，如非离子表面活性剂如briji、ps-80、ps-40或类似物。调配物还可以包括如edta或乙醇或edta和乙醇的组合等防腐剂，所述防腐剂被认为会阻止一种或多种可能的降解途径。在一个实施例中，调配物将包括根据本公开的纯化溶瘤病毒，例如每剂量1x1010个到1x1014个病毒颗粒，如1x1010个到1x1012个病毒颗粒。在一个实施例中，调配物中病毒的浓度范围为2x108到2x1014vp/ml，如2x1012vp/ml。在一个实施例中，肠胃外调配物包括甘油。在一个实施例中，调配物包括如本文所描述的溶瘤腺病毒、hepes(n-2-羟乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸)、甘油和缓冲剂。在一个实施例中，肠胃外调配物由本公开的病毒、hepes(例如5mm)、甘油(例如5-20％(v/v))、盐酸(例如用于将ph调整到范围7-8)和注射用水组成。在一个实施例中，在5mmhepes、20％的甘油中调配浓度为2x1012vp/ml的0.7ml本公开的病毒，最终ph为7.8。对药学上可接受的载剂的深入讨论可在《雷明顿氏药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》(新泽西州马克出版公司(mackpublishingcompany,n.j.)，1991)中获得。在一个实施例中，调配物作为用于包含吸入在内的局部施用的调配物提供。适合的可吸入制剂包含可吸入粉末、含有推进剂气体的计量气溶胶或不含推进剂气体的可吸入溶液。根据本公开的可吸入粉末通常将含有如本文所描述的病毒以及生理学上可接受的赋形剂。这些可吸入粉末可以包含单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、低聚糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或其与彼此的混合物。适合地使用如乳糖等单糖或如葡萄糖等二糖，尤其是但不排除呈其水合物形式。用于沉积到肺中的颗粒的粒度需要小于10微米，如1-9微米，例如0.1μm到5μm，尤其是1μm到5μm。携带病毒的颗粒的大小是最重要的，并且因此，在一个实施例中，根据本公开的病毒可以吸附或吸收到如给定大小的乳糖颗粒等颗粒上。可以用于制备可吸入气溶胶的推进剂气体在本领域是已知的。适合的推进剂气体选自：烃类，如正丙烷、正丁烷或异丁烷；以及卤烃类，如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进剂气体可以单独使用或以其混合物使用。特别适合的推进剂气体是选自tg11、tg12、tg134a和tg227的卤化烷烃衍生物。在上述卤化烃中，tg134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和tg227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)以及其混合物是特别适合的。含推进剂气体的可吸入气溶胶还可以含有其它成分，如助溶剂、稳定剂、表面活化剂(surface-activeagent)(表面活性剂(surfactant))、抗氧化剂、润滑剂和用于调整ph的手段。所有这些成分在本领域中是已知的。根据本发明的含推进剂气体的可吸入气溶胶可以含有活性物质的按重量计最多5％。根据本发明的气溶胶含有例如活性成分的按重量计0.002％到5％、按重量计0.01％到3％、按重量计0.015％到2％、按重量计0.1％到2％、按重量计0.5％到2％或按重量计0.5％到1％。可替代地，对肺部的局部施用还可以通过施用液体溶液或悬浮液调配物，例如采用如喷雾器等装置，例如连接到压缩机的喷雾器(例如连接到由弗吉尼亚州里士满的pari呼吸设备公司(parirespiratoryequipment,inc.,richmond,va.)制造的parimaster(r)压缩机的parilc-jetplus(r)喷雾器)。本发明的病毒可以分散在溶剂中递送，例如以溶液或悬浮液的形式，例如如上文所描述的用于肠胃外调配物。其可以悬浮在适当的生理溶液中，例如盐水或其它药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可以含有每1ml水中0.05mg到0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg到9.0mgnacl、0.15mg到0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg到0.30mg无水柠檬酸和0.45mg到0.55mg柠檬酸钠，以便达到约4.0到5.0的ph。治疗性悬浮液或溶液调配物还可以含有一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域中是众所周知的并且包含缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、edta、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。溶液或悬浮液可以包封在脂质体或可生物降解的微球中。调配物通常将采用无菌制造方法以基本上无菌的形式提供。这可以包含通过过滤用于调配物的缓冲溶剂/溶液来生产和灭菌、抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将调配物分配到无菌接收器中。根据本公开的可雾化调配物可以例如作为包装在箔包膜中的单个剂量单位(例如密封的塑料容器或小瓶)提供。每个小瓶含有一定单位剂量体积的溶剂/溶液缓冲液，例如2ml。本公开还扩展到鼻内递送的液体溶液或悬浮液，例如采用如均通过引用的方式并入本文的wo2009/068877和us2004/0153033中公开的装置。治疗在另外方面，本公开扩展到如本文所描述的用于治疗尤其是用于癌症治疗的病毒或其调配物。在一个实施例中，治疗方法用于治疗肿瘤。如本文所采用的，肿瘤(tumour)旨在指代由不受控制的且进行性过度细胞分裂引起的异常组织团块，也称为肿瘤(neoplasm)。肿瘤可以是良性的(非癌性的)或恶性的。肿瘤涵盖所有癌症形式和转移。在一个实施例中，肿瘤是癌性的。在一个实施例中，肿瘤是实体瘤。实体瘤可以定位或转移。在一个实施例中，肿瘤是上皮源的。在一个实施例中，肿瘤是恶性肿瘤，如结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。在一个实施例中，肿瘤是结肠直肠恶性肿瘤。如本文所采用的，恶性肿瘤是指癌性细胞。在一个实施例中，采用溶瘤腺病毒来治疗或预防转移。在一个实施例中，采用本文的方法或调配物来治疗抗药性癌症。在一个实施例中，病毒与另外的癌症治疗或疗法的施用组合地施用。在一个实施例中，提供了根据本公开的病毒或调配物，所述病毒或调配物用于制造用于治疗癌症(例如上文所描述的癌症)的药物。在另外方面，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者(例如人类患者)施用治疗有效量的根据本公开的病毒或调配物。在一个实施例中，本文的溶瘤病毒或调配物与另一种疗法组合地施用。如本文所采用的，“组合地”旨在涵盖在癌症治疗或疗法之前、同时和/或之后施用溶瘤病毒的情况。然而，通常，用于组合疗法的治疗方案通常会重叠。如本文所采用的，“组合疗法”是指一起例如作为试剂盒或共调配尤其是用于癌症治疗的两种药物产品。癌症疗法包含外科手术、放射疗法、靶向疗法和/或化学疗法。如本文所采用的，癌症治疗是指用治疗性化合物或生物剂(例如旨在治疗癌症的抗体和/或其维持疗法)进行治疗。在一个实施例中，癌症治疗选自包含以下的任何其它抗癌疗法：化学治疗剂；靶向抗癌剂，如抗体药物缀合物；放射疗法、放射性同位素疗法或其任何组合。在一个实施例中，本公开的如溶瘤腺病毒等病毒可以用作如手术(新辅助疗法)等疗法的预治疗，例如以缩小肿瘤，例如以治疗转移和/或预防转移或进一步转移。溶瘤腺病毒可以在如手术(辅助疗法)等疗法之后使用，例如以保持癌症缓解、治疗转移和/或预防转移或进一步转移。在一个实施例中，采用本公开的病毒或调配物来维持疗法。如本文所采用的，同时是另外的癌症治疗与溶瘤腺病毒调配物在同一时间或大致同一时间施用。治疗可以包含在同一调配物中或作为单独的调配物施用。在一个实施例中，病毒与化学治疗剂的施用组合地施用。如本文所采用的，化学治疗剂旨在指代选择性地破坏恶性细胞和组织的的特异性抗肿瘤化学剂或药物。例如，烷化剂、抗代谢物、蒽环霉素、植物碱、拓扑异构酶抑制剂和其它抗肿瘤剂。特异性化学治疗剂的实例包含多柔比星(doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-fu)、紫杉醇、卡培他滨(capecitabine)、伊立替康(irinotecan)以及如顺铂和奥沙利铂(oxaliplatin)等铂类。剂量可以由从业者基于所治疗的癌症的性质来选择。在一个实施例中，治疗剂是更昔洛韦(ganciclovir)，其可以帮助控制免疫应答和/或肿瘤血管形成。在一个实施例中，本文的方法中采用的一个或多个疗法是有节奏的，也就是说，用低剂量抗癌药物进行连续的或频繁的治疗，这经常是在考虑到伴随有其它疗法的情况下。b亚组溶瘤腺病毒尤其是ad11和由其衍生的如enad等那些腺病毒可以与化学治疗剂特别协同，因为所述腺病毒似乎具有在很大程度上不依赖于细胞凋亡的作用机制，从而通过主要的坏死性机制杀死癌细胞。此外，在化学疗法期间出现的免疫抑制可以允许溶瘤病毒以更高的效率发挥作用。如本文所采用的，治疗剂量是指当在适合的治疗方案中采用时适合于实现预期治疗效果，例如改善疾病的症状或病状、尤其是不会引发剂量限制性副作用的如溶瘤腺病毒等病毒的量。当病毒颗粒的数量可以足够导致以下时，剂量可被视为治疗癌症或转移的治疗剂量：肿瘤或转移性生长减慢或停止、或发现肿瘤或转移的大小缩小和/或患者的寿命延长。适合的治疗剂量通常是治疗效果与可耐受毒性之间的平衡，例如其中在考虑到疗法所达到的益处的情况下，副作用和毒性是可耐受的。在一个实施例中，提供了在单个治疗周期中全身施用多个剂量的根据本公开的溶瘤腺病毒的肠胃外调配物，例如其中每次施用时给予的总剂量在每剂量1x1010个到1x1014个病毒颗粒的范围内。在一个实施例中，施用一个或多个剂量(例如每个剂量)的病毒或包括所述病毒的组合物，使得病毒颗粒递送速率在每分钟2x1010个颗粒到每分钟2x1012个颗粒的范围内。在一个实施例中，每周施用根据本公开的病毒或治疗性构建体(包含包括所述病毒或治疗性构建体的调配物)，例如在第1周，在第1天、第3天、第5天施用所述剂量，之后后续每周一个剂量。在一个实施例中，每两周或每三周施用根据本公开的病毒或治疗性构建体(包含包括所述病毒或治疗性构建体的调配物)，例如在第1(一)周在第1天、第3天和第5天施用并且在第2周或第3周也在第1天、第3天和第5天施用所述病毒或治疗性构建体。此给药方案可以重复多次，视情况而定。在一个实施例中，每月施用根据本公开的病毒或治疗性构建体(包含包括所述病毒或治疗性构建体的调配物)，例如在治疗周期内或作为维持疗法。在一个实施例中，通过重组技术制备本公开的病毒和构建体。技术人员将理解，经过武装的腺病毒基因组可以通过其它技术手段制造，所述技术手段包含完全合成基因组或包括基因组中所有基因组的一部分的质粒。技术人员将理解，在合成基因组的情况下，插入区可以不包括限制性位点核苷酸，因为后者是在用克隆方法插入基因后的假象。在一个实施例中，经过武装的腺病毒基因组是以完全合成的方式制造的。本公开进一步扩展到通过插入转基因或转基因盒获得的或可获得的式(i)或其子式的腺病毒。如本文所采用的，“是”意指包括。在本说明书的上下文中，“包括”应被解释为“包含”。包括某些特征/要素的本发明的实施例还旨在扩展到“由相关要素/特征组成”或“基本上由相关要素/特征组成”的替代性实施例。当在技术上适合时，可以组合本发明的实施例。如专利和申请等技术参考文献以引用的方式并入本文。本文具体地和明确地叙述的任何实施例可以单独地或与一个或多个另外的实施例组合地形成免责声明的基础。本文的标题用于将文件分成各章节并且不旨在用于解释本文所提供的本公开的含义。本公开还扩展到本文具体公开的任何病毒序列或盒序列、包括所述病毒的组合物、使用所述盒来生成病毒的用途以及根据本公开的病毒用于疗法尤其是癌症疗法的用途。本申请要求均于2017年6月1日提交的gb1708779.2和gb1708778.4的优先权。每个文献的公开内容通过引用的方式并入本文，具体地说并入的是本文所公开的氨基酸序列和多核苷酸序列。优先权文件可以用作修正本说明书的基础。在以下实例中仅通过说明的方式进一步描述本发明。实例实例1：表达抗cd40单克隆抗体(ng-350)的enad病毒的产生.所产生的对抗cd40单克隆抗体进行编码的第一enadenotucirev病毒基因组被命名为ng-350(seqidno.13)。为了产生ng-350基因组，通过将对以下进行编码的盒直接插入到质粒penad2.4中来产生质粒png-350：5'短剪接受体序列(cagg，seqidno.2)；重链前导序列(seqidno.3)；抗cd40vh链(seqidno.4)；抗体重链恒定区(seqidno.5)；p2a高效可自切割肽(seqidno.6)；轻链前导序列(seqidno.7)；抗cd40vl链(seqidno.8)；抗体轻链恒定区(seqidno.9)；以及sv40poly(a)尾(seqidno.10)。图1中示出了转基因盒(seqidno.11)的示意图。病毒产生和表征通过用酶asci进行限制性消化来使质粒png-350线性化以产生病毒基因组ng-350(seqidno.1)。根据下文给出的方法扩增并纯化病毒ng-350。通过苯酚/氯仿萃取纯化经过消化的dna，并且在-20℃下在300μl>95％分子生物级乙醇和10μl3m乙酸钠中将其析出，持续16小时。通过在14000rpm下离心5分钟来沉淀析出的dna，并且在14000rpm下再次离心5分钟之前在500μl70％乙醇中进行洗涤。将干净的dna团粒空气干燥，重悬于含有15μl脂质体转染试剂的500μloptimem中，并且在rt下温育30分钟。然后将转染混合物逐滴添加到含有生长到70％融合的293个细胞的t-25烧瓶中。在将细胞与转染混合物在37℃下温育2小时后，向细胞中添加5％co24ml的细胞培养基(dmem高葡萄糖和补充有2％fbs的谷氨酰胺)，并且将烧瓶在37℃下在5％co2下温育。每24小时监测经过转染的293个细胞，并且每48小时到72小时补充另外的培养基。通过观察细胞单层中的显著细胞病变效应(cpe)来监测病毒的产生。一旦观察到广泛的cpe，就通过三次冻融循环从293细胞中采集病毒。采集的病毒用于再感染293个细胞以便扩增病毒原种。通过观察细胞单层中的显著cpe来确认扩增期间活病毒的产生。一旦观察到cpe，就通过三次冻融循环从293个细胞中采集病毒。在通过双氯化铯条带纯化病毒以产生ng-350病毒原种之前，将经过扩增的原种用于进一步扩增。实例2：ng-350病毒活性和抗cd40抗体产生在hek293悬浮培养细胞系中评估ng-350病毒在颗粒产率和分泌抗cd40抗体产生方面的活性。将hek293细胞以1x106vp/ml的密度接种到摇瓶中，并用每个细胞50个ng-350病毒颗粒(ppc)感染。还用ng-350亲代病毒感染hek293细胞，以enadenotucirev(enad)作为对照物(50ppc)。在感染后48和72小时，通过在1200rpm下离心5分钟来收集细胞上清液。将澄清的上清液样品用于通过hplc评估病毒颗粒浓度，或者通过人igg2elisa评估抗cd40抗体浓度。hplc分析使用resourceq(阴离子交换)柱通过高效液相色谱(hplc)对上清液中的病毒颗粒浓度进行定量。在260nm处检测病毒洗脱，并且通过整合260nm信号峰并根据enadenotucirev标准曲线计算浓度来确定病毒浓度。从ng-350和enadenotucirev细胞中产生病毒的比较示出，ng-350病毒在总颗粒产生和细胞上清液中的病毒颗粒产生方面的活性显著低于enadenotucirev(图2a和2b)。igg2elisa将澄清的上清液以1:2的比例稀释到pbs10％bsa中。根据制造商的方案(igg2人simplestepelisa试剂盒，ab202402，艾宾公司(abeam))制备标准曲线和阴性对照物样品。将样品和标准品添加到elisa板中，并且根据制造商的方案进行测定。使用板读取器(biotek)测量在板的每个孔中在450nm处的吸光度，并通过从标准曲线内插来测定分泌igg2抗cd40抗体的浓度(图2c)。抗cd40由ng-350产生和分泌，而非由enadenotucirev感染的细胞。这些数据一起表明，尽管ng-350能够产生抗cd40抗体，但这种经过修饰的病毒的病毒活性显著受损。因此，对ng-350病毒颗粒进行进一步表征(实例3)。实例3：ng-350病毒同一性测试和基因组分析限制性酶分析最初通过限制性酶分析对基因组同一性进行分析来研究ng-350病毒原种材料的同一性。将ng-350或enadenotucirev病毒颗粒(3.5x1011vp)在pbs中稀释到200μl的最终体积。根据制造商的方案，使用qiagenminelute病毒旋转试剂盒从病毒中萃取dna。通过在37℃下用酶asci使png-350质粒线性化2小时并且然后通过琼脂糖凝胶电泳和用qiaquick凝胶萃取试剂盒(qiagen)进行的凝胶萃取纯化dna来制备用于测定的对照dna。使用限制性酶、ecorv/nhei(图3a)或单独限制性酶、ncoi或fspi(图3b)的组合对经过纯化的对照物或ng-350dna进行限制性消化。通过琼脂糖凝胶电泳分离经过消化的dna，并且使用uv透照器可视化。用fspi或ecorv/nhei进行的消化示出ng-350病毒基因组材料中的无法预测的另一个条带(图3，红色箭头)。pcr分析使用表1中所示的8种不同引物探针组通过病毒基因组的pcr分析进一步评估基因组同一性：引物组正向引物反向引物dacggaacttgttactacacagcctttcacagtccaactgctgc1agccggagaacaactacaagacctttcacagtccaactgctgc2catccagatgacccagtctccggacaaaccacaactagaatgcag3catccagatgacccagtctccctttcacagtccaactgctgc4agccggagaacaactacaagacggacaaaccacaactagaatgcag5cctcagtgaaggtctcctgcctttcacagtccaactgctgc6cctcagtgaaggtctcctgcggacaaaccacaactagaatgcag这些pcr被设计成测定多于一种基因组物种是否存在于ng-350病毒原种中以及此物种是否含有抗cd40抗体转基因盒。将ng-350或enadenotucirev病毒颗粒(2x1010vp)在pbs中稀释到200μl的最终体积。根据制造商的方案，使用qiagenminelute病毒旋转试剂盒从病毒中萃取dna。正如限制性酶分析那样制备对照dna。使用1μldna(100ng/μl)在50μl反应体积中建立pcr反应，所述反应体积含有正向引物和反向引物(2μm)和phusion高保真预混合物(neb)。通过琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，并且使用uv透照器可视化(图5a和5b)。用引物组d进行的分析示出，阳性对照dna和ng-350测试样品中的预期条带大小为2920bp。然而，ng-350测试样品另外含有约800bp的第二pcr产物，使用用于产生ng-350病毒的png-350-psi-01质粒dna未见到所述第二pcr产物。用引物组1-6进行的分析还示出当使用引物组5和6时另外的污染条带。这些数据表明，ng-350病毒原种中存在两种病毒物种，一种含有全长抗cd40转基因盒，而另一种含有所述盒的截短形式。此截短通过对污染物pcr产物进行测序来确认。转基因盒优化在病毒扩增期间发生截短的一种解释是转基因盒中意想不到的不稳定性，所述不稳定性导致vh区与sv40polya之间重组并且因此导致大部分抗体编码区的损失。因此，需要对转基因盒dna序列进行修饰以克服这个问题。因此，改变dna序列以减少与其它盒和病毒序列的同源性并移除较小的直接和反向重复(由英国牛津遗传学公司(oxfordgenetics)进行)。根据实例4，使用经过优化的盒序列来产生新的质粒png-350a。实例4：表达抗cd40单克隆抗体(ng-350a)的enad病毒的产生为了产生ng-350a基因组，通过将对以下进行编码的盒直接插入到质粒penad2.4中来产生质粒png-350a：5'短剪接受体序列(cagg，seqidno.2)；重链前导序列(seqidno.3)；抗cd40vh链(seqidno.4)，抗体恒定重链(seqidno.5)；p2a高效可自切割肽(seqidno.6)；轻链前导序列(seqidno.7)；抗cd40vl链(seqidno.8)；抗体恒定轻链(seqidno.9)；以及sv40poly(a)尾(seqidno.10)。ng-350a编码的抗cd40抗体的氨基酸序列与在ng-350病毒中编码的氨基酸序列相同，并且盒结构相同(图1)。然而，转基因盒的核酸序列被修饰并且与ng-350的核酸序列显著不同(seqidno.11)。病毒产生和表征通过用酶asci进行限制性消化来使质粒png-350a线性化以产生病毒基因组ng-350a(seqidno.1)。根据实例1中描述的方法扩增和纯化病毒ng-350a。实例5：通过pcr进行ng-350a病毒同一性测试使用2个引物探针组(表2；d和k)通过pcr分析来确认ng-350a基因组同一性，所述引物探针组产生跨越转基因盒的产物。根据实例3中详述的方法制备ng-350adna和对照dna。根据实例3中详述的方法，使用引物组d和k进行pcr分析。pcr产物的可视化示出预测大小的单种产物(图6)。用任一引物组均未检测到污染产物。表2同一性pcr引物组引物组正向引物反向引物dacggaacttgttactacacagcctttcacagtccaactgctgckagccggagaacaactacaagacctttcacagtccaactgctgc实例6：ng-350a病毒在结肠癌细胞中的复制和溶瘤活性病毒溶瘤效能将ht-29结肠癌细胞以2.5e4个细胞/孔的细胞密度接种在96孔板中。在每个细胞100-0.39个颗粒(ppc)的感染密度范围下用enad或ng-350a病毒颗粒感染细胞之前，将板在37℃下在5％co2下温育24小时。感染后72小时，使用celltitre96mts试剂(普洛麦格公司(promega)：g3581)评估ht-29细胞的活力。在每种感染密度下对细胞存活％的定量表明，与enad类似，ng-350a对ht-29细胞示出强大的溶瘤活性(图7a)。病毒复制用100ppcng-350a或ng-350a亲代病毒enadenotucirev感染肺癌细胞(a549)或结肠癌细胞(hct-116)持续24、48、72或96小时，或使其保持未感染。用100ppcng-350a或enadenotucirev感染结肠癌细胞(ht-29)或膀胱癌细胞(htb-5、ht-1197和ht-1376)持续24、48、72、144和168小时，或使其保持未感染。在每个时间点，收集细胞上清液并通过在1200rpm下离心5分钟来澄清所述细胞上清液。根据制造商的方案，使用dneasy血液和组织试剂盒(qiagen)从10μl(ht-29、a549或hct-116)或50μl(htb-5、ht-1197和ht-1376)的上清液中萃取dna。还使用dneasy血液和组织试剂盒(qiagen)制备并萃取使用enad病毒颗粒(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线。使用enadenotucireve3基因特异性引物-探针组，通过qpcr分析每个经过萃取的样品或标准品。对每个细胞中检测到的病毒基因组数量的定量表明，ng-350a和enadenotucirev的病毒复制动力学在所有测试的细胞系中和在所有分析的时间点下相当(图7和图8)。不可能在未感染的细胞中检测到病毒基因组(数据未显示)。实例7：ng-350a感染的结肠癌细胞系中的抗cd40抗体表达igg2elisa用100ppcenad、两个不同批次的ng-350a(ng-350ab1或ng-350ab2)感染24、48小时或72小时或保持未感染的a549细胞用于通过igg2elisa分析抗cd40抗体表达(igg2人simplestepelisa试剂盒，ab202402，艾博抗公司(abcam))。从每个孔中移除培养上清液，并且在1200rpm下离心5分钟以移除细胞碎片。将澄清的上清液以1:2的比例稀释到pbs10％bsa中。根据制造商的方案制备标准曲线和阴性对照样品。将样品和标准品添加到elisa板中，并且根据制造商的方案进行测定。使用板读取器(biotek)测量在板的每个孔中在450nm处的吸光度，并通过从标准曲线内插来测定分泌igg2抗cd40抗体的浓度(图9a和9b)。cd40结合elisa用100ppcenad、两个不同批次的ng-350a(ng-350ab1或ng-350ab2)感染24、48或72小时或保持未感染的a549细胞用于通过cd40结合elisa分析抗cd40抗体表达。从每个孔中移除培养上清液，并且在1200rpm下离心5分钟以移除细胞碎片。elisa板(nuncimmunomaxisorp96孔微型板)是通过在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中在4℃下用人cd40(100μg/ml，r&d系统公司(randdsystems)，1493-cd)涂覆过夜而制备的。用pbs0.05％吐温20在所有后续结合步骤之间对板进行洗涤。在室温下用pbs5％bsa封闭板，持续1小时。将澄清的感染上清液稀释到pbs5％bsa中(1:2、1:10和1:100)。在此测定中，抗cd40抗体(biolegend公司，334308)用作人cd40与elisa板结合的阳性对照物。在浓度为30ng/ml下，在pbs5％bsa中制备所述阳性对照物。将所有样品添加到cd40涂覆的板中并且在室温下温育1小时。然后在室温下将检测抗体(即病毒上清液的hrp缀合的抗人igg2-fc(艾博抗公司，ab97225)或阳性对照抗体的抗小鼠iggabs(hrp)(艾博抗公司，ab6728))应用于所有孔中，持续1小时。用hrp底物溶液3.3.5.5'-四甲基乙二胺(tmb，赛默飞世尔科技公司(thermo-fisher))进行hrp检测。使用1mhc1停止反应，并且在板读取器上在450nm处测量显色。绘制在450nm处针对enad、ng-350a和阳性对照物的吸光度(图9c)，并且所述吸光度表明，ng-350a感染的细胞的上清液中存在通过分泌抗cd40抗体与cd40的特异性结合。实例8：cd40功能性信号传导报告基因测定用10ppcenad、ng-350a感染24或48小时或用ng-165(表达对照抗体[抗vegf]的病毒)感染48小时或保持未感染的a549细胞用于使用cd40 hek-blue报告基因细胞来分析抗cd40抗体功能活性，所述cd40 hek-blue报告基因细胞响应于通过其膜表达的cd40分子进行的活化而分泌碱性磷酸酶(英杰公司(invivogen))。感染后，从每个孔中移除来自a549细胞的培养上清液，并且在1500rpm下离心5分钟以移除细胞碎片。将20gl培养上清液在180μl培养基中稀释，并应用于hek-bluecd40细胞，持续20小时。在培养基中制备浓度为10ng/ml的cd40l作为阳性对照物。然后从hek-bluecd40细胞中收集上清液，并通过离心澄清。通过用160μlquanti-blue试剂在37摄氏度下温育1小时来测定40μl澄清的上清液的碱性磷酸酶活性。使用板读取器测量每个样品在620nm处的吸光度，并且所述吸光度表明，来自ng-350a而非enad或ng-165感染的细胞的上清液触发由表达hek-blue报告基因细胞的cd40产生seap(图10)。实例9：ng-350a病毒在癌细胞系中的选择性活性对enad病毒活性呈半允许的肺癌细胞(a549)、结肠癌细胞(hct-116)或肺成纤维细胞(mrc-5)用于证明ng-350a病毒对癌细胞的选择性。用100ppcng-350a或ng-350a亲代病毒enadenotucirev感染细胞系72小时，或使其保持未感染。在每个时间点，从每个孔中移除培养上清液，并且将所述培养上清液用于通过qpcr分析病毒基因组复制或通过elisa分析抗cd40抗体表达。通过rt-qpcr分析孔中剩余的细胞的病毒基因e3和转基因的表达。病毒复制收集细胞上清液并且通过在1200rpm下离心5分钟来澄清。根据制造商的方案，使用sigmagenelutedna萃取试剂盒从10μl(a549，hct-116)或100μl(mrc-5)的上清液中萃取dna。还使用sigmagenelute试剂盒制备并萃取使用enad病毒颗粒(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线。使用enadenotucireve3基因特异性引物-探针组，通过qpcr分析每个经过萃取的样品或标准品。每个细胞中检测到的病毒基因组数量的定量表明，在a549和hct-116细胞中可检测到的ng-350a和enadenotucirev病毒复制的水平相当，但是在mrc-5中的表达显著低于在癌细胞系中的表达(图11a)。不可能在未感染的细胞中检测到病毒基因组(数据未显示)。igg2抗体表达通过igg2elisa(igg2人simplestepelisa试剂盒，ab202402，艾博抗公司)评估细胞上清液中的抗体表达。从每个孔中移除培养上清液，并且在1200rpm下离心5分钟以移除细胞碎片。将澄清的上清液以1:2的比例稀释到pbs10％bsa中。根据制造商的方案制备标准曲线和阴性对照样品。将样品和标准品添加到elisa板中，并且根据制造商的方案进行测定。使用板读取器(biotek)测量在板的每个孔中在450nm处的吸光度，并通过从标准曲线内插来测定分泌igg2抗cd40抗体的浓度(图11b)。实例10：从ng-350a感染的细胞中纯化抗cd40抗体将悬浮hek293细胞以1x106个细胞/ml接种在erlenmeyer烧瓶中，并用100ppcng-350a感染。72小时后，将5％fbs和蛋白酶抑制剂混合物(1:2000)添加到细胞中，并且将悬浮液在4600rpm下离心15分钟。小心地移除上清液，并通过截留分子量为500kda的中空纤维膜进行过滤，以从抗cd40抗体中分离出ng-350a病毒颗粒。使来自过滤步骤的含有抗cd40抗体的流出物通过截留分子量为30kda的第二中空纤维膜。使用akta在蛋白a柱上从来自第二个过滤步骤的截留物中纯化抗cd40抗体。将经过纯化的抗体过滤灭菌并且储存在-80℃下。根据制造商的方案，使用igg2人simplestepelisa试剂盒(ab202402，艾博抗公司)通过igg2elisa测定经过纯化的抗体的浓度(图12)。实例11：ng-350a衍生的抗cd40抗体活性以及与原代人单核细胞衍生的dc中的病毒活性协同作用通过ficoll-paque梯度离心从来源于英国牛津nhs血液和移植中心(nhsbloodandtransplantunit)的nc24白细胞视锥细胞中分离出pbmc。使用cd14microbeads试剂盒(miltenyibiotec)分离cd14 单核细胞。然后对单核细胞进行计数、离心(300xg)并以5x105个细胞/ml悬浮于补充有gm-csf(800u/ml)和il-4(500u/ml)的10％rpm1培养基中。将40ml单核细胞悬浮液转移到一个t175烧瓶中。培养72小时后，将单核细胞衍生的dc(modc)以每孔1x106个细胞的密度接种在10％rpmi培养基中的24孔板中。用0.5μg/ml的抗cd40抗体(根据实例10，从病毒感染的细胞中纯化)、enad(100ppc)、人cd40l处理单核细胞衍生的dc或使其保持不处理。同时，用经过纯化的抗cd40抗体(0.5μg/ml)和enad(100ppc)处理modc。然后，在采集上清液和细胞之前，将板温育48小时。从培养孔中移除上清液和细胞，并进行离心(300xg)。将上清液用pbs5％bsa以1:2的比例稀释，并且储存以便进行elisa分析。将细胞沉淀物在200μl的pbs中洗涤、离心，然后在rt下重悬于50μl的含有live/fixablenear-ir(生命科技公司(lifetech))的pbs中，持续15分钟。在用以下直接缀合的抗体组染色之前，将细胞在fac缓冲液(1％fbs/pbs)中洗涤一次：与bv421缀合的抗cd86；与af647缀合的抗cd54；以及与pecy5缀合的抗hla-dr。还用相关的同种型对照抗体对来自每种共培养条件的细胞样品进行染色。所有染色都在fac缓冲液中以50μl/孔的总体积在4℃下进行15分钟。然后，在重悬于200μl的fac缓冲液中并通过流式细胞术(attune)分析之前，用fac缓冲液(200μl)洗涤细胞两次。对上清液样品进行解冻，并通过根据制造商的方案稀释并进行测定来通过elisa(il-12quantikineelisa，dp400，r&d系统公司)进行分析。用从病毒感染的细胞中纯化的抗cd40抗体进行的处理导致表达cd86、cd54和hla-dr活化标志物的modc的百分比增加，并且导致il12p40分泌(图13和图14)。值得注意的是，与单独用抗cd40ab或enad病毒进行处理相比，用抗cd40抗体和enad病毒两者对modc进行组合处理产生更强的modc活化。实例12：ng-350a衍生的抗cd40抗体活性以及与原代人b细胞中的病毒活性的协同作用通过ficoll-paque梯度离心从来源于英国牛津nhs血液和移植中心的nc24白细胞视锥细胞中分离出pbmc。使用panb细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)分离cd19 b细胞。然后将b细胞以每孔1x106个细胞的密度接种在10％rpmi培养基中的24孔板中。用浓度增加的经过纯化的抗cd40转基因abs、人cd40l处理所述b细胞，或使其保持不处理。然后，在采集上清液和细胞之前，将板温育48小时。从培养孔中移除上清液和细胞，并进行离心(300xg)。小心移除上清液，用pbs5％bsa以1:2的比例稀释，并且储存以便进行elisa分析。将细胞沉淀物在200μl的pbs中洗涤、离心，然后在rt下重悬于50μl的含有live/fixablenear-ir(生命科技公司)的pbs中，持续15分钟。在用以下直接缀合的抗体组染色之前，将细胞在fac缓冲液中洗涤一次：与bv421缀合的抗cd86；与af647缀合的抗cd54；与pecy5缀合的抗hla-dr；以及与bv605缀合的抗cd80。还用相关的同种型对照抗体对来自每种共培养条件的细胞样品进行染色。所有染色都在fac缓冲液中以50μl/孔的总体积在4℃下进行15分钟。然后，在重悬于200μl的fac缓冲液中并通过流式细胞术(attune)分析之前，用fac缓冲液(200μl)洗涤细胞两次。与未处理或同种型对照物处理的b细胞相比，在表达cd86、cd19和cd80的b细胞百分比增加和cd19 细胞上的hla-drmf1增加方面，用在所有测试浓度下的抗cd40抗体进行的处理b细胞导致b细胞活化(图15)。就增加增殖细胞的百分比而言，用抗cd40抗体进行的处理还导致b细胞活化(图16)。值得注意的是，与单独的抗体或病毒处理相比，用抗cd40抗体和enad病毒对b细胞进行的组合处理导致增殖的b细胞百分比提高(图16)。实例13：ng-350a衍生的抗cd40抗体对原代人单核细胞衍生的dc的活性将a549肿瘤细胞以每烧瓶分别10x106个或50x106个细胞的密度接种在t175烧瓶或hyperflask中。4小时后，用每个细胞10个enad或ng-350a病毒颗粒感染细胞。72小时后，采集上清液，并且使用300kda截留大小排阻柱耗尽病毒。随后，使用50kda截留大小排阻柱富集抗体的病毒耗尽的上清液。将这些富含病毒耗尽的ab的级分储存在-80℃下。使用igg2elisa测定抗cd40ab滴度，并使用实例8中所描述的hekblue报告基因细胞测定法确认功能性。基本上如实例11中所概述的制备单核细胞衍生的树突状细胞(modc)以用于另一组研究。通过ficoll-paque梯度离心从来源于英国牛津nhs血液和移植中心的nc24白细胞视锥细胞中分离出pbmc(供体177)。使用cd14microbeads试剂盒(miltenyibiotec)分离cd14 单核细胞。在用gm-csf和il-4培养72小时后，将modc以每个孔1.25x105个细胞的密度接种在48孔板中，或以每个孔2.5x105个细胞的密度接种在10％rpmi培养基中的24孔板中，并与上文段落中所述的病毒耗尽的ng-350a或enad培养上清液一起温育。将细胞染色以便进行流式细胞术分析。通过细胞因子珠阵列(legendplex，biolegend公司)将上清液用于细胞因子分析。为了证明抗cd40ab与modc表面上的cd40结合，用浓度增加的来自ng-350a感染的细胞的病毒耗尽的、富含抗cd40ab的上清液处理细胞(不同稀释度用于提供不同量的抗体)或使其保持不处理(培养基)。作为对照，还用病毒耗尽的enad上清液(denad)对细胞进行处理，其体积与含有ng-350a抗cd40ab的样品的体积相匹配。24小时和48小时后，采集细胞，并且在进行流式细胞术分析之前，用针对cd40的荧光标记抗体对所述细胞进行染色。在单个(fsc-h相对于fsc-a)活细胞(live/fixableaqua阴性)上对细胞进行门控。图17a示出了用1000ng/mlab处理后24小时获得的代表性流式细胞术结果，图17b示出了用不同浓度的病毒耗尽的上清液处理后24小时和48小时modc上的cd40表达。在较高的抗体浓度下，cd40facs染色减少或不存在，这反映了在ng-350a病毒耗尽的培养上清液中结合抗cd40抗体的阻断。然后评估抗cd40tgab处理(使用病毒耗尽的上清液)对modc上的细胞表面标志物上调的影响。用浓度增加的经过纯化的抗cd40tgab处理modc，或使其保持不处理(培养基)。用病毒耗尽的enad上清液(denad)对所述modc进行处理，其体积与抗cd40ab的体积相匹配。24小时和48小时后，采集细胞，并且在进行流式细胞术分析之前，用针对cd54、cd83和cd86表面标志物的抗体对所述细胞进行染色。在单个(fsc-h相对于fsc-a)活细胞(live/fixableaqua阴性)上对细胞进行门控。图18a中示出了用1000ng/mlab处理后24小时获得的代表性流式细胞术结果，所述结果用于用来自供体177的pbmc制备modc。图18b示出了在处理后24小时和48小时来自4种不同供体的modc上的活化标志物表达。然后评估抗cd40tgab对modc细胞因子产生的影响。用浓度增加的含有病毒耗尽的上清液的抗cd40ab对来自四种不同供体的modc进行处理或使其保持不处理(培养基)。用病毒耗尽的enad上清液(denad)对所述modc进行处理，其体积与抗cd40ab的体积相匹配。在24小时和48小时之后，采集上清液，并且使用基于legendplextm珠的免疫测定法(biolegend公司)分析促炎性细胞因子分泌。图19示出了tnfα、il-6和il-8的选择性诱导。实例14：ng-350a病毒的活性和衍生的含有病毒感染的肿瘤细胞上清液的抗cd40抗体对原代人单核细胞衍生的dc的活性在实例13中描述的类似的研究中，将a549细胞以4x106个细胞的密度接种在t25烧瓶中。4小时后，用每个细胞10个enad或ng-350a病毒颗粒感染细胞。72小时后，采集上清液，并且在1600rpm下离心5分钟。在这项研究中，将这些澄清的上清液保持在37℃下直至使用(在1小时内)，而不是移除病毒。因此，上清液含有ng-350a(或enad对照物)感染的肿瘤细胞的产物，所述产物包含病毒和抗cd40抗体转基因产物两者。通过ficoll-paque梯度离心从来源于英国牛津nhs血液和移植中心的nc24白细胞视锥细胞中分离出pbmc。使用cd14microbeads试剂盒(miltenyibiotec)分离cd14 单核细胞。在用gm-csf和il-4培养72小时后，将modc以每个孔1.25x105个细胞的密度接种在48孔板中，并且用在不同稀释度下的enad和ng-350a病毒上清液进行处理。然后，在采集上清液和细胞之前，将板温育24小时和48小时。将上清液离心，并且从细胞沉淀中移除所述上清液并储存在-80℃下。将细胞染色以便进行流式细胞术分析。将上清液用于通过cba进行细胞因子分析。为了证明抗cd40ab与modc表面上的cd40结合，用浓度增加的来自ng-350a或enad感染的细胞的上清液处理细胞(不同稀释度用于提供不同量的抗体)或使其保持不处理(培养基)。24小时和48小时后，采集细胞，并且在进行流式细胞术分析之前，用针对cd40的荧光标记抗体对所述细胞进行染色。在单个(fsc-h相对于fsc-a)活细胞(live/fixableaqua阴性)上对细胞进行门控。图20示出了用不同浓度的上清液处理后24小时和48小时modc上的cd40表达。在来自ng-350a(而不是enad)感染的肿瘤细胞的1:2上清液稀释度下，cd40facs染色减少或不存在，这反映了在ng-350a病毒耗尽的培养上清液中结合抗cd40抗体的阻断。然后评估了ng-350a病毒处理的肿瘤细胞上清液对来自两种供体(177和179)的modc上的细胞表面标志物上调的影响。用经过稀释的enad或ng-350a病毒上清液处理modc，或使其保持不处理(培养基)。24小时和48小时后，采集细胞，并且在进行流式细胞术分析之前，用针对cd86、cd54和cd83的抗体对所述细胞进行染色。在单个(fsc-h相对于fsc-a)活细胞(fixableaqua阴性)上对细胞进行门控。图21中的结果示出了ng-350a选择性上调的所有三种modc活化标志物。然后评估ng-350a病毒上清液对modc细胞因子产生的影响。用经过稀释的enad或ng-350a病毒处理的肿瘤细胞上清液处理来自两种供体(177和179)的modc或使其保持不处理(培养基)。在24小时和48小时之后，采集上清液，并且使用基于legendplextm珠的免疫测定法(biolegend公司)分析促炎性细胞因子分泌。图22中的结果示出了通过ng-350a处理的细胞上清液对tnfα、il-6、il-8、il-28和il-29进行的选择性上调。实例15：ng-350a衍生的抗cd40抗体对原代人b细胞的活性通过ficoll-paque梯度离心从来源于英国牛津nhs血液和移植中心的nc24白细胞视锥细胞中分离出pbmc。使用panb细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)分离b细胞。将细胞以每个孔1.25x105个细胞的密度接种在10％rpm1培养基中的48孔板中。用实例13中所描述的来自ng-350a感染的细胞的不同浓度的病毒耗尽的、富含抗cd40ab的上清液对所述细胞进行处理或使其保持不处理。还用作为对照物的病毒耗尽的enad病毒上清液处理b细胞。然后，在采集细胞之前，将板温育24小时和48小时。在进行流式细胞术分析之前，用针对cd23、cd54、cd86和hla-dr的抗体对细胞进行染色。在单个(fsc-h相对于fsc-a)活细胞(fixableaqua阴性)上对细胞进行门控。图23示出了通过含有病毒耗尽的ng-350a抗cd40抗体的上清液对来自3种不同供体(177、178、179)的b细胞上的所有4种表面标志物(cd23、cd54、cd86和hla-dr)进行的选择性上调。实例16：ng-350a病毒的活性和衍生的含有病毒感染的肿瘤细胞上清液的抗cd40抗体对原代人b细胞的活性通过ficoll-paque梯度离心从来源于英国牛津nhs血液和移植中心的nc24白细胞视锥细胞中分离出pbmc。使用panb细胞分离试剂盒(miltenyibiotec)分离b细胞。将细胞以每个孔1.25x105个细胞的密度接种在48孔板中，并用实例14中所描述的相同enad和ng-350a病毒上清液的样品的不同稀释液进行处理。然后，在采集细胞之前，将板温育24小时和48小时，并且在进行流式细胞术分析之前，用针对cd23、cd54、cd86和hla-dr的抗体对所述细胞进行染色。在单个(fsc-h相对于fsc-a)活细胞(fixableaqua阴性)上对细胞进行门控。图24示出了通过来自ng-350a感染的肿瘤细胞的含有病毒和抗cd40抗体的上清液对来自3种不同供体(177、178、179)的b细胞上的所有四种标志物(cd23、cd54、cd86和hla-dr)进行的选择性上调。实例17：在另一项研究中，评估了ng-350a对跨六种癌症适应症(结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌)的一系列不同肿瘤细胞系的活性。用每个细胞1或100个颗粒(ppc)的enadenotucirev(enad)或ng-350a感染细胞，并培养3到11天，从而评估病毒基因组复制、病毒介导的溶瘤作用、病毒转基因表达(在mrna和蛋白质水平下)和在ng-350a感染的肿瘤细胞中的功能性病毒转基因表达。在所有实验中，将ng-350a的活性与enad的活性进行比较。将a549(非小细胞肺癌)细胞用作阳性对照物，而将ct26(小鼠结肠肿瘤)细胞用作阴性对照物。病毒基因组复制将肿瘤细胞系在175cm2烧瓶中在补充有l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠和10％胎牛血清(fbs)(生长培养基)的高葡萄糖dmem中进行培养。使用前，使用显微镜检查细胞以确保60-80％融合。然后将细胞用pbs洗涤，并且加入0.25％胰蛋白酶-edta以使细胞与烧瓶底部分离。将细胞在37℃下在5％co2下温育2到10分钟，直到细胞分离，此后使用生长培养基使胰蛋白酶失活。将细胞悬浮液混合，并以300g旋转5分钟。丢弃上清液，并且将细胞沉淀重悬于10ml的测定培养基中；如上所述的dmem培养基补充有2％(而不是10％)的fbs。对细胞进行计数，并使用测定培养基稀释细胞悬浮液以使其浓度达到5x105个细胞/ml，将其100μl接种到平底96孔板中(在每个板上，按每种病毒两个孔以及每种未感染对照物(uic)2个孔的方式接种每种细胞系——一个时间点一个板)。将enad和uic的样品接种(并且感染)在一组板上，并且将ng-350a和uic的样品接种(并且感染)在另一组板上。在细胞接种后4-6小时进行接种之前，将板在37℃下在5％co2下进行温育。随后，将enad和ng-350a病毒在测定培养基中稀释以使其浓度达到5x105个病毒颗粒/ml，将其100μl添加到每个相关的细胞孔中(每种病毒一式两份地添加到每个板上的每种细胞系中)。这使得接种了1ppc的enad或1ppc的ng-350a。代替添加病毒，在接种后20小时，还将100μl的测定培养基添加到每个板上的每种细胞系(uic)的重复孔中，从细胞中移除培养基并且用200μl的新鲜测定培养基代替。然后，在接种后，将板在37℃下在5％co2下温育3天、4天、8天或11天。如果将细胞温育8天或更多天，则在接种后4天用50μl的测定培养基向细胞进料。dna采集：接种后，从细胞中移除培养基，并在96孔v型底板中离心。然后将上清液转移到新鲜的96孔平底板中，并且储存在-80℃下。然后将200μl的1x报告基因裂解缓冲液(rlb)添加到原始细胞板中，并且储存在-80℃下。标准曲线制备：根据制造商的方案，在用qiagendneasy96试剂盒萃取dna之前，将原种enad稀释到介于1.25x1011个病毒颗粒/ml与1.25x106个病毒颗粒/ml之间(萃取200gl的每种标准曲线样品，并且在200gl的体积中洗脱经过纯化的dna)。然后将经过纯化的dna等分，并且在每个qpcr板上使用之前储存在-20℃下。在每个qpcr反应中使用2μl的这些标准曲线样品，这相当于每个qpcr孔2.5x103-2.5x108个基因组。dna萃取：根据制造商的方案，在用qiagendneasy96试剂盒萃取dna之前，将上清液和裂解物测试样品进行解冻(萃取50μl的测试样品，并且在200μl的体积中洗脱经过纯化的dna)。在每个板上萃取1xrlb的萃取对照物。使用实例6中所概述的e3引物-探针组通过细胞裂解物和上清液(s/n)的qpcr评估病毒基因组复制。根据图25a-f中的肿瘤类型(结肠直肠癌ht-29和hct-116；前列腺癌du145；胰腺癌bxpc-3；乳腺癌mba-mb-453；卵巢癌pa-1和caov-3；膀胱癌rt24、t24和um-uc-3)绘制来自10种测试肿瘤细胞系加上阳性(a549)细胞的细胞裂解物和上清液样品两者的时间进程。阴性对照细胞(小鼠ct26)为阴性并且未绘制。用虚线示出在enad感染的细胞中检测到的病毒基因组，并且用实线示出在ng-350a感染的细胞中检测到的病毒基因组。数据表明，ng-350a在一系列不同的癌细胞类型中复制与enad亲代病毒相当的其基因组dna。为了评估ng-350a的溶瘤效应，用100ppc的enad、100ppc的ng-350a、单独的测定培养基(未感染的对照物)或4％吐温(裂解的)接种四种肿瘤细胞系。通过xcelligence实时细胞分析仪(rtca)监测细胞的生长和活力，直到接种病毒的细胞发生超过50％的裂解。通过ximt软件计算所有时间点的细胞指数(ci)，并且测定未感染的、enad、ng-350a和以一式三份裂解的平均值和sd；在图中绘制了平均值，并且sd由误差条表示。图26中示出了用于未感染对照物、enad和ng-350a接种细胞以及裂解细胞的xcelligence迹线。在0小时接种细胞，并在接种后24小时(在由每个图上的箭头指示的时间点)感染细胞。肿瘤细胞系示出为每张图一种细胞系：结肠直肠癌(ht29和hct116)、前列腺癌(bxpc-3)和乳房癌(mda-mb-453)。ng-350a示出了与enad亲代病毒相当的溶瘤活性。还评估了在不同时间从用ng-350a感染的肿瘤细胞系中获取的裂解物中的抗cd40转基因mrna表达。用1ppc的enad、1ppc的ng-350a或单独的测定培养基(未感染的对照物)接种与用于本研究中的基因组复制部分相同的10种测试肿瘤细胞系加上阳性(a549)和阴性(ct26)对照物细胞系。在接种后的不同时间(3天、4天、8天和11天)，在萃取rna并进行dnase净化之前，采集细胞裂解物。然后使用抗cd40特异性引物/探针组进行一步法rt-qpcr。将对应于抗cd40的有义链的合成rna寡核苷酸用于创建标准曲线，根据所述标准曲线计算测试样品的rna量。从对应的单独enad和ng-350a值中减去背景的每种未感染对照物一式三份的平均rna量。然后计算每个细胞的抗cd40mrna拷贝，并且测定两个enad和两个ng-350art-qpcr一式三份的平均值。然后在每个时间点计算每种细胞系的这些重复值的平均值和sd(n＝2，bxpc-3第8天样品除外，其中n＝1)。绘制平均值并且所述图在图27中示出，sd由误差条表示。enad接种的细胞给出可忽略不计的应答，由此根据生物学重复计算出的每个细胞的平均基因组跨所有时间点和细胞系的范围为0x100到6.26x100。因此，未绘制enad数据。对于未感染的对照物样品，根据生物学重复计算出的每个细胞的平均抗cd40拷贝范围为0.00x100到9.09x100。这些图描绘了抗cd40转基因在结肠直肠(a)、前列腺、胰腺和乳腺(b)、卵巢(c)和膀胱(d)肿瘤细胞系中的表达。ng-350a感染导致抗cd40转基因mrna在所有人类肿瘤细胞系中的表达，其中观察到不同细胞的动力学差异。为了评估转基因蛋白igg2表达，测量了由用ng-350a感染的不同肿瘤细胞系产生的人igg2(由ng-350a编码的抗cd40抗体重链的同种型)。用1ppc的ng-350a、1ppc的enad或单独的测定培养基(未感染的对照物)接种六种测试肿瘤细胞系加上阳性(a549)和阴性(ct26)对照物细胞系。在接种后的不同时间(3天、4天、8天和11天)，采集上清液，并且在使用前储存在-80℃下。将来自ng-350a接种的测试细胞系和a549细胞的上清液以1:2、1:5、1:10、1:20、1:40和1:80进行稀释。来自所有未感染的对照物样品、enad感染的细胞和ng-350a感染的ct26细胞的上清液仅按1:2进行稀释。然后根据制造商的方案进行人igg2体外simplestepelisa(艾宾公司)。使用人igg2纯化的蛋白(用elisa试剂盒供应)创建标准曲线，从所述标准曲线中测定样品中的igg2蛋白的浓度(ng/ml)。然后计算每1x106个细胞(ng/1x106个细胞)的igg2蛋白的量。根据标准曲线内的elisa重复品的平均值来测定均值和sd。绘制平均值并且所述图在图28中示出，sd由误差条表示。没有对使用未感染的对照物样品进行背景减除，因为对于每个细胞系和时间点，这些样品都没有给出应答(0x100ng/1x106个细胞)。enad接种的细胞也没有给出应答，因此未绘制enad数据。用ng-350a感染的所有细胞系检测到igg2抗体产生。实例8中所描述的hek-bluecd40信号传导报告基因测定用于测试由用ng-350a感染的不同肿瘤细胞系产生的抗体的功能。用1ppc的enad、1ppc的ng-348或单独的测定培养基(uic)接种六种测试肿瘤细胞系加上阳性(a549)和阴性(ct26)对照细胞系。接种后8或11天，采集上清液。然后将上清液与hek-blue细胞一起温育20到24小时。然后，在设置为读取620nm吸光度的spectramaxi3x上读取光密度(od)之前，从经过处理的hek-blue细胞中移除上清液，将所述上清液添加到quanti-blue中并温育1小时。从对应的单独enad和ng-350a值中减去每个uic测定重复的平均光密度，从而给出对感染的肿瘤细胞的上清液中的抗体的cd40信号传导活性的估计。然后取减去uic背景的enad和ng-350a测定重复的平均值，从而得出对应于每个接种和接种复制的每个细胞系(每种条件)的2个值。然后测定这些复制的平均值和标准偏差(sd)，并且表3中示出所述平均值和sd。表3来自ng-350a感染的肿瘤细胞的上清液中的功能性抗cd40抗体活性(hek-blue报告基因测定)实例18在另外一系列实验中，监测ng-350a病毒在体内病毒颗粒介导的影响，并且在给小鼠单次或多次静脉内给药后，将所述影响与在enad中的影响进行比较。向雌性cd-1小鼠静脉内注射enad或ng-350a的媒剂对照物或2.2x1010个颗粒。注射后6小时、24小时、48小时或7天对小鼠心脏进行放血，并且将血液收集到抗凝血剂管中并且进行处理以回收血浆。通过elisa测定法对血浆样品进行测试以检测急性细胞因子对病毒颗粒的应答。图29中示出的数据代表每组3-6只小鼠。通过ng-350a给药刺激的mcp-1(图29a)、il-6(图29b)和tnfα(图29c)水平与enad的水平类似。实心实线表示平均值。基线表示媒剂对照组的平均值 3xsd。测试血浆样品的其它等分试样的丙氨酸转氨酶(alt)水平作为急性肝毒性的量度。使用alt比色终点酶法测定试剂盒分析血浆样品。图30示出的数据代表每组3-6只小鼠。实心实线表示平均值。基线表示媒剂对照组的平均值 3xsd。alt水平在不同的小鼠之间是可变的，而ng-350a和enad诱导类似的应答曲线。在第1天向另外的雌性cd-1小鼠组静脉内注射pbs，或在第1天、第3天和第5天注射2.2x1010个病毒颗粒的enad或ng-350a。给药后6小时，对经过pbs处理的小鼠心脏进行放血。在第一次给药后6小时和24小时(分别)通过侧尾静脉和心脏穿刺对经过病毒处理的小鼠进行放血，或者在第三次给药后6小时、24小时或7天通过心脏穿刺对小鼠进行放血。通过elisa测定法对血浆样品进行测试以检测急性细胞因子对病毒颗粒的应答。图31中示出的数据代表每组3-6只小鼠。通过ng-350a给药刺激的mcp-1(图31a)和il-6(图31b)水平与enad的水平类似。实心实线表示平均值。基线表示媒剂对照组的平均值 3xsd。实例19在免疫活性cd-1小鼠中，在第1天、第3天和第5天施用三个静脉内(iv)剂量的2.2x1010个病毒颗粒中的每个iv剂量之后，将ng-350a的血液药代动力学与enadenotucirev(enad)进行比较。在第1天、第3天和第5天向雌性cd-1小鼠静脉内注射2.2x1010个病毒颗粒的enad或ng-350a。每次给药后，在给药后1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、7分钟、10分钟和60分钟对一组用每种病毒处理的4只小鼠进行放血。萃取dna并通过靶向对enad和ng-350a两者共有的病毒e3基因的qpcr进行分析。图32中示出的数据代表每组4只小鼠 sd。在值低于测定的定量限值的情况下，将其排除。未绘制超过7分钟的数据，因为它们始终低于测定的定量限值。ng-350a示出的药代动力学曲线与enad相当。实例20在用ng-350a给小鼠给药后，通过测量单次静脉内给药后从组织中回收的活病毒来评估病毒的生物分布。向雌性cd-1小鼠静脉内注射媒剂对照物或2.2x1010个颗粒的ng-350a。在给药后6小时、24小时、8天或28天对各组小鼠实施安乐死，并且切除其肝、肺和脾，并且立即在干冰上冷冻。随后将样品解冻，将其在保存蛋白的裂解缓冲液中匀化，并且将裂解物稀释并添加到融合的a549单层中，其中每个器官的ng-350a掺入的组织匀浆作为阳性对照物和阴性对照物。在固定并使用抗腺病毒六邻体抗体进行免疫染色测定之前，将单层培养96小时。数据由图33中的每个孔的样品照片表示。六邻体阳性细胞被染成棕色(图中示出为深灰色)。24小时后，在小鼠的肝、肺或脾(小鼠中的病毒生物分布的主要部位)可能检测不到活病毒。实例21在这一系列研究中，在携带人肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠体内估计ng-350a病毒的活性。在三次iv注射或单次分级肿瘤内(it)给药后，评估了皮下a549肺细胞系肿瘤中的病毒复制。在雌性scid小鼠的侧腹上皮下植入a549肿瘤细胞，并且一旦肿瘤达到至少50mm3，就向其it或iv注射病毒或对照物。向it给药的小鼠注射两次10μl的pbs，或将2.2x109个病毒颗粒的enad或ng-350a注射到肿瘤的空间分离区中，其中总剂量为20μl/4.4x109个病毒颗粒。在第1天、第3天和第5天，向iv给药的小鼠注射100μl的pbs或2.2x109个病毒颗粒的enad或ng-350a，其中总剂量为300μl/6.6x109个病毒颗粒。给药后7或21天，在安乐死后从小鼠身上切除肿瘤，并且进行冷冻。随后将肿瘤匀化、萃取dna，并使用靶向对enad和ng-350a两者共有的病毒e3区的引物和探针通过qpcr进行分析。图34a和b中示出的数据代表每组2-4只小鼠 /-sd。ng-350a示出在it(图34a)或iv(图34b)给药后a549肿瘤异种移植物中的基因组复制与enad相当。还使用hct-116结肠直肠癌细胞系的第二种肿瘤异种移植物模型重复此实验。在雌性scid小鼠的侧腹上皮下植入hct116肿瘤细胞，并且一旦肿瘤达到至少50mm3，就向其it或iv注射病毒或对照物。向it给药的小鼠注射两次10μl的pbs，或将2.2x109个病毒颗粒的enad或ng-350a注射到肿瘤的空间分离区中，其中总剂量为20μl/4.4x109个病毒颗粒。在第1天、第3天和第5天，向iv给药的小鼠注射100μl的pbs或2.2x109个病毒颗粒的enad或ng-350a，其中总剂量为300μl/6.6x109个病毒颗粒。给药后7或21天，在安乐死后从小鼠身上切除肿瘤，并且进行冷冻。随后将肿瘤匀化、萃取dna，并使用靶向对enad和ng-350a两者共有的病毒e3区的引物和探针通过qpcr进行分析。图34c和d中示出的数据代表每组2-4只小鼠 /-sd。ng-350a示出在it(图34c)或iv(图34d)给药后hct-116肿瘤异种移植物中的基因组复制与enad相当。在用scid小鼠中的a549和hct-116皮下异种移植物肿瘤两者进行的类似实验中，测量肿瘤中的病毒rna表达。在雌性scid小鼠的侧腹上皮下植入a549或hct-116肿瘤细胞，并且一旦肿瘤达到至少50mm3，就向其it或iv注射病毒或对照物。向it给药的小鼠注射两次10μl的pbs，或将2.2x109个病毒颗粒的enad或ng-350a注射到肿瘤的空间分离区中，其中总剂量为20μl/4.4x109个病毒颗粒。在第1天、第3天和第5天，向iv给药的小鼠注射100μl的pbs或2.2x109个病毒颗粒的enad或ng-350a，其中总剂量为300μl/6.6x109个病毒颗粒。给药后7天，在安乐死后从小鼠身上切除肿瘤，并且进行冷冻。随后将肿瘤匀化、萃取rna，并使用靶向enad和ng-350a两者共有的病毒e3mrna的引物和探针通过rt-qpcr进行分析。图35中示出的数据代表每组3-4只小鼠。黑线表示平均值。a549it(图35a)、iv(图35b)、hct-116it(图35c)和hct-116iv(图35d)示出在ng-350a或enad给药后相当的病毒e3mrna表达。还在相同的皮下a549和hct-116异种移植物肿瘤rna样品中测量了抗cd40抗体转基因mrna表达的水平。使用靶向αcd40抗体转基因mrna的引物和探针通过rt-qpcr对rna进行分析。图36中示出的数据代表每组3-4只小鼠。黑线表示平均值。仅在ng-350a处理的肿瘤中容易检测到抗cd40抗体转基因mrna表达。还使用igg2elisa在携带a549肿瘤的小鼠的肿瘤裂解物和血清两者中测量抗cd40抗体蛋白的a549it(图36a)、iv(图36b)、hct-116it(图36c)和hct-116iv(图36d)水平。图37中示出的数据示出在it(a)或iv(b)施用ng-350a后对抗体的选择性检测，其中肿瘤中的水平高于血液中的水平。序列seqidno.4-抗cd40vh链氨基酸序列seqidno.5-抗体恒定重链氨基酸序列seqidno.8-抗cd40vl链氨基酸序列seqidno.9-恒定轻链氨基酸序列seqidno.12-ng-350a转基因盒核酸序列序列表<110>皮斯奥克斯治疗公司<120>病毒和方法<130>p000216_wo<150>gb1708779.2<151>2017-06-01<160>27<170>patentin版本3.5<210>1<211>34794<212>dna<213>人工序列<220><223>ng-350a基因组序列<400>1tctatctatataatataccttatagatggaatggtgccaatatgtaaatgaggtgatttt60aaaaagtgtggatcgtgtggtgattggctgtggggttaacggctaaaaggggcggtgcga120ccgtgggaaaatgacgttttgtgggggtggagtttttttgcaagttgtcgcgggaaatgt180gacgcataaaaaggcttttttctcacggaactacttagttttcccacggtatttaacagg240aaatgaggtagttttgaccggatgcaagtgaaaattgttgattttcgcgcgaaaactgaa300tgaggaagtgtttttctgaataatgtggtatttatggcagggtggagtatttgttcaggg360ccaggtagactttgacccattacgtggaggtttcgattaccgtgttttttacctgaattt420ccgcgtaccgtgtcaaagtcttctgtttttacgtaggtgtcagctgatcgctagggtatt480tatacctcagggtttgtgtcaagaggccactcttgagtgccagcgagaagagttttctcc540tctgcgccggcagtttaataataaaaaaatgagagatttgcgatttctgcctcaggaaat600aatctctgctgagactggaaatgaaatattggagcttgtggtgcacgccctgatgggaga660cgatccggagccacctgtgcagctttttgagcctcctacgcttcaggaactgtatgattt720agaggtagagggatcggaggattctaatgaggaagctgtaaatggcttttttaccgattc780tatgcttttagctgctaatgaagggttagaattagatccgcctttggacacttttgatac840tccaggggtaattgtggaaagcggtacaggtgtaagaaaattacctgatttgagttccgt900ggactgtgatttgcactgctatgaagacgggtttcctccgagtgatgaggaggaccatga960aaaggagcagtccatgcagactgcagcgggtgagggagtgaaggctgccaatgttggttt1020tcagttggattgcccggagcttcctggacatggctgtaagtcttgtgaatttcacaggaa1080aaatactggagtaaaggaactgttatgttcgctttgttatatgagaacgcactgccactt1140tatttacagtaagtgtgtttaagttaaaatttaaaggaatatgctgtttttcacatgtat1200attgagtgtgagttttgtgcttcttattataggtcctgtgtctgatgctgatgaatcacc1260atctcctgattctactacctcacctcctgagattcaagcacctgttcctgtggacgtgcg1320caagcccattcctgtgaagcttaagcctgggaaacgtccagcagtggaaaaacttgagga1380cttgttacagggtggggacggacctttggacttgagtacacggaaacgtccaagacaata1440agtgttccatatccgtgtttacttaaggtgacgtcaatatttgtgtgacagtgcaatgta1500ataaaaatatgttaactgttcactggtttttattgctttttgggcggggactcaggtata1560taagtagaagcagacctgtgtggttagctcataggagctggctttcatccatggaggttt1620gggccattttggaagaccttaggaagactaggcaactgttagagaacgcttcggacggag1680tctccggtttttggagattctggttcgctagtgaattagctagggtagtttttaggataa1740aacaggactataaacaagaatttgaaaagttgttggtagattgcccaggactttttgaag1800ctcttaatttgggccatcaggttcactttaaagaaaaagttttatcagttttagactttt1860caaccccaggtagaactgctgctgctgtggcttttcttacttttatattagataaatgga1920tcccgcagactcatttcagcaggggatacgttttggatttcatagccacagcattgtgga1980gaacatggaaggttcgcaagatgaggacaatcttaggttactggccagtgcagcctttgg2040gtgtagcgggaatcctgaggcatccaccggtcatgccagcggttctggaggaggaacagc2100aagaggacaacccgagagccggcctggaccctccagtggaggaggcggagtagctgactt2160gtctcctgaactgcaacgggtgcttactggatctacgtccactggacgggataggggcgt2220taagagggagagggcatctagtggtactgatgctagatctgagttggctttaagtttaat2280gagtcgcagacgtcctgaaaccatttggtggcatgaggttcagaaagagggaagggatga2340agtttctgtattgcaggagaaatattcactggaacaggtgaaaacatgttggttggagcc2400tgaggatgattgggaggtggccattaaaaattatgccaagatagctttgaggcctgataa2460acagtataagattactagacggattaatatccggaatgcttgttacatatctggaaatgg2520ggctgaggtggtaatagatactcaagacaaggcagttattagatgctgcatgatggatat2580gtggcctggggtagtcggtatggaagcagtaacttttgtaaatgttaagtttaggggaga2640tggttataatggaatagtgtttatggccaataccaaacttatattgcatggttgtagctt2700ttttggtttcaacaatacctgtgtagatgcctggggacaggttagtgtacggggatgtag2760tttctatgcgtgttggattgccacagctggcagaaccaagagtcaattgtctctgaagaa2820atgcatatttcaaagatgtaacctgggcattctgaatgaaggcgaagcaagggtccgcca2880ctgcgcttctacagatactggatgttttattttgattaagggaaatgccagcgtaaagca2940taacatgatttgcggtgcttccgatgagaggccttatcaaatgctcacttgtgctggtgg3000gcattgtaatatgctggctactgtgcatattgtttcccatcaacgcaaaaaatggcctgt3060ttttgatcacaatgtgatgacgaagtgtaccatgcatgcaggtgggcgtagaggaatgtt3120tatgccttaccagtgtaacatgaatcatgtgaaagtgttgttggaaccagatgccttttc3180cagaatgagcctaacaggaatttttgacatgaacatgcaaatctggaagatcctgaggta3240tgatgatacgagatcgagggtacgcgcatgcgaatgcggaggcaagcatgccaggttcca3300gccggtgtgtgtagatgtgactgaagatctcagaccggatcatttggttattgcccgcac3360tggagcagagttcggatccagtggagaagaaactgactaaggtgagtattgggaaaactt3420tggggtgggattttcagatggacagattgagtaaaaatttgttttttctgtcttgcagct3480gtcatgagtggaaacgcttcttttaaggggggagtcttcagcccttatctgacagggcgt3540ctcccatcctgggcaggagttcgtcagaatgttatgggatctactgtggatggaagaccc3600gtccaacccgccaattcttcaacgctgacctatgctactttaagttcttcacctttggac3660gcagctgcagctgccgccgccgcttctgttgccgctaacactgtgcttggaatgggttac3720tatggaagcatcatggctaattccacttcctctaataacccttctaccctgactcaggac3780aagttacttgtccttttggcccagctggaggctttgacccaacgtctgggtgaactttct3840cagcaggtggtcgagttgcgagtacaaactgagtctgctgtcggcacggcaaagtctaaa3900taaaaaaatcccagaatcaatgaataaataaacaagcttgttgttgatttaaaatcaagt3960gtttttatttcatttttcgcgcacggtatgccctagaccaccgatctctatcattgagaa4020ctcggtggattttttccaggatcctatagaggtgggattgaatgtttagatacatgggca4080ttaggccgtctttggggtggagatagctccattgaagggattcatgctccggggtagtgt4140tgtaaatcacccagtcataacaaggtcgcagtgcatggtgttgcacaatatcttttagaa4200gtaggctgattgccacagataagcccttggtgtaggtgtttacaaaccggttgagctggg4260atgggtgcattcggggtgaaattatgtgcattttggattggatttttaagttggcaatat4320tgccgccaagatcccgtcttgggttcatgttatgaaggaccaccaagacggtgtatccgg4380tacatttaggaaatttatcgtgcagcttggatggaaaagcgtggaaaaatttggagacac4440ccttgtgtcctccaagattttccatgcactcatccatgataatagcaatggggccgtggg4500cagcggcgcgggcaaacacgttccgtgggtctgacacatcatagttatgttcctgagtta4560aatcatcataagccattttaatgaatttggggcggagagtaccagattggggtatgaatg4620ttccttcgggccccggagcatagttcccctcacagatttgcatttcccaagctttcagtt4680ccgagggtggaatcatgtccacctggggggctatgaaaaacaccgtttctggggcggggg4740tgattaattgtgatgatagcaaatttctgagcaattgagatttgccacatccggtggggc4800cataaatgattccgattacgggttgcaggtggtagtttagggaacggcaactgccgtctt4860ctcgaagcaagggggccacctcgttcatcatttcccttacatgcatattttcccgcacca4920aatccattaggaggcgctctcctcctagtgatagaagttcttgtagtgaggaaaagtttt4980tcagcggtttcagaccgtcagccatgggcattttggagagagtttgctgcaaaagttcta5040gtctgttccacagttcagtgatgtgttctatggcatctcgatccagcagacctcctcgtt5100tcgcgggtttggacggctcctggaatagggtatgagacgatgggcgtccagcgctgccag5160ggttcggtccttccagggtctcagtgttcgagtcagggttgtttccgtcacagtgaaggg5220gtgtgcgcctgcttgggcgcttgccagggtgcgcttcagactcatcctgctggtcgaaaa5280cttctgtcgcttggcgccctgtatgtcggccaagtagcagtttaccatgagttcgtagtt5340gagcgcctcggctgcgtggcctttggcgcggagcttacctttggaagttttcttgcatac5400cgggcagtataggcatttcagcgcatacaacttgggcgcaaggaaaacggattctgggga5460gtatgcatctgcgccgcaggaggcgcaaacagtttcacattccaccagccaggttaaatc5520cggttcattggggtcaaaaacaagttttccgccatattttttgatgcgtttcttaccttt5580ggtctccatgagttcgtgtcctcgttgagtgacaaacaggctgtccgtgtccccgtagac5640tgattttacaggcctcttctccagtggagtgcctcggtcttcttcgtacaggaactctga5700ccactctgatacaaaggcgcgcgtccaggccagcacaaaggaggctatgtgggaggggta5760gcgatcgttgtcaaccagggggtccaccttttccaaagtatgcaaacacatgtcaccctc5820ttcaacatccaggaatgtgattggcttgtaggtgtatttcacgtgacctggggtccccgc5880tgggggggtataaaagggggcggttctttgctcttcctcactgtcttccggatcgctgtc5940caggaacgtcagctgttggggtaggtattccctctcgaaggcgggcatgacctctgcact6000caggttgtcagtttctaagaacgaggaggatttgatattgacagtgccggttgagatgcc6060tttcatgaggttttcgtccatctggtcagaaaacacaatttttttattgtcaagtttggt6120ggcaaatgatccatacagggcgttggataaaagtttggcaatggatcgcatggtttggtt6180cttttccttgtccgcgcgctctttggcggcgatgttgagttggacatactcgcgtgccag6240gcacttccattcggggaagatagttgttaattcatctggcacgattctcacttgccaccc6300tcgattatgcaaggtaattaaatccacactggtggccacctcgcctcgaaggggttcatt6360ggtccaacagagcctacctcctttcctagaacagaaagggggaagtgggtctagcataag6420ttcatcgggagggtctgcatccatggtaaagattcccggaagtaaatccttatcaaaata6480gctgatgggagtggggtcatctaaggccatttgccattctcgagctgccagtgcgcgctc6540atatgggttaaggggactgccccatggcatgggatgggtgagtgcagaggcatacatgcc6600acagatgtcatagacgtagatgggatcctcaaagatgcctatgtaggttggatagcatcg6660cccccctctgatacttgctcgcacatagtcatatagttcatgtgatggcgctagcagccc6720cggacccaagttggtgcgattgggtttttctgttctgtagacgatctggcgaaagatggc6780gtgagaattggaagagatggtgggtctttgaaaaatgttgaaatgggcatgaggtagacc6840tacagagtctctgacaaagtgggcataagattcttgaagcttggttaccagttcggcggt6900gacaagtacgtctagggcgcagtagtcaagtgtttcttgaatgatgtcataacctggttg6960gtttttcttttcccacagttcgcggttgagaaggtattcttcgcgatccttccagtactc7020ttctagcggaaacccgtctttgtctgcacggtaagatcctagcatgtagaactgattaac7080tgccttgtaagggcagcagcccttctctacgggtagagagtatgcttgagcagcttttcg7140tagcgaagcgtgagtaagggcaaaggtgtctctgaccatgactttgaggaattggtattt7200gaagtcgatgtcgtcacaggctccctgttcccagagttggaagtctacccgtttcttgta7260ggcggggttgggcaaagcgaaagtaacatcattgaagagaatcttgccggccctgggcat7320gaaattgcgagtgatgcgaaaaggctgtggtacttccgctcggttattgataacctgggc7380agctaggacgatctcgtcgaaaccgttgatgttgtgtcctacgatgtataattctatgaa7440acgcggcgtgcctctgacgtgaggtagcttactgagctcatcaaaggttaggtctgtggg7500gtcagataaggcgtagtgttcgagagcccattcgtgcaggtgaggattcgctttaaggaa7560ggaggaccagaggtccactgccagtgctgtttgtaactggtcccggtactgacgaaaatg7620ccgtccgactgccattttttctggggtgacgcaatagaaggtttgggggtcctgccgcca7680gcgatcccacttgagttttatggcgaggtcataggcgatgttgacgagccgctggtctcc7740agagagtttcatgaccagcatgaaggggattagctgcttgccaaaggaccccatccaggt7800gtaggtttccacatcgtaggtgagaaagagcctttctgtgcgaggatgagagccaatcgg7860gaagaactggatctcctgccaccagttggaggaatggctgttgatgtgatggaagtagaa7920ctccctgcgacgcgccgagcattcatgcttgtgcttgtacagacggccgcagtagtcgca7980gcgttgcacgggttgtatctcgtgaatgagttgtacctggcttcccttgacgagaaattt8040cagtgggaagccgaggcctggcgattgtatctcgtgctttactatgttgtctgcatcggc8100ctgttcatcttctgtctcgatggtggtcatgctgacgagccctcgcgggaggcaagtcca8160gacctcggcgcggcaggggcggagctcgaggacgagagcgcgcaggctggagctgtccag8220ggtcctgagacgctgcggactcaggttagtaggcagtgtcaggagattaacttgcatgat8280cttttggagggcgtgcgggaggttcagatagtacttgatctcaacgggtccgttggtgga8340gatgtcgatggcttgcagggttccgtgtcccttgggcgctaccaccgtgcccttgttttt8400cattttggacggcggtggctctgttgcttcttgcatgtttagaagcggtgtcgagggcgc8460gcaccgggcggcaggggcggctcgggacccggcggcatggctggcagtggtacgtcggcg8520ccgcgcgcgggtaggttctggtactgcgccctgagaagactcgcatgcgcgacgacgcgg8580cggttgacatcctggatctgacgcctctgggtgaaagctaccggccccgtgagcttgaac8640ctgaaagagagttcaacagaatcaatctcggtatcgttgacggcggcttgcctaaggatt8700tcttgcacgtcaccagagttgtcctggtaggcgatctccgccatgaactgctcgatctct8760tcctcttgaagatctccgcggcccgctctctcgacggtggccgcgaggtcgttggagatg8820cgcccaatgagttgagagaatgcattcatgcccgcctcgttccagacgcggctgtagacc8880acggcccccacgggatctctcgcgcgcatgaccacctgggcgaggttgagctccacgtgg8940cgggtgaagaccgcatagttgcataggcgctggaaaaggtagttgagtgtggtggcgatg9000tgctcggtgacgaagaaatacatgatccatcgtctcagcggcatctcgctgacatcgccc9060agagcttccaagcgctccatggcctcgtagaagtccacggcaaaattaaaaaactgggag9120tttcgcgcggacacggtcaactcctcttccagaagacggataagttcggcgatggtggtg9180cgcacctcgcgctcgaaagcccctgggatttcttcctcaatctcttcttcttccactaac9240atctcttcctcttcaggtggggctgcaggaggagggggaacgcggcgacgccggcggcgc9300acgggcagacggtcgatgaatctttcaatgacctctccgcggcggcggcgcatggtttca9360gtgacggcgcggccgttctcgcgcggtcgcagagtaaaaacaccgccgcgcatctcctta9420aagtggtgactgggaggttctccgtttgggagggagagggcgctgattatacattttatt9480aattggcccgtagggactgcacgcagagatctgatcgtgtcaagatccacgggatctgaa9540aacctttcgacgaaagcgtctaaccagtcacagtcacaaggtaggctgagtacggcttct9600tgtgggcgggggtggttatgtgttcggtctgggtcttctgtttcttcttcatctcgggaa9660ggtgagacgatgctgctggtgatgaaattaaagtaggcagttctaagacggcggatggtg9720gcgaggagcaccaggtctttgggtccggcttgctggatacgcaggcgattggccattccc9780caagcattatcctgacatctagcaagatctttgtagtagtcttgcatgagccgttctacg9840ggcacttcttcctcacccgttctgccatgcatacgtgtgagtccaaatccgcgcattggt9900tgtaccagtgccaagtcagctacgactctttcggcgaggatggcttgctgtacttgggta9960agggtggcttgaaagtcatcaaaatccacaaagcggtggtaagctcctgtattaatggtg10020taagcacagttggccatgactgaccagttaactgtctggtgaccagggcgcacgagctcg10080gtgtatttaaggcgcgaataggcgcgggtgtcaaagatgtaatcgttgcaggtgcgcacc10140agatactggtaccctataagaaaatgcggcggtggttggcggtagagaggccatcgttct10200gtagctggagcgccaggggcgaggtcttccaacataaggcggtgatagccgtagatgtac10260ctggacatccaggtgattcctgcggcggtagtagaagcccgaggaaactcgcgtacgcgg10320ttccaaatgttgcgtagcggcatgaagtagttcattgtaggcacggtttgaccagtgagg10380cgcgcgcagtcattgatgctctatagacacggagaaaatgaaagcgttcagcgactcgac10440tccgtagcctggaggaacgtgaacgggttgggtcgcggtgtaccccggttcgagacttgt10500actcgagccggccggagccgcggctaacgtggtattggcactcccgtctcgacccagcct10560acaaaaatccaggatacggaatcgagtcgttttgctggtttccgaatggcagggaagtga10620gtcctattttttttttttgccgctcagatgcatcccgtgctgcgacagatgcgcccccaa10680caacagcccccctcgcagcagcagcagcagcaatcacaaaaggctgtccctgcaactact10740gcaactgccgccgtgagcggtgcgggacagcccgcctatgatctggacttggaagagggc10800gaaggactggcacgtctaggtgcgccttcacccgagcggcatccgcgagttcaactgaaa10860aaagattctcgcgaggcgtatgtgccccaacagaacctatttagagacagaagcggcgag10920gagccggaggagatgcgagcttcccgctttaacgcgggtcgtgagctgcgtcacggtttg10980gaccgaagacgagtgttgcgggacgaggatttcgaagttgatgaaatgacagggatcagt11040cctgccagggcacacgtggctgcagccaaccttgtatcggcttacgagcagacagtaaag11100gaagagcgtaacttccaaaagtcttttaataatcatgtgcgaaccctgattgcccgcgaa11160gaagttacccttggtttgatgcatttgtgggatttgatggaagctatcattcagaaccct11220actagcaaacctctgaccgcccagctgtttctggtggtgcaacacagcagagacaatgag11280gctttcagagaggcgctgctgaacatcaccgaacccgaggggagatggttgtatgatctt11340atcaacattctacagagtatcatagtgcaggagcggagcctgggcctggccgagaaggtg11400gctgccatcaattactcggttttgagcttgggaaaatattacgctcgcaaaatctacaag11460actccatacgttcccatagacaaggaggtgaagatagatgggttctacatgcgcatgacg11520ctcaaggtcttgaccctgagcgatgatcttggggtgtatcgcaatgacagaatgcatcgc11580gcggttagcgccagcaggaggcgcgagttaagcgacagggaactgatgcacagtttgcaa11640agagctctgactggagctggaaccgagggtgagaattacttcgacatgggagctgacttg11700cagtggcagcctagtcgcagggctctgagcgccgcgacggcaggatgtgagcttccttac11760atagaagaggcggatgaaggcgaggaggaagagggcgagtacttggaagactgatggcac11820aacccgtgttttttgctagatggaacagcaagcaccggatcccgcaatgcgggcggcgct11880gcagagccagccgtccggcattaactcctcggacgattggacccaggccatgcaacgtat11940catggcgttgacgactcgcaaccccgaagcctttagacagcaaccccaggccaaccgtct12000atcggccatcatggaagctgtagtgccttcccgctctaatcccactcatgagaaggtcct12060ggccatcgtgaacgcgttggtggagaacaaagctattcgtccagatgaggccggactggt12120atacaacgctctcttagaacgcgtggctcgctacaacagtagcaatgtgcaaaccaattt12180ggaccgtatgataacagatgtacgcgaagccgtgtctcagcgcgaaaggttccagcgtga12240tgccaacctgggttcgctggtggcgttaaatgctttcttgagtactcagcctgctaatgt12300gccgcgtggtcaacaggattatactaactttttaagtgctttgagactgatggtatcaga12360agtacctcagagcgaagtgtatcagtccggtcctgattacttctttcagactagcagaca12420gggcttgcagacggtaaatctgagccaagcttttaaaaaccttaaaggtttgtggggagt12480gcatgccccggtaggagaaagagcaaccgtgtctagcttgttaactccgaactcccgcct12540attattactgttggtagctcctttcaccgacagcggtagcatcgaccgtaattcctattt12600gggttacctactaaacctgtatcgcgaagccatagggcaaagtcaggtggacgagcagac12660ctatcaagaaattacccaagtcagtcgcgctttgggacaggaagacactggcagtttgga12720agccactctgaacttcttgcttaccaatcggtctcaaaagatccctcctcaatatgctct12780tactgcggaggaggagaggatccttagatatgtgcagcagagcgtgggattgtttctgat12840gcaagagggggcaactccgactgcagcactggacatgacagcgcgaaatatggagcccag12900catgtatgccagtaaccgacctttcattaacaaactgctggactacttgcacagagctgc12960cgctatgaactctgattatttcaccaatgccatcttaaacccgcactggctgcccccacc13020tggtttctacacgggcgaatatgacatgcccgaccctaatgacggatttctgtgggacga13080cgtggacagcgatgttttttcacctctttctgatcatcgcacgtggaaaaaggaaggcgg13140cgatagaatgcattcttctgcatcgctgtccggggtcatgggtgctaccgcggctgagcc13200cgagtctgcaagtccttttcctagtctacccttttctctacacagtgtacgtagcagcga13260agtgggtagaataagtcgcccgagtttaatgggcgaagaggagtatctaaacgattcctt13320gctcagaccggcaagagaaaaaaatttcccaaacaatggaatagaaagtttggtggataa13380aatgagtagatggaagacttatgctcaggatcacagagacgagcctgggatcatggggat13440tacaagtagagcgagccgtagacgccagcgccatgacagacagaggggtcttgtgtggga13500cgatgaggattcggccgatgatagcagcgtgctggacttgggtgggagaggaaggggcaa13560cccgtttgctcatttgcgccctcgcttgggtggtatgttgtaaaaaaaaataaaaaaaaa13620actcaccaaggccatggcgacgagcgtacgttcgttcttctttattatctgtgtctagta13680taatgaggcgagtcgtgctaggcggagcggtggtgtatccggagggtcctcctccttcgt13740acgagagcgtgatgcagcagcagcaggcgacggcggtgatgcaatccccactggaggctc13800cctttgtgcctccgcgatacctggcacctacggagggcagaaacagcattcgttattcgg13860aactggcacctcagtacgataccaccaggttgtatctggtggacaacaagtcggcggaca13920ttgcttctctgaactatcagaatgaccacagcaacttcttgaccacggtggtgcaaaaca13980atgactttacccctacggaagccagcacccagaccattaactttgatgaacgatcgcggt14040ggggcggtcagctaaagaccatcatgcatactaacatgccaaacgtgaacgagtatatgt14100ttagtaacaagttcaaagcgcgtgtgatggtgtccagaaaacctcccgacggtgctgcag14160ttggggatacttatgatcacaagcaggatattttgaaatatgagtggttcgagtttactt14220tgccagaaggcaacttttcagttactatgactattgatttgatgaacaatgccatcatag14280ataattacttgaaagtgggtagacagaatggagtgcttgaaagtgacattggtgttaagt14340tcgacaccaggaacttcaagctgggatgggatcccgaaaccaagttgatcatgcctggag14400tgtatacgtatgaagccttccatcctgacattgtcttactgcctggctgcggagtggatt14460ttaccgagagtcgtttgagcaaccttcttggtatcagaaaaaaacagccatttcaagagg14520gttttaagattttgtatgaagatttagaaggtggtaatattccggccctcttggatgtag14580atgcctatgagaacagtaagaaagaacaaaaagccaaaatagaagctgctacagctgctg14640cagaagctaaggcaaacatagttgccagcgactctacaagggttgctaacgctggagagg14700tcagaggagacaattttgcgccaacacctgttccgactgcagaatcattattggccgatg14760tgtctgaaggaacggacgtgaaactcactattcaacctgtagaaaaagatagtaagaata14820gaagctataatgtgttggaagacaaaatcaacacagcctatcgcagttggtatctttcgt14880acaattatggcgatcccgaaaaaggagtgcgttcctggacattgctcaccacctcagatg14940tcacctgcggagcagagcaggtctactggtcgcttccagacatgatgaaggatcctgtca15000ctttccgctccactagacaagtcagtaactaccctgtggtgggtgcagagcttatgcccg15060tcttctcaaagagcttctacaacgaacaagctgtgtactcccagcagctccgccagtcca15120cctcgcttacgcacgtcttcaaccgctttcctgagaaccagattttaatccgtccgccgg15180cgcccaccattaccaccgtcagtgaaaacgttcctgctctcacagatcacgggaccctgc15240cgttgcgcagcagtatccggggagtccaacgtgtgaccgttactgacgccagacgccgca15300cctgtccctacgtgtacaaggcactgggcatagtcgcaccgcgcgtcctttcaagccgca15360ctttctaaaaaaaaaaaaaatgtccattcttatctcgcccagtaataacaccggttgggg15420tctgcgcgctccaagcaagatgtacggaggcgcacgcaaacgttctacccaacatcctgt15480ccgtgttcgcggacattttcgcgctccatggggcgccctcaagggccgcactcgcgttcg15540aaccaccgtcgatgatgtaatcgatcaggtggttgccgacgcccgtaattatactcctac15600tgcgcctacatctactgtggatgcagttattgacagtgtagtggctgacgctcgcaacta15660tgctcgacgtaagagccggcgaaggcgcattgccagacgccaccgagctaccactgccat15720gcgagccgcaagagctctgctacgaagagctagacgcgtggggcgaagagccatgcttag15780ggcggccagacgtgcagcttcgggcgccagcgccggcaggtcccgcaggcaagcagccgc15840tgtcgcagcggcgactattgccgacatggcccaatcgcgaagaggcaatgtatactgggt15900gcgtgacgctgccaccggtcaacgtgtacccgtgcgcacccgtccccctcgcacttagaa15960gatactgagcagtctccgatgttgtgtcccagcggcgaggatgtccaagcgcaaatacaa16020ggaagaaatgctgcaggttatcgcacctgaagtctacggccaaccgttgaaggatgaaaa16080aaaaccccgcaaaatcaagcgggttaaaaaggacaaaaaagaagaggaagatggcgatga16140tgggctggcggagtttgtgcgcgagtttgccccacggcgacgcgtgcaatggcgtgggcg16200caaagttcgacatgtgttgagacctggaacttcggtggtctttacacccggcgagcgttc16260aagcgctacttttaagcgttcctatgatgaggtgtacggggatgatgatattcttgagca16320ggcggctgaccgattaggcgagtttgcttatggcaagcgtagtagaataacttccaagga16380tgagacagtgtcgatacccttggatcatggaaatcccacccctagtcttaaaccggtcac16440tttgcagcaagtgttacccgtaactccgcgaacaggtgttaaacgcgaaggtgaagattt16500gtatcccactatgcaactgatggtacccaaacgccagaagttggaggacgttttggagaa16560agtaaaagtggatccagatattcaacctgaggttaaagtgagacccattaagcaggtagc16620gcctggtctgggggtacaaactgtagacattaagattcccactgaaagtatggaagtgca16680aactgaacccgcaaagcctactgccacctccactgaagtgcaaacggatccatggatgcc16740catgcctattacaactgacgccgccggtcccactcgaagatcccgacgaaagtacggtcc16800agcaagtctgttgatgcccaattatgttgtacacccatctattattcctactcctggtta16860ccgaggcactcgctactatcgcagccgaaacagtacctcccgccgtcgccgcaagacacc16920tgcaaatcgcagtcgtcgccgtagacgcacaagcaaaccgactcccggcgccctggtgcg16980gcaagtgtaccgcaatggtagtgcggaacctttgacactgccgcgtgcgcgttaccatcc17040gagtatcatcacttaatcaatgttgccgctgcctccttgcagatatggccctcacttgtc17100gccttcgcgttcccatcactggttaccgaggaagaaactcgcgccgtagaagagggatgt17160tgggacgcggaatgcgacgctacaggcgacggcgtgctatccgcaagcaattgcggggtg17220gttttttaccagccttaattccaattatcgctgctgcaattggcgcgataccaggcatag17280cttccgtggcggttcaggcctcgcaacgacattgacattggaaaaaaacgtataaataaa17340aaaaaaaaaatacaatggactctgacactcctggtcctgtgactatgttttcttagagat17400ggaagacatcaatttttcatccttggctccgcgacacggcacgaagccgtacatgggcac17460ctggagcgacatcggcacgagccaactgaacgggggcgccttcaattggagcagtatctg17520gagcgggcttaaaaattttggctcaaccataaaaacatacgggaacaaagcttggaacag17580cagtacaggacaggcgcttagaaataaacttaaagaccagaacttccaacaaaaagtagt17640cgatgggatagcttccggcatcaatggagtggtagatttggctaaccaggctgtgcagaa17700aaagataaacagtcgtttggacccgccgccagcaaccccaggtgaaatgcaagtggagga17760agaaattcctccgccagaaaaacgaggcgacaagcgtccgcgtcccgatttggaagagac17820gctggtgacgcgcgtagatgaaccgccttcttatgaggaagcaacgaagcttggaatgcc17880caccactagaccgatagccccaatggccaccggggtgatgaaaccttctcagttgcatcg17940acccgtcaccttggatttgccccctccccctgctgctactgctgtacccgcttctaagcc18000tgtcgctgccccgaaaccagtcgccgtagccaggtcacgtcccgggggcgctcctcgtcc18060aaatgcgcactggcaaaatactctgaacagcatcgtgggtctaggcgtgcaaagtgtaaa18120acgccgtcgctgcttttaattaaatatggagtagcgcttaacttgcctatctgtgtatat18180gtgtcattacacgccgtcacagcagcagaggaaaaaaggaagaggtcgtgcgtcgacgct18240gagttactttcaagatggccaccccatcgatgctgccccaatgggcatacatgcacatcg18300ccggacaggatgcttcggagtacctgagtccgggtctggtgcagttcgcccgcgccacag18360acacctacttcaatctgggaaataagtttagaaatcccaccgtagcgccgacccacgatg18420tgaccaccgaccgtagccagcggctcatgttgcgcttcgtgcccgttgaccgggaggaca18480atacatactcttacaaagtgcggtacaccctggccgtgggcgacaacagagtgctggata18540tggccagcacgttctttgacattaggggtgtgttggacagaggtcccagtttcaaaccct18600attctggtacggcttacaactccctggctcctaaaggcgctccaaatacatctcagtgga18660ttgcagaaggtgtaaaaaatacaactggtgaggaacacgtaacagaagaggaaaccaata18720ctactacttacacttttggcaatgctcctgtaaaagctgaagctgaaattacaaaagaag18780gactcccagtaggtttggaagtttcagatgaagaaagtaaaccgatttatgctgataaaa18840catatcagccagaacctcagctgggagatgaaacttggactgaccttgatggaaaaaccg18900aaaagtatggaggcagggctctcaaacccgatactaagatgaaaccatgctacgggtcct18960ttgccaaacctactaatgtgaaaggcggtcaggcaaaacaaaaaacaacggagcagccaa19020atcagaaagtcgaatatgatatcgacatggagttttttgatgcggcatcgcagaaaacaa19080acttaagtcctaaaattgtcatgtatgcagaaaatgtaaatttggaaactccagacactc19140atgtagtgtacaaacctggaacagaagacacaagttccgaagctaatttgggacaacaat19200ctatgcccaacagacccaactacattggcttcagagataactttattggacttatgtact19260ataacagtactggtaacatgggggtgctggctggtcaagcgtctcagttaaatgcagtgg19320ttgacttgcaggacagaaacacagaactttcttaccaactcttgcttgactctctgggcg19380acagaaccagatactttagcatgtggaatcaggctgtggacagttatgatcctgatgtac19440gtgttattgaaaatcatggtgtggaagatgaacttcccaactactgttttccactggacg19500gcataggtgttccaacaaccagttacaaatcaatagttccaaatggagacaatgcgccta19560attggaaggaacctgaagtaaatggaacaagtgagatcggacagggtaatttgtttgcca19620tggaaattaaccttcaagccaatctatggcgaagtttcctttattccaatgtggctctat19680atctcccagactcgtacaaatacaccccgtccaatgtcactcttccagaaaacaaaaaca19740cctacgactacatgaacgggcgggtggtgccgccatctctagtagacacctatgtgaaca19800ttggtgccaggtggtctctggatgccatggacaatgtcaacccattcaaccaccaccgta19860acgctggcttgcgttaccgatccatgcttctgggtaacggacgttatgtgcctttccaca19920tacaagtgcctcaaaaattcttcgctgttaaaaacctgctgcttctcccaggctcctaca19980cttatgagtggaactttaggaaggatgtgaacatggttctacagagttccctcggtaacg20040acctgcgggtagatggcgccagcatcagtttcacgagcatcaacctctatgctacttttt20100tccccatggctcacaacaccgcttccacccttgaagccatgctgcggaatgacaccaatg20160atcagtcattcaacgactacctatctgcagctaacatgctctaccccattcctgccaatg20220caaccaatattcccatttccattccttctcgcaactgggcggctttcagaggctggtcat20280ttaccagactgaaaaccaaagaaactccctctttggggtctggatttgacccctactttg20340tctattctggttctattccctacctggatggtaccttctacctgaaccacacttttaaga20400aggtttccatcatgtttgactcttcagtgagctggcctggaaatgacaggttactatctc20460ctaacgaatttgaaataaagcgcactgtggatggcgaaggctacaacgtagcccaatgca20520acatgaccaaagactggttcttggtacagatgctcgccaactacaacatcggctatcagg20580gcttctacattccagaaggatacaaagatcgcatgtattcatttttcagaaacttccagc20640ccatgagcaggcaggtggttgatgaggtcaattacaaagacttcaaggccgtcgccatac20700cctaccaacacaacaactctggctttgtgggttacatggctccgaccatgcgccaaggtc20760aaccctatcccgctaactatccctatccactcattggaacaactgccgtaaatagtgtta20820cgcagaaaaagttcttgtgtgacagaaccatgtggcgcataccgttctcgagcaacttca20880tgtctatgggggcccttacagacttgggacagaatatgctctatgccaactcagctcatg20940ctctggacatgacctttgaggtggatcccatggatgagcccaccctgctttatcttctct21000tcgaagttttcgacgtggtcagagtgcatcagccacaccgcggcatcatcgaggcagtct21060acctgcgtacaccgttctcggccggtaacgctaccacgtaagaagcttcttgcttcttgc21120aaatagcagctgcaaccatggcctgcggatcccaaaacggctccagcgagcaagagctca21180gagccattgtccaagacctgggttgcggaccctattttttgggaacctacgataagcgct21240tcccggggttcatggcccccgataagctcgcctgtgccattgtaaatacggccggacgtg21300agacggggggagagcactggttggctttcggttggaacccacgttctaacacctgctacc21360tttttgatccttttggattctcggatgatcgtctcaaacagatttaccagtttgaatatg21420agggtctcctgcgccgcagcgctcttgctaccaaggaccgctgtattacgctggaaaaat21480ctacccagaccgtgcagggtccccgttctgccgcctgcggacttttctgctgcatgttcc21540ttcacgcctttgtgcactggcctgaccgtcccatggacggaaaccccaccatgaaattgc21600taactggagtgccaaacaacatgcttcattctcctaaagtccagcccaccctgtgtgaca21660atcaaaaagcactctaccattttcttaatacccattcgccttattttcgctcccatcgta21720cacacatcgaaagggccactgcgttcgaccgtatggatgttcaataatgactcatgtaaa21780caacgtgttcaataaacatcactttatttttttacatgtatcaaggctctgcattactta21840tttatttacaagtcgaatgggttctgacgagaatcagaatgacccgcaggcagtgatacg21900ttgcggaactgatacttgggttgccacttgaattcgggaatcaccaacttgggaaccggt21960atatcgggcaggatgtcactccacagctttctggtcagctgcaaagctccaagcaggtca22020ggagccgaaatcttgaaatcacaattaggaccagtgctttgagcgcgagagttgcggtac22080accggattgcagcactgaaacaccatcagcgacggatgtctcacgcttgccagcacggtg22140ggatctgcaatcatgcccacatccagatcttcagcattggcaatgctgaacggggtcatc22200ttgcaggtctgcctacccatggcgggcacccaattaggcttgtggttgcaatcgcagtgc22260agggggatcagtatcatcttggcctgatcctgtctgattcctggatacacggctctcatg22320aaagcatcatattgcttgaaagcctgctgggctttactaccctcggtataaaacatcccg22380caggacctgctcgaaaactggttagctgcacagccggcatcattcacacagcagcgggcg22440tcattgttagctatttgcaccacacttctgccccagcggttttgggtgattttggttcgc22500tcgggattctcctttaaggctcgttgtccgttctcgctggccacatccatctcgataatc22560tgctccttctgaatcataatattgccatgcaggcacttcagcttgccctcataatcattg22620cagccatgaggccacaacgcacagcctgtacattcccaattatggtgggcgatctgagaa22680aaagaatgtatcattccctgcagaaatcttcccatcatcgtgctcagtgtcttgtgacta22740gtgaaagttaactggatgcctcggtgctcctcgtttacgtactggtgacagatgcgcttg22800tattgttcgtgttgctcaggcattagtttaaaagaggttctaagttcgttatccagcctg22860tacttctccatcagcagacacatcacttccatgcctttctcccaagcagacaccaggggc22920aagctaatcggattcttaacagtgcaggcagcagctcctttagccagagggtcatcttta22980gcgatcttctcaatgcttcttttgccatccttctcaacgatgcgcacgggcgggtagctg23040aaacccactgctacaagttgcgcctcttctctttcttcttcgctgtcttgactgatgtct23100tgcatggggatatgtttggtcttccttggcttctttttggggggtatcggaggaggagga23160ctgtcgctccgttccggagacagggaggattgtgacgtttcgctcaccattaccaactga23220ctgtcggtagaagaacctgaccccacacggcgacaggtgtttctcttcgggggcagaggt23280ggaggcgattgcgaagggctgcggtccgacctggaaggcggatgactggcagaacccctt23340ccgcgttcgggggtgtgctccctgtggcggtcgcttaactgatttccttcgcggctggcc23400attgtgttctcctaggcagagaaacaacagacatggaaactcagccattgctgtcaacat23460cgccacgagtgccatcacatctcgtcctcagcgacgaggaaaaggagcagagcttaagca23520ttccaccgcccagtcctgccaccacctctaccctagaagataaggaggtcgacgcatctc23580atgacatgcagaataaaaaagcgaaagagtctgagacagacatcgagcaagacccgggct23640atgtgacaccggtggaacacgaggaagagttgaaacgctttctagagagagaggatgaaa23700actgcccaaaacaacgagcagataactatcaccaagatgctggaaatagggatcagaaca23760ccgactacctcatagggcttgacggggaagacgcgctccttaaacatctagcaagacagt23820cgctcatagtcaaggatgcattattggacagaactgaagtgcccatcagtgtggaagagc23880tcagccgcgcctacgagcttaacctcttttcacctcgtactccccccaaacgtcagccaa23940acggcacctgcgagccaaatcctcgcttaaacttttatccagcttttgctgtgccagaag24000tactggctacctatcacatcttttttaaaaatcaaaaaattccagtctcctgccgcgcta24060atcgcacccgcgccgatgccctactcaatctgggacctggttcacgcttacctgatatag24120cttccttggaagaggttccaaagatcttcgagggtctgggcaataatgagactcgggccg24180caaatgctctgcaaaagggagaaaatggcatggatgagcatcacagcgttctggtggaat24240tggaaggcgataatgccagactcgcagtactcaagcgaagcatcgaggtcacacacttcg24300catatcccgctgtcaacctgccccctaaagtcatgacggcggtcatggaccagttactca24360ttaagcgcgcaagtcccctttcagaagacatgcatgacccagatgcctgtgatgagggta24420aaccagtggtcagtgatgagcagctaacccgatggctgggcaccgactctcccagggatt24480tggaagagcgtcgcaagcttatgatggccgtggtgctggttaccgtagaactagagtgtc24540tccgacgtttctttaccgattcagaaaccttgcgcaaactcgaagagaatctgcactaca24600cttttagacacggctttgtgcggcaggcatgcaagatatctaacgtggaactcaccaacc24660tggtttcctacatgggtattctgcatgagaatcgcctaggacaaagcgtgctgcacagca24720ccctgaagggggaagcccgccgtgattacatccgcgattgtgtctatctgtacctgtgcc24780acacgtggcaaaccggcatgggtgtatggcagcaatgtttagaagaacagaacttgaaag24840agcttgacaagctcttacagaaatctcttaaggttctgtggacagggttcgacgagcgca24900ccgtcgcttccgacctggcagacctcatcttcccagagcgtctcagggttactttgcgaa24960acggattgcctgactttatgagccagagcatgcttaacaattttcgctctttcatcctgg25020aacgctccggtatcctgcccgccacctgctgcgcactgccctccgactttgtgcctctca25080cctaccgcgagtgccccccgccgctatggagtcactgctacctgttccgtctggccaact25140atctctcctaccactcggatgtgatcgaggatgtgagcggagacggcttgctggagtgtc25200actgccgctgcaatctgtgcacgccccaccggtccctagcttgcaacccccagttgatga25260gcgaaacccagataataggcacctttgaattgcaaggccccagcagccaaggcgatgggt25320cttctcctgggcaaagtttaaaactgaccccgggactgtggacctccgcctacttgcgca25380agtttgctccggaagattaccacccctatgaaatcaagttctatgaggaccaatcacagc25440ctccaaaggccgaactttcggcctgcgtcatcacccagggggcaattctggcccaattgc25500aagccatccaaaaatcccgccaagaatttctactgaaaaagggtaagggggtctaccttg25560acccccagaccggcgaggaactcaacacaaggttccctcaggatgtcccaacgacgagaa25620aacaagaagttgaaggtgcagccgccgcccccagaagatatggaggaagattgggacagt25680caggcagaggaggcggaggaggacagtctggaggacagtctggaggaagacagtttggag25740gaggaaaacgaggaggcagaggaggtggaagaagtaaccgccgacaaacagttatcctcg25800gctgcggagacaagcaacagcgctaccatctccgctccgagtcgaggaacccggcggcgt25860cccagcagtagatgggacgagaccggacgcttcccgaacccaaccagcgcttccaagacc25920ggtaagaaggatcggcagggatacaagtcctggcgggggcataagaatgccatcatctcc25980tgcttgcatgagtgcgggggcaacatatccttcacgcggcgctacttgctattccaccat26040ggggtgaactttccgcgcaatgttttgcattactaccgtcacctccacagcccctactat26100agccagcaaatcccggcagtctcgacagataaagacagcggcggcgacctccaacagaaa26160accagcagcggcagttagaaaatacacaacaagtgcagcaacaggaggattaaagattac26220agccaacgagccagcgcaaacccgagagttaagaaatcggatctttccaaccctgtatgc26280catcttccagcagagtcggggtcaagagcaggaactgaaaataaaaaaccgatctctgcg26340ttcgctcaccagaagttgtttgtatcacaagagcgaagatcaacttcagcgcactctcga26400ggacgccgaggctctcttcaacaagtactgcgcgctgactcttaaagagtaggcagcgac26460cgcgcttattcaaaaaaggcgggaattacatcatcctcgacatgagtaaagaaattccca26520cgccttacatgtggagttatcaaccccaaatgggattggcggcaggcgcctcccaggact26580actccacccgcatgaattggctcagcgccgggccttctatgatttctcgagttaatgata26640tacgcgcctaccgaaaccaaatacttttggaacagtcagctcttaccaccacgccccgcc26700aacaccttaatcccagaaattggcccgccgccctagtgtaccaggaaagtcccgctccca26760ccactgtattacttcctcgagacgcccaggccgaagtccaaatgactaatgcaggtgcgc26820agttagctggcggctccaccctatgtcgtcacaggcctcggcataatataaaacgcctga26880tgatcagaggccgaggtatccagctcaacgacgagtcggtgagctctccgcttggtctac26940gaccagacggaatctttcagattgccggctgcgggagatcttccttcacccctcgtcagg27000ctgttctgactttggaaagttcgtcttcgcaaccccgctcgggcggaatcgggaccgttc27060aatttgtggaggagtttactccctctgtctacttcaaccccttctccggatctcctgggc27120attacccggacgagttcataccgaacttcgacgcgattagcgagtcagtggacggctacg27180attgatgtctggtgacgcggctgagctatctcggctgcgacatctagaccactgccgccg27240ctttcgctgctttgcccgggaactcattgagttcatctacttcgaactccccaaggatca27300ccctcaaggtccggcccacggagtgcggatttctatcgaaggcaaaatagactctcgcct27360gcaacgaattttctcccagcggcccgtgctgatcgagcgagaccagggaaacaccacggt27420ttccatctactgcatttgtaatcaccccggattgcatgaaagcctttgctgtcttatgtg27480tactgagtttaataaaaactgaattaagactctcctacggactgccgcttcttcaacccg27540gattttacaaccagaagaacgaaacttttcctgtcgtccaggactctgttaacttcacct27600ttcctactcacaaactagaagctcaacgactacaccgcttttccagaagcattttcccta27660ctaatactactttcaaaaccggaggtgagctccaaggtcttcctacagaaaacccttggg27720tggaagcgggccttgtagtgctaggaattcttgcgggtgggcttgtgattattctttgct27780acctatacacaccttgcttcactttcttagtggtgttgtggtattggtttaaaaaatggg27840gcccatactagtcttgcttgttttactttcgcttttggaaccgggttctgccaattacga27900tccatgtctagacttcgacccagaaaactgcacacttacttttgcacccgacacaagccg27960catctgtggagttcatcgcctctcttacgaacttggcccccaacgacaaaaatttacctg28020catggtgggaatcaaccccatagttatcacccagcaaagtggagatactaagggttgcat28080tcactgctcctgcgattccatcgagtgcacctacaccctgctgaagaccctatgcggcct28140aagagacctgctaccaatgaattaaaaaatgattaataaaaaatcacttacttgaaatca28200gcaataaggtctctgttgaaattttctcccagcagcacctcacttccctcttcccaactc28260tggtattctaaaccccgttcagcggcatactttctccatactttaaaggggatgtcaaat28320tttagctcctctcctgtacccacaatcttcatgtctttcttcccagatgaccaagagagt28380ccggctcagtgactccttcaaccctgtctacccctatgaagatgaaagcacctcccaaca28440cccctttataaacccagggtttatttccccaaatggcttcacacaaagcccaaacggagt28500tcttactttaaaatgtttaaccccactaacaaccacaggcggatctctacagctaaaagt28560gggagggggacttacagtggatgacaccaacggttttttgaaagaaaacataagtgccac28620cacaccactcgttaagactggtcactctataggtttaccactaggagccggattgggaac28680gaatgaaaataaactttgtatcaaattaggacaaggacttacattcaattcaaacaacat28740ttgcattgatgacaatattaacaccttatggacaggagtcaaccccaccgaagccaactg28800tcaaatcatgaactccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacactagttaaaac28860tggagcactagtcactgcatttgtttatgttataggagtatctaacaattttaatatgct28920aactacacacagaaatataaattttactgcagagctgtttttcgattctactggtaattt28980actaactagactctcatccctcaaaactccacttaatcataaatcaggacaaaacatggc29040tactggtgccattactaatgctaaaggtttcatgcccagcacgactgcctatcctttcaa29100tgataattctagagaaaaagaaaactacatttacggaacttgttactacacagctagtga29160tcgcactgcttttcccattgacatatctgtcatgcttaaccgaagagcaataaatgacga29220gacatcatattgtattcgtataacttggtcctggaacacaggagatgccccagaggtgca29280aacctctgctacaaccctagtcacctccccatttaccttttactacatcagagaagacga29340ctgacaaataaagtttgcgatcgccaggcccaccatggactggacctggcgcatcctgtt29400cttggtggcagctgctacgggagctcattcccaggtgcagctggtgcaatccggcgctga29460ggtgaagaaacccggggcttcagtcaaagtcagctgcaaggctagcggctacacctttac29520tggctattacatgcactgggtgaggcaggctccgggacagggtctggaatggatgggatg29580gatcaatccggacagcggcgggaccaattacgcacaaaagttccaaggccgcgtgacgat29640gacccgggacacttcgatctcaaccgcctacatggagctgaaccgcctgaggtcggatga29700caccgctgtgtactactgcgctcgcgaccaacccctggggtactgcaccaacggagtgtg29760ttcatacttcgactactggggccaaggcacgctggtcactgtgtcatcggcgtccactaa29820gggcccgtcggtcttcccactagctccgtgctcgcggtcgacttcggaatcaactgcggc29880actcggatgccttgtcaaggactacttcccagaacccgtgaccgtctcgtggaactcagg29940cgccctgacgagcggtgtccacactttcccggcggtgctgcagtcatcggggctatacag30000cctgagcagcgtggttactgtgccgtcatcaaacttcgggacccagacttacacttgcaa30060tgtggaccacaagccgtcaaataccaaagtggacaagactgtggaacgcaaatgttgcgt30120ggaatgccctccgtgcccggcccccccagtcgctggcccatccgtgttcctcttccctcc30180gaagccaaaagacactctgatgatttcgagaactccggaggtcacttgcgtggtggtcga30240cgtgtcgcacgaggatccagaggtgcagttcaactggtacgtggatggagtggaggtgca30300caatgccaagaccaagccgcgcgaagaacaattcaactccacctttcgggtcgtgtccgt30360gctgaccgtggtacaccaagactggctgaacggaaaggagtacaaatgcaaggtgagcaa30420caaggggctgccggctccaatcgaaaagaccatctcaaagactaaggggcaacctcgcga30480gccacaggtgtataccctgcctccaagcagggaggaaatgaccaaaaaccaggtgagcct30540gacctgtctggtgaagggcttttaccccagcgacatcgccgtcgagtgggaaagcaacgg30600acaacccgagaacaactacaagaccactccgcccatgctggactccgacgggtcattttt30660cctgtactcaaagctgactgtggacaagtcccggtggcagcaaggtaacgtgttctcctg30720ctcggtgatgcacgaagctttgcacaaccactacactcaaaagtcactttccttgtcacc30780gggcaaggggtcgggcgccactaacttttccttgctcaagcaggcgggcgatgtggagga30840gaatccgggcccgcgcctcccggcgcaactgctgggcctcctcctcctctggtttcccgg30900ctcccgctgtgacatccagatgactcagtcgcccagctccgtgtccgcatcggtggggga30960cagagtcaccatcacctgcagagcttcacaagggatctattcctggctggcgtggtatca31020gcagaagcctggaaaggcccccaacctcctgatttacaccgcatcgactctccagtcagg31080cgtgccatcccggttctcagggtccggctccggaaccgacttcactctgactatcagctc31140cctgcaaccagaagatttcgctacctactactgccagcaggcaaacatctttccgctaac31200tttcggcggaggcacgaaggtggagatcaagagaaccgtggcggccccttccgtcttcat31260cttcccaccgtcagacgaacaactcaaatccggtaccgcctccgtcgtgtgcctgctcaa31320taacttctatccacgcgaggccaaggtccagtggaaagtggataacgccctgcagtccgg31380aaacagccaggagtcagtgaccgaacaggattccaaggacagcacttactcgctctcaag31440caccctcaccctgtcgaaggcggattacgagaagcacaaagtctacgcctgcgaagtgac31500tcatcaaggactctcatcaccggtaactaagagcttcaatcgcggagaatgctaggctag31560cttgactgactgagatacagcgtaccttcagctcacagacatgataagatacattgatga31620gtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtga31680tgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattg31740cattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaa31800cctctacaaatgtggtcctgcaggaacttgtttatttgaaaatcaattcacaaaatccga31860gtagttattttgcctcccccttcccatttaacagaatacaccaatctctccccacgcaca31920gctttaaacatttggataccattagatatagacatggttttagattccacattccaaaca31980gtttcagagcgagccaatctggggtcagtgatagataaaaatccatcgggatagtctttt32040aaagcgctttcacagtccaactgctgcggatgcgactccggagtctggatcacggtcatc32100tggaagaagaacgatgggaatcataatccgaaaacggtatcggacgattgtgtctcatca32160aacccacaagcagccgctgtctgcgtcgctccgtgcgactgctgtttatgggatcagggt32220ccacagtgtcctgaagcatgattttaatagcccttaacatcaactttctggtgcgatgcg32280cgcagcaacgcattctgatttcactcaaatctttgcagtaggtacaacacattattacaa32340tattgtttaataaaccataattaaaagcgctccagccaaaactcatatctgatataatcg32400cccctgcatgaccatcataccaaagtttaatataaattaaatgacgttccctcaaaaaca32460cactacccacatacatgatctcttttggcatgtgcatattaacaatctgtctgtaccatg32520gacaacgttggttaatcatgcaacccaatataaccttccggaaccacactgccaacaccg32580ctcccccagccatgcattgaagtgaaccctgctgattacaatgacaatgaagaacccaat32640tctctcgaccgtgaatcacttgagaatgaaaaatatctatagtggcacaacatagacata32700aatgcatgcatcttctcataatttttaactcctcaggatttagaaacatatcccagggaa32760taggaagctcttgcagaacagtaaagctggcagaacaaggaagaccacgaacacaactta32820cactatgcatagtcatagtatcacaatctggcaacagcgggtggtcttcagtcatagaag32880ctcgggtttcattttcctcacaacgtggtaactgggctctggtgtaagggtgatgtctgg32940cgcatgatgtcgagcgtgcgcgcaaccttgtcataatggagttgcttcctgacattctcg33000tattttgtatagcaaaacgcggccctggcagaacacactcttcttcgccttctatcctgc33060cgcttagcgtgttccgtgtgatagttcaagtacaaccacactcttaagttggtcaaaaga33120atgctggcttcagttgtaatcaaaactccatcgcatctaatcgttctgaggaaatcatcc33180aagcaatgcaactggattgtgtttcaagcaggagaggagagggaagagacggaagaacca33240tgttaatttttattccaaacgatctcgcagtacttcaaattgtagatcgcgcagatggca33300tctctcgcccccactgtgttggtgaaaaagcacagctagatcaaaagaaatgcgattttc33360aaggtgctcaacggtggcttccagcaaagcctccacgcgcacatccaagaacaaaagaat33420accaaaagaaggagcattttctaactcctcaatcatcatattacattcctgcaccattcc33480cagataattttcagctttccagccttgaattattcgtgtcagttcttgtggtaaatccaa33540tccacacattacaaacaggtcccggagggcgccctccaccaccattcttaaacacaccct33600cataatgacaaaatatcttgctcctgtgtcacctgtagcgaattgagaatggcaacatca33660attgacatgcccttggctctaagttcttctttaagttctagttgtaaaaactctctcata33720ttatcaccaaactgcttagccagaagccccccgggaacaagagcaggggacgctacagtg33780cagtacaagcgcagacctccccaattggctccagcaaaaacaagattggaataagcatat33840tgggaaccgccagtaatatcatcgaagttgctggaaatataatcaggcagagtttcttgt33900aaaaattgaataaaagaaaaatttgccaaaaaaacattcaaaacctctgggatgcaaatg33960caataggttaccgcgctgcgctccaacattgttagttttgaattagtctgcaaaaataaa34020aaaaaaaacaagcgtcatatcatagtagcctgacgaacagatggataaatcagtctttcc34080atcacaagacaagccacagggtctccagctcgaccctcgtaaaacctgtcatcatgatta34140aacaacagcaccgaaagttcctcgcggtgaccagcatgaataattcttgatgaagcatac34200aatccagacatgttagcatcagttaacgagaaaaaacagccaacatagcctttgggtata34260attatgcttaatcgtaagtatagcaaagccacccctcgcggatacaaagtaaaaggcaca34320ggagaataaaaaatataattatttctctgctgctgttcaggcaacgtcgcccccggtccc34380tctaaatacacatacaaagcctcatcagccatggcttaccagacaaagtacagcgggcac34440acaaagcacaagctctaaagtgactctccaacctctccacaatatatatatacacaagcc34500ctaaactgacgtaatgggagtaaagtgtaaaaaatcccgccaaacccaacacacaccccg34560aaactgcgtcaccagggaaaagtacagtttcacttccgcaatcccaacaggcgtaacttc34620ctctttctcacggtacgtgatatcccactaacttgcaacgtcattttcccacggtcgcac34680cgccccttttagccgttaaccccacagccaatcaccacacgatccacactttttaaaatc34740acctcatttacatattggcaccattccatctataaggtatattatatagataga34794<210>2<400>2000<210>3<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>重链前导序列<400>3metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly151015alahisser<210>4<211>126<212>prt<213>人工序列<220><223>抗cd40vh链氨基酸序列<400>4glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrglytyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glytrpileasnproaspserglyglythrasntyralaglnlysphe505560glnglyargvalthrmetthrargaspthrserileserthralatyr65707580metgluleuasnargleuargseraspaspthralavaltyrtyrcys859095alaargaspglnproleuglytyrcysthrasnglyvalcyssertyr100105110pheasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser115120125<210>5<211>326<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体恒定重链氨基酸序列<400>5alaserthrlysglyproservalpheproleualaprocysserarg151015serthrsergluserthralaalaleuglycysleuvallysasptyr202530pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser354045glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser505560leuserservalvalthrvalproserserasnpheglythrglnthr65707580tyrthrcysasnvalasphislysproserasnthrlysvalasplys859095thrvalgluarglyscyscysvalglucysproprocysproalapro100105110provalalaglyproservalpheleupheproprolysprolysasp115120125thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalasp130135140valserhisgluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspgly145150155160valgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasn165170175serthrpheargvalvalservalleuthrvalvalhisglnasptrp180185190leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleupro195200205alaproileglulysthrileserlysthrlysglyglnproargglu210215220proglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasn225230235240glnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspile245250255alavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthr260265270thrproprometleuaspseraspglyserphepheleutyrserlys275280285leuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercys290295300servalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleu305310315320serleuserproglylys325<210>6<400>6000<210>7<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链前导序列<400>7argleuproalaglnleuleuglyleuleuleuleutrppheprogly151015serargcys<210>8<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>抗cd40vl链氨基酸序列<400>8aspileglnmetthrglnserproserservalseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnglyiletyrsertrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaproasnleuleuile354045tyrthralaserthrleuglnserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnalaasnilepheproleu859095thrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105<210>9<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>恒定轻链氨基酸序列<400>9argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu151015glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe202530tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln354045serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser505560thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu65707580lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser859095provalthrlysserpheasnargglyglucys100105<210>10<211>192<212>dna<213>人工序列<220><223>聚腺苷化序列<400>10cagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaa60aatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgca120ataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgt180gggaggtttttt192<210>11<211>2468<212>dna<213>人工序列<220><223>ng-350转基因盒核酸序列<400>11gcgatcgccaggcccaccatggactggacctggaggatcctcttcttggtggcagcagcc60acaggagcccactcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggg120gcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccggctactatatgcac180tgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcaaccctgacagt240ggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtcc300atcagcacagcctacatggagctgaacaggctgagatctgacgacacggccgtgtattac360tgtgcgagagatcagcccctaggatattgtactaatggtgtatgctcctactttgactac420tggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttc480cccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtc540aaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggc600gtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtg660accgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagccc720agcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgc780ccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacacc840ctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac900cccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaag960ccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcac1020caggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcc1080cccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacc1140ctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa1200ggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac1260tacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc1320accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag1380gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggaagcgga1440gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctagg1500ctccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccaggttccagatgcgacatc1560cagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcact1620tgtcgggcgagtcagggtatttacagctggttagcctggtatcagcagaaaccagggaaa1680gcccctaacctcctgatctatactgcatccactttacaaagtggggtcccatcaaggttc1740agcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaacctgaagat1800tttgcaacttactattgtcaacaggctaacattttcccgctcactttcggcggagggacc1860aaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgat1920gagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccaga1980gaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagt2040gtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagc2100aaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagc2160tcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaggctagcttgactgactgagat2220acagcgtaccttcagctcacagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccaca2280actagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttattt2340gtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgttt2400caggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggt2460cctgcagg2468<210>12<211>2468<212>dna<213>人工序列<220><223>ng-350a转基因盒核酸序列<400>12gcgatcgccaggcccaccatggactggacctggcgcatcctgttcttggtggcagctgct60acgggagctcattcccaggtgcagctggtgcaatccggcgctgaggtgaagaaacccggg120gcttcagtcaaagtcagctgcaaggctagcggctacacctttactggctattacatgcac180tgggtgaggcaggctccgggacagggtctggaatggatgggatggatcaatccggacagc240ggcgggaccaattacgcacaaaagttccaaggccgcgtgacgatgacccgggacacttcg300atctcaaccgcctacatggagctgaaccgcctgaggtcggatgacaccgctgtgtactac360tgcgctcgcgaccaacccctggggtactgcaccaacggagtgtgttcatacttcgactac420tggggccaaggcacgctggtcactgtgtcatcggcgtccactaagggcccgtcggtcttc480ccactagctccgtgctcgcggtcgacttcggaatcaactgcggcactcggatgccttgtc540aaggactacttcccagaacccgtgaccgtctcgtggaactcaggcgccctgacgagcggt600gtccacactttcccggcggtgctgcagtcatcggggctatacagcctgagcagcgtggtt660actgtgccgtcatcaaacttcgggacccagacttacacttgcaatgtggaccacaagccg720tcaaataccaaagtggacaagactgtggaacgcaaatgttgcgtggaatgccctccgtgc780ccggcccccccagtcgctggcccatccgtgttcctcttccctccgaagccaaaagacact840ctgatgatttcgagaactccggaggtcacttgcgtggtggtcgacgtgtcgcacgaggat900ccagaggtgcagttcaactggtacgtggatggagtggaggtgcacaatgccaagaccaag960ccgcgcgaagaacaattcaactccacctttcgggtcgtgtccgtgctgaccgtggtacac1020caagactggctgaacggaaaggagtacaaatgcaaggtgagcaacaaggggctgccggct1080ccaatcgaaaagaccatctcaaagactaaggggcaacctcgcgagccacaggtgtatacc1140ctgcctccaagcagggaggaaatgaccaaaaaccaggtgagcctgacctgtctggtgaag1200ggcttttaccccagcgacatcgccgtcgagtgggaaagcaacggacaacccgagaacaac1260tacaagaccactccgcccatgctggactccgacgggtcatttttcctgtactcaaagctg1320actgtggacaagtcccggtggcagcaaggtaacgtgttctcctgctcggtgatgcacgaa1380gctttgcacaaccactacactcaaaagtcactttccttgtcaccgggcaaggggtcgggc1440gccactaacttttccttgctcaagcaggcgggcgatgtggaggagaatccgggcccgcgc1500ctcccggcgcaactgctgggcctcctcctcctctggtttcccggctcccgctgtgacatc1560cagatgactcagtcgcccagctccgtgtccgcatcggtgggggacagagtcaccatcacc1620tgcagagcttcacaagggatctattcctggctggcgtggtatcagcagaagcctggaaag1680gcccccaacctcctgatttacaccgcatcgactctccagtcaggcgtgccatcccggttc1740tcagggtccggctccggaaccgacttcactctgactatcagctccctgcaaccagaagat1800ttcgctacctactactgccagcaggcaaacatctttccgctaactttcggcggaggcacg1860aaggtggagatcaagagaaccgtggcggccccttccgtcttcatcttcccaccgtcagac1920gaacaactcaaatccggtaccgcctccgtcgtgtgcctgctcaataacttctatccacgc1980gaggccaaggtccagtggaaagtggataacgccctgcagtccggaaacagccaggagtca2040gtgaccgaacaggattccaaggacagcacttactcgctctcaagcaccctcaccctgtcg2100aaggcggattacgagaagcacaaagtctacgcctgcgaagtgactcatcaaggactctca2160tcaccggtaactaagagcttcaatcgcggagaatgctaggctagcttgactgactgagat2220acagcgtaccttcagctcacagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccaca2280actagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttattt2340gtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgttt2400caggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggt2460cctgcagg2468<210>13<211>34794<212>dna<213>人工序列<220><223>ng-350病毒基因组<400>13tctatctatataatataccttatagatggaatggtgccaatatgtaaatgaggtgatttt60aaaaagtgtggatcgtgtggtgattggctgtggggttaacggctaaaaggggcggtgcga120ccgtgggaaaatgacgttttgtgggggtggagtttttttgcaagttgtcgcgggaaatgt180gacgcataaaaaggcttttttctcacggaactacttagttttcccacggtatttaacagg240aaatgaggtagttttgaccggatgcaagtgaaaattgttgattttcgcgcgaaaactgaa300tgaggaagtgtttttctgaataatgtggtatttatggcagggtggagtatttgttcaggg360ccaggtagactttgacccattacgtggaggtttcgattaccgtgttttttacctgaattt420ccgcgtaccgtgtcaaagtcttctgtttttacgtaggtgtcagctgatcgctagggtatt480tatacctcagggtttgtgtcaagaggccactcttgagtgccagcgagaagagttttctcc540tctgcgccggcagtttaataataaaaaaatgagagatttgcgatttctgcctcaggaaat600aatctctgctgagactggaaatgaaatattggagcttgtggtgcacgccctgatgggaga660cgatccggagccacctgtgcagctttttgagcctcctacgcttcaggaactgtatgattt720agaggtagagggatcggaggattctaatgaggaagctgtaaatggcttttttaccgattc780tatgcttttagctgctaatgaagggttagaattagatccgcctttggacacttttgatac840tccaggggtaattgtggaaagcggtacaggtgtaagaaaattacctgatttgagttccgt900ggactgtgatttgcactgctatgaagacgggtttcctccgagtgatgaggaggaccatga960aaaggagcagtccatgcagactgcagcgggtgagggagtgaaggctgccaatgttggttt1020tcagttggattgcccggagcttcctggacatggctgtaagtcttgtgaatttcacaggaa1080aaatactggagtaaaggaactgttatgttcgctttgttatatgagaacgcactgccactt1140tatttacagtaagtgtgtttaagttaaaatttaaaggaatatgctgtttttcacatgtat1200attgagtgtgagttttgtgcttcttattataggtcctgtgtctgatgctgatgaatcacc1260atctcctgattctactacctcacctcctgagattcaagcacctgttcctgtggacgtgcg1320caagcccattcctgtgaagcttaagcctgggaaacgtccagcagtggaaaaacttgagga1380cttgttacagggtggggacggacctttggacttgagtacacggaaacgtccaagacaata1440agtgttccatatccgtgtttacttaaggtgacgtcaatatttgtgtgacagtgcaatgta1500ataaaaatatgttaactgttcactggtttttattgctttttgggcggggactcaggtata1560taagtagaagcagacctgtgtggttagctcataggagctggctttcatccatggaggttt1620gggccattttggaagaccttaggaagactaggcaactgttagagaacgcttcggacggag1680tctccggtttttggagattctggttcgctagtgaattagctagggtagtttttaggataa1740aacaggactataaacaagaatttgaaaagttgttggtagattgcccaggactttttgaag1800ctcttaatttgggccatcaggttcactttaaagaaaaagttttatcagttttagactttt1860caaccccaggtagaactgctgctgctgtggcttttcttacttttatattagataaatgga1920tcccgcagactcatttcagcaggggatacgttttggatttcatagccacagcattgtgga1980gaacatggaaggttcgcaagatgaggacaatcttaggttactggccagtgcagcctttgg2040gtgtagcgggaatcctgaggcatccaccggtcatgccagcggttctggaggaggaacagc2100aagaggacaacccgagagccggcctggaccctccagtggaggaggcggagtagctgactt2160gtctcctgaactgcaacgggtgcttactggatctacgtccactggacgggataggggcgt2220taagagggagagggcatctagtggtactgatgctagatctgagttggctttaagtttaat2280gagtcgcagacgtcctgaaaccatttggtggcatgaggttcagaaagagggaagggatga2340agtttctgtattgcaggagaaatattcactggaacaggtgaaaacatgttggttggagcc2400tgaggatgattgggaggtggccattaaaaattatgccaagatagctttgaggcctgataa2460acagtataagattactagacggattaatatccggaatgcttgttacatatctggaaatgg2520ggctgaggtggtaatagatactcaagacaaggcagttattagatgctgcatgatggatat2580gtggcctggggtagtcggtatggaagcagtaacttttgtaaatgttaagtttaggggaga2640tggttataatggaatagtgtttatggccaataccaaacttatattgcatggttgtagctt2700ttttggtttcaacaatacctgtgtagatgcctggggacaggttagtgtacggggatgtag2760tttctatgcgtgttggattgccacagctggcagaaccaagagtcaattgtctctgaagaa2820atgcatatttcaaagatgtaacctgggcattctgaatgaaggcgaagcaagggtccgcca2880ctgcgcttctacagatactggatgttttattttgattaagggaaatgccagcgtaaagca2940taacatgatttgcggtgcttccgatgagaggccttatcaaatgctcacttgtgctggtgg3000gcattgtaatatgctggctactgtgcatattgtttcccatcaacgcaaaaaatggcctgt3060ttttgatcacaatgtgatgacgaagtgtaccatgcatgcaggtgggcgtagaggaatgtt3120tatgccttaccagtgtaacatgaatcatgtgaaagtgttgttggaaccagatgccttttc3180cagaatgagcctaacaggaatttttgacatgaacatgcaaatctggaagatcctgaggta3240tgatgatacgagatcgagggtacgcgcatgcgaatgcggaggcaagcatgccaggttcca3300gccggtgtgtgtagatgtgactgaagatctcagaccggatcatttggttattgcccgcac3360tggagcagagttcggatccagtggagaagaaactgactaaggtgagtattgggaaaactt3420tggggtgggattttcagatggacagattgagtaaaaatttgttttttctgtcttgcagct3480gtcatgagtggaaacgcttcttttaaggggggagtcttcagcccttatctgacagggcgt3540ctcccatcctgggcaggagttcgtcagaatgttatgggatctactgtggatggaagaccc3600gtccaacccgccaattcttcaacgctgacctatgctactttaagttcttcacctttggac3660gcagctgcagctgccgccgccgcttctgttgccgctaacactgtgcttggaatgggttac3720tatggaagcatcatggctaattccacttcctctaataacccttctaccctgactcaggac3780aagttacttgtccttttggcccagctggaggctttgacccaacgtctgggtgaactttct3840cagcaggtggtcgagttgcgagtacaaactgagtctgctgtcggcacggcaaagtctaaa3900taaaaaaatcccagaatcaatgaataaataaacaagcttgttgttgatttaaaatcaagt3960gtttttatttcatttttcgcgcacggtatgccctagaccaccgatctctatcattgagaa4020ctcggtggattttttccaggatcctatagaggtgggattgaatgtttagatacatgggca4080ttaggccgtctttggggtggagatagctccattgaagggattcatgctccggggtagtgt4140tgtaaatcacccagtcataacaaggtcgcagtgcatggtgttgcacaatatcttttagaa4200gtaggctgattgccacagataagcccttggtgtaggtgtttacaaaccggttgagctggg4260atgggtgcattcggggtgaaattatgtgcattttggattggatttttaagttggcaatat4320tgccgccaagatcccgtcttgggttcatgttatgaaggaccaccaagacggtgtatccgg4380tacatttaggaaatttatcgtgcagcttggatggaaaagcgtggaaaaatttggagacac4440ccttgtgtcctccaagattttccatgcactcatccatgataatagcaatggggccgtggg4500cagcggcgcgggcaaacacgttccgtgggtctgacacatcatagttatgttcctgagtta4560aatcatcataagccattttaatgaatttggggcggagagtaccagattggggtatgaatg4620ttccttcgggccccggagcatagttcccctcacagatttgcatttcccaagctttcagtt4680ccgagggtggaatcatgtccacctggggggctatgaaaaacaccgtttctggggcggggg4740tgattaattgtgatgatagcaaatttctgagcaattgagatttgccacatccggtggggc4800cataaatgattccgattacgggttgcaggtggtagtttagggaacggcaactgccgtctt4860ctcgaagcaagggggccacctcgttcatcatttcccttacatgcatattttcccgcacca4920aatccattaggaggcgctctcctcctagtgatagaagttcttgtagtgaggaaaagtttt4980tcagcggtttcagaccgtcagccatgggcattttggagagagtttgctgcaaaagttcta5040gtctgttccacagttcagtgatgtgttctatggcatctcgatccagcagacctcctcgtt5100tcgcgggtttggacggctcctggaatagggtatgagacgatgggcgtccagcgctgccag5160ggttcggtccttccagggtctcagtgttcgagtcagggttgtttccgtcacagtgaaggg5220gtgtgcgcctgcttgggcgcttgccagggtgcgcttcagactcatcctgctggtcgaaaa5280cttctgtcgcttggcgccctgtatgtcggccaagtagcagtttaccatgagttcgtagtt5340gagcgcctcggctgcgtggcctttggcgcggagcttacctttggaagttttcttgcatac5400cgggcagtataggcatttcagcgcatacaacttgggcgcaaggaaaacggattctgggga5460gtatgcatctgcgccgcaggaggcgcaaacagtttcacattccaccagccaggttaaatc5520cggttcattggggtcaaaaacaagttttccgccatattttttgatgcgtttcttaccttt5580ggtctccatgagttcgtgtcctcgttgagtgacaaacaggctgtccgtgtccccgtagac5640tgattttacaggcctcttctccagtggagtgcctcggtcttcttcgtacaggaactctga5700ccactctgatacaaaggcgcgcgtccaggccagcacaaaggaggctatgtgggaggggta5760gcgatcgttgtcaaccagggggtccaccttttccaaagtatgcaaacacatgtcaccctc5820ttcaacatccaggaatgtgattggcttgtaggtgtatttcacgtgacctggggtccccgc5880tgggggggtataaaagggggcggttctttgctcttcctcactgtcttccggatcgctgtc5940caggaacgtcagctgttggggtaggtattccctctcgaaggcgggcatgacctctgcact6000caggttgtcagtttctaagaacgaggaggatttgatattgacagtgccggttgagatgcc6060tttcatgaggttttcgtccatctggtcagaaaacacaatttttttattgtcaagtttggt6120ggcaaatgatccatacagggcgttggataaaagtttggcaatggatcgcatggtttggtt6180cttttccttgtccgcgcgctctttggcggcgatgttgagttggacatactcgcgtgccag6240gcacttccattcggggaagatagttgttaattcatctggcacgattctcacttgccaccc6300tcgattatgcaaggtaattaaatccacactggtggccacctcgcctcgaaggggttcatt6360ggtccaacagagcctacctcctttcctagaacagaaagggggaagtgggtctagcataag6420ttcatcgggagggtctgcatccatggtaaagattcccggaagtaaatccttatcaaaata6480gctgatgggagtggggtcatctaaggccatttgccattctcgagctgccagtgcgcgctc6540atatgggttaaggggactgccccatggcatgggatgggtgagtgcagaggcatacatgcc6600acagatgtcatagacgtagatgggatcctcaaagatgcctatgtaggttggatagcatcg6660cccccctctgatacttgctcgcacatagtcatatagttcatgtgatggcgctagcagccc6720cggacccaagttggtgcgattgggtttttctgttctgtagacgatctggcgaaagatggc6780gtgagaattggaagagatggtgggtctttgaaaaatgttgaaatgggcatgaggtagacc6840tacagagtctctgacaaagtgggcataagattcttgaagcttggttaccagttcggcggt6900gacaagtacgtctagggcgcagtagtcaagtgtttcttgaatgatgtcataacctggttg6960gtttttcttttcccacagttcgcggttgagaaggtattcttcgcgatccttccagtactc7020ttctagcggaaacccgtctttgtctgcacggtaagatcctagcatgtagaactgattaac7080tgccttgtaagggcagcagcccttctctacgggtagagagtatgcttgagcagcttttcg7140tagcgaagcgtgagtaagggcaaaggtgtctctgaccatgactttgaggaattggtattt7200gaagtcgatgtcgtcacaggctccctgttcccagagttggaagtctacccgtttcttgta7260ggcggggttgggcaaagcgaaagtaacatcattgaagagaatcttgccggccctgggcat7320gaaattgcgagtgatgcgaaaaggctgtggtacttccgctcggttattgataacctgggc7380agctaggacgatctcgtcgaaaccgttgatgttgtgtcctacgatgtataattctatgaa7440acgcggcgtgcctctgacgtgaggtagcttactgagctcatcaaaggttaggtctgtggg7500gtcagataaggcgtagtgttcgagagcccattcgtgcaggtgaggattcgctttaaggaa7560ggaggaccagaggtccactgccagtgctgtttgtaactggtcccggtactgacgaaaatg7620ccgtccgactgccattttttctggggtgacgcaatagaaggtttgggggtcctgccgcca7680gcgatcccacttgagttttatggcgaggtcataggcgatgttgacgagccgctggtctcc7740agagagtttcatgaccagcatgaaggggattagctgcttgccaaaggaccccatccaggt7800gtaggtttccacatcgtaggtgagaaagagcctttctgtgcgaggatgagagccaatcgg7860gaagaactggatctcctgccaccagttggaggaatggctgttgatgtgatggaagtagaa7920ctccctgcgacgcgccgagcattcatgcttgtgcttgtacagacggccgcagtagtcgca7980gcgttgcacgggttgtatctcgtgaatgagttgtacctggcttcccttgacgagaaattt8040cagtgggaagccgaggcctggcgattgtatctcgtgctttactatgttgtctgcatcggc8100ctgttcatcttctgtctcgatggtggtcatgctgacgagccctcgcgggaggcaagtcca8160gacctcggcgcggcaggggcggagctcgaggacgagagcgcgcaggctggagctgtccag8220ggtcctgagacgctgcggactcaggttagtaggcagtgtcaggagattaacttgcatgat8280cttttggagggcgtgcgggaggttcagatagtacttgatctcaacgggtccgttggtgga8340gatgtcgatggcttgcagggttccgtgtcccttgggcgctaccaccgtgcccttgttttt8400cattttggacggcggtggctctgttgcttcttgcatgtttagaagcggtgtcgagggcgc8460gcaccgggcggcaggggcggctcgggacccggcggcatggctggcagtggtacgtcggcg8520ccgcgcgcgggtaggttctggtactgcgccctgagaagactcgcatgcgcgacgacgcgg8580cggttgacatcctggatctgacgcctctgggtgaaagctaccggccccgtgagcttgaac8640ctgaaagagagttcaacagaatcaatctcggtatcgttgacggcggcttgcctaaggatt8700tcttgcacgtcaccagagttgtcctggtaggcgatctccgccatgaactgctcgatctct8760tcctcttgaagatctccgcggcccgctctctcgacggtggccgcgaggtcgttggagatg8820cgcccaatgagttgagagaatgcattcatgcccgcctcgttccagacgcggctgtagacc8880acggcccccacgggatctctcgcgcgcatgaccacctgggcgaggttgagctccacgtgg8940cgggtgaagaccgcatagttgcataggcgctggaaaaggtagttgagtgtggtggcgatg9000tgctcggtgacgaagaaatacatgatccatcgtctcagcggcatctcgctgacatcgccc9060agagcttccaagcgctccatggcctcgtagaagtccacggcaaaattaaaaaactgggag9120tttcgcgcggacacggtcaactcctcttccagaagacggataagttcggcgatggtggtg9180cgcacctcgcgctcgaaagcccctgggatttcttcctcaatctcttcttcttccactaac9240atctcttcctcttcaggtggggctgcaggaggagggggaacgcggcgacgccggcggcgc9300acgggcagacggtcgatgaatctttcaatgacctctccgcggcggcggcgcatggtttca9360gtgacggcgcggccgttctcgcgcggtcgcagagtaaaaacaccgccgcgcatctcctta9420aagtggtgactgggaggttctccgtttgggagggagagggcgctgattatacattttatt9480aattggcccgtagggactgcacgcagagatctgatcgtgtcaagatccacgggatctgaa9540aacctttcgacgaaagcgtctaaccagtcacagtcacaaggtaggctgagtacggcttct9600tgtgggcgggggtggttatgtgttcggtctgggtcttctgtttcttcttcatctcgggaa9660ggtgagacgatgctgctggtgatgaaattaaagtaggcagttctaagacggcggatggtg9720gcgaggagcaccaggtctttgggtccggcttgctggatacgcaggcgattggccattccc9780caagcattatcctgacatctagcaagatctttgtagtagtcttgcatgagccgttctacg9840ggcacttcttcctcacccgttctgccatgcatacgtgtgagtccaaatccgcgcattggt9900tgtaccagtgccaagtcagctacgactctttcggcgaggatggcttgctgtacttgggta9960agggtggcttgaaagtcatcaaaatccacaaagcggtggtaagctcctgtattaatggtg10020taagcacagttggccatgactgaccagttaactgtctggtgaccagggcgcacgagctcg10080gtgtatttaaggcgcgaataggcgcgggtgtcaaagatgtaatcgttgcaggtgcgcacc10140agatactggtaccctataagaaaatgcggcggtggttggcggtagagaggccatcgttct10200gtagctggagcgccaggggcgaggtcttccaacataaggcggtgatagccgtagatgtac10260ctggacatccaggtgattcctgcggcggtagtagaagcccgaggaaactcgcgtacgcgg10320ttccaaatgttgcgtagcggcatgaagtagttcattgtaggcacggtttgaccagtgagg10380cgcgcgcagtcattgatgctctatagacacggagaaaatgaaagcgttcagcgactcgac10440tccgtagcctggaggaacgtgaacgggttgggtcgcggtgtaccccggttcgagacttgt10500actcgagccggccggagccgcggctaacgtggtattggcactcccgtctcgacccagcct10560acaaaaatccaggatacggaatcgagtcgttttgctggtttccgaatggcagggaagtga10620gtcctattttttttttttgccgctcagatgcatcccgtgctgcgacagatgcgcccccaa10680caacagcccccctcgcagcagcagcagcagcaatcacaaaaggctgtccctgcaactact10740gcaactgccgccgtgagcggtgcgggacagcccgcctatgatctggacttggaagagggc10800gaaggactggcacgtctaggtgcgccttcacccgagcggcatccgcgagttcaactgaaa10860aaagattctcgcgaggcgtatgtgccccaacagaacctatttagagacagaagcggcgag10920gagccggaggagatgcgagcttcccgctttaacgcgggtcgtgagctgcgtcacggtttg10980gaccgaagacgagtgttgcgggacgaggatttcgaagttgatgaaatgacagggatcagt11040cctgccagggcacacgtggctgcagccaaccttgtatcggcttacgagcagacagtaaag11100gaagagcgtaacttccaaaagtcttttaataatcatgtgcgaaccctgattgcccgcgaa11160gaagttacccttggtttgatgcatttgtgggatttgatggaagctatcattcagaaccct11220actagcaaacctctgaccgcccagctgtttctggtggtgcaacacagcagagacaatgag11280gctttcagagaggcgctgctgaacatcaccgaacccgaggggagatggttgtatgatctt11340atcaacattctacagagtatcatagtgcaggagcggagcctgggcctggccgagaaggtg11400gctgccatcaattactcggttttgagcttgggaaaatattacgctcgcaaaatctacaag11460actccatacgttcccatagacaaggaggtgaagatagatgggttctacatgcgcatgacg11520ctcaaggtcttgaccctgagcgatgatcttggggtgtatcgcaatgacagaatgcatcgc11580gcggttagcgccagcaggaggcgcgagttaagcgacagggaactgatgcacagtttgcaa11640agagctctgactggagctggaaccgagggtgagaattacttcgacatgggagctgacttg11700cagtggcagcctagtcgcagggctctgagcgccgcgacggcaggatgtgagcttccttac11760atagaagaggcggatgaaggcgaggaggaagagggcgagtacttggaagactgatggcac11820aacccgtgttttttgctagatggaacagcaagcaccggatcccgcaatgcgggcggcgct11880gcagagccagccgtccggcattaactcctcggacgattggacccaggccatgcaacgtat11940catggcgttgacgactcgcaaccccgaagcctttagacagcaaccccaggccaaccgtct12000atcggccatcatggaagctgtagtgccttcccgctctaatcccactcatgagaaggtcct12060ggccatcgtgaacgcgttggtggagaacaaagctattcgtccagatgaggccggactggt12120atacaacgctctcttagaacgcgtggctcgctacaacagtagcaatgtgcaaaccaattt12180ggaccgtatgataacagatgtacgcgaagccgtgtctcagcgcgaaaggttccagcgtga12240tgccaacctgggttcgctggtggcgttaaatgctttcttgagtactcagcctgctaatgt12300gccgcgtggtcaacaggattatactaactttttaagtgctttgagactgatggtatcaga12360agtacctcagagcgaagtgtatcagtccggtcctgattacttctttcagactagcagaca12420gggcttgcagacggtaaatctgagccaagcttttaaaaaccttaaaggtttgtggggagt12480gcatgccccggtaggagaaagagcaaccgtgtctagcttgttaactccgaactcccgcct12540attattactgttggtagctcctttcaccgacagcggtagcatcgaccgtaattcctattt12600gggttacctactaaacctgtatcgcgaagccatagggcaaagtcaggtggacgagcagac12660ctatcaagaaattacccaagtcagtcgcgctttgggacaggaagacactggcagtttgga12720agccactctgaacttcttgcttaccaatcggtctcaaaagatccctcctcaatatgctct12780tactgcggaggaggagaggatccttagatatgtgcagcagagcgtgggattgtttctgat12840gcaagagggggcaactccgactgcagcactggacatgacagcgcgaaatatggagcccag12900catgtatgccagtaaccgacctttcattaacaaactgctggactacttgcacagagctgc12960cgctatgaactctgattatttcaccaatgccatcttaaacccgcactggctgcccccacc13020tggtttctacacgggcgaatatgacatgcccgaccctaatgacggatttctgtgggacga13080cgtggacagcgatgttttttcacctctttctgatcatcgcacgtggaaaaaggaaggcgg13140cgatagaatgcattcttctgcatcgctgtccggggtcatgggtgctaccgcggctgagcc13200cgagtctgcaagtccttttcctagtctacccttttctctacacagtgtacgtagcagcga13260agtgggtagaataagtcgcccgagtttaatgggcgaagaggagtatctaaacgattcctt13320gctcagaccggcaagagaaaaaaatttcccaaacaatggaatagaaagtttggtggataa13380aatgagtagatggaagacttatgctcaggatcacagagacgagcctgggatcatggggat13440tacaagtagagcgagccgtagacgccagcgccatgacagacagaggggtcttgtgtggga13500cgatgaggattcggccgatgatagcagcgtgctggacttgggtgggagaggaaggggcaa13560cccgtttgctcatttgcgccctcgcttgggtggtatgttgtaaaaaaaaataaaaaaaaa13620actcaccaaggccatggcgacgagcgtacgttcgttcttctttattatctgtgtctagta13680taatgaggcgagtcgtgctaggcggagcggtggtgtatccggagggtcctcctccttcgt13740acgagagcgtgatgcagcagcagcaggcgacggcggtgatgcaatccccactggaggctc13800cctttgtgcctccgcgatacctggcacctacggagggcagaaacagcattcgttattcgg13860aactggcacctcagtacgataccaccaggttgtatctggtggacaacaagtcggcggaca13920ttgcttctctgaactatcagaatgaccacagcaacttcttgaccacggtggtgcaaaaca13980atgactttacccctacggaagccagcacccagaccattaactttgatgaacgatcgcggt14040ggggcggtcagctaaagaccatcatgcatactaacatgccaaacgtgaacgagtatatgt14100ttagtaacaagttcaaagcgcgtgtgatggtgtccagaaaacctcccgacggtgctgcag14160ttggggatacttatgatcacaagcaggatattttgaaatatgagtggttcgagtttactt14220tgccagaaggcaacttttcagttactatgactattgatttgatgaacaatgccatcatag14280ataattacttgaaagtgggtagacagaatggagtgcttgaaagtgacattggtgttaagt14340tcgacaccaggaacttcaagctgggatgggatcccgaaaccaagttgatcatgcctggag14400tgtatacgtatgaagccttccatcctgacattgtcttactgcctggctgcggagtggatt14460ttaccgagagtcgtttgagcaaccttcttggtatcagaaaaaaacagccatttcaagagg14520gttttaagattttgtatgaagatttagaaggtggtaatattccggccctcttggatgtag14580atgcctatgagaacagtaagaaagaacaaaaagccaaaatagaagctgctacagctgctg14640cagaagctaaggcaaacatagttgccagcgactctacaagggttgctaacgctggagagg14700tcagaggagacaattttgcgccaacacctgttccgactgcagaatcattattggccgatg14760tgtctgaaggaacggacgtgaaactcactattcaacctgtagaaaaagatagtaagaata14820gaagctataatgtgttggaagacaaaatcaacacagcctatcgcagttggtatctttcgt14880acaattatggcgatcccgaaaaaggagtgcgttcctggacattgctcaccacctcagatg14940tcacctgcggagcagagcaggtctactggtcgcttccagacatgatgaaggatcctgtca15000ctttccgctccactagacaagtcagtaactaccctgtggtgggtgcagagcttatgcccg15060tcttctcaaagagcttctacaacgaacaagctgtgtactcccagcagctccgccagtcca15120cctcgcttacgcacgtcttcaaccgctttcctgagaaccagattttaatccgtccgccgg15180cgcccaccattaccaccgtcagtgaaaacgttcctgctctcacagatcacgggaccctgc15240cgttgcgcagcagtatccggggagtccaacgtgtgaccgttactgacgccagacgccgca15300cctgtccctacgtgtacaaggcactgggcatagtcgcaccgcgcgtcctttcaagccgca15360ctttctaaaaaaaaaaaaaatgtccattcttatctcgcccagtaataacaccggttgggg15420tctgcgcgctccaagcaagatgtacggaggcgcacgcaaacgttctacccaacatcctgt15480ccgtgttcgcggacattttcgcgctccatggggcgccctcaagggccgcactcgcgttcg15540aaccaccgtcgatgatgtaatcgatcaggtggttgccgacgcccgtaattatactcctac15600tgcgcctacatctactgtggatgcagttattgacagtgtagtggctgacgctcgcaacta15660tgctcgacgtaagagccggcgaaggcgcattgccagacgccaccgagctaccactgccat15720gcgagccgcaagagctctgctacgaagagctagacgcgtggggcgaagagccatgcttag15780ggcggccagacgtgcagcttcgggcgccagcgccggcaggtcccgcaggcaagcagccgc15840tgtcgcagcggcgactattgccgacatggcccaatcgcgaagaggcaatgtatactgggt15900gcgtgacgctgccaccggtcaacgtgtacccgtgcgcacccgtccccctcgcacttagaa15960gatactgagcagtctccgatgttgtgtcccagcggcgaggatgtccaagcgcaaatacaa16020ggaagaaatgctgcaggttatcgcacctgaagtctacggccaaccgttgaaggatgaaaa16080aaaaccccgcaaaatcaagcgggttaaaaaggacaaaaaagaagaggaagatggcgatga16140tgggctggcggagtttgtgcgcgagtttgccccacggcgacgcgtgcaatggcgtgggcg16200caaagttcgacatgtgttgagacctggaacttcggtggtctttacacccggcgagcgttc16260aagcgctacttttaagcgttcctatgatgaggtgtacggggatgatgatattcttgagca16320ggcggctgaccgattaggcgagtttgcttatggcaagcgtagtagaataacttccaagga16380tgagacagtgtcgatacccttggatcatggaaatcccacccctagtcttaaaccggtcac16440tttgcagcaagtgttacccgtaactccgcgaacaggtgttaaacgcgaaggtgaagattt16500gtatcccactatgcaactgatggtacccaaacgccagaagttggaggacgttttggagaa16560agtaaaagtggatccagatattcaacctgaggttaaagtgagacccattaagcaggtagc16620gcctggtctgggggtacaaactgtagacattaagattcccactgaaagtatggaagtgca16680aactgaacccgcaaagcctactgccacctccactgaagtgcaaacggatccatggatgcc16740catgcctattacaactgacgccgccggtcccactcgaagatcccgacgaaagtacggtcc16800agcaagtctgttgatgcccaattatgttgtacacccatctattattcctactcctggtta16860ccgaggcactcgctactatcgcagccgaaacagtacctcccgccgtcgccgcaagacacc16920tgcaaatcgcagtcgtcgccgtagacgcacaagcaaaccgactcccggcgccctggtgcg16980gcaagtgtaccgcaatggtagtgcggaacctttgacactgccgcgtgcgcgttaccatcc17040gagtatcatcacttaatcaatgttgccgctgcctccttgcagatatggccctcacttgtc17100gccttcgcgttcccatcactggttaccgaggaagaaactcgcgccgtagaagagggatgt17160tgggacgcggaatgcgacgctacaggcgacggcgtgctatccgcaagcaattgcggggtg17220gttttttaccagccttaattccaattatcgctgctgcaattggcgcgataccaggcatag17280cttccgtggcggttcaggcctcgcaacgacattgacattggaaaaaaacgtataaataaa17340aaaaaaaaaatacaatggactctgacactcctggtcctgtgactatgttttcttagagat17400ggaagacatcaatttttcatccttggctccgcgacacggcacgaagccgtacatgggcac17460ctggagcgacatcggcacgagccaactgaacgggggcgccttcaattggagcagtatctg17520gagcgggcttaaaaattttggctcaaccataaaaacatacgggaacaaagcttggaacag17580cagtacaggacaggcgcttagaaataaacttaaagaccagaacttccaacaaaaagtagt17640cgatgggatagcttccggcatcaatggagtggtagatttggctaaccaggctgtgcagaa17700aaagataaacagtcgtttggacccgccgccagcaaccccaggtgaaatgcaagtggagga17760agaaattcctccgccagaaaaacgaggcgacaagcgtccgcgtcccgatttggaagagac17820gctggtgacgcgcgtagatgaaccgccttcttatgaggaagcaacgaagcttggaatgcc17880caccactagaccgatagccccaatggccaccggggtgatgaaaccttctcagttgcatcg17940acccgtcaccttggatttgccccctccccctgctgctactgctgtacccgcttctaagcc18000tgtcgctgccccgaaaccagtcgccgtagccaggtcacgtcccgggggcgctcctcgtcc18060aaatgcgcactggcaaaatactctgaacagcatcgtgggtctaggcgtgcaaagtgtaaa18120acgccgtcgctgcttttaattaaatatggagtagcgcttaacttgcctatctgtgtatat18180gtgtcattacacgccgtcacagcagcagaggaaaaaaggaagaggtcgtgcgtcgacgct18240gagttactttcaagatggccaccccatcgatgctgccccaatgggcatacatgcacatcg18300ccggacaggatgcttcggagtacctgagtccgggtctggtgcagttcgcccgcgccacag18360acacctacttcaatctgggaaataagtttagaaatcccaccgtagcgccgacccacgatg18420tgaccaccgaccgtagccagcggctcatgttgcgcttcgtgcccgttgaccgggaggaca18480atacatactcttacaaagtgcggtacaccctggccgtgggcgacaacagagtgctggata18540tggccagcacgttctttgacattaggggtgtgttggacagaggtcccagtttcaaaccct18600attctggtacggcttacaactccctggctcctaaaggcgctccaaatacatctcagtgga18660ttgcagaaggtgtaaaaaatacaactggtgaggaacacgtaacagaagaggaaaccaata18720ctactacttacacttttggcaatgctcctgtaaaagctgaagctgaaattacaaaagaag18780gactcccagtaggtttggaagtttcagatgaagaaagtaaaccgatttatgctgataaaa18840catatcagccagaacctcagctgggagatgaaacttggactgaccttgatggaaaaaccg18900aaaagtatggaggcagggctctcaaacccgatactaagatgaaaccatgctacgggtcct18960ttgccaaacctactaatgtgaaaggcggtcaggcaaaacaaaaaacaacggagcagccaa19020atcagaaagtcgaatatgatatcgacatggagttttttgatgcggcatcgcagaaaacaa19080acttaagtcctaaaattgtcatgtatgcagaaaatgtaaatttggaaactccagacactc19140atgtagtgtacaaacctggaacagaagacacaagttccgaagctaatttgggacaacaat19200ctatgcccaacagacccaactacattggcttcagagataactttattggacttatgtact19260ataacagtactggtaacatgggggtgctggctggtcaagcgtctcagttaaatgcagtgg19320ttgacttgcaggacagaaacacagaactttcttaccaactcttgcttgactctctgggcg19380acagaaccagatactttagcatgtggaatcaggctgtggacagttatgatcctgatgtac19440gtgttattgaaaatcatggtgtggaagatgaacttcccaactactgttttccactggacg19500gcataggtgttccaacaaccagttacaaatcaatagttccaaatggagacaatgcgccta19560attggaaggaacctgaagtaaatggaacaagtgagatcggacagggtaatttgtttgcca19620tggaaattaaccttcaagccaatctatggcgaagtttcctttattccaatgtggctctat19680atctcccagactcgtacaaatacaccccgtccaatgtcactcttccagaaaacaaaaaca19740cctacgactacatgaacgggcgggtggtgccgccatctctagtagacacctatgtgaaca19800ttggtgccaggtggtctctggatgccatggacaatgtcaacccattcaaccaccaccgta19860acgctggcttgcgttaccgatccatgcttctgggtaacggacgttatgtgcctttccaca19920tacaagtgcctcaaaaattcttcgctgttaaaaacctgctgcttctcccaggctcctaca19980cttatgagtggaactttaggaaggatgtgaacatggttctacagagttccctcggtaacg20040acctgcgggtagatggcgccagcatcagtttcacgagcatcaacctctatgctacttttt20100tccccatggctcacaacaccgcttccacccttgaagccatgctgcggaatgacaccaatg20160atcagtcattcaacgactacctatctgcagctaacatgctctaccccattcctgccaatg20220caaccaatattcccatttccattccttctcgcaactgggcggctttcagaggctggtcat20280ttaccagactgaaaaccaaagaaactccctctttggggtctggatttgacccctactttg20340tctattctggttctattccctacctggatggtaccttctacctgaaccacacttttaaga20400aggtttccatcatgtttgactcttcagtgagctggcctggaaatgacaggttactatctc20460ctaacgaatttgaaataaagcgcactgtggatggcgaaggctacaacgtagcccaatgca20520acatgaccaaagactggttcttggtacagatgctcgccaactacaacatcggctatcagg20580gcttctacattccagaaggatacaaagatcgcatgtattcatttttcagaaacttccagc20640ccatgagcaggcaggtggttgatgaggtcaattacaaagacttcaaggccgtcgccatac20700cctaccaacacaacaactctggctttgtgggttacatggctccgaccatgcgccaaggtc20760aaccctatcccgctaactatccctatccactcattggaacaactgccgtaaatagtgtta20820cgcagaaaaagttcttgtgtgacagaaccatgtggcgcataccgttctcgagcaacttca20880tgtctatgggggcccttacagacttgggacagaatatgctctatgccaactcagctcatg20940ctctggacatgacctttgaggtggatcccatggatgagcccaccctgctttatcttctct21000tcgaagttttcgacgtggtcagagtgcatcagccacaccgcggcatcatcgaggcagtct21060acctgcgtacaccgttctcggccggtaacgctaccacgtaagaagcttcttgcttcttgc21120aaatagcagctgcaaccatggcctgcggatcccaaaacggctccagcgagcaagagctca21180gagccattgtccaagacctgggttgcggaccctattttttgggaacctacgataagcgct21240tcccggggttcatggcccccgataagctcgcctgtgccattgtaaatacggccggacgtg21300agacggggggagagcactggttggctttcggttggaacccacgttctaacacctgctacc21360tttttgatccttttggattctcggatgatcgtctcaaacagatttaccagtttgaatatg21420agggtctcctgcgccgcagcgctcttgctaccaaggaccgctgtattacgctggaaaaat21480ctacccagaccgtgcagggtccccgttctgccgcctgcggacttttctgctgcatgttcc21540ttcacgcctttgtgcactggcctgaccgtcccatggacggaaaccccaccatgaaattgc21600taactggagtgccaaacaacatgcttcattctcctaaagtccagcccaccctgtgtgaca21660atcaaaaagcactctaccattttcttaatacccattcgccttattttcgctcccatcgta21720cacacatcgaaagggccactgcgttcgaccgtatggatgttcaataatgactcatgtaaa21780caacgtgttcaataaacatcactttatttttttacatgtatcaaggctctgcattactta21840tttatttacaagtcgaatgggttctgacgagaatcagaatgacccgcaggcagtgatacg21900ttgcggaactgatacttgggttgccacttgaattcgggaatcaccaacttgggaaccggt21960atatcgggcaggatgtcactccacagctttctggtcagctgcaaagctccaagcaggtca22020ggagccgaaatcttgaaatcacaattaggaccagtgctttgagcgcgagagttgcggtac22080accggattgcagcactgaaacaccatcagcgacggatgtctcacgcttgccagcacggtg22140ggatctgcaatcatgcccacatccagatcttcagcattggcaatgctgaacggggtcatc22200ttgcaggtctgcctacccatggcgggcacccaattaggcttgtggttgcaatcgcagtgc22260agggggatcagtatcatcttggcctgatcctgtctgattcctggatacacggctctcatg22320aaagcatcatattgcttgaaagcctgctgggctttactaccctcggtataaaacatcccg22380caggacctgctcgaaaactggttagctgcacagccggcatcattcacacagcagcgggcg22440tcattgttagctatttgcaccacacttctgccccagcggttttgggtgattttggttcgc22500tcgggattctcctttaaggctcgttgtccgttctcgctggccacatccatctcgataatc22560tgctccttctgaatcataatattgccatgcaggcacttcagcttgccctcataatcattg22620cagccatgaggccacaacgcacagcctgtacattcccaattatggtgggcgatctgagaa22680aaagaatgtatcattccctgcagaaatcttcccatcatcgtgctcagtgtcttgtgacta22740gtgaaagttaactggatgcctcggtgctcctcgtttacgtactggtgacagatgcgcttg22800tattgttcgtgttgctcaggcattagtttaaaagaggttctaagttcgttatccagcctg22860tacttctccatcagcagacacatcacttccatgcctttctcccaagcagacaccaggggc22920aagctaatcggattcttaacagtgcaggcagcagctcctttagccagagggtcatcttta22980gcgatcttctcaatgcttcttttgccatccttctcaacgatgcgcacgggcgggtagctg23040aaacccactgctacaagttgcgcctcttctctttcttcttcgctgtcttgactgatgtct23100tgcatggggatatgtttggtcttccttggcttctttttggggggtatcggaggaggagga23160ctgtcgctccgttccggagacagggaggattgtgacgtttcgctcaccattaccaactga23220ctgtcggtagaagaacctgaccccacacggcgacaggtgtttctcttcgggggcagaggt23280ggaggcgattgcgaagggctgcggtccgacctggaaggcggatgactggcagaacccctt23340ccgcgttcgggggtgtgctccctgtggcggtcgcttaactgatttccttcgcggctggcc23400attgtgttctcctaggcagagaaacaacagacatggaaactcagccattgctgtcaacat23460cgccacgagtgccatcacatctcgtcctcagcgacgaggaaaaggagcagagcttaagca23520ttccaccgcccagtcctgccaccacctctaccctagaagataaggaggtcgacgcatctc23580atgacatgcagaataaaaaagcgaaagagtctgagacagacatcgagcaagacccgggct23640atgtgacaccggtggaacacgaggaagagttgaaacgctttctagagagagaggatgaaa23700actgcccaaaacaacgagcagataactatcaccaagatgctggaaatagggatcagaaca23760ccgactacctcatagggcttgacggggaagacgcgctccttaaacatctagcaagacagt23820cgctcatagtcaaggatgcattattggacagaactgaagtgcccatcagtgtggaagagc23880tcagccgcgcctacgagcttaacctcttttcacctcgtactccccccaaacgtcagccaa23940acggcacctgcgagccaaatcctcgcttaaacttttatccagcttttgctgtgccagaag24000tactggctacctatcacatcttttttaaaaatcaaaaaattccagtctcctgccgcgcta24060atcgcacccgcgccgatgccctactcaatctgggacctggttcacgcttacctgatatag24120cttccttggaagaggttccaaagatcttcgagggtctgggcaataatgagactcgggccg24180caaatgctctgcaaaagggagaaaatggcatggatgagcatcacagcgttctggtggaat24240tggaaggcgataatgccagactcgcagtactcaagcgaagcatcgaggtcacacacttcg24300catatcccgctgtcaacctgccccctaaagtcatgacggcggtcatggaccagttactca24360ttaagcgcgcaagtcccctttcagaagacatgcatgacccagatgcctgtgatgagggta24420aaccagtggtcagtgatgagcagctaacccgatggctgggcaccgactctcccagggatt24480tggaagagcgtcgcaagcttatgatggccgtggtgctggttaccgtagaactagagtgtc24540tccgacgtttctttaccgattcagaaaccttgcgcaaactcgaagagaatctgcactaca24600cttttagacacggctttgtgcggcaggcatgcaagatatctaacgtggaactcaccaacc24660tggtttcctacatgggtattctgcatgagaatcgcctaggacaaagcgtgctgcacagca24720ccctgaagggggaagcccgccgtgattacatccgcgattgtgtctatctgtacctgtgcc24780acacgtggcaaaccggcatgggtgtatggcagcaatgtttagaagaacagaacttgaaag24840agcttgacaagctcttacagaaatctcttaaggttctgtggacagggttcgacgagcgca24900ccgtcgcttccgacctggcagacctcatcttcccagagcgtctcagggttactttgcgaa24960acggattgcctgactttatgagccagagcatgcttaacaattttcgctctttcatcctgg25020aacgctccggtatcctgcccgccacctgctgcgcactgccctccgactttgtgcctctca25080cctaccgcgagtgccccccgccgctatggagtcactgctacctgttccgtctggccaact25140atctctcctaccactcggatgtgatcgaggatgtgagcggagacggcttgctggagtgtc25200actgccgctgcaatctgtgcacgccccaccggtccctagcttgcaacccccagttgatga25260gcgaaacccagataataggcacctttgaattgcaaggccccagcagccaaggcgatgggt25320cttctcctgggcaaagtttaaaactgaccccgggactgtggacctccgcctacttgcgca25380agtttgctccggaagattaccacccctatgaaatcaagttctatgaggaccaatcacagc25440ctccaaaggccgaactttcggcctgcgtcatcacccagggggcaattctggcccaattgc25500aagccatccaaaaatcccgccaagaatttctactgaaaaagggtaagggggtctaccttg25560acccccagaccggcgaggaactcaacacaaggttccctcaggatgtcccaacgacgagaa25620aacaagaagttgaaggtgcagccgccgcccccagaagatatggaggaagattgggacagt25680caggcagaggaggcggaggaggacagtctggaggacagtctggaggaagacagtttggag25740gaggaaaacgaggaggcagaggaggtggaagaagtaaccgccgacaaacagttatcctcg25800gctgcggagacaagcaacagcgctaccatctccgctccgagtcgaggaacccggcggcgt25860cccagcagtagatgggacgagaccggacgcttcccgaacccaaccagcgcttccaagacc25920ggtaagaaggatcggcagggatacaagtcctggcgggggcataagaatgccatcatctcc25980tgcttgcatgagtgcgggggcaacatatccttcacgcggcgctacttgctattccaccat26040ggggtgaactttccgcgcaatgttttgcattactaccgtcacctccacagcccctactat26100agccagcaaatcccggcagtctcgacagataaagacagcggcggcgacctccaacagaaa26160accagcagcggcagttagaaaatacacaacaagtgcagcaacaggaggattaaagattac26220agccaacgagccagcgcaaacccgagagttaagaaatcggatctttccaaccctgtatgc26280catcttccagcagagtcggggtcaagagcaggaactgaaaataaaaaaccgatctctgcg26340ttcgctcaccagaagttgtttgtatcacaagagcgaagatcaacttcagcgcactctcga26400ggacgccgaggctctcttcaacaagtactgcgcgctgactcttaaagagtaggcagcgac26460cgcgcttattcaaaaaaggcgggaattacatcatcctcgacatgagtaaagaaattccca26520cgccttacatgtggagttatcaaccccaaatgggattggcggcaggcgcctcccaggact26580actccacccgcatgaattggctcagcgccgggccttctatgatttctcgagttaatgata26640tacgcgcctaccgaaaccaaatacttttggaacagtcagctcttaccaccacgccccgcc26700aacaccttaatcccagaaattggcccgccgccctagtgtaccaggaaagtcccgctccca26760ccactgtattacttcctcgagacgcccaggccgaagtccaaatgactaatgcaggtgcgc26820agttagctggcggctccaccctatgtcgtcacaggcctcggcataatataaaacgcctga26880tgatcagaggccgaggtatccagctcaacgacgagtcggtgagctctccgcttggtctac26940gaccagacggaatctttcagattgccggctgcgggagatcttccttcacccctcgtcagg27000ctgttctgactttggaaagttcgtcttcgcaaccccgctcgggcggaatcgggaccgttc27060aatttgtggaggagtttactccctctgtctacttcaaccccttctccggatctcctgggc27120attacccggacgagttcataccgaacttcgacgcgattagcgagtcagtggacggctacg27180attgatgtctggtgacgcggctgagctatctcggctgcgacatctagaccactgccgccg27240ctttcgctgctttgcccgggaactcattgagttcatctacttcgaactccccaaggatca27300ccctcaaggtccggcccacggagtgcggatttctatcgaaggcaaaatagactctcgcct27360gcaacgaattttctcccagcggcccgtgctgatcgagcgagaccagggaaacaccacggt27420ttccatctactgcatttgtaatcaccccggattgcatgaaagcctttgctgtcttatgtg27480tactgagtttaataaaaactgaattaagactctcctacggactgccgcttcttcaacccg27540gattttacaaccagaagaacgaaacttttcctgtcgtccaggactctgttaacttcacct27600ttcctactcacaaactagaagctcaacgactacaccgcttttccagaagcattttcccta27660ctaatactactttcaaaaccggaggtgagctccaaggtcttcctacagaaaacccttggg27720tggaagcgggccttgtagtgctaggaattcttgcgggtgggcttgtgattattctttgct27780acctatacacaccttgcttcactttcttagtggtgttgtggtattggtttaaaaaatggg27840gcccatactagtcttgcttgttttactttcgcttttggaaccgggttctgccaattacga27900tccatgtctagacttcgacccagaaaactgcacacttacttttgcacccgacacaagccg27960catctgtggagttcatcgcctctcttacgaacttggcccccaacgacaaaaatttacctg28020catggtgggaatcaaccccatagttatcacccagcaaagtggagatactaagggttgcat28080tcactgctcctgcgattccatcgagtgcacctacaccctgctgaagaccctatgcggcct28140aagagacctgctaccaatgaattaaaaaatgattaataaaaaatcacttacttgaaatca28200gcaataaggtctctgttgaaattttctcccagcagcacctcacttccctcttcccaactc28260tggtattctaaaccccgttcagcggcatactttctccatactttaaaggggatgtcaaat28320tttagctcctctcctgtacccacaatcttcatgtctttcttcccagatgaccaagagagt28380ccggctcagtgactccttcaaccctgtctacccctatgaagatgaaagcacctcccaaca28440cccctttataaacccagggtttatttccccaaatggcttcacacaaagcccaaacggagt28500tcttactttaaaatgtttaaccccactaacaaccacaggcggatctctacagctaaaagt28560gggagggggacttacagtggatgacaccaacggttttttgaaagaaaacataagtgccac28620cacaccactcgttaagactggtcactctataggtttaccactaggagccggattgggaac28680gaatgaaaataaactttgtatcaaattaggacaaggacttacattcaattcaaacaacat28740ttgcattgatgacaatattaacaccttatggacaggagtcaaccccaccgaagccaactg28800tcaaatcatgaactccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacactagttaaaac28860tggagcactagtcactgcatttgtttatgttataggagtatctaacaattttaatatgct28920aactacacacagaaatataaattttactgcagagctgtttttcgattctactggtaattt28980actaactagactctcatccctcaaaactccacttaatcataaatcaggacaaaacatggc29040tactggtgccattactaatgctaaaggtttcatgcccagcacgactgcctatcctttcaa29100tgataattctagagaaaaagaaaactacatttacggaacttgttactacacagctagtga29160tcgcactgcttttcccattgacatatctgtcatgcttaaccgaagagcaataaatgacga29220gacatcatattgtattcgtataacttggtcctggaacacaggagatgccccagaggtgca29280aacctctgctacaaccctagtcacctccccatttaccttttactacatcagagaagacga29340ctgacaaataaagtttgcgatcgccaggcccaccatggactggacctggaggatcctctt29400cttggtggcagcagccacaggagcccactcccaggtgcagctggtgcagtctggggctga29460ggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcac29520cggctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatg29580gatcaaccctgacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccat29640gaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgaacaggctgagatctgacga29700cacggccgtgtattactgtgcgagagatcagcccctaggatattgtactaatggtgtatg29760ctcctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccaccaa29820gggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggc29880cctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg29940cgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactc30000cctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaa30060cgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgt30120cgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttcccccc30180aaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtgga30240cgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgca30300taatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgt30360cctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaa30420caaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgaga30480accacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcct30540gacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgg30600gcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttctt30660cctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatg30720ctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcc30780gggtaaaggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggagga30840gaaccctggacctaggctccctgctcagctcctggggctcctgctgctctggttcccagg30900ttccagatgcgacatccagatgacccagtctccatcttccgtgtctgcatctgtaggaga30960cagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtatttacagctggttagcctggtatca31020gcagaaaccagggaaagcccctaacctcctgatctatactgcatccactttacaaagtgg31080ggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcag31140cctgcaacctgaagattttgcaacttactattgtcaacaggctaacattttcccgctcac31200tttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcat31260cttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaa31320taacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcggg31380taactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcag31440caccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcac31500ccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaggctag31560cttgactgactgagatacagcgtaccttcagctcacagacatgataagatacattgatga31620gtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtga31680tgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattg31740cattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaa31800cctctacaaatgtggtcctgcaggaacttgtttatttgaaaatcaattcacaaaatccga31860gtagttattttgcctcccccttcccatttaacagaatacaccaatctctccccacgcaca31920gctttaaacatttggataccattagatatagacatggttttagattccacattccaaaca31980gtttcagagcgagccaatctggggtcagtgatagataaaaatccatcgggatagtctttt32040aaagcgctttcacagtccaactgctgcggatgcgactccggagtctggatcacggtcatc32100tggaagaagaacgatgggaatcataatccgaaaacggtatcggacgattgtgtctcatca32160aacccacaagcagccgctgtctgcgtcgctccgtgcgactgctgtttatgggatcagggt32220ccacagtgtcctgaagcatgattttaatagcccttaacatcaactttctggtgcgatgcg32280cgcagcaacgcattctgatttcactcaaatctttgcagtaggtacaacacattattacaa32340tattgtttaataaaccataattaaaagcgctccagccaaaactcatatctgatataatcg32400cccctgcatgaccatcataccaaagtttaatataaattaaatgacgttccctcaaaaaca32460cactacccacatacatgatctcttttggcatgtgcatattaacaatctgtctgtaccatg32520gacaacgttggttaatcatgcaacccaatataaccttccggaaccacactgccaacaccg32580ctcccccagccatgcattgaagtgaaccctgctgattacaatgacaatgaagaacccaat32640tctctcgaccgtgaatcacttgagaatgaaaaatatctatagtggcacaacatagacata32700aatgcatgcatcttctcataatttttaactcctcaggatttagaaacatatcccagggaa32760taggaagctcttgcagaacagtaaagctggcagaacaaggaagaccacgaacacaactta32820cactatgcatagtcatagtatcacaatctggcaacagcgggtggtcttcagtcatagaag32880ctcgggtttcattttcctcacaacgtggtaactgggctctggtgtaagggtgatgtctgg32940cgcatgatgtcgagcgtgcgcgcaaccttgtcataatggagttgcttcctgacattctcg33000tattttgtatagcaaaacgcggccctggcagaacacactcttcttcgccttctatcctgc33060cgcttagcgtgttccgtgtgatagttcaagtacaaccacactcttaagttggtcaaaaga33120atgctggcttcagttgtaatcaaaactccatcgcatctaatcgttctgaggaaatcatcc33180aagcaatgcaactggattgtgtttcaagcaggagaggagagggaagagacggaagaacca33240tgttaatttttattccaaacgatctcgcagtacttcaaattgtagatcgcgcagatggca33300tctctcgcccccactgtgttggtgaaaaagcacagctagatcaaaagaaatgcgattttc33360aaggtgctcaacggtggcttccagcaaagcctccacgcgcacatccaagaacaaaagaat33420accaaaagaaggagcattttctaactcctcaatcatcatattacattcctgcaccattcc33480cagataattttcagctttccagccttgaattattcgtgtcagttcttgtggtaaatccaa33540tccacacattacaaacaggtcccggagggcgccctccaccaccattcttaaacacaccct33600cataatgacaaaatatcttgctcctgtgtcacctgtagcgaattgagaatggcaacatca33660attgacatgcccttggctctaagttcttctttaagttctagttgtaaaaactctctcata33720ttatcaccaaactgcttagccagaagccccccgggaacaagagcaggggacgctacagtg33780cagtacaagcgcagacctccccaattggctccagcaaaaacaagattggaataagcatat33840tgggaaccgccagtaatatcatcgaagttgctggaaatataatcaggcagagtttcttgt33900aaaaattgaataaaagaaaaatttgccaaaaaaacattcaaaacctctgggatgcaaatg33960caataggttaccgcgctgcgctccaacattgttagttttgaattagtctgcaaaaataaa34020aaaaaaaacaagcgtcatatcatagtagcctgacgaacagatggataaatcagtctttcc34080atcacaagacaagccacagggtctccagctcgaccctcgtaaaacctgtcatcatgatta34140aacaacagcaccgaaagttcctcgcggtgaccagcatgaataattcttgatgaagcatac34200aatccagacatgttagcatcagttaacgagaaaaaacagccaacatagcctttgggtata34260attatgcttaatcgtaagtatagcaaagccacccctcgcggatacaaagtaaaaggcaca34320ggagaataaaaaatataattatttctctgctgctgttcaggcaacgtcgcccccggtccc34380tctaaatacacatacaaagcctcatcagccatggcttaccagacaaagtacagcgggcac34440acaaagcacaagctctaaagtgactctccaacctctccacaatatatatatacacaagcc34500ctaaactgacgtaatgggagtaaagtgtaaaaaatcccgccaaacccaacacacaccccg34560aaactgcgtcaccagggaaaagtacagtttcacttccgcaatcccaacaggcgtaacttc34620ctctttctcacggtacgtgatatcccactaacttgcaacgtcattttcccacggtcgcac34680cgccccttttagccgttaaccccacagccaatcaccacacgatccacactttttaaaatc34740acctcatttacatattggcaccattccatctataaggtatattatatagataga34794<210>14<211>13<212>rna<213>人工序列<220><223>kozak序列<220><221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>r是嘌呤、腺嘌呤或鸟嘌呤<400>14gccgccrccaugg13<210>15<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>剪接受体序列<400>15tgctaatcttcctttctctcttcagg26<210>16<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>剪接受体序列<400>16tttctctcttcagg14<210>17<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>正向引物<400>17acggaacttgttactacacagc22<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>反向引物<400>18ctttcacagtccaactgctgc21<210>19<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>正向引物<400>19agccggagaacaactacaagac22<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>正向引物<400>20catccagatgacccagtctcc21<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>反向引物<400>21ggacaaaccacaactagaatgcag24<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>正向引物<400>22cctcagtgaaggtctcctgc20<210>23<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>反向引物<400>23ggacaaaccacaactagaatgcag24<210>24<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自切割p2a肽序列<400>24glyserglyalathrasnpheserleuleulysglnalaglyaspval151015glugluasnproglypro20<210>25<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自切割f2a肽序列<400>25glyserglygluglyargglyserleuleuthrcysglyaspvalglu151015gluasnproglypro20<210>26<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自切割e2a肽序列<400>26glyserglyglncysthrasntyralaleuleulysleualaglyasp151015valgluserasnproglypro20<210>27<211>25<212>prt<213>人工序列<220><223>高效可自切割t2a肽序列<400>27glyserglyvallysglnthrleuasnpheaspleuleulysleuala151015glyaspvalgluserasnproglypro2025当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种溶瘤病毒(例如有复制能力的病毒)，其包括对抗cd40抗体或其结合片段进行编码的转基因盒，尤其是seqidno:12的盒，其中所述转基因盒包括seqidno:12中给出的氨基酸序列或与其至少95％相同(如与其96％、97％、98％或99％相同)的序列。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自腺病毒、单纯性疱疹病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、塞内加谷病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、echo肠道病毒、柯萨奇病毒和牛痘病毒，尤其是腺病毒。
3.根据权利要求1或2所述的溶瘤病毒，其中所述病毒选自由以下组成的组：enadenotucirev、talimogenelaherparepvec、rigvir、ad5-ycd/muttksr39rep-hil12、cavataktm、cg0070、dnx-2401、g207、hf10、jx-594、mg1-ma3、mv-nis、obp-301、toca511，尤其是enadenotucirev。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的溶瘤病毒，其中所述病毒包括seqidno:1或与其至少95％相同(如与其96％、97％、98％或99％相同)的序列，如包括seqidno:1。
5.根据权利要求4所述的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒由seqidno:1组成。
6.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到5中任一项所述的病毒和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
7.一种根据权利要求1到5中任一项所述的溶瘤病毒或根据权利要求6所述的药物组合物，其用于治疗。
8.根据权利要求1到5中任一项所述的溶瘤病毒或根据权利要求6所述的药物组合物，其用于治疗癌症、胰岛素抵抗、肥胖和/或免疫缺陷。
9.一种根据权利要求6所述的用途，其中所述病毒或组合物用于治疗癌症，例如用于治疗表达cd40的癌症(如具有上调的cd40表达的癌症)。
10.一种组合疗法(例如用于治疗癌症)，其包括根据权利要求1到5中任一项所述的病毒或根据权利要求6所述的组合物以及另外的抗癌疗法。
11.根据权利要求10所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是化学疗法。
12.根据权利要求10或11所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是检查点抑制剂。
13.根据权利要求12所述的组合疗法，其中所述抗癌疗法选自包括以下的组：pd-1抑制剂、pd-l1抑制剂、ctla-4抑制剂、tim-3抑制剂、lag-3抑制剂、tigit抑制剂、b7-h3(cd276)抑制剂、b7-h4(b7s1)抑制剂、b7h7(hhla2)抑制剂、cd96抑制剂、vista抑制剂和其中两种或更多种的组合。
14.根据权利要求13所述的组合疗法，其中所述抑制剂是抗体或其结合片段。
15.根据权利要求10到14中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法是共刺激途径激动剂。
16.根据权利要求15所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法选自包括以下的组：cd27激动剂、cd28激动剂、icos激动剂、tmigd2(igpr-1/cd28h)激动剂、cd226激动剂、ox40激动剂、4-1bb激动剂和其中两种或更多种的组合。
17.根据权利要求14所述的组合疗法，其中所述疗法是抗体或其结合片段。
18.根据权利要求8到15中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的抗癌疗法活化例如选自il-10、tgfβ、ido抑制剂或其中两种或更多种的组合的免疫应答或免疫应答反向抑制。
19.根据权利要求10到18中任一项所述的组合疗法，其中所述另外的癌症疗法是溶瘤病毒，例如有复制能力的溶瘤病毒，如腺病毒，尤其是b组腺病毒。
20.根据权利要求19所述的组合疗法，其中所述溶瘤病毒对治疗性基因编码材料进行编码，所述治疗性基因编码材料选自由以下组成的组：rnai序列、抗体或其结合片段、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂和酶。
技术总结一种溶瘤病毒(例如有复制能力的病毒)，所述溶瘤病毒包括对抗CD40抗体或其结合片段进行编码的转基因盒，尤其是SEQ ID NO:12的盒，其中所述转基因盒包括SEQ ID NO:12中给出的氨基酸序列或与其至少95％相同(如与其96％、97％、98％或99％相同)的序列；包括所述溶瘤病毒的药物组合物、制备所述溶瘤病毒和所述组合物的方法以及所述溶瘤病毒或所述组合物用于治疗，尤其是用于治疗癌症的用途。还提供了用根据本公开的疗法来治疗表征为具有表达CD40的癌症，尤其是过表达CD40的癌症的患者人群。
技术研发人员：B·查皮尔;A·C·N·布罗姆利;M·贝斯纽克斯
受保护的技术使用者：皮斯奥克斯治疗公司
技术研发日：2018.06.01
技术公布日：2020.06.05
