本发明涉及包含豆培养组织提取物的用于防脱发或者促进生发的组合物及其制备方法。
背景技术：
最近随着饮食生活的变化、压力的增加等而因脱发苦恼的人逐渐增多，其年龄也在降低，而且不仅是男性，女性脱发人数也在逐渐增多。
脱发原因中，与男性荷尔蒙分泌过多有直接关系的最普遍的类型为通常称为男性型脱发(malepatternbaldness)的雄性激素源脱发(androgenicalopecia)。如果有雄性激素源脱发，则健康的毛发会逐渐变细变短，毛发变软而产生容易折断的现象，将所述现象称为萎缩(miniaturization)。引起萎缩的毛囊最终会变细且肉眼很难看到，并变成短的细毛而产生脱发。
最近进行着通过抑制男性荷尔蒙活性来预防以及治疗脱发的很多研究。男性型脱发是男性荷尔蒙之一的睾丸素(testosterone)因5α-还原酶(5α-reductase)而转化为活跃型男性荷尔蒙的双氢睾酮(dihydrotestosterone，dht)，如此活性化的双氢睾酮与雄激素受体结合，延迟毛囊细胞的蛋白质合成，缩短毛囊的生长期，使毛囊萎缩，引发脱发。另外，在雄性激素源脱发过程中，还会生成过多的皮脂，其结果，在头皮还会产生伴随炎症的脱发。有报告指出女性脱发相比男性其原因更加多样，然而因对男性荷尔蒙的敏感度的遗传产生的雄性激素源脱发占成人女性脱发中的50％左右。
市售的非那雄胺(propecia)或者米诺地尔(minoxidil)之类的脱发治疗剂其效果微乎其微或者副作用大，因此根据对象而使用受限制，而且使用的消费者也可能抗拒使用。为了解决所述问题，迫切需要开发利用天然原料等的同时，效果也优秀的防脱发剂或者生发剂。
技术实现要素：
技术问题
本说明书的课题为，利用天然原料的同时提供无副作用的用于防脱发或者促进生发的组合物和均匀制备所述组合物的方法。
技术方案
为了解决所述课题，本说明书提供用于防脱发或者促进生发的组合物，其包括豆培养组织的提取物，所述豆培养组织为豆培养根或者豆愈伤组织。
另外，本说明书提供均匀且大量制备用于防脱发或者促进生发的组合物的方法，其包括：(1)步骤，使豆培养根位于生物反应器内的培养基中，在所述生物反应器内保持一定的空气供应量并进行增殖；(2)步骤，干燥经过所述(1)步骤的培养根；(3)步骤，将经过所述(2)步骤的产物浸渍到醇进行提取；以及(4)步骤，经过所述(3)步骤之后，进行过滤以及干燥。
发明效果
本发明利用一方面时，可以均匀且大量制备含有均匀质量的豆培养组织的用于防脱发或者促进生发的组合物，通过所述方法制备的组合物使用天然原料的同时，防脱发以及促进生发效果显著，因此可以成为能够克服现有的用于防脱发或者促进生发的产品的缺点的代替方案。
附图说明
图1是利用根据本发明的一方面的外植技术，培养豆培养根4周的情况的图；
图2是示出根据本发明的一方面的提取物依靠浓度增进wnt/β-catenin活性的图；
图3是示出根据本发明的一方面的提取物在毛囊周期中对退行期相比生长期的比率产生的影响的图。
具体实施方式
本说明书中，外植(explantation)可以称为外植或者体外培养，主要分离动植物个体的一部分并在体外培养的技术。主要包括在体外生存一定时间，并耗时培养直到逐渐确认到某种发生的变化。一般的组织培养也是体外培养的一种方法。另外，根据本发明的一方面的反应器内培养也包含在体外培养中。
在本说明书中，外植技术包括在添加有特定成分的培养基等的人工培养器生长选自包括原生质体、细胞、组织、器官、胚、种子、培养根以及植物体的一部分的群中的一种以上的情况。
一方面，本发明为用于防脱发或者促进生发的组合物，其包括豆培养组织的提取物，所述豆培养组织为豆培养根或者豆愈伤组织。
另一方面，本发明涉及包括将豆培养组织的提取物投入到个体的用于防脱发或者促进生发的方法，可以涉及所述豆培养组织为豆培养根或者豆愈伤组织的防脱发或者促进生发的方法。
又一其他方面，本发明涉及用在用于防脱发或者促进生发的组合物的制备的、豆培养组织的提取物的用途，可以涉及所述豆培养组织为豆培养根或者豆愈伤组织的、豆培养组织的提取物的用途。
作为一体现例，所述豆可以为大豆、宽叶蔓豆(glycinegracilis)、青仁黑豆、鼠目太豆、黑大豆、青豆、黄豆、四季豆、红腰豆、菜豆、斑豆、赤豆、小黑豆或豆芽豆，可以优选为大豆或者宽叶蔓豆。所述豆的品种不受限制，一方面，可以为豆酱类以及豆腐用、豆芽用、煮饭用或者毛豆用品种。作为豆酱以及豆腐用品种包括大丰(daepung，品种保护申请，申请-2003-152)、湖酱(hojang，品种保护申请，申请-2003-155)、壮元(jangwon，品种保护申请，申请-2001-34)、大潢(品种保护申请，申请-2000-19)、小胆(sodamkong，品种保护申请，申请-1999-19)、松鹤(品种保护申请，申请-1999-22)、大元(daewonkong，品种名称登记编号第01-0003-38号)、真品(jinpumkong，品种保护申请，申请-1998-204)、蛋白(danbaegkong，品种保护申请，申请-1998-201)、豆油(duyoukong，品种保护申请，申请-1998-151)、新八达(shinpaldalkong，品种保护申请，申请-1998-199)、太光(taekwangkong，品种保护申请，申请-1998-198)、万里(mallikong，品种名称登记编号第01-0003-11号)、长寿(jangsukong，品种名称登记编号第01-0003-9)、无限(muhankong，品种平常登记编号第01-0003-7号)、白云(baegunkong，品种保护申请，申请-1998-193)、鸟卵(saealkong，品种保护申请，申请-1998-143)、黄金(品种名称登记编号第01-0003-1号)以及长叶(品种名称登记编号第01-0003-41号)等。作为豆芽用品种包括神话(shinhwa，品种名称登记编号第01-0003-134号)、小圆(sowon，品种保护申请，申请-2000-16)、安平(anpyeong，品种保护申请，申请-2003-151)、西南(sunam，品种保护申请，申请-2003-153)、多彩(dachae，品种保护申请，申请-2003-148)、小绿(品种保护申请，申请-2002-116)、小胡(sohokong，品种保护申请，申请-2001-36)、疏明(somyeongkong，品种保护申请，申请-1998-18)、多元(品种保护申请，申请-1998-209)、丰产豆芽(pungsannamul，品种保护申请，申请-1998-140)、益山豆芽(iksannamul，品种保护申请，申请-1998-139)、小白豆芽(品种名称登记编号第01-0003-31号)、光安(kwangankong，品种保护申请，申请-1998-202)、短叶以及银河(eunhakong，品种名称登记编号第01-0003-6号)等。作为煮饭用品种包括青磁(cheongjakong，品种保护申请，申请-2001-38)、黑青(heugcheong，品种保护申请，申请-2000-27)、褐味(品种保护申请，申请-2000-25)、鲜黑(seonheukkong，品种保护申请，申请-1999-20)、黑豆以及一品黑豆(品种保护申请，申请-1998-158)等。作为毛豆用品种包括多兀(daol，品种保护申请，申请-2003-149)、新绿(品种保护申请，申请-2001-35)、新乙(saeol)、黑乙(geomjeongol)、夕凉毛豆(seokyang-putkong)、华严毛豆(hwaeom-putkong)(品种名称登记编号第01-0003-21号)以及大乙(keunol)等。在本发明的其他一方面，豆优选为可发芽且对病虫害强的品种。作为如上所述豆，例如包括神话、小圆、安平、西南、多彩、小绿、小胡、疏明、多元、丰产豆芽、益山豆芽、小白豆芽、光安、短叶以及银河等。然而，根据本发明的一方面的豆并不局限于所述豆品种。
根据本发明的一方面的宽叶蔓豆有扁豆、扁细豆、扁平豆、扁扁豆、宽叶蔓豆等多种叫法。
作为其他体现例，所述提取物可以为将水、c1至c6的低级醇或者其混合物作为溶剂进行提取的。
作为其他体现例，所述低级醇可以为乙醇。
作为其他体现例，所述醇浓度可以为60至100％(w/v)。一方面，所述醇浓度可以为60％(w/v)以上、70％(w/v)以上、75％(w/v)以上、80％(w/v)以上、85％(w/v)以上、90％(w/v)以上或者95％(w/v)以上。另一方面，所述醇浓度可以为100％(w/v)以下、95％(w/v)以下、90％(w/v)以下、85％(w/v)以下、80％(w/v)以下、75％(w/v)以下、70％(w/v)以下或者65％(w/v)以下。
作为其他体现例，所述提取物相对于提取物总重量，可以含有5至15重量％的香豆雌酚。另外，所述组合物相对于提取物或者组合物总重量，可以含有5至15重量％的香豆雌酚。一方面，所述香豆雌酚的含量可以为5重量％以上、7重量％以上、8重量％以上、9重量％以上、10重量％以上、12重量％以上或者14重量％以上。另一方面，所述香豆雌酚的含量可以为15重量％以下、13重量％以下、12重量％以下、11重量％以下、10重量％以下、8重量％以下或者6重量％以下。
作为又一其他体现例，所述防脱发或者促进生发可以是通过选自由增殖毛乳头细胞、增加毛囊干细胞活性、诱导毛囊生长期、维持或者延长毛囊生长期以及抑制毛囊周期中朝退行期的过渡而成的群中的一种以上完成的。
根据本发明的一方面的组合物增加毛囊干细胞活性，促进毛乳头细胞的增殖，由此能够谋求防脱发、促进生发、各种脱发(选自由雄性激素源脱发、外伤性脱发、斑秃、药物引起的脱发以及微生物感染引起的脱发而成的群中的一种以上)的改善以及治疗。
毛发作为有规律地反复生长期、退行期、休止期的周期性变化的过程，每根毛发都在独自反复生成和凋亡。生长期中，毛球细胞被由基质细胞构成的毛乳头围绕而呈圆形，生长期是为了新生毛发的生成而细胞分裂活跃的时期。退行期是毛囊的生长活动发生静止并快速萎缩的时期，此时的毛发的形状与棍棒类似。休止期是毛囊的细胞活动被完全消灭的时期，经过2-3个月的时间，因从休止期毛发的基底部新长出的生长期毛发而被挤出脱落或者因梳头或者洗头等机械作用而自然脱落。通常，脱发包括在该周期中生长期的毛发比率变短而退行期或者休止期的毛发变多，导致不正常的毛发脱落的数量变多的情况。根据本发明的一方面的组合物诱导、维持以及延长毛囊的生长期，抑制朝退行期的过渡，因此可以利用所述组合物防脱发、促进生发、各种脱发(选自由雄性激素源脱发、外伤性脱发、斑秃、药物引起的脱发以及微生物感染引起的脱发而成的群中的一种以上)的改善以及治疗。
一方面，所述防脱发或者促进生发可以是通过增加β-连环蛋白(β-catenin)的转录活性或者增加wnt/β-catenin活性而完成的。根据本发明的一方面的组合物依靠浓度增加β-连环蛋白的转录活性或者增加wnt/β-catenin活性，由此调节毛囊周期(即，诱导生长期以及维持生长期)，因此，由此可以将本发明的一方面活用到防脱发、促进生发以及各种脱发(选自由雄性激素源脱发、外伤性脱发、斑秃、药物引起的脱发以及微生物感染引起的脱发而成的群中的一种以上)的治疗中。
作为一体现例，所述组合物的投入路径不受限制，可以优选经皮或者皮肤外用。
作为其他体现例，所述组合物内所述提取物的浓度可以为10至100ppm(w/v)。一方面，所述投入浓度可以为10ppm(w/v)以上、20ppm(w/v)以上、25ppm(w/v)以上、30ppm(w/v)以上、35ppm(w/v)以上、40ppm(w/v)以上、45ppm(w/v)以上、50ppm(w/v)以上、60ppm(w/v)以上、70ppm(w/v)以上、80ppm(w/v)以上、90ppm(w/v)以上或者95ppm(w/v)以上。另一方面，所述投入浓度可以为100ppm(w/v)以下、90ppm(w/v)以下、80ppm(w/v)以下、70ppm(w/v)以下、60ppm(w/v)以下、50ppm(w/v)以下、45ppm(w/v)以下、40ppm(w/v)以下、35ppm(w/v)以下、30ppm(w/v)以下、25ppm(w/v)以下、20ppm(w/v)以下或者15ppm(w/v)以下。
作为其他体现例，基于所述组合物的投入的所述提取物的投入量可以为5mg/kg日至300mg/kg/日。一方面，所述投入量可以为5mg/kg/日以上、10mg/kg/日以上、30mg/kg/日以上、50mg/kg/日以上、80mg/kg/日以上、100mg/kg/日以上、120mg/kg/日以上、140mg/kg/日以上、160mg/kg/日以上、180mg/kg/日以上、200mg/kg/日以上、250mg/kg/日以上或者280mg/kg/日以上。另一方面，所述投入量可以为300mg/kg/日以下、280mg/kg/日以下、250mg/kg/日以下、200mg/kg/日以下、180mg/kg/日以下、160mg/kg/日以下、140mg/kg/日以下、120mg/kg/日以下、100mg/kg/日以下、80mg/kg/日以下、50mg/kg/日以下、30mg/kg/日以下、10mg/kg/日以下或者8mg/kg/日以下。
另一方面，所述组合物可以为食品、药学或者化妆品组合物。
又一其他方面，所述组合物可以为用于改善或者治疗选自由雄性激素源脱发、外伤性脱发、斑秃、药物引起的脱发以及微生物感染引起的脱发而成的群中的一种以上的组合物。
根据本发明的一方面的食品组合物可以为健康食品组合物，在所述健康食品组合物中，对所述化合物的投入量的决定在本领域技术人员的水平内，可以根据所要投入的对象的年龄、健康状态、并发症等多种因素而不同。
所述食品组合物的剂型不作特别限定，例如可以剂型化为片剂、颗粒剂、丸剂、粉末剂、饮品剂之类的液剂、焦糖、凝胶、棒条、茶包等。各个剂型的食品组合物除了有效成分之外，还可以按照剂型或者使用目的，方便本领域技术人员选定本领域中通常使用的成分进行配合，而且与其他原料同时使用时，可以引起效果提升。
所述组合物可以以单纯摄入、饮用、注射投入、喷洒投入或者挤压投入等多种方法进行投入。
根据本发明的一方面的健康食品组合物可以为保健食品，不仅如此，还包括例如口香糖、焦糖产品、糖果类、冷冻甜品类、饼干类、面包类等各种食品类、清凉饮料、矿物质水、酒精饮料等饮料产品之类的任何形态的加工食品，可以为包括维生素或者矿物质等的功能性食品类。
除此之外，根据本发明的一方面的健康食品组合物可以包括多种营养剂、维生素、矿物质(电解质)、合成调味剂以及天然调味剂等的调味剂、着色剂以及增进剂(芝士、巧克力等)、果胶酸以及其盐、藻酸以及其盐、有机酸、保护性胶状增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸剂等。除此之外，根据本发明的一方面的健康食品组合物可以包括天然果汁以及用于制备果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。可以独自或者组合使用所述成分。所述添加物的比率不是很重要，然而通常是每100重量份的根据本发明的一方面的组合物，包含0至约50重量份的范围。
根据本发明的一方面的化妆品组合物例如为皮肤用、手脚指甲用和/或毛发用组合物，可以具有柔软性化妆水、收敛性化妆水、营养性化妆水、营养霜、按摩霜、眼霜、眼部精华、精华、洁面霜、洁面乳、洁面泡沫、卸妆水、面膜、粉末、润体乳、润体霜、润体精华、身体清洗剂、染发剂、洗发水、护发素(rinse)、头发固定剂、养发剂、软膏、凝胶、霜、贴片、喷雾剂、粉末剂以及皮肤粘接类型等的剂型，然而并不局限于此。
另外，各个剂型除了所述必要成分之外，还可以按照其他外用剂的种类或者使用目的，方便本领域技术人员适当选定其他成分进行配合。
所述化妆品组合物可以提供为适合局部使用的所有剂型。例如可以提供为如下剂型：溶液、在水相分散油相获得的乳剂、在油相分散水相获得的乳剂、悬浮液、固体、凝胶、粉末、膏体、微型探针、泡沫(foam)或者气溶胶组合物。所述剂型的组合物可以按照本领域的通常的方法制备。
根据本说明书的化妆品组合物中除了本说明书的化合物、提取物或者馏分物之外，可以进一步包括功能性添加物以及一般化妆品组合物中包含的成分。作为所述功能性添加物可以包括选自由水溶性维生素、维生素、高分子肽、高分子多糖、神经鞘脂类以及海藻汁而成的群中的成分。根据本说明书的化妆品组合物在不破坏主要效果的范围内，可以优选包括可以在主要效果上起到效果提升作用的其他成分。另外，根据本说明书的化妆品组合物可以进一步包括保湿剂、润滑剂、表面活性剂、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、ph调节剂、有机以及无机颜料、香料、凉感剂或者止汗剂。在不破坏本说明书的目的以及效果的范围内，本领域技术人员可以容易选定所述成分的配合量，其配合量以组合物整体重量为基准，可以为0.001至10重量％，具体为0.01至3重量％。
根据又一其他体现例，所述组合物可以为皮肤外用剂组合物。皮肤外用剂组合物可以为化妆品、口腔剂、清洗剂、药学以及医药外用品等的组合物，然而并不局限于此。所述皮肤外用剂在其剂型上不作特别限定。
另外，本说明书的皮肤外用剂组合物可以进一步包括选自用于特殊目的的功能性盐(salt)以及用于调节ph的ph调节剂中的一个以上。此时，所述盐可以选自用于离子阻隔、保湿、紫外线阻隔等的无机盐、有机盐和/或有机-无机盐。具体为，例如，所述盐可以选自氯化钠(nacl)、磷酸钠(na3po4)以及氯化钙(cacl2)等。所述ph调节剂选自酸(acid)或者碱基(base)，例如可以选自由盐酸、硫酸、酒石酸、柠檬酸、磷酸、醋酸、乳酸、乳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、烷基胺、烷醇胺以及氨等而成的群。
本说明书的皮肤外用剂组合物可以为化妆品、药学或者医药外用品组合物，所述化妆品、药学或者医药外用品组合物可以进一步含有防腐剂、稳定剂、可湿性粉剂或者乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等的助剂以及其他治疗上有用的物质。所述组合物可以剂型化为乳液、霜、软膏或者凝胶等。所述皮肤外用剂组合物优选为经皮投入。
所述药学或者医药外用品组合物的有效成分的投入量可以根据接受治疗的对象的年龄、性别、体重和所要治疗的特定疾病或者病状、疾病或者病状的严重程度、投入路径以及处方人的判断而不同。针对基于所述因子决定的投入量，在本领域技术人员的水平内。
根据本发明的一方面的所述药学组合物可以通过口服、非口服、直肠、局部、经皮、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下等投入。用于口服的剂型可以为片剂、丸剂、软质以及硬质胶囊、颗粒剂、散剂、细粒剂、液剂、乳浊剂或者球剂，然而并不局限于此。用于非口服的剂型可以为溶液剂、悬浮剂、乳液剂、凝胶、注射剂、滴剂、栓剂(坐剂)、贴片或者喷雾剂，然而并不局限于此。所述剂型可以按照本领域的常规方法方便制备，可以进一步包括表面活性剂、赋形剂、可湿性粉剂、乳化促进剂、悬浮剂、用于调节渗透压的盐或者缓冲剂、着色剂、香辛料、稳定剂、防腐剂、保存剂或者其他常用的助剂。
根据本发明的一方面的所述药学组合物的使用量或者投入量可以根据接受投入的对象的年龄、性别、体重、病状以及其严重程度、投入路径或者处方人的判断而不同。针对基于所述因子决定的使用量，在本领域技术人员的水平内。
另一方面，本发明可以为均匀且大量制备用于防脱发或者促进生发的组合物的方法，其包括：(1)步骤，使豆培养根位于生物反应器内的培养基中，在所述生物反应器内保持一定的空气供应量并进行增殖；(2)步骤，干燥经过所述(1)步骤的培养根；(3)步骤，将经过所述(2)步骤的产物浸渍到醇进行提取；以及(4)步骤，经过所述(3)步骤之后，进行过滤以及干燥。
另一方面，本发明可以为均匀且大量制备豆培养组织的提取物的方法，其包括：(1)步骤，使豆培养根位于生物反应器内的培养基中，在所述生物反应器内保持一定的空气供应量并进行增殖；(2)步骤，干燥经过所述(1)步骤的培养根；(3)步骤，将经过所述(2)步骤的产物浸渍到醇进行提取；以及(4)步骤，经过所述(3)步骤之后，进行过滤以及干燥。
一方面，所述方法可以包括在(1)步骤之前，在培养基内发芽豆的步骤。另一方面，所述方法还可以包括在(1)步骤之前从豆植物体中诱导豆培养根的步骤。
一般，露地栽培并通过常规方法提取的豆提取物由于成分等不一定，因此很难均匀地大量生产用于达成特定目的的组合物。然而，根据本发明的一方面的方法，使外部影响因素等最小化，从而可以均匀且大量生产用于防脱发或者促进生发的组合物。
作为一体现例，所述生物反应器可以为搅拌釜反应器(stirredtankreactor)、鼓泡塔反应器(bubblecolumnreactor)、气升式生物反应器(airliftreactor)、流化床反应器(fludizedbedreactor)、固定床/填充床反应器(fixed/packedbedreactor)或者塔式发酵罐(towerfermenter)，可以优选为球状鼓泡生物反应器(bulbtypebubblebioreactor)。
作为其他体现例，所述(1)步骤的培养基可以为添加有iba(3-吲哚丁酸；indole-3-butyricacid)、碳源的培养基。一方面，所述碳源可以为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、直链淀粉、淀粉(starch)、山梨糖醇、甘露醇以及甘油而成的群中的一种以上。
作为其他体现例，所述(1)步骤的培养基可以为ms(murashigeandskoog)培养基。
作为其他体现例，使所述豆培养根位于培养基时的培养基ph可以为4.8至6.8。一方面，所述ph可以为4.8以上、5以上、5.2以上、5.4以上、5.6以上、5.8以上、6.0以上、6.2以上、6.4以上或者6.6以上。另一方面，所述ph可以为6.8以下、6.6以下、6.4以下、6.2以下、6.0以下、5.8以下、5.6以下、5.4以下、5.2以下、5.0以下。
作为其他体现例，使所述豆培养根位于培养基时的密度可以为2至6g/l。一方面，所述密度可以为2g/l以上、3g/l以上、4g/l以上或者5g/l以上。另一方面，所述密度可以为6g/l以下、5g/l以下、4g/l以下或者3g/l以下。
作为其他体现例，所述(1)步骤的增殖可以是在黑暗条件下进行。
作为其他体现例，所述(1)步骤可以在19至25℃下进行。一方面，所述温度可以为19℃以上、20℃以上、21℃以上、22℃以上、23℃以上或者24℃以上。另一方面，所述温度可以为25℃以下、24℃以下、23℃以下、22℃以下、21℃以下或者20℃以下。
一方面，所述(1)步骤的空气供应量可以为0.05至0.4vvm(通气比；airvolume/culturevolumepermin)。作为一体现例，所述空气供应量可以为0.05vvm以上、0.08vvm以上、0.1vvm以上、0.12vvm以上、0.14vvm以上、0.16vvm以上、0.18vvm以上、0.2vvm以上、0.22vvm以上、0.24vvm以上、0.26vvm以上、0.28vvm以上、0.3vvm以上、0.32vvm以上、0.34vvm以上、0.36vvm以上或者0.38vvm以上。作为其他体现例，所述空气供应量可以为0.4vvm以下、0.38vvm以下、0.36vvm以下、0.34vvm以下、0.32vvm以下、0.3vvm以下、0.28vvm以下、0.26vvm以下、0.24vvm以下、0.22vvm以下、0.2vvm以下、0.18vvm以下、0.16vvm以下、0.14vvm以下、0.12vvm以下、0.1vvm以下、0.08vvm以下或者0.06vvm以下。
作为一体现例，所述(1)步骤的增殖可以进行2至5周。一方面，所述(1)步骤的增殖可以进行2周以上、3周以上或者4周以上。另一方面，所述(1)步骤的增殖可以进行5周以下、4周以下或者3周以下。
作为其他体现例，所述(3)步骤的醇浓度可以为60至100％(w/v)。一方面，所述醇浓度可以为60％(w/v)以上、70％(w/v)以上、80％(w/v)以上、90％(w/v)以上或者95％(w/v)以上。另一方面，所述醇浓度可以为100％(w/v)以下、95％(w/v)以下、90％(w/v)以下、85％(w/v)以下、80％(w/v)以下、75％(w/v)以下、70％(w/v)以下、65％(w/v)以下。
一方面，所述干燥的产物和醇的重量比可以为1:50以下、1:45以下、1:40以下、1:35以下、1:32以下、1:30以下、1:25以下或者1:22以下。另一方面，所述重量比可以为1:20以上、1:22以上、1:24以上、1:26以上、1:28以上、1:31以上、1:33以上、1:35以上、1:40以上、1:45以上或者1:48以上。
作为其他体现例，所述(3)步骤的提取时间可以为20至28小时。一方面，所述提取时间可以为20小时以上、22小时以上、24小时以上、25小时以上或者26小时以上。另一方面，所述提取时间可以为28小时以下、26小时以下、25小时以下、24小时以下、22小时以下或者21小时以下。
通过所述方法，无需使用生长促进剂或者肥料、农药等，就可以环保且均匀地大量收获豆培养组织，从而大量制备发挥环保且均匀效果的所述提取物以及组合物。
以下，举出实施例等更加具体说明本发明一方面的结构以及效果。然而，以下实施例等仅是为了有助于理解本发明的一方面而作为示例目的提供的，本发明的范畴以及范围并不由此进行限定。
【实施例1】豆培养根的培养
将豆(大豆；glycinemax.)以及宽叶蔓豆(glycinegracilis)分别搁置到ms培养基(murashigeandskoogmedium，duchefa，haarlem，荷兰)中，在反应器内进行发芽。利用离体豆植物的胚根、胚轴、子叶诱导培养根(尤其，从豆的胚根进行诱导)之后，将豆培养根在空气容积为3l的球状(bulbtype)生物反应器(一般可以从市场购入，参考图1)内位于添加有4mg/l的iba(3-吲哚丁酸；indole-3-butyricacid，sigma-aldrich；merckkgaa，darmstadt，德国)、30g/l的蔗糖的ms培养基(murashigeandskoogmedium，duchefa，荷兰)，并每隔3周替换新鲜的培养基，进行传代培养以及增殖。所述培养基是使用了利用1nnaoh将ph调整为5.8之后，在121℃、1.2气压下灭菌35分钟的培养基。所述培养根增殖3周，并切成1-1.5cm，以鲜重为基准以4g/l的密度接种到所述培养基之后，在保持22±1℃的黑暗条件下进行培养。该过程中一直未使用农药、肥料等。空气供应量则是在培养的整个期间利用空气流量计(airflowmeters，rmaseries；dwyerinstruments，inc.美国)以0.1vvm(通气比；airvolume/culturevolumepermin)调整为一定，供应到生物反应器内部的空气则为了保持一定的温度，依次通过能够凝结压缩空气的空气凝结器和能够去除杂质的过滤器以及空气干燥器等之后，利用没有使用油的空气压缩机供应到生物反应器内部。
确认到使用如上所述生物反应器等时，与露地或野外栽培的一般的豆(来自种子、植物体)提取物不同，能够全年生产均匀质量的豆培养根提取物(参考图1)。
【实施例2】提取物的制备
热风干燥利用实施例1的生物反应器增殖4周的豆培养根之后，浸渍到80％(w/v)乙醇使培养根:乙醇的重量比率为1:30，并在常温下提取24小时。提取液是利用滤纸过滤之后蒸发干燥溶剂，收获粉末。确认到本提取物包含约10重量％的香豆雌酚在内的多种活性物质。另外，通过反复提取实验，可以确认到利用通过所述实施例1生产的培养根制备提取物时，提取物内成分保持均匀，确认到可以通过结合传代培养等的所述提取物制备方式进行大量生产。
【实验例1】毛囊干细胞活性的确认(wnt/β-连环蛋白荧光素酶检测；wnt/β-cateninluciferaseassay)
利用leadinglightwntreportercellline(enzolifescience公司)以及one-glo荧光素酶检测报告试剂盒(one-gloluciferaseassayreporterkit，promega,madison，美国)确认所述提取物的毛囊干细胞是否有活性。具体为，在96孔板(wellplate)按照10000个/孔播种(seeding)小鼠胚胎成纤维细胞(nih3t3)(wnt)之后，培养24小时(5％co2，37℃)，然后对阴性对照组未作任何处理，对阳性对照组处理licl(氯化锂；lithiumchloride)24小时，对实验群按照各个浓度处理所述提取物24小时。
然后，在96孔板的各个孔放入100
所述提取物的浓度越高，则β-连环蛋白的转录活性越高(参考图2)。处理50ppm(w/v)所述提取物时，显示wnt/β-连环蛋白活性相比对照组高3.28倍。图2中sare表示所述提取物(大豆不定根提取物；soybeanadventitiousrootextract)。通过β-连环蛋白路径的wnt信号通路(wntsignaling)的维持以及活性化在毛乳头(dermalpapilla)的毛发诱导活性中是必须的，另外，在毛乳头细胞中为了维持生长期(anagen-phase)是必须的。由于所述提取物的处理而wnt/β-连环蛋白活性增加很多，所述活性增加调节毛囊周期(维持生长期以及诱导生长期)，因此可以确认到本发明的提取物具有诱导毛发、促进生发、防脱发等的效果。
【实验例2】毛囊器官的培养以及毛囊周期的测定
为了用于实验，针对6个群的人体，对每个群(组；group)提取15个毛囊样品，分离出90个样品。对于分离的毛囊，在24孔板(nunc，wiesbaden，德国)分株500ul的培养基之后，在各个孔放置5-6样品进行培养。
作为使用的培养基，使用包含2mml-谷氨酰胺(paa，coelbe，德国)、10μg/ml的胰岛素、10ng/ml的皮质醇(hydrocortiisone，sigma公司，美国)、0.1％的两性霉素b(fungizone，gibco公司，美国)、10μg/ml的链霉素、100u/ml的青霉素(gibco公司，美国)的williamse(gibco公司，美国)。
将所述提取物按照各个浓度(0、10、50ppm)处理到所述培养基内的毛囊样品中，并每隔2-3日替换培养基。利用显微镜拍摄毛囊，按照形态基准，分类周期。
从毛囊周期(hairfolliclecycle，hfcycle)测定退行期(catagenphase)相比生长期(anagenphase)的比率。尤其，在生长期-退行期过渡时，角质细胞的凋亡增加，抑制角质细胞的增殖，确认到投入所述提取物的结果，仅27至36％的毛囊过渡到退行期，使用50ppm的所述提取物时，11日之后，退行期相比生长期的比率相比对照组高2倍以上(图3)。即，使用本发明的提取物时，显示毛囊(hf)周期中生长期显著延长(图3中，mnx为米诺地尔(minoxidil)、sare为本发明的提取物(大豆不定根提取物))。由此，可以确认到本发明的提取物具有促进生发以及防脱发效果。另外，由于使用作为天然植物的豆，因此可以确认到也可以解决现有治疗剂的副作用。
【剂型例1】软胶囊剂
混合10mg的所述实施例2的提取物、80-140mg的左旋肉碱(l-carnitine)、180mg的大豆油、2mg的棕榈油、8mg的植物性硬化油、4mg的黄蜂蜡以及6mg的卵磷脂，按照通常的方法填充到1个胶囊，制备软胶囊剂。
【剂型例2】片剂
混合10mg的所述实施例2的提取物、200mg的低聚半乳糖、60mg的乳糖以及140mg的麦芽糖，利用流动层干燥机造粒之后，添加6mg的糖酯(sugarester)，利用压片机压片，制备片剂。
【剂型例3】饮品剂
混合5mg的所述实施例2的提取物、10g的葡萄糖、0.6g的柠檬酸以及25g的液相低聚糖之后，添加300ml的净化水，向每瓶填充200ml。填充到瓶里之后，在130℃下杀菌4-5秒，制备饮品剂。
【剂型例4】注射剂
利用20mg的所述实施例2的提取物、适量的注射用灭菌蒸馏水、适量的ph调节剂，按照通常的方法，制备注射剂。
【剂型例5】健康食品
根据5mg的所述实施例2的提取物、70μg的维生素a醋酸酯、1.0mg的维生素e、0.13mg的维生素b1、0.15mg的维生素b2、60.5mg的维生素b、0.2μg的维生素b12、10mg的维生素c、10μg的生物素、1.7mg的烟酰胺、50μg的叶酸、0.5mg的泛酸钙、1.75mg的硫酸亚铁、0.82mg的氧化锌、25.3mg的碳酸镁、15mg的磷酸二氢钾、55mg的磷酸氢钙、90mg的柠檬酸钾、100mg的碳酸钙、24.8mg的氯化镁的组分，按照通常的方法，制备健康食品。
所述维生素以及无机质混合物的组成比是以比较适合健康食品的成分为例混合组成，然而还可以任意变形实施该配合比也无妨，可以按照通常的健康食品制备方法混合所述成分之后，按照通常的方法制备健康食品组合物而使用。
【剂型例6】霜制剂
使用0.2重量％的所述实施例2的提取物、2.00重量％的聚乙二醇单硬脂酸酯、5.00重量％的自乳化单硬脂酸甘油酯、4.00重量％的丙二醇、6.00重量％的角鲨烯、6.00重量％的三-2-乙基己烷甘油酯、1.00重量％的神经鞘糖酯类、7.00重量％的1,3-丁二醇、5.00重量％的蜂蜡、剩余量的净化水，制备霜制剂。另外，还通过调节净化水的量，调节粘度，制备软膏剂。
1.一种用于防脱发或者促进生发的组合物，其包括豆培养组织的提取物，所述豆培养组织为豆培养根或者豆愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述豆为大豆或者宽叶蔓豆。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述提取物为将水、c1至c6的低级醇或者其混合物作为溶剂进行提取的。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述低级醇为乙醇。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述低级醇浓度为60至100％(w/v)。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物相对于组合物总重量，含有5至15重量％的香豆雌酚。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述防脱发或者促进生发是通过选自由增殖毛乳头细胞、增加毛囊干细胞活性、诱导毛囊生长期、维持或者延长毛囊生长期以及抑制毛囊周期中朝退行期的过渡而成的群中的一种以上完成的。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述防脱发或者促进生发是通过增加β-连环蛋白的转录活性或者增加wnt/β-连环蛋白活性而完成的。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物的投入路径为经皮或者皮肤外用。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物内的所述提取物的浓度为10至100ppm(w/v)。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中，基于所述组合物的投入的所述提取物的投入量为5mg/kg/日至300mg/kg/日。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物为食品、药学或者化妆品组合物。
13.一种均匀且大量制备权利要求1所述的用于防脱发或者促进生发的组合物的方法，其包括：
(1)步骤，使豆培养根位于生物反应器内的培养基中，在所述生物反应器内保持一定的空气供应量并进行增殖；
(2)步骤，干燥经过所述(1)步骤的培养根；
(3)步骤，将经过所述(2)步骤的产物浸渍到醇进行提取；以及
(4)步骤，经过所述(3)步骤之后，进行过滤以及干燥。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述生物反应器为球状鼓泡生物反应器。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(1)步骤的培养基为添加有3-吲哚丁酸、碳源的培养基。
16.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(1)步骤的培养基为ms培养基。
17.根据权利要求13所述的方法，其中，在所述(1)步骤中，使豆培养根位于培养基时的培养基ph为4.8至6.8。
18.根据权利要求13所述的方法，其中，在所述(1)步骤中，使豆培养根位于培养基时的密度为2至6g/l。
19.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(1)步骤的增殖是在黑暗条件下进行。
20.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(1)步骤是在19至25℃下进行。
21.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(1)步骤的空气供应量为0.05至0.4vvm。
22.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(1)步骤的增殖进行3至5周。
23.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(3)步骤的醇浓度为60至100％(w/v)。
24.根据权利要求13所述的方法，其中，所述(3)步骤的提取时间为20至28小时。
技术总结