本公开包括融合多肽、融合多肽的制造方法和编码融合多肽的dna。
背景技术：
：非专利文献1记载有：当使重组vp1蛋白在大肠杆菌中表达且按照以往的蛋白质生成规程用离子交换色谱进行纯化时，重组vp1蛋白的收率变差。并且，非专利文献1中记载有：在vp1蛋白的位于hi-loop附近的半胱氨酸紧后方插入包含低聚谷氨酸序列(e6、e8、e10)的序列，防止重组vp1蛋白的聚集而形成病毒样粒子。现有技术文献非专利文献非专利文献1：k.stubenraucha,bachmannb,rudolpha,h.lilie；journalofchromatographyb,737(2000)77-84技术实现要素：发明要解决的课题在通过基因重组制造多肽的情况下，存在如下课题：所表达的多肽的半胱氨酸中所含的自由巯基不稳定，与其它巯基键合，结果是所制造的多肽容易形成多聚体。本发明的课题在于，在宿主细胞中通过基因重组表达多肽并回收多肽时，尽可能以还原状态维持多肽内的巯基。用于解决课题的手段本发明提供一种融合多肽，其包含目标多肽和标签多肽。涉及一种融合多肽，其中，标签多肽存在于目标多肽的n末端侧和/或c末端侧且包含xaa-cys-zaa所示的结构。在该融合多肽中，(1)xaa为asp或glu且zaa为asp或glu；或者，(2)xaa为lys或arg且zaa为lys或arg。根据本发明，可以提供一种融合多肽，其中，标签多肽部分的半胱氨酸的巯基受到保护，受到保护的巯基变得容易结合标记等。本发明涉及一种融合多肽的制造方法，其包含：使用编码上述融合多肽的dna产生上述融合多肽的工序；回收所表达的上述融合多肽的工序。另外，本发明涉及编码融合多肽的dna。根据这些实施方式，可以制造标签多肽部分的半胱氨酸的巯基受到保护的融合多肽。发明的效果根据本发明，可以提供标签多肽部分的半胱氨酸的巯基受到保护的融合多肽。附图说明图1：(a)示出在目标多肽的c末端侧包含标签多肽的融合多肽的结构例。(b)示出在目标多肽的n末端侧包含标签多肽的融合多肽的结构例。(c)示出在目标多肽的c末端侧包含接头和标签多肽的融合多肽的结构例。(d)示出在目标多肽的n末端侧包含接头和标签多肽的融合多肽的结构例。(e)作为包含2个以上的肽单元的融合多肽的例子，示出包含抗体的重链的fab’和抗体的轻链的抗体的fab’的例子。(f)示出从融合多肽的n末端侧起包含第一目标多肽、标签多肽和第二目标多肽的融合多肽的结构例。(g)示出在标签多肽的半胱氨酸上结合有标记物的例子。图2：(a)示出编码在目标多肽的c末端侧包含标签多肽的融合多肽的核酸的结构例。(b)示出编码在目标多肽的n末端侧包含标签多肽的融合多肽的核酸的结构例。(c)示出编码在目标多肽的c末端侧包含接头和标签多肽的融合多肽的核酸的结构例。(d)示出编码在目标多肽的n末端侧包含接头和标签多肽的融合多肽的核酸的结构例。(e)示出编码包含第一目标多肽、标签多肽和第二目标多肽的融合多肽的核酸的结构例。图3示出用大肠杆菌所表达的融合多肽的sds-page图像。图4示出用大肠杆菌所表达的融合多肽的蛋白质印迹图像。图5示出用大肠杆菌所表达的融合多肽的蛋白质印迹图像。图6示出使用以融合多肽形式表达的fab’的elisa的结果。图7示出用大肠杆菌所表达的融合多肽的sds-page图像。具体实施方式[融合多肽]本公开的第一实施方式涉及融合多肽。如图1的(a)和(b)所示，融合多肽至少包含目标多肽和标签多肽。＜目标多肽＞目标多肽是指与融合多肽的使用目的相应的多肽。构成目标多肽的氨基酸残基的数量没有特别限定。例如，可以是数个残基左右的寡肽，也可以是数百至数万残基的蛋白质。目标多肽没有特别限定，可列举例如抗体、抗体片段、抗原、酶、受体蛋白、配体蛋白等。具体而言，可列举构成抗体的免疫球蛋白、细胞的表面抗原、细胞内蛋白、核内蛋白等。另外，可以是用于封闭在免疫分析等中使用的固相(板、珠、膜等)的表面的蛋白质(通常称为封闭剂)。可列举例如白蛋白、酪蛋白、明胶等。作为抗体片段，可列举抗体的fab、抗体的fab’、抗体的重链或轻链。重链或轻链可以是至少包含部分可变区的重链和/或轻链的一部分。至少部分可变区中包含至少1个、优选至少2个、更优选3个互补性决定区(cdr)。另外，至少部分可变区中可以与cdr相邻地包含框架区(fr)。在至少包含部分可变区的重链和轻链的一部分中，可包含例如scfv(singlechainfv)之类的在1个多肽内包含至少1个重链的cdr和至少1个轻链的cdr的所谓单链抗体的形态。作为目标多肽，更优选列举抗体的fab、抗体的fab’、重链的fab部分或fab’部分。在此，抗体的fab是指重链的fab部分和轻链结合的片段。抗体的fab’是指重链的fab’部分和轻链结合的片段。重链的fab部分是不含成为抗体的铰链部的2个半胱氨酸的抗原结合区域，是指未与轻链结合的重链片段。重链的fab’部分是包含成为抗体的铰链部分的2个半胱氨酸的抗原结合区域，是未与轻链结合的重链片段。重链的恒定区可以是α链、δ链、ε链、γ链、和μ链中的任一者。α链和γ链的同种型也不受限制。另外，轻链的恒定区可以是κ链、和λ链中的任一者。重链或轻链的来源可以列举人、小鼠、大鼠、鸡、狗、猫、绵羊、天竺鼠、山羊、猪等。另外，重链或轻链可以是将来源于人以外的动物种属的氨基酸序列改造为人的氨基酸序列的改造体，也可以是具有2种以上的异种动物的氨基酸序列的嵌合体。＜标签多肽＞标签多肽包含xaa-cys(半胱氨酸)-zaa所示的结构。xaa和zaa分别表示1个氨基酸。在此，“zaa”不同于氨基酸的单字母表示法中的表示“谷氨酸或谷氨酰胺”的“z”。xaa是指n末端侧，zaa是指c末端侧。在一实施方式中，xaa和zaa均为酸性氨基酸。该实施方式中，xaa可以是asp或glu且zaa可以是asp或glu。在另一实施方式中，xaa和zaa均为碱性氨基酸。该实施方式中，xaa可以是lys或arg且zaa可以是lys或arg。本公开中，除了用3字母来表示氨基酸以外，有时也用单字母表示法表示。用单字母法时，半胱氨酸用“c”来表示，天冬氨酸用“d”来表示，谷氨酸用“e”来表示，赖氨酸用“k”来表示，精氨酸用“r”来表示，丙氨酸用“a”来表示。优选标签多肽包含(paa)m-xaa-cys-zaa-(qaa)n所示的结构。在此，“paa”表示1个氨基酸，不同于氨基酸的单字母表示法中的表示“脯氨酸”的“p”。“qaa”表示1个氨基酸，不同于氨基酸的单字母表示法中的表示“谷氨酰胺”的“q”。x和z分别表示氨基酸，m和n分别独立地表示氨基酸数，从0至20、优选1至15的整数中选择。更优选m和n分别独立地表示选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、和15中的氨基酸数。(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n优选具有相同的电极性。通过使(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n具有相同的电极性，从而彼此排斥，可期待防止夹在其间的半胱氨酸的巯基与其它基团结合的效果。因此，(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性可以是阴性也可以是阳性。电极性可以如下求出：基于(paa)m-xaa或zaa-(qaa)n中所含的各氨基酸的侧链的pka值，计算标签多肽所存在的溶液的ph下(paa)m-xaa或zaa-(qaa)n的有效电荷。在有效电荷为正值时，电极性为阳性，在有效电荷为负值时，电极性为阴性。在此，(paa)m-xaa的有效电荷和zaa-(qaa)n的有效电荷可以不相等。在(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阴性时，优选xaa为asp或glu、m为1以上且xaa紧前方的氨基酸、即与xaa的n末端侧相邻的氨基酸为asp或glu。另外，在(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阴性时，优选zaa为asp或glu、n为1以上且zaa紧后方的氨基酸、即与zaa的c末端侧相邻的氨基酸为asp或glu。另外，在(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阴性时，更优选(paa)m和/或(qaa)n不含碱性氨基酸。在(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阳性时，优选xaa为lys或arg、m为1以上且xaa紧前方的氨基酸、即与xaa的n末端侧相邻的氨基酸为lys或arg。另外，在(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阳性时，优选zaa为lys或arg、n为1以上且zaa紧后方的氨基酸、即与zaa的c末端侧相邻的氨基酸为lys或arg。另外，在(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阳性时，更优选(paa)m和/或(qaa)n不含酸性氨基酸。氨基酸的极性如下所示。有时将酸性氨基酸和碱性氨基酸统称为极性氨基酸。酸性氨基酸：asp(天冬氨酸)、glu(谷氨酸)碱性氨基酸：arg(精氨酸)、trp(色氨酸)、his(组氨酸)、lys(赖氨酸)另外，(paa)m和/或(qaa)n优选不含cys。＜融合多肽的结构＞融合多肽中，标签多肽可以存在于目标多肽的n末端侧也可以存在于c末端侧。图1的(a)中示出在目标多肽的n末端侧存在标签多肽的例子。另外，图1的(b)中示出在目标多肽的c末端侧存在标签多肽的例子。优选标签多肽存在于目标多肽的c末端区域。标签多肽和目标多肽可以直接结合，也可以如图1的(c)和图1的(d)所示那样借助接头结合。接头可以是目标多肽、标签多肽中不包含的任意序列，可以具有例如聚组氨酸标签序列、c-myc标签序列、flag(注册商标)标签序列、ha标签序列、v5序列、硫氧还蛋白序列、谷胱甘肽-s-转移酶序列、增强可溶性的标签(solubilityenhancementtags，set)序列等第二标签序列。接头可以包含至少1个氨基酸。接头优选包含1至20个氨基酸，更优选包含1至15个氨基酸。融合多肽可以包含图1的(a)至(d)所示那样的单一的肽单元，也可以如图1的(e)所示那样包含2个以上的肽单元。图1的(e)示出抗体的fab’的例子。关于融合多肽中所含的肽单元的数量，只要能够发挥融合多肽中所含的目标多肽的功能则没有限制。融合多肽中包含2个以上的肽单元的情况下，标签多肽可以包含在任意1个单元中，也可以包含在多个单元中。融合多肽可以在n末端侧或c末端侧包含目标多肽和标签多肽以外的序列。一实施方式中，融合多肽包含第一目标多肽、标签多肽和第二目标多肽。即，在该融合多肽中，标签多肽被两种目标多肽夹着(图1的(f))。第一目标多肽和第二目标多肽是来源于构成特定的1种蛋白质的多肽的多肽，可以是具有相同的氨基酸序列或具有不同的氨基酸序列的多肽。或者，第一目标多肽和第二目标多肽可以是来源于不同种类的蛋白质的多肽。例如，第一目标多肽可以为来源于期望的蛋白质的多肽、第二目标多肽可以为提高融合多肽的可溶性的多肽。另外，在构成包含于特定的蛋白质的1个单元的多肽的氨基酸序列中，可以插入标签多肽的氨基酸序列。具体而言，可以在sv40的vp1蛋白的环区域(hi环、de环等)中插入标签多肽的氨基酸序列。这种情况下，该融合多肽包含作为第一目标多肽的vp1的n末端侧的多肽、标签多肽和作为第二目标多肽的vp1的c末端侧的多肽。另外，融合多肽可以包含糖链修饰。另外，融合多肽中所含的标签多肽内的用xaa-cys-zaa表示的结构中的半胱氨酸可以如图1的(g)所示那样被标记物标记。在此，“标记”是指通过化学键直接或间接地与标记物结合。作为标记物，可列举例如半抗原、粒子、信号发生物质、酶、荧光物质等。作为半抗原，可列举生物素、二硝基苯酚(dnp)等。作为粒子，可列举金属粒子、聚苯乙烯粒子、胶乳粒子等。粒子可以具有磁性。作为信号发生物质，可列举荧光物质、发光物质、放射性同位素等。作为荧光物质，可列举异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明、alexafluor(注册商标)等荧光色素、gfp等荧光蛋白等。酶是可催化其它物质的化学反应而产生信号的物质，具体可列举碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。标记物可借助半胱氨酸的巯基与融合多肽结合。标记物与巯基的结合方法如以下所示，是公知的。半胱氨酸的巯基可以通过与具有马来酰亚胺基或溴(或碘)乙酰胺基作为反应基团的化合物进行交联、从而与标记物结合(参照下图)。例如，在标签多肽的半胱氨酸的巯基与具有巯基的标记物进行交联时，可以使用两端具有马来酰亚胺的交联试剂或接头。【化1】上述的交联反应可以在常温常压下进行。反应中使用的溶剂只要是相对于上述反应为惰性、且可以溶解或分散供于反应的各化合物就没有特别限定。作为这样的溶剂，可列举例如：苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃类；乙醚、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、1,4-二噁烷等醚类；n,n-二甲基甲酰胺等酰胺类；二甲基亚砜等亚砜类；二氯甲烷、氯仿等卤代烃类等。可以单独使用这些溶剂或以混合液形式使用。[融合多肽的制造方法]本公开的第二实施方式涉及第一实施方式所述的融合多肽的制造方法。融合多肽的制造方法只要可得到期望的融合多肽就没有限制。例如，可以使用基因重组技术进行融合多肽的制造。可以使用编码融合多肽的dna利用无细胞系或细胞进行融合多肽的制造。融合多肽的制造方法包含使用至少编码融合多肽的dna产生上述融合多肽的工序和回收所表达的上述融合多肽的工序。＜表达载体的准备＞首先，准备编码融合多肽的氨基酸序列的核酸(dna)。就编码融合多肽的核酸而言，例如将编码用于表达目标多肽的cdna序列的互补链序列的(以下简记为“编码目标多肽”)的dna和编码标签序列的dna插入表达载体，从而构建表达融合多肽的表达载体。当融合多肽的c末端侧存在标签多肽时，如图2的(a)所示，载体中，在启动子的下游从5’侧起排列编码目标多肽的序列、编码标签多肽的序列。当融合多肽的n末端侧存在标签多肽时，如图2的(b)所示，载体中，在启动子的下游从5’侧起排列编码标签多肽的序列、编码目标多肽的序列。另外，在目标多肽和标签多肽之间存在接头、且融合多肽的c末端侧存在标签多肽的情况下，如图2的(c)所示，载体中，在启动子的下游从5’侧起排列编码目标多肽的序列、编码接头的序列、编码标签多肽的序列。在目标多肽和标签多肽之间存在接头、且融合多肽的n末端侧存在标签多肽的情况下，如图2(d)所示，载体中，在启动子的下游从5’侧起排列编码标签多肽的序列、编码接头的序列、编码目标多肽的序列。在融合多肽包含第一目标多肽、标签多肽和第二目标多肽的情况下，如图2的(e)所示，载体中，在启动子的下游从5’侧起排列编码第一目标多肽的序列、编码标签多肽的序列、编码第二目标多肽的序列。编码目标多肽的序列和编码标签多肽的序列既可以分别插入到表达载体中，也可以以编码目标多肽的序列和编码标签多肽的序列连接而成的核酸形式插入。编码接头的序列既可以是表达载体预先具备的序列，也可以添加在编码标签多肽的序列或编码目标多肽的序列上。另外，也可以以编码目标多肽的序列、编码接头的序列和编码标签多肽的序列连接而成的核酸形式插入。表达载体可以选择公知的载体。作为载体的具体例，可列举质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(例如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)和疱疹病毒载体等)等。作为无细胞系的表达系统、和宿主为大肠杆菌时的载体，可列举例如pbluescript、pbr322或其改造体(例如pb325、pat153、和puc8等)；puc19、pgem-t、pcr-blunt、pta2、pet等质粒载体；或者m13噬菌体或其改造体；λ噬菌体或其改造体等。优选载体包含营养需求性标记、抗药标记、表达融合多肽的启动子以外的表达启动子序列、表达终止子序列。更优选载体包含pbluescript来源的氨苄青霉素抗性基因、乳糖启动子。另外，还可使用适合于自我克隆的载体。在以酵母为宿主的情况下，可以使用pyepsec1、pmfa、pyes2等质粒载体。在以昆虫细胞为宿主的情况下，可以使用例如pac、pvl等质粒载体。在以哺乳类细胞为宿主的情况下，可以使用例如pcdm8、pmt2pc等质粒载体，当然，不限于这些。用于表达上述融合多肽的表达载体的构建方法是公知的。＜无细胞系的表达系统＞在使用无细胞系的表达系统表达融合多肽的情况下，首先取得编码融合多肽的rna。上述rna可如下取得：将包含编码融合多肽的dna的载体在融合多肽序列的3’末端的下游用限制酶切割而直链化，使用能够从存在于融合多肽的5’末端侧的启动子进行翻译的转录酶进行转录反应。这种情况下，作为启动子，可以使用t7启动子、t3启动子、sp6启动子等。对应于上述启动子的转录酶为t7rna聚合酶、t3rna聚合酶、sp6rna聚合酶。将通过转录反应得到的rna与从大肠杆菌、兔网织红细胞裂解物(rrl)、小麦胚芽提取物和昆虫细胞(sf9或sf21等)等提取的维持翻译功能的无细胞提取物(包含核糖体、翻译因子和trna等)以及能量源(atp)、氨基酸混合，在规定的温度下孵育规定时间，从而可以产生融合多肽。＜使用宿主细胞的表达系统＞作为导入用于表达融合多肽的表达载体的宿主细胞，可列举大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞。表达载体向这些宿主细胞中的导入方法、宿主细胞的培养方法是公知的。在导入了表达载体的宿主细胞中诱导插入到表达载体中的融合多肽的表达的方法也是公知的。例如，在宿主的基因组具有de3序列的情况下，作为用于表达t7rna聚合酶、t3rna聚合酶的启动子，具有lac操纵子序列，因此可以利用异丙基-β-硫代半乳吡喃糖苷诱导t7rna聚合酶、t3rna聚合酶的表达。在这样的宿主细胞中，可以通过有无添加异丙基-β-硫代半乳吡喃糖苷来控制融合多肽的表达。＜所表达的融合多肽的回收和折叠＞可以通过公知的方法回收所表达的融合多肽。另外，可以根据需要对所回收的融合多肽进行重折叠。重折叠方法也是公知的。当所表达的融合多肽存在于培养基等细胞外级分中时，可以通过离心分离等将细胞外级分和宿主细胞分离后，回收包含融合多肽的细胞外级分作为融合多肽粗纯化液。在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，有时所表达的融合多肽存在于周质级分中。这种情况下，例如可以将回收到包含蔗糖、tris盐酸缓冲液和edta等的蔗糖缓冲液等周质提取缓冲液中的宿主细胞悬浮，利用硫酸镁施加渗透压冲击，从而提取周质级分。可以回收周质级分的提取液作为融合多肽的粗纯化液。当所表达的融合多肽存在于宿主细胞的可溶性级分中时，可以将宿主细胞悬浮于包含表面活性剂的细胞溶解缓冲液等中，根据需要用超声波等进行破碎处理并回收通过离心分离等得到的上清来作为融合多肽的粗纯化液。当所表达的融合多肽存在于宿主细胞的不溶性级分(用细胞溶解缓冲液等溶解全部细胞后的固态级分或包涵体等)时，可以将不溶性级分悬浮、溶解于尿素或盐酸胍等变性缓冲液等后，对溶解液进行透析而除去变性剂成分，从而得到融合多肽的粗纯化液。关于从所回收的融合多肽的粗纯化液中纯化融合多肽，可以通过凝胶过滤、离子交换色谱等进行纯化。另外，在融合多肽具有接头且其接头内存在上述第二标签序列的情况下，可以通过进行与第二标签序列相应的亲和纯化来纯化融合多肽。进一步地，在纯化后的融合多肽未正确折叠时，可以进行重折叠。例如，将纯化后的融合多肽溶解于含有尿素、盐酸胍等的变性缓冲液等或者向融合多肽的粗纯化液中添加尿素、盐酸胍等变性剂而溶解融合多肽的聚集体后，通过例如arakawaandejima(antibodies2014,3,232-241；doi:10.3390/antib3020232)中记载的稀释重折叠法、透析重折叠法、固相重折叠法、尺寸排阻色谱重折叠法、表面活性剂重折叠法等进行重折叠。优选透析重折叠法。例如，为了制造抗体的fab部分和fab’部分，在不同的烧瓶内使大肠杆菌分别表达以抗体的重链的fab部分(或fab’部分)为目标多肽的融合多肽和抗体的轻链，从各烧瓶中回收大肠杆菌，将各大肠杆菌的周质级分溶解于变性缓冲液(优选6m盐酸胍缓冲液)。按照所表达的融合多肽和抗体的轻链为等摩尔比的方式将各变性缓冲液溶解液混合，例如按照arakawaandejima中记载的透析重折叠法对该混合液进行透析，从而可以回收融合多肽中所含的重链的fab部分(或fab’部分)和轻链结合而成的抗体的fab部分(或fab’部分)。透析的条件可根据纯化规模、目标多肽的种类适当变更。用于使抗体的fab部分(或fab’部分)重折叠的透析可以在下述条件下进行：透析液1[3m～3.5m盐酸胍；50mm左右的tris-hcl缓冲液(ph7.8～8.2)；1mm左右的edta]中6～10小时左右、透析液2[2m～2.5m盐酸胍；50mm左右的tris-hcl缓冲液(ph7.8～8.2)；1mm左右的edta]中10～14小时左右、透析液3[1m～1.5m盐酸胍；0.3m～0.5m精氨酸盐酸盐；50mm左右的tris-hcl缓冲液(ph7.8～8.2)；1mm左右的edta；二硫键交换反应试剂(1mmgsh/1mmgssg)]中10～14小时左右、透析液4[0.3m～0.75m盐酸胍；0.3m～0.5m精氨酸盐酸盐；50mm左右的tris-hcl缓冲液(ph7.8～8.2)；1mm左右的edta；二硫键交换反应试剂(1mmgsh/1mmgssg)]中10～14小时左右、透析液5[50mm左右的tris-hcl缓冲液(ph7.8～8.2)；1mm左右的edta]中10～14小时左右。进一步地，融合多肽的制造方法可以包含下述工序：使标签多肽中所含的上述xaa-cys-zaa中的cys与标记物结合。关于“标记物”和标记物的结合，在此援引[融合多肽]部分的说明。【实施例】以下示出实施例来更详细地说明本公开的实施方式，本公开的实施方式并非限定于实施例来解释。1.实施例1使用pmal-p5x大肠杆菌表达系统表达融合多肽，所述融合多肽是在作为目标多肽的麦芽糖结合蛋白(mbp)的c末端侧借助6个组氨酸的聚组氨酸标签分别连接表1所示的序列号1至5的标签多肽而成的。该系统中，mbp不含半胱氨酸，因此融合多肽的聚集性依赖于标签多肽内的半胱氨酸。【表1】标签多肽序列号dddcddd(d3cd3)1ddddddcdd(d6cd2)2ddddcdddd(d4cd4)3ddddcdd(d4cd2)4dddddcd(d5cd)5利用使用蔗糖缓冲液(30mmtrishcl、20％蔗糖、ph＝8、1mmedta)和5mm硫酸镁的冰冷却下的渗透压冲击法，提取包含所表达的融合多肽的周质级分。从所提取的周质级分中，使用直链淀粉树脂和洗脱缓冲液(20mmtris-cl，200mmnacl，1mmedta，ph7.4)纯化融合多肽。不经还原，将所纯化的融合多肽用sds-page进行分析。作为不形成二硫键的对照，使用mbp和结合有sibtech所设计的15个氨基酸的肽标签(sib)的mbp。另外，作为形成二硫键的对照，使用小鼠铰链(vprdcgg：序列号14)重链链间二硫化物序列(m.hinge)。将结果示于图3。mbp和sib在非还原状态下也不形成二硫键，因此仅检测到单体的条带。m.hinge检测到二聚物条带。认为原因在于，m.hinge的序列内包含半胱氨酸，在非还原状态下形成了二硫键。结合有序列号1至5的标签多肽的融合蛋白与m.hinge相比，二聚物的形成得到了抑制。关于图3所示的结果，使用imagej(美国国立卫生研究所)对各多肽的单体和二聚物的条带浓度进行定量并求出单体的比率。进一步地，对于所求出的单体比率，以m.hinge为基准计算单体比率的相对比(monomerratio/m.hinge)。将其结果示于表2。【表2】单体比率/m.hingembp1.658sib1.632m.hinge1d3cd31.455d6cd21.586d4cd41.563d4cd21.528d5cd1551与m.hinge相比，就d3cd3、d6cd2、d4cd4、d4cd2、或d5cd的标签多肽而言，表明monomerratio/m.hinge得到改善，聚集得到抑制。2.实施例2然后，与实施例1同样地使用mbp作为目标多肽，将标签多肽中所含的半胱氨酸以外的氨基酸变更为碱性氨基酸的情况下，改变天冬氨酸的数量、位置，通过蛋白质印迹研究单体的比率。研究通过蛋白质印迹而进行。作为蛋白质印迹的一抗，使用anti-6-his兔多克隆抗体。作为二抗，使用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/hrp缀合物。将实施例2中使用的标签多肽的序列示于表3。【表3】标签多肽序列号kkkckk6rrcrr7ddcdd8dddcddd1图4示出蛋白质印迹的结果。关于图4所示的结果，对各多肽的单体和二聚物的条带浓度进行定量并求出单体比率。将其结果示于表4。【表4】单体比率(％)kkckk100rrcrr100ddcdd92.53082077dddcddd100如图4的左图所示，即使在将作为酸性氨基酸的天冬氨酸变更为作为碱性氨基酸的赖氨酸或精氨酸的序列号6或序列号7的标签多肽的情况下，也可以维持单体的状态。另外，如序列号8所示，即使减少天冬氨酸的数量，单体的比率也超过92％。这些结果表明，优选半胱氨酸的两侧存在极性氨基酸。另外，在融合多肽的收率方面，对比在半胱氨酸的两侧存在2个极性氨基酸的序列号6、7、和8，包含含有酸性氨基酸的序列号8的标签多肽的融合多肽在图4中清晰地出现条带。3.实施例3然后进行hbs85单克隆抗体的fab’部分的体外构建。使用pet系统在de3阳性的大肠杆菌中表达作为目标多肽的在hbs85单克隆抗体的重链的fab’部分的c末端侧夹着作为接头的甘氨酸而连接序列号1、2和5所示的标签多肽而成的融合多肽。另外，在另外的大肠杆菌中表达hbs85单克隆抗体的轻链。提取表达融合多肽的大肠杆菌的周质级分和表达轻链的大肠杆菌的周质级分，分别溶解于包含6m盐酸胍的变性缓冲液，制备溶解液。按照融合多肽和轻链为等摩尔比的方式将各溶解液混合，供于以下条件的透析，使融合多肽和轻链边进行重折叠边结合。透析液1[3m盐酸胍；50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)；1mmedta]中8小时、透析液2[2m盐酸胍；50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)；1mmedta]中12小时、透析液3[1m盐酸胍；0.4m精氨酸盐酸盐；50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)；1mmedta；二硫键交换反应试剂(1mmgsh/1mmgssg)]中12小时、透析液4[0.3m盐酸胍；0.4m精氨酸盐酸盐；50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)；1mmedta；二硫键交换反应试剂(1mmgsh/1mmgssg)]中12小时、透析液5[50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)；1mmedta]中12小时。透析在4℃下进行。通过非还原条件和还原条件的蛋白质印迹对重折叠后的hbs85单克隆抗体的fab’部分进行评价。抗体使用了hrp标记抗小鼠免疫球蛋白抗体。作为形成二硫键的对照，使用originalmousehinge(m.hingewt：ckpcic：序列号15)。作为不形成二硫键的阴性对照，为hbs85wt(包含铰链序列和标签多肽，不形成二聚物)。如图5所示，在非还原状态下，m.hingewt显示强聚集，而包含序列号1、2、和5所示的标签多肽的融合多肽和轻链的复合体以不聚集的状态存在。关于图5所示的结果，对各多肽的单体和二聚物的条带浓度进行定量，求出单体的比率，结果，就hbs85wt和包含序列号1、2、或5所示的标签多肽的fab’部分而言，单体比率为100％。然后，使用重折叠的hbs85单克隆抗体的fab’部分，通过elisa法确认非还原条件下与抗原的结合性。使用马来酰亚胺反应在重折叠后的hbs85单克隆抗体的fab’部分结合生物素，通过elisa检测hbs抗原。将elisa中各fab’部分的反应性示于图6。以将m.hingewt作为阴性对照的相对比率来表示反应性。使用融合多肽构建的fab’部分与使用hbs85-wt构建的fab’部分显示出同等的反应性。4.实施例4然后，与实施例1同样地以mbp为目标多肽，对其它标签多肽的序列研究是否具有维持融合多肽的单体比率的效果。除了序列号1、2、和5所示的标签多肽以外，对表5所示的序列进行了研究。序列号9至13是在标签多肽中插入了作为中性氨基酸的丙氨酸。作为不形成二硫键的对照，使用mbp，作为形成二硫键的对照，使用m.hinge2(ckpsis：序列号16)。【表5】标签多肽序列号dddcddd(d3cd3)1dddddcd(d5cd)5ddddddcdd(d6cd2)2dcdaaaaaaaaaaaaaaaaaa(dcda18)9aaaaaaaaaaaaaaaaaadcd(a18dcd)10aaaaaaaaadcdaaaaaaaaa(a9dcda9)11aaaadcdaaaa(a4dcda4)12adcda13dcdecercrkck图7示出通过sds-page对融合多肽进行电泳的结果。另外，关于图7所示的结果，对各多肽的单体和二聚物的条带浓度进行定量并求出单体的比率。进一步地，对于所求出的单体比率，以m.hinge2为基准计算单体比率的相对比(monomerratio/m.hinge2)。将其结果示于表6。【表6】单体比率/m.hinge2mbp2.486m.hinge21d3cd32.002d5cd1.977d6cd22.134dcda181.680a18dcd1.575a9dcda92.290a4dcda42.288adcda1.906dcd1.663ece1.473rcr1.447kck1.603图7中，与m.hinge2相比，就所研究的标签多肽而言，单体的条带均比二聚物的条带强。另外，表6中，与m.hinge2的单体比率相比，所研究的包含标签多肽的融合多肽显示出高的单体比率。另外，显示出极性氨基酸的数量越多则单体的比率越高的倾向。即使标签多肽内插入无极性的氨基酸，单体比率也显示出高于m.hinge2的值，但是序列号9和10的标签多肽在图7中检测出2条单体的条带。这表明，在回收融合多肽期间，a18的部分有可能被切断。另一方面，虽然序列号12的标签多肽夹着半胱氨酸而包含各9个、共计18个无极性的氨基酸，但未确认到切断。序列表<110>希森美康株式会社（sysmexcorporation）<120>融合多肽<130>18-009cn<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>1aspaspaspcysaspaspasp15<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>2aspaspaspaspaspaspcysaspasp15<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>3aspaspaspaspcysaspaspaspasp15<210>4<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>4aspaspaspaspcysaspasp15<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>5aspaspaspaspaspcysasp15<210>6<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>6lyslyscyslyslys15<210>7<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>7argargcysargarg15<210>8<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>8aspaspcysaspasp15<210>9<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>9aspcysaspalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaala151015alaalaalaalaala20<210>10<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>10alaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaalaala151015alaalaaspcysasp20<210>11<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>11alaalaalaalaalaalaalaalaalaaspcysaspalaalaalaala151015alaalaalaalaala20<210>12<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>12alaalaalaalaaspcysaspalaalaalaala1510<210>13<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>13alaaspcysaspala15<210>14<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>14valproargaspcysglygly15<210>15<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>15cyslysprocysilecys15<210>16<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>标签序列<400>16cyslysproserileser15当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种融合多肽，其包含目标多肽和标签多肽，
标签多肽存在于目标多肽的n末端侧和/或c末端侧且包含xaa-cys-zaa所示的结构，
xaa为asp或glu且zaa为asp或glu，或者
xaa为lys或arg且zaa为lys或arg。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中，所述标签多肽包含(paa)m-xaa-cys-zaa-(qaa)n所示的结构，paa和qaa各自表示氨基酸，m和n分别独立地表示选自0至20的整数的氨基酸数量，
(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n具有相同的电极性。
3.根据权利要求2所述的融合多肽，其中，(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阴性，或者
(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阳性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合多肽，其中，所述目标多肽为抗体。
5.根据权利要求4所述的融合多肽，其中，所述抗体包含选自由
·抗体的重链的fab、
·fab’、和
·抗体的轻链
组成的组中的至少1者。
6.根据权利要求1至7中任一项所述的融合多肽，其中，所述标签多肽结合在所述目标多肽的c末端侧。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的融合多肽，其中，(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阴性，m从1至20的整数中选择，xaa紧前方的氨基酸为asp或glu。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的融合多肽，其中，(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阴性，n从1至20的整数中选择，zaa紧后方的氨基酸为asp或glu。
9.根据权利要求7或8所述的融合多肽，其中，(paa)m不含碱性氨基酸。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的融合多肽，其中，(qaa)n不含碱性氨基酸。
11.根据权利要求3至6中任一项所述的融合多肽，其中，(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阳性，m从1至20的整数中选择，xaa紧前方的氨基酸为lys或arg。
12.根据权利要求3至7中任一项所述的融合多肽，其中，(paa)m-xaa和zaa-(qaa)n的电极性为阳性，n从1至20的整数中选择，zaa紧后方的氨基酸为lys或arg。
13.根据权利要求11或12所述的融合多肽，其中，(paa)m不含酸性氨基酸。
14.根据权利要求12至15中任一项所述的融合多肽，其中，(qaa)n不含酸性氨基酸。
15.根据权利要求4所述的融合多肽，其中，所述抗体是抗体的重链的fab或fab’与抗体的轻链结合着的抗体的fab或fab’。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的融合多肽，其中，所述xaa-cys-zaa中的cys上结合有标记物。
17.一种融合多肽的制造方法，其包含：
使用编码权利要求1～17中任一项所述的融合多肽的dna产生所述融合多肽的工序；和
回收所表达的所述融合多肽的工序。
18.根据权利要求17所述的融合多肽的制造方法，其中，在所述产生工序中，将所述dna序列导入到宿主细胞中，在所述宿主细胞中表达所述融合多肽。
19.根据权利要求17或18所述的制造方法，其还包含：使从所述宿主细胞回收的融合多肽重折叠。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的制造方法，其中，融合多肽为抗体，所述制造方法还包含使抗体的重链的fab或fab’与抗体的轻链结合的工序。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的制造方法，其还包含使所述融合多肽的所述xaa-cys-zaa中的cys与标记物结合的工序。
22.一种dna，其编码权利要求1～16中任一项所述的融合多肽。
技术总结本发明提供融合多肽、融合多肽的制造方法、和编码融合多肽的DNA。本发明的融合多肽包含目标多肽和标签多肽。标签多肽存在于目标多肽的N末端侧和/或C末端侧，包含Xaa‑Cys‑Zaa所示的结构，Xaa为Asp或Glu且Zaa为Asp或Glu，或者Xaa为Lys或Arg且Zaa为Lys或Arg。
技术研发人员：R·巴亚;福永淳
受保护的技术使用者：希森美康株式会社
技术研发日：2019.11.27
技术公布日：2020.06.05
