本发明涉及治疗和营养品领域，特别是本发明涉及葡萄皮或包含葡萄皮的组合物作为益生元用于使对象增加产丁酸盐细菌(例如普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌(roseburiahominis)和变异罕见小球菌(subdoligranulumvariabile))中的用途。
更具体地，本发明涉及治疗对象的肠生态失调的方法中使用的葡萄皮或包含葡萄皮的组合物，其中肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌的水平降低和/或活性降低。另外，本发明涉及葡萄皮或包含葡萄皮的组合物，该葡萄皮或包含葡萄皮的组合物用于治疗产丁酸盐细菌的水平降低和/或活性降低的对象的炎性或非炎性肠疾病的方法。
背景技术：
越来越多的证据表明，肠道微生物群的生态失调是一种与肠疾病和肠外疾病的发病机制相关的病症(cardingetal.,microbecolhealthdis.2015；26:10.3402；lopetusoetal.,gutpathogens2013,5:23)。肠疾病可包括炎性肠病、肠易激综合征和乳糜泻，而肠外疾病包括例如过敏、哮喘、代谢综合征、心血管疾病和肥胖症。
多位作者报道了肠疾病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎或结直肠癌)中的普氏粪杆菌的丰度降低(miquels.etal.,currentopinioninmicrobiology2013,16:1-7；sartorr.b,the111thabbottnutritionresearchconference2010,p23-29；lopez-silesetal.,appl.environmicrobiol.2015,81:7582-7592；lopez-silesetal.inflammboweldis2016,22:28-41；andlopez-silesetal.,theismejournal2017,11:841-852)。特别是，炎性肠病(ibd)患者经常表现出普氏粪杆菌肠道水平降低。例如，miquels.等人(currentopinioninmicrobiology2013,16:1-7)提供了，各种研究报告了在粘膜和粪便样品中ibd患者的普氏粪杆菌水平降低，并且使用了不同的定量技术，例如rt-qpcr、fish等(参见miquels.等人的表1)。还报道了在溃疡性结肠炎患者中，另一种产丁酸盐物种人罗斯拜瑞氏菌减少(machielsetal.,gut.2014,63(8):1275-83)。
为了增加普氏粪杆菌的肠道水平，已经通过益生元策略做出努力来调节普氏粪杆菌的肠丰度。然而，仍然未知哪些因素调节普氏粪杆菌的肠道存在及普氏粪杆菌影响程度(lopez-silesetal.,theismejournal2017,11:841-852)。特别地，已经报道了普氏粪杆菌使用各种益生元底物，例如菊粉(ramirez-fariasc.etal.,britishjournalofnutrition.2019,101:541-550)；核黄素(wo2014/070014a1)，以及聚右旋糖和可溶性玉米纤维(wo2013/067146a1)。
已描述果胶为葡萄皮纤维的主要可发酵成分(bravol.andsaura-calixtof.,“characterizationofdietaryfiberandtheinvitroindigestiblefractionofgrapepomace”,am.j.enol.vitic.,1998,49:135-141)。lopez-silesm.等人(appl.environ.microbiol.2012,78(2):420)公开了发现普氏粪杆菌使用苹果果胶作为底物，但是所测试的普氏粪杆菌菌株均无法在柑橘果胶中生长(参见第424页的表2的图)。这与salyersa.等人的“fermentationofmucinsandplantpolysaccharidesbyanaerobicbacteriafromthehumancolon”,appl.environ.microbiol.1977,34:529-533相一致，该文献报道了普氏粪杆菌不能使用(柑橘)果胶。
另外，benusr.等人(“associationbetweenfaecalibacteriumprausnitziianddietaryfibreincolonicfermentationinhealthyhumansubjects”,britishjournalofnutrition.2010,104:693-70)教导，并非所有果胶都可被普氏粪杆菌同样地使用。特别是，作者报道了在用豌豆纤维补充饮食处理的健康人对象中观察到普氏粪杆菌和肠道罗斯拜瑞氏菌(roseburiaintestinalis)群的减少，作者发现这表明使用的纤维无法支持这些细菌物种的增殖，并且可以通过豌豆果胶中的糖醛酸和木糖之间的强连接来解释。
此外，bralleye.等人(“anti-inflammatoryeffectsofmuscadineskinextractinexperimentally-inducedulcerativecolitisinrats”,fromthethesisnutraceuticalpropertiesofthemuscadinegrape(vitisrotundifolia),sorghumbicolor,andpolygonumcuspidatum,1998,georgiauniversity)描述了脱水圆叶葡萄(vitisrotundifolia)皮对tnbs(2,4,6-三硝基苯磺酸)诱导的大鼠结肠炎模型的抗炎作用。该文献不涉及患有结肠炎的对象的生态失调的治疗，而是旨在治疗肠炎性疾病的炎症特征，并且指出圆叶葡萄中存在的具有抗氧化特性的植物化学物质(例如槲皮素和白藜芦醇)作为葡萄皮中负责获得抗炎作用的成分。
因此，普氏粪杆菌和其他产丁酸盐细菌是肠微生物群的一部分，并且在肠道健康中具有保护作用。尽管近年来已做出努力，但仍然需要找到治疗对象的肠道微生物群生态失调的策略，特别是增加有益细菌物种(例如普氏粪杆菌)和其他产丁酸盐细菌的肠道水平的策略。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及治疗对象的肠生态失调的方法中使用的葡萄皮，优选分离的葡萄皮，其中肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌的水平降低和/或活性降低(例如，产丁酸盐细菌的短链脂肪酸(scfa)水平低或降低)，优选地其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
在另一方面，本发明涉及治疗对象的肠疾病的方法中使用的葡萄皮，优选分离的葡萄皮，其中所述对象患有以产丁酸盐细菌水平降低和/或活性降低(例如，产丁酸盐细菌的短链脂肪酸(scfa)的水平低或降低)为特征的肠生态失调，优选其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
在另一方面，本发明涉及用于治疗对象的肠疾病的方法的葡萄皮，优选分离的葡萄皮。
在另一方面，本发明涉及葡萄皮和以下化合物的协同组合，所述化合物选自由益生元、单一的益生菌物种或益生菌物种群、细菌的次级产物、细菌/宿主相互作用的分子途径调节剂和窄谱抗生素组成的组。本发明还涉及在治疗肠生态失调中提供协同作用的包含葡萄皮和如上定义的化合物的组合物，以及其在治疗肠生态失调中的用途，优选在治疗产丁酸盐细菌生态失调中的用途。
附图说明
图1a.克罗恩氏病(cd)患者样品的fpra水平/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mg果胶，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图1b.溃疡性结肠炎(uc)患者样品的fpra/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图1c.健康(h)对象样品的fpra/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图2a.cd患者样品的phg-i/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图2b.uc患者样品的phg-i/eublct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图2c.h对象样品的phg-i/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图3a.cd患者样品中的phg-ii/eubct值(实验3)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图3b.uc患者样品的phg-ii/eublct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图3c.h对象样品的phg-ii/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图4a.cd患者样品的eco/eublct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图4b.uc患者样品的eco/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图4c.h对象样品的eco/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图5a.cd患者样品的b46/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图5b.uc患者样品的b46/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图5c.h对象样品的b46/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图6a.cd患者样品的ros/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图6b.uc样品的ros/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图6c.h对象样品的ros/eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图7a.cd患者样品的丁酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图7b.uc患者样品的丁酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图7c.h对象样品的丁酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图8a.cd患者样品的乙酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图8b.uc患者样品的乙酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图8c.h对象样品的乙酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图9a.cd患者样品的丙酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图9b.uc患者样品的丙酸水平(mg/l)(实验3)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图9c.h对象样品的丙酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图10a.cd患者样品的己酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图10b.uc患者样品的己酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图10c.h对象样品的己酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图11a.cd患者样品的戊酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图11b.uc患者样品的戊酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图11c.h对象样品的戊酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图12a.cd患者样品的异戊酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图12b.uc患者样品的异戊酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图12c.h对象样品的异戊酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图13a.cd患者样品的异丁酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图13b.uc患者样品的异丁酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图13c.h对象样品的异丁酸水平(mg/l)；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝600mgprevipect，4＝200mgprevipect 200mgpectin，5＝200mgpectin。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图14a.肠易激综合征(ibs)患者样品的eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图14b.健康对象样品的eubct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图15a.ibs患者样品的fpract值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图15b.健康对象样品的fpract值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图16a.ibs患者样品的phgict值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图16b.健康对象样品的phgict值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图17a.ibs患者样品的phgiict值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图17b.健康对象样品的phgiict值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图18a.ibs患者样品的ecoct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图18b.健康对象样品的ecoct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图19a.ibs患者样品的rosct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图19b.健康对象样品的rosct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图20a.ibs患者样品的b46ct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图20b.健康对象样品的b46ct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图21a.ibs患者样品的akkct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图21b.健康对象样品的akkct值；1＝阴性对照(无底物)，2＝200mgprevipect，3＝200mg圆苞车前。显著的值差异用星号标记(p≤0.05时为*；p≤0.01时为**；p≤0.001时为***)。
图22.图显示了在60至62℃的空气循环烘箱中经过5天(第0至5天)脱水的葡萄样品的湿度(％)和水活性。
具体实施方式
定义
术语“对象”或“个体”在本文中可互换使用，是指被分类为哺乳动物的所有动物，包括但不限于家畜和农场动物、灵长类动物和人类，例如人、非人灵长类动物、牛、马，猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。优选地，对象是任何年龄或种族的男性或女性。
术语“治疗”涵盖预防性和治疗性治疗。如本文所用，术语“治疗性治疗”是指使身体从病理状态或疾病回到其正常健康状态。如本文所用，术语“预防性治疗”是指预防病理状态。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指向处在预防或治疗本文所定义的疾病、病症或病理状况中的对象(例如人类患者)单次或多次给药后有效的量。
术语“益生元”是1995年由gibson和roberfroid提出的(thejournalofnutrition,125,1401-1412)，是指“一种非消化性食品成分，该非消化性食品成分通过选择性刺激结肠中的一种或有限数量细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主，从而改善健康”。益生元可用于治疗或预防可被定义为肠微生物群失衡的肠生态失调。已知益生元通过两种主要机制对肠道功能产生积极影响：1)刺激肠道中固有的有益原生细菌(通常是双歧杆菌和乳杆菌)的生长和/或活性；2)增加短链脂肪酸(scfa)的产量。应该注意的是，并非膳食纤维的所有成分都是益生元。未消化的底物的益生元特征取决于固有的肠道微生物群的有益成分是否会选择性地将其用作底物(gálvezetal.,“prebioticsandprobioticsinexperimentalmodelsofrodentcolitis:lessonsintreatmentorpreventionofinflammatoryboweldiseases”,chapter35(p.601-610)ofthebookbioactivefoodsinpromotinghealth,ed:r.r.watsonandv.r.preedy,2010,academicpress；manningt.s.andgibsong.r.“prebiotics”,bestpractice&researchclinicalgastroenterology2004,18(2):287-298)。
如本文所用，术语“探针”指这样的长度为10至285个碱基对的合成或生物产生的核酸，所述核酸包含允许在预定条件下特异性和优先杂交至靶核酸序列的特定核苷酸序列，并任选地包含用于检测或增强测定性能的部分。为了在统计学上获得特异性并形成稳定的杂交产物，通常至少需要10个核苷酸，而最多285个核苷酸通常代表可以轻松调整反应参数以确定错配序列和优先杂交的长度上限。探针可任选地包含在某些测定条件下有助于探针适当或最佳起作用的某些成分。例如，可以修饰探针以提高探针对核酸酶降解的抗性(例如，通过封端)，携带检测配体(例如荧光素)，或促进探针被捕获到固体支持物上(例如，聚脱氧腺苷“尾”)。
如本文所用，术语“引物”是指可用于扩增方法(例如聚合酶链反应(“pcr”))中来扩增核苷酸序列的寡核苷酸。引物基于特定靶序列的多核苷酸序列(例如一种特定的16srdna序列)而设计。引物和探针的设计和验证是本领域熟知的。对于实时定量pcr方法，请参见rodrigueza等人(methodsmolbiol.,2015,1275:31-56)。
如本文所用，术语“特异性的”是指在测定条件下，通常使用严格条件，核苷酸序列会杂交/扩增预定的靶序列并且将基本上不杂交/扩增非靶序列。
如本文所用，术语“杂交”是指这样的过程，通过该过程，在预定的反应条件下，使两条部分或完全互补的核酸链以反平行的方式结合在一起，遵循关于哪些核酸碱基可以彼此配对的明确规则，从而形成具有特异性且稳定的氢键的双链核酸。
术语“充分杂交”是指观察到的杂交量使得观察结果的人认为结果相对于阳性对照和阴性对照中的杂交数据是阳性的。被认为是“背景噪声”的数据不是充分杂交。
术语“严格杂交条件”是指在约0.9摩尔nacl的盐溶液中约35℃至65℃下。严格性还可以由反应参数来控制，反应参数诸如杂交溶液中存在的离子种类的浓度和类型、存在的变性剂的类型和浓度以及杂交温度。通常，随着杂交条件变得更加严格，如果要形成稳定的杂交体，则优选更长的探针。通常，发生杂交的条件的严格性将决定所采用的优选探针的某些特征。
如本文所用，术语“同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列分别的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的对应关系。可以通过确定两个或更多个序列(“多核苷酸”或“氨基酸”)的“同一性百分比”来比较该两个或更多个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)。两个序列的“同一性百分比”是两个比对序列之间精确匹配的数目除以较短序列的长度乘以100。用于计算序列之间同一性或相似性百分比的合适程序是本领域熟知的，例如ncbiblast程序，该程序例如以默认参数使用(http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/blast)。
详细说明
在第一方面，本发明涉及葡萄皮或包含该葡萄皮的组合物作为益生元用于增加产丁酸盐细菌的肠道水平的用途。
丁酸盐生产者显示丁酰coa:乙酸盐coa转移酶活性(duncanetal.,applenvironmicrobiol.2002,68:5186-5190)。这种活性广泛存在于属于梭菌亚门的厌氧细菌中，例如梭菌簇iv的成员，也称为柔嫩梭菌(clostridiumleptum)群(duncanetal.,intjsystevolmicrobiol2002,52,2141–2146)以及簇xiva，也被称为球状梭菌(clostridiumcoccoides)群(holdetal.,applenvironmicrobiol2003,69,4320–4324；barcenillaetal.,applenvironmicrobiol2000,66,1654–166)。普氏粪杆菌是代表性的丁酸盐生产者，属于梭菌簇iv，而罗斯拜瑞氏菌属的各种物种(例如盲肠栖罗斯拜瑞氏菌(roseburiacecicola)、肠道罗斯拜瑞氏菌和人罗斯拜瑞氏菌)是丁酸生产者，归类于梭菌簇xiva。
更具体地，在第一方面，本发明涉及治疗对象的肠生态失调的方法中使用的葡萄皮，其中肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌水平降低和/或产丁酸盐细菌活性降低(本文中也称为“产丁酸盐细菌生态失调”)。优选地，所述产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌(包括其遗传谱系(例如phgi和/或phgii))、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
在相关的方面，本发明提供治疗对象的肠生态失调的方法，其中肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌水平降低和/或产丁酸盐细菌活性降低(例如，产丁酸盐细菌的短链脂肪酸(scfa)的水平低或降低)，所述方法包括向需要这样的治疗的对象给药治疗有效量的本文所述的葡萄皮。
优选地，所述治疗对象的肠生态失调的方法是预防性方法，即所述对象不表现出产丁酸盐细菌的水平和/或活性低或降低。
据报道，在疾病中，微生物群的组成和多样性发生变化。术语“生态失调”是指保护性细菌和有害细菌的微生物失衡的状况或在体内保护性细菌和有害细菌之间微生物失衡的状况。术语“肠生态失调”涉及肠道微生物群的不利改变。例如，一些作者研究了炎性肠病中的微生物组成，并定义了表征克罗恩氏病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)的生态失调标志。特别是，joosens等人(gut2011,60:631–7)报告了5种细菌物种是cd中生态失调的特征，即普氏粪杆菌、青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、难见戴阿利斯特杆菌(dialisterinvisus)和梭菌簇xiva的未表征物种减少，而活泼瘤胃球菌(ruminococcusgnavus)增加；该细菌标志表明在该疾病的发病机理中产丁酸盐细菌缺乏。最近，已经描述了人罗斯拜瑞氏菌和普氏粪杆菌减少是uc生态失调的特征(machielsetal.gut.2014,63(8):1275-83)。
在特别的实施方式中，肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌水平低或减少，优选地，其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
产丁酸盐细菌水平低或减少可以通过这样的方法确定，所述方法包括：
a)确定所述对象的肠样品中产丁酸盐细菌的水平；
b)将所述对象样品中所述产丁酸盐细菌的水平与参考样品中的水平进行比较；
其中当所述对象样品中的水平低于所述参考样品中的水平时，则产丁酸盐细菌减少。下文描述了定量肠样品中细菌物种水平的方法。
肠样品可以是例如来自回肠、结肠和/或直肠的粘膜组织的活检样品。优选地，该肠样品是粪便样品。这些类型的样品通常在临床实践中使用，并且本领域技术人员将知道如何鉴定最合适的方式来获得和保存所述样品。一旦获得样品，可以使用新鲜的该样品，可以冷冻、冻干或使用适当的方法保存该样品。
如本文中所使用的，术语“参考值”涉及预定的标准，该预定的标准用作评估由从对象收集的样品所获得的值或数据的参考。参考值或参考水平可以是绝对值、相对值、具有上限或下限的值、值的范围、平均值(averagevalue)、中值、均值(meanvalue)、或与特定对照或基线值相比的值。参考值可以基于单个样品值，也可以基于大量样品，例如来自实足年龄匹配组的对象群体，或者基于包括或不包括待测样品的样品池。
参考值可以从不表现出肠疾病的体征和/或症状的对象或对象组，从未患有肠疾病的对象或对象组，或从同一健康对象或曾在较早的时间点被诊断为患有肠疾病的对象中获得。优选地，所述参考样品是没有肠道疾病的对象或对象组的样品。
当样品中所述标志物的水平低于其参考值时，标志物的水平被认为“降低”。当标志物的水平至少为10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或低于其参考值时，认为标志物的水平低于其参考值。优选地，为了确定肠道生态失调，对象样品中一种或多种细菌标志物的丰度水平相对于参考值的降低在统计学上是显著的。
同样地，当样品中所述标志物的水平高于其参考值时，标志物的水平被认为“增加”。当标志物的水平至少为10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或高于其参考值时，认为标志物的水平高于其参考值。
可供选择地或另外地，与本文所述的参考值相比具有大于约1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍水平偏差(即，增加或减少)的受试者可被鉴定为患有肠生态失调。
统计学上显著的量可以由本领域技术人员通过使用不同的统计工具来确定；所述统计工具的说明性非限制性实例包括确定置信区间，确定p值，卡方检验判别函数等。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％。p值优选小于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001。通常，适当的统计学分析根据所研究的变量是否具有正态分布来确定(例如通过使用kolmogorov-smirnov检验)，以及根据是否存在均方差来确定(例如通过levene检验确定)。优选地，在存在正态分布和均方差的情况下，则使用参数模型，例如t检验或anova检验；在无法实现正态性的情况下，则通常使用非参数模型，例如mann-whitneyu检验或kruskal-wallis检验。
可供选择地，可通过确定特定对象中一种或多种产丁酸盐细菌物种或物种群相对于所述对象中其他细菌物种或物种群的丰度水平的比值来定义产丁酸盐细菌的减少。例如，在以下情况下，可能会发现产丁酸盐细菌减少：
-普氏粪杆菌/大肠杆菌(escherichiacoli)的水平(例如log1016srrna基因拷贝/百万细菌16srrna基因拷贝的中位数)之比小于2.5；或
-真细菌(eubacteria)/人罗斯拜瑞氏菌的水平之比大于12.5。
在任选地与上文或下文所述的一个或多个实施方式或特征结合的特别的实施方式中，产丁酸盐细菌的减少通过确定特定对象中一种或多种产生丁酸盐的细菌物种或物种群相对于所述对象中其他细菌物种或物种群的丰度水平之比来定义，并且表示为标准化指数，包括但不限于：
-普氏粪杆菌/大肠杆菌之比(fe指数)：该值越低，对象的生态失调程度越高；和/或
-产丁酸盐细菌/促炎细菌之比(bp指数)：该值越低，对象的生态失调程度越高；例如，其中产丁酸盐细菌通过普氏粪杆菌(任选地，而且或可供选择地，普氏粪杆菌phgi、普氏粪杆菌phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌的总丰度的总和来计算，促炎细菌通过大肠杆菌的总丰度来计算。
另外，对象的肠生态失调的特征还可以是产丁酸盐细菌(scfa生产水平低或降低的产丁酸盐细菌)活性降低。这可以通过丁酸盐/产丁酸盐细菌之比(bb指数)来确定：产丁酸盐细菌通过普氏粪杆菌(任选地，而且或可供选择地，普氏粪杆菌phgi、普氏粪杆菌phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌的总丰度的总和来计算，丁酸盐是发酵管中获得的丁酸盐的浓度。值越低，产丁酸盐细菌的活性就越差。丁酸盐生产水平降低或低可以是例如其中对象的bb指数低于参考或对照样品中的bb指数。
如本文所用，术语“丰度”、“水平”或“载量”是指生物样品内靶微生物的量的量度。细菌定量通常通过分子方法进行，通常通过确定所述靶微生物的16srrna基因拷贝数，例如通过荧光原位杂交(fish)、定量聚合酶链反应(qpcr)或pcr/焦磷酸测序来进行。生物样品中靶核酸序列丰度的定量可以是绝对的或相对的。“相对定量”通常基于一个或多个内部参考基因，即来自参考菌株的16srrna基因，例如使用通用引物并将靶核酸序列的丰度表示为细菌16srrna基因总拷贝数的百分比或通过大肠杆菌16srrna基因拷贝进行标准化的百分比确定总细菌。“绝对定量”通过与dna标准品进行比较或通过dna浓度进行标准化，得出靶分子的确切数量。
定量水平可以表示为浓度(每单位体积的dna量)、每细胞数量的dna数量或基因拷贝数、循环阈值(ct值)或其任何数学转换，例如基因拷贝数的log10。ct值与样品中靶核酸浓度的log10成反比。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，本文所述的产丁酸盐物种通过qpcr定量。优选地，已经通过qpcr进行定量，并且定量水平被表示为循环阈值(ct值)，在这种情况下，产丁酸盐细菌的丰度水平的降低显示为ct值的增加。
定量pcr(qpcr)，也称为实时pcr，在本领域中是熟知的。可获得不同仪器，例如来自appliedbiosystems的abiprism7700sds、geneamp5700sds、abiprism7900htsds；来自bio-rad的icycleriq；来自cepheid的smartcycler；来自corbettresearch的rotor-gene；来自rochemolecularbiochemicals的lightcycler和来自stratagene的mx4000multiplex。通过在反应的指数阶段很早时测量pcr产物的积累，qpcr过程可以实时准确定量pcr产物，从而减少了与终点pcr中发生的pcr扩增效率相关的定量偏差。qpcr的技术概述和协议例如可从上述供应商处获得的，例如http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html或http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html。对于qpcr方法的综述，参见smithcjandosbornam.,femsmicrobiolecol.,2009；67(1):6-20andgiuliettietal.,methods2001；25,386–401。在特别的实施方式中，定量方法包括多重qpcr，例如当在单个qpcr反应中定量普氏粪杆菌遗传谱系i和遗传谱系ii的水平时的多重qpcr。
几种基因可用于细菌定量目的。通常，通过16srrna基因的pcr扩增对特定的靶细菌进行定量。几乎每种细菌物种的16srrna都不同。细菌物种难以定义，但通常被视为具有被定义为操作分类单位(otu)的具有至少97％的同一性的16srrna基因序列的生物体。约1500个碱基的16srrna基因序列具有9个区分细菌类群的短高变区；在社区普查中将这些区域中的一个或多个的序列作为目标(weinstockb.m,nature2012,489,250–256)。
也可以使用蛋白质编码基因，例如管家基因。roux等人(femsmicrobiolecol78(2011)617–628)描述了五个蛋白质标志物基因(rplb、pyrg、fusa、leus和rpob)作为生态学研究的分类标志物的用途，用于所述基因的引物组是可获得的。还已经描述了核苷酸基转移酶基因和丁酰-coa转移酶基因用于特定靶细菌定量目的的用途(jiaetal.femsmicrobiollett.2010；310:138-144)。
不同的检测型化学可用于qpcr。它们都可以与上述qpcr仪器一起使用。术语“检测型化学”是指一种在实时pcr中报告特定pcr产物扩增的方法，并且可以包括水解或
优选地，本文所述的产丁酸盐物种的定量通过16srrna基因定量来进行。在优选的实施方式中，用于定量本文所述的产丁酸盐物种的多核苷酸(例如，引物和探针)是实施例中公开的那些多核苷酸，或与所述多核苷酸具有至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少97％、98％、99％的同一性或与所述多核苷酸100％相同的多核苷酸。
优选地，所述多核苷酸具有10至30个核苷酸，更优选15至26个核苷酸，甚至更优选18至22个核苷酸，甚至更优选约20个核苷酸。在特别的实施方式中，所述引物和/或探针已被修饰以用于检测或用于增强测定性能。
在特别的实施方式中，产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组，各自的丰度水平通过包括使用以下中的一项或多项的方法来确定：
-用于测定普氏粪杆菌的水平的选自由seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3组成的组中的多核苷酸和与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3具有至少85％同一性的多核苷酸；
-用于确定phgi水平的由seqidno:6组成的多核苷酸或与seqidno:6具有至少85％同一性的多核苷酸，任选地，与seqidno:4和/或seqidno:5组合，或和与seqidno:4和/或seqidno:5具有至少85％同一性的多核苷酸组合；
-用于确定phgii水平的由seqidno:7组成的多核苷酸或与seqidno:7具有至少85％同一性的多核苷酸，任选地，与seqidno:4和/或seqidno:5组合，或和与seqidno:4和/或seqidno:5具有至少85％同一性的多核苷酸组合；
-用于确定人罗斯拜瑞氏菌水平的选自由seqidno:11、seqidno:12组成的组中的多核苷酸和与seqidno:11、seqidno:12具有至少85％同一性的多核苷酸；和
-用于确定变异罕见小球菌水平的选自由seqidno:13、seqidno:14组成的组中的多核苷酸和与seqidno:13、seqidno:14具有至少85％同一性的多核苷酸。
粪杆菌属是duncan等人创建的新属。(duncanetal.,intjsystevolmicrobiol.2002；52,2141-2146)。该无孢子形成、非活动性革兰氏阳性、严格厌氧的生物体产生丁酸盐、d-乳酸盐和甲酸盐，并利用乙酸盐。基因组dnag-c含量为47±57mol％(如通过热变性所确定)。其特征被cato等人(1974)报道过的模式菌株为普氏粪杆菌atcc27768t(ncimb13872t)。但是，最近十年来对该物种进行的大多数最新研究都是基于同样由duncan等人描述的菌株a2-165(dsm17677)(duncanetal.,intjsystevolmicrobiol.2002；52,2141-2146)。如今，普氏粪杆菌物种是厚壁菌门梭菌纲瘤胃菌科的主要代表(miquels.etal.,currentopinioninmicrobiology2013,16:1-7)。
先前已描述了两种普氏粪杆菌的遗传谱系(lopez-silesetal.,applenvironmicrobiol.2012；78:420-428)。本研究分析了基于16srrna基因序列而分到梭菌簇iv的其他成员的普氏粪杆菌分离系(isolates)的系统发生关系，并首次定义了普氏粪杆菌物种内的两种遗传谱系(lopez-silesetal.2012的图1)，特别是它定义了瘤胃菌科中具有>97％的序列同一性的两个分支。这些包括先前报道的分离系m21/2、atcc27766和atcc27768(属于phgi)和a2-165和l2-6(属于phgii)的五个序列。
wo2017/025617描述了一种用于同时定量两种普氏粪杆菌遗传谱系的qpcr测定，包括使用一对独特的针对普氏粪杆菌的16srrna基因的物种特异性引物以及两个靶向每种普氏粪杆菌遗传谱系的水解探针。用于该测定的寡核苷酸示于wo2017/025617的表15中，其内容通过引用并入本文。
如本文所用，表述“普氏粪杆菌生态失调”是指普氏粪杆菌(fpra)、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)和/或普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)总体减少。
duncan等人首次描述了人罗斯拜瑞氏菌(internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology2006,56,2437–2441)。人罗斯拜瑞氏菌是一种革兰氏可变或革兰氏阴性的、严格厌氧的、稍微弯曲的棒状，在系统发育上与小肠念珠菌相关，但与现有物种中所含物相关性不足。模式菌株是a2-183。人罗斯拜瑞氏菌能够在甘油上生长，但不能在复杂底物(例如菊粉、木聚糖和支链淀粉)上生长(见表1)。丁酸盐和甲酸盐是人罗斯拜瑞氏菌代谢的主要产物(见表2)。
holmstrom等人首次描述了变异罕见小球菌(anaerobe2004,10,197–203)。变异罕见小球菌是一种严格厌氧的、无芽孢形成的、革兰氏染色阴性的生物体，呈现出有些变化的球菌形形态。比较性的16s核糖体rna基因测序研究表明，系统发育上是柔嫩梭菌超属rrna簇的成员。变异罕见小球菌的模式菌株为bi114t。葡萄糖发酵的主要产物是丁酸和乳酸。
所述对象可以是不表现出肠疾病症状的对象。实际上，对象可能在患有肠疾病之前，例如在炎性疾病的情况下，在炎症的体征和/或症状出现之前，经历肠生态失调，例如以普氏粪杆菌和/或其他产丁酸盐细菌减少为特征的生态失调。在实施例2的体外发酵实验中，在来自健康人的粪便样品(其中使用previpecttm作为底物)中，观察到人罗斯拜瑞氏菌、普氏粪杆菌遗传谱系ii和变异罕见小球菌丰度相对于阴性对照在统计学上显著增加。在确定这些标志物相对于真细菌的相对水平时，对于人罗斯拜瑞氏菌和普氏粪杆菌遗传谱系ii而言，这种增加得以维持(见表1和2)。在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述对象不表现出肠疾病的症状，并且患有phgii、变异罕见小球菌和/或人罗斯拜瑞氏菌的生态失调。
可供选择地，所述对象可以患有肠疾病。该肠疾病可以是炎性肠疾病，例如“炎性肠病(ibd)”或非炎性肠疾病。
如本文所用，术语“炎性肠病(ibd)”是指一组特发性慢性炎性肠疾病。该术语涵盖的两个主要疾病类别是克罗恩氏病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，它们具有重叠和区分性的临床和病理特征。ibd的诊断需要全面的身体检查和患者病史的回顾。包括血液检查、粪便检查、内窥镜检查、活检和影像学检查在内的各种检查有助于排除其他原因并确定诊断结果。(worldgastroenterologyorganisationglobalguidelines,inflammatoryboweldisease:aglobalperspective,june2009；andsilverbergetal.,canjgastroenterol.2005,19suppla:5-36)。随着对ibd流行病学和遗传学的了解不断加深，对临床医生来说清楚的是，uc和cd可能实际上代表了几种形式的ibd。因此，本文所用的术语“ibd”包括ibd表型。
如本文所用，术语“ibd表型”包括疾病或病症，例如cd、uc、不确定性结肠炎、未分类的炎性肠病(ibdu)、结肠袋炎、微观结肠炎、直肠炎、憩室炎(mowatetal.,gut2011,1-37；geboesetal.,jclinpathol2005；58:1133–1134；regueirom,jclingastroenterol.2004,38(9):733-740；cheifetza,anditzkowitzs.,jclingastroenterol.2004may-jun；38(5suppl1):s44-50)。它进一步包括ibd疾病或病症内的亚型。cd亚型是例如由蒙特利尔分类法定义的亚型，其中cd根据诊断时的年龄、位置和/或表现进行分类。uc亚型也可以是蒙特利尔分类法定义的亚型，其中uc根据疾病范围和/或疾病严重程度进行分类(worldgastroenterologyorganisationglobalguidelines,inflammatoryboweldisease:aglobalperspective,june2009；andsilverbergetal.,canjgastroenterol.2005,19suppla:5-36)。
如本文所用，术语“不确定性结肠炎(ic)”是指在结肠切除术样品中没有uc或cd的特有特征的那些慢性ibd病例(silverbergetal.,canjgastroenterol.2005,19suppla:5-36；satsangietal.,gut2006；55,749-753)。
如本文所用，术语“未分类的炎性肠病(ibdu)”是指这样的情况，其中临床和内窥镜检查有证据表明慢性炎症性肠病影响结肠而不累及小肠，并且没有组织学或其他证据来确定cd或uc，其中已经排除了感染(satsangietal.,gut2006；55,749-753)。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述对象患有ibd。优选地，所述对象患有uc。先前已经报道了uc患者的特征是phgii水平降低(wo2017/025617)。
在实施例2的体外发酵实验中，在来自uc患者的粪便样品中(其中使用previpecttm作为底物)观察到普氏粪杆菌遗传谱系ii丰度相对于阴性对照在统计学上显著增加，甚至当确定相对于真细菌的相对水平时，所述丰度也增加(参见表4和5)。在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述对象患有溃疡性结肠炎和phgii生态失调。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的另一特别的实施方式中，所述对象患有非炎性肠疾病。非炎性肠疾病的说明性非限制性实例是肠易激综合征(ibs)和结肠直肠癌(miquels.etal.,currentopinioninmicrobiology2013,16:1-7)。在本发明的特别的实施方式中，所述肠疾病是非炎性肠疾病，前提是该非炎性肠疾病不是结肠直肠癌。在另一特别的实施方式中，所述非炎性肠疾病是肠易激综合征。实施例3提供了ibs患者和健康对象中粪便样品与previpecttm200、苹果果胶和圆苞车前孵育时获得的实验结果。如表12所示，相对于阴性对照，ibs患者的粪便样品与previpecttm200孵育时，观察到普氏粪杆菌、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌总体的总丰度在统计学上显著增加。在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述对象患有ibs以及普氏粪杆菌、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌生态失调。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的又一特别的实施方式中，所述对象是人类对象。
在第二方面，本发明涉及在治疗对象的肠疾病的方法中使用的葡萄皮，优选分离的葡萄皮，其中所述对象患有以产丁酸盐细菌减少为特征的肠生态失调，优选其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
本发明还涉及治疗对象的肠疾病的方法，其中所述对象患有以产丁酸盐细菌减少为特征的肠生态失调，优选其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组，其中所述方法包括向需要这样的治疗的对象给药治疗有效量的本文所述的葡萄皮。
在特别的实施方式中，所述治疗肠道疾病的方法是预防性方法，并且所述对象不表现出肠道疾病的体征和/或症状。在另一种实施方式中，所述治疗肠疾病的方法是治疗性方法，并且所述对象患有肠疾病，即，表现出肠疾病的体征和/或症状。这些方面的特别的实施方式和优选特征如上所述。
在另一方面，本发明涉及在治疗对象的肠疾病的方法中使用的葡萄皮，优选分离的葡萄皮。在相关方面，本发明涉及治疗对象的肠疾病的方法，其中所述方法包括向需要这样的治疗的对象给药治疗有效量的本文所述的葡萄皮。在上述任意的特别的实施方式中，所述肠疾病不是溃疡性结肠炎，优选地，所述不是溃疡性结肠炎的疾病是cd或ibs。这些方面的特别的实施方式和优选特征如上所述。
本文所指的葡萄皮优选为“分离的葡萄皮”。如本文所用，术语“分离的葡萄皮”是指与果肉、种子和梗中分离的葡萄皮。将葡萄皮与果肉和其他果渣分离的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以手工分离葡萄皮。在特别的实施方式中，使整个葡萄脱水，然后使葡萄皮与其他果渣(例如种子和梗)分离。
葡萄可以来自任何葡萄物种，来自白葡萄或红葡萄品种，优选来自白葡萄品种。据报道，葡萄果渣中果胶的含量在红色和白色葡萄品种之间存在显著差异，在来自白葡萄品种的果渣中含量更高(gónzalez-centenomr,etal.foodscitechnol.2010；43:1580-1586)。白葡萄品种的说明性非限制性实例包括酿酒葡萄(vitisvinifera)、美洲葡萄(vitislabrusca)、河岸葡萄(vitisriparia)、杂交酿酒葡萄(v.viniferahybrids)和杂交非酿酒葡萄(non-v.viniferahybrids)。
优选地，葡萄皮来自除圆叶葡萄以外的其他葡萄物种。basha等人描述了圆叶葡萄(vitisrotundifolia)葡萄酒的化学组成(africanjournalofbiotechnology2004,vol.3(10),523-528)，圆叶葡萄葡萄酒的化学组成与酿酒葡萄(vitisvinifera)葡萄酒不同，特别是关于抗氧化剂化合物的组成。值得注意的是，据报道，圆叶葡萄以具有高浓度的某些酚类化合物为特征，并且含有除圆叶葡萄以外的其他葡萄物种中通常不存在的鞣花酸(olienetal.hortsci.199025,732-739；linandvinej.foodsci.1990,55,1607-1613)。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的优选的实施方式中，所述葡萄来自葡萄物种酿酒葡萄。酿酒葡萄物种的白葡萄品种的实例是本领域熟知的，包括但不限于白歌海娜、白皮诺、霞多丽和长相思。优选地，该葡萄来自葡萄物种酿酒葡萄和白歌海娜品种。
分离的葡萄皮可能会经历物理转化过程，例如脱水(包括冻干)或研磨。在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述葡萄皮是脱水葡萄皮，特征是水含量等于或小于20％，例如约18％。优选地，所述葡萄皮是脱水葡萄皮，其水含量等于或小于15％，例如水含量在5％至15％之间，更优选在10％至12％之间，例如约11％。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的进一步的实施方式中，所述葡萄皮通过以下方法获得或可通过以下方法获得：
a)干燥整个葡萄，以及
b)分离葡萄皮；
c)任选地，研磨在b)中获得的产物；和
d)任选地，筛分在c)中获得的产物。
优选地，在步骤a)中，将葡萄在空气循环烘箱中在60℃至62℃下干燥至少2天。例如，可以将葡萄干燥2至5天，更优选2天。
研磨产物不受该研磨产物的粒度的特别限制。在步骤c)之后获得的研磨产物的粒度可以是例如0.001mm至5mm。通常，研磨产物的粒度小于2mm，优选小于1mm，更优选小于0.1mm。在特别的实施方式中，研磨产物是微粉化的。
如本文所用，术语“微粉化”是指减小固体材料的颗粒的平均直径的过程。通常，术语“微粉化”在产生的颗粒仅为几微米(通常小于100μm)到纳米直径范围内时使用。传统的微粉化技术基于使用摩擦来减小粒度。如本文所用，术语“研磨”被广泛地用于涵盖旨在减小粒度的任何技术，例如磨粉(milling)和研磨(grinding)。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的优选的实施方式中，本发明涉及一种治疗对象的肠生态失调的方法中使用的组合物，该组合物包含如本文所述的分离的葡萄皮和至少一种药学上、兽医学上或饮食上可接受的赋形剂或载体，其中肠生态失调的特征是如本文所述的产丁酸盐细菌减少。本发明还涉及所述药物组合物用在治疗对象的肠疾病的方法中的用途，其中所述对象患有本文所述的以产丁酸盐细菌减少为特征的肠生态失调。
术语“药学上、兽医学上或饮食上可接受的赋形剂或载体”是指适用于在药学、兽医学或食品技术中用于制备组合物的赋形剂或媒介物。这些组分、赋形剂或载体必须与组合物中的其他成分相容。它也必须适合于在合理的利益/风险比下与人和动物的组织或器官接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他免疫原性问题或并发症。它们是在以药物形式存在的浓度下缺乏药理活性的物质。赋形剂或载体用于提供药学或兽医学形式的特征，确保一种或多种活性成分的稳定性、生物利用度、可接受性和易于给药。关于赋形剂影响活性成分释放的程度，它们将能够通过改变活性成分的生物利用度来改变药物产品的药理活性的大小和时间分布。赋形剂还用于提供具有合适形式或稠度的制剂。赋形剂类型的实例：增溶剂，崩解剂或崩解试剂，乳化剂(乳化试剂)，染料，调味剂，粘合剂，抗氧化剂，润滑剂，防腐剂，增稠剂等。药学上可接受的载体或赋形剂，例如remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.(1980)orremington:thescienceandpracticeofpharmacy22ndedition,pharmaceuticalpress(2012),isbn-13:9780857110626中描述的那些也可以被包括在本文所述的药物组合物之内，条件是它们不会对药物组合物的所需特性产生不利影响。
根据优选的实施方式，该组合物是药物组合物。任何给药途径都是合适的，但是口服或直肠给药可能是优选的。优选配制药物组合物以用于口服或直肠给药。口服组合物可以是例如丸剂、片剂、锭剂、胶囊剂、粉剂、薄片剂(wafer)、泡腾粉剂或片剂、溶液、混悬剂、糖浆或颗粒剂的形式。对于固体药物组合物，可以使用常规的无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。直肠组合物尤其可以是栓剂、灌肠剂或专用导管的形式。
根据另一种优选的实施方式，该组合物是食品组合物。食品组合物可以是液体组合物或饮料、固体组合物或营养补充剂或补品(也称为饮食或食物补充剂或补品)。在本发明的上下文中，术语“食品组合物”将包括富含分离的葡萄皮以及含有分离的葡萄皮的任何营养补充剂或补品的任何固体或液体食品。
根据社会上最常用的术语，食品组合物可以是液体组合物，即饮料。在本发明的上下文中，这样的液体组合物包括但不限于任何饮料，所述任何饮料选自由以下组成的组：动物或植物乳以及其任何衍生物，例如奶昔、酸奶、克菲尔等；水果和/或蔬菜汁；静水或苏打水，或(通过营养性甜味剂(蔗糖、果糖...)或人造甜味剂)调味或增甜的水或饮料；调味品(seasoning)，例如任何莎莎酱、调料(dressing)、番茄酱、油、醋或醋制品；任何类型的酒精饮料；茶、咖啡；以及所有类型的清凉饮料或软饮料或赋能饮料。
食品组合物也可以是固体组合物。这样的固体组合物可以例如选自但不限于由以下组成的组：动物或植物乳衍生物，例如奶酪、黄油、人造黄油和豆腐；任何类型的面包，包括新鲜、包装或冷冻面包、切片面包、全麦面包、香料面包、甜面包、咸面包等；由例如小麦或粗面粉的任何谷物粉制成的面食(通心粉、意大利面、面条等)；烘焙食品，包括蛋糕、饼干、松饼，甜甜圈等；用于制备饮料的散装或袋装的冲泡剂、茶或咖啡；果冻，糖果，包括通常被称为“软水果糖”的软糖；以及任何类型的固体调味料，例如牛至、盐、香菜、欧芹、罗勒等，或其混合物。
最后，食品组合物也可以是营养、饮食或食物补充剂或补品，这些术语中的任何一个均以等效方式用于本发明的上下文。这些术语通常用于口服食用的组合物，所述组合物包含旨在补充饮食的成分，在本发明的情况下，即分离的葡萄皮。它们绝不能替代传统食品，也不能成为餐食或饮食中的唯一成分。它们可见于不同的形式，例如锭剂、丸剂、片剂、胶囊剂、软明胶胶囊剂、明胶胶囊剂、薄片剂、泡腾片剂、液体(溶液、混悬剂、糖浆)、颗粒剂和粉剂，所有这些都包括作为在本发明范围内的实施例。由于获得前面的任意陈述，饮食上或药学上可接受的赋形剂对于技术人员来说是显而易见的，并且它们被包括在本发明的范围内。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，将分离的葡萄皮组合物配制成延迟释放或肠溶口服形式。在延迟释放的口服形式中，外表面或内含物抵抗胃液的作用，但在肠液存在下释放活性成分。这种延迟释放的口服形式包括但不限于颗粒剂、片剂以及硬胶囊剂或软胶囊剂及其组合。
所述延迟释放的口服形式包括至少一层抗胃酸层或包衣，其中所述抗胃酸层或包衣包含至少一种胃肠聚合物。如本文所用，术语“包衣”是指将层施加至整个表面，例如施加至胶囊或包含活性成分的核心的外壳。在一些实施方式中，所述延迟释放形式可包含2、3个或更多个抗胃酸层或包衣。
抗胃酸聚合物是本领域熟知的。这些聚合物通常在高于5.5的ph值下溶解，并且可以保护它们涂覆的物质或组合物不受胃环境的影响。抗胃酸聚合物和聚合物包衣的说明性非限制性实例为乙酸纤维素、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯的不同比例的共聚物(商业上已知商标为
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述组合物还包含选自由益生元、单一的益生菌物种或益生菌物种群(包括天然或遗传修饰的微生物)、细菌的次级产物(例如，丁酸盐)、细菌/宿主相互作用的分子途径调节剂和窄谱抗生素组成的组中的化合物。益生元和益生菌化合物是本领域熟知的，并且可以单独或组合使用(即合生元应用)，参见例如handbookofprebioticsandprobioticsingredients；healthbenefitsandfoodapplications(ed.ungsoochos.andfinocchiarot.,crcpress,2009)。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述组合物还包含益生元化合物。可以与本文所述的葡萄皮结合使用的益生元化合物的说明性非限制性实例包括并且可以选自其他葡萄衍生物(例如，葡萄籽或葡萄籽原花青素提取物(gspe，参见liuw.etal.,mol.nutr.foodres61,9,2017))、发芽大麦食品(gbf)、低聚果糖(fos)、菊粉、苹果果胶和卵叶车前果壳(ispaghulahusk)(也称为圆苞车前)种子和/或花朵和/或该植物的其他任何部分。优选地，所述益生元化合物是苹果果胶。
已经描述了许多益生菌物种，包括酸奶和其他乳制品中存在的益生菌物种。益生菌物种的说明性非限制性实例包括乳杆菌(例如嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgarius)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri))、双歧杆菌(例如两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum))、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、布拉酵母菌(saccharomycesboulardii)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和大肠杆菌的非致病性物种。
在任选地与上文或下文所述的一种或多种实施方式结合的特别的实施方式中，所述组合物还包含单一的益生菌物种或益生菌物种群，所述益生菌物种选自由产丁酸盐细菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、布拉酵母菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的非致病性物种组成的组，其中优选地，所述产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i、普氏粪杆菌遗传谱系ii、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
该组合物可以是任何形式，例如冻干、液体或雾化形式。如果例如将冻干细菌用于制备组合物，则可以将冻干细菌的所述初步组合物再水化，例如用无菌等渗盐水溶液再水化，从而获得具有所需总浓度(cfu/ml)的最终组合物。
为了易于使用，该组合物可以呈剂量形式。例如，每个剂量包含107或更多、108或更多、109或更多、1010或更多、1011或更多的菌落形成单位(cfu)的细菌(109或更多可能是优选的)。剂量的体积可以为0.1至100ml，优选0.2至50ml，更优选0.5至20ml，更优选1.0至10ml，更优选1.5至5ml。
在另一方面，本发明涉及葡萄皮和选自由益生元、单一的益生菌物种或益生菌物种群、细菌的次级产物、细菌/宿主相互作用的分子途径调节剂和窄谱抗生素组成的组中的化合物的组合。还涉及在治疗肠生态失调中提供协同作用的包含葡萄皮和如上定义的化合物的组合物，以及其在治疗肠生态失调中的用途，优选在治疗产丁酸盐细菌生态失调中的用途。特别的实施方式和优选特征如本文所述。
预期本文所述的任何特征可以任选地与本发明的任何医学用途、组合物、药物组合物、治疗方法、制造组合物的方法和/或组合疗法的任何实施方式组合；本说明书中讨论的任何实施方式都可以相对于任何这些而实施。将理解的是，本文中描述的特别的实施方式是通过举例说明的方式显示的，而不是对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，可以在各种实施方式中采用本发明的主要特征。仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体方法的许多等效物。这样的等效物被认为在本发明的范围内，并权利要求涵盖这样的等效物。
所有出版物和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，正如同明确地且单独地指出将每个单独的出版物或专利申请通过引用并入一样。
单词“一种/一个(a/an)”的使用可能表示“一种/一个”，但也与“一种/一个或多种/多个”、“至少一种/一个”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义一致。术语“另一个/另一种”的使用也可以指一个或多个/一种或多种。除非明确指出仅指代可供选择的方案或者可供选择的方案是互斥的，否则在权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”。
如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包括(comprising)”(以及包括的任何形式，例如“包含”和“含有”)，“具有”(以及具有的任何形式，例如“带有”和“有”)，“包含(including)”(以及包含的任何形式，例如“包括”和“含有”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，例如“包括”和“包含”)是包含性的或开放性的，且不排除其他未引用的元素或方法步骤。术语“包括”还涵盖并明确公开了术语“由…组成”和“基本上由…组成”。如本文所用，词组“基本上由…组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤以及不会实质性影响要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。如本文所使用的，词组“由……组成”排除了权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分，除了例如通常与该元素或限制相关的杂质。
如本文所用，术语“或其组合”是指该术语之前所列项目的所有排列和组合，例如，“a、b、c或其组合”旨在包括以下中至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，如果顺序在特定情况下很重要，那么还有ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续该示例，明确包括的是包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如bb、aaa、ab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。本领域技术人员将理解，除非从上下文是明显的，否则通常对任何组合中的项目或术语的数量没有限制。
如本文所使用的，近似词，例如但不限于“约”、“大约”、“近似”，是指这样的状况，当被如此修饰时，应理解为不一定是绝对的或正好的，而应被认为足够接近，使得本领域普通技术人员保证指定该条件是存在的。描述可以改变的程度将取决于可以进行多大的改变，并且仍然使本领域的普通技术人员认识到该修饰的特征仍然具有该未修饰的特征所需的特性和能力。经过前面的讨论，总的来说，本文通过近似词(例如“约”)修饰的数值可能会与规定值相差±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。因此，术语“约”可以表示指示值±其值的5％，优选地是指示值±其值的2％，最优选地术语“约”是指准确的指示值(±0％)。
本发明的项目
1.在治疗对象的肠生态失调的方法中使用的分离的葡萄皮，其中肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌减少，优选地，其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
2.根据项目1的使用的分离的葡萄皮，其中所述对象不表现出肠道疾病的体征和/或症状。
3.根据项目1的使用的分离的葡萄皮，其中所述对象患有肠疾病。
4.在治疗对象的肠疾病的方法中使用的分离的葡萄皮，其中所述对象患有以产丁酸盐细菌减少为特征的肠生态失调，优选地，其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
5.根据项目4的使用的分离的葡萄皮，其中所述方法是预防性方法，并且所述对象不表现出肠道疾病的体征和/或症状。
6.根据项目4的使用的分离的葡萄皮，其中所述方法是治疗性方法，并且所述对象患有肠道疾病。
7.根据项目3至6中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述肠疾病是炎性肠病。
8.根据项目3至7中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述肠疾病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
9.根据项目3至6中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述肠疾病是肠易激综合征。
10.根据项目1至9中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述对象是人类对象。
11.根据项目1至10中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中通过这样的方法确定产丁酸盐细菌减少，所述方法包括：
a.确定所述对象的肠样品中产丁酸盐细菌的水平，所述肠样品优选粪便样品；
b.将所述对象样品中所述产丁酸盐细菌的水平与参考样品中的水平进行比较，优选地，其中所述参考样品是未患有肠疾病的对象或对象组的样品；
其中当所述对象样品中的水平低于所述参考样品中的水平时，则产丁酸盐细菌减少。
12.根据项目11的使用的分离的葡萄皮，其中通过定量pcr确定产丁酸盐细菌的水平。
13.根据项目11或12中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组，产丁酸盐细菌的各自水平通过这样的方法来确定，所述方法包括使用以下中的一项或多项：
-用于测定普氏粪杆菌的水平的选自由seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3组成的组中的多核苷酸和与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3具有至少85％同一性的多核苷酸；
-用于确定phgi水平的由seqidno:6组成的多核苷酸或与seqidno:6具有至少85％同一性的多核苷酸，任选地，与seqidno:4和/或seqidno:5组合，或和与seqidno:4和/或seqidno:5具有至少85％同一性的多核苷酸组合；
-用于确定phgii水平的由seqidno:7组成的多核苷酸或与seqidno:7具有至少85％同一性的多核苷酸，任选地，与seqidno:4和/或seqidno:5组合，或和与seqidno:4和/或seqidno:5具有至少85％同一性的多核苷酸组合；
-用于确定人罗斯拜瑞氏菌水平的选自由seqidno:11、seqidno:12组成的组中的多核苷酸和与seqidno:11、seqidno:12具有至少85％同一性的多核苷酸；和
-用于确定变异罕见小球菌水平的选自由seqidno:13、seqidno:14组成的组中的多核苷酸和与seqidno:13、seqidno:14具有至少85％同一性的多核苷酸。
14.根据项目1至13中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述葡萄皮来自除圆叶葡萄之外的葡萄。
15.根据项目1至14中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述葡萄皮来自葡萄物种酿酒葡萄，优选来自白葡萄品种。
16.根据项目1至15中任一项的使用的分离的葡萄皮，其中所述葡萄皮是以水含量等于或小于20％为特征的脱水葡萄皮。
17.根据项目1至15中任一项的使用的分离的葡萄皮，所述葡萄皮通过包括以下的方法获得或可通过包括以下的方法获得：
a)干燥整个葡萄，以及
b)分离葡萄皮；
c)任选地，研磨在b)中获得的产物；和
d)任选地，筛分在c)中获得的产物，优选地获得粒度为1mm或更小的产物。
18.根据项目17的使用的分离的葡萄皮，其中在步骤a)中，将整个葡萄在空气循环烘箱中在60℃至62℃下干燥至少2天。
19.一种组合物，包含根据项目1至15中任一项的使用的分离的葡萄皮，所述组合物用于根据项目1至18中的任一项用途。
20.根据项目17的使用的组合物，其中所述组合物还包含选自由益生元、单一的益生菌物种或益生菌物种群、细菌的次级产物、细菌/宿主相互作用的分子途径调节剂和窄谱抗生素组成的组中的化合物。
21.根据项目19或20中任一项的使用的组合物，其中所述组合物还包含选自由发芽大麦食品(gbf)、低聚果糖(fos)、菊粉、苹果果胶和卵叶车前果壳种子和/或花朵和/或该植物的其他任何部分组成的组中的益生元化合物。
22根据项目19至21中任一项的使用的组合物，其中所述组合物还包含单一的益生菌物种或益生菌物种群，所述益生菌物种选自由产丁酸盐细菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、布拉酵母菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的非致病性物种组成的组，其中优选地，所述产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i、普氏粪杆菌遗传谱系ii、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌组成的组。
23.根据项目1至22中任一项的使用的组合物，其中配制所述组合物以用于口服或直肠给药。
以下实施例用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1.-测定的脱水葡萄皮组合物的表征
通过以下方法获得了脱水的葡萄皮组合物，该方法包括在60℃至62℃的空气循环烘箱中干燥来自葡萄物种酿酒葡萄的白葡萄品种(即白歌海娜(arenempordà，加泰罗尼亚，西班牙))的完整的葡萄皮2天，然后进行研磨并使用1mm的筛子对其进行筛分，所得的粒度为1mm或更小的组合物在本文中称为“previpecttm”。
下表提供了该葡萄皮成分的化学组成分析结果，例如，其中指明了可溶性和不溶性纤维以及中性糖的含量：
化学组成分析：
结果：
总糖(以葡萄糖表示)％(p/p)s.s.n53.24
方法：lurff-schoorl体积法(规则(ec)n°152/2009)
糖色谱图
方法：hplc折光率(ri)
可溶性和不溶性膳食纤维％(p/p)s.s.n
方法：重量分析(aoac官方方法993.191(1996)第16版)
总膳食纤维％(p/p)s.s.n32.16
可溶性膳食纤维％(p/p)s.s.n3.30
不溶性膳食纤维％(p/p)s.s.n28.86
湿度和挥发性物质(103℃)％(p/p)s.s.n6.30
方法：重量分析(规则(ec)n°152/2009)
钠(na)mg/kgs.s.n78
方法：火焰原子吸收光谱法(a.a.s.)
硝酸盐(no3na)mg/kgs.s.n26
方法：hplc-uv(dad)
脱水测试
在空气循环烘箱中在60℃至62℃下干燥5天后，使用热天平确定酿酒葡萄物种(白歌海娜品种)的葡萄皮样品的水分含量。结果表明，两天后湿度百分比低于20％，三天后稳定在11％左右。结果如下所示，并显示在图22中。
实施例2.-previpecttm与来自ibd患者和健康对象的粪便样品的体外孵育
材料与方法
1.患者、临床数据和采样
从13名健康对象(h)和11名被诊断为炎性肠病(ibd)的患者(其中5名被诊断为克罗恩氏病(cd)，6名被诊断为溃疡性结肠炎(uc))获得了粪便样品。这些志愿者由dr.joseptrueta大学医院(girona，西班牙)的胃肠科服务处招募。
招募为ibd患者的对象已根据标准的临床、病理和内窥镜标准进行了诊断，所有患者在炎症反应方面均处于活动性疾病之中(钙卫蛋白水平超过250μg/g或c蛋白反应(pcr)水平超过0.5μg/l)。根据临床标准招募由没有任何已知的胃肠疾病的健康对象组成的对照组。
2.样品收集、保存和储存
每个对象提供一个粪便样品。这些是在dr.joseptrueta大学医院胃肠科服务处收集的。简而言之，将样品收集在无菌尿壶(sarstedt，布雷希特，德国)中，保持室温并在沉积后不到4小时内使用新鲜的样品。将来自所有对象的所有样品均质化并立即用于实验。
3.粪便培养
如上所述，用从ibd和健康对象获得的人新鲜粪便进行粪便发酵。在实验室中，粪便样品转移至匀质器无菌塑料袋，添加5:1的发酵缓冲液(0.1mkh2po4，0.05mmnaoh；ph7.0)后，仔细地挤压该袋以混合内容物。将混合物或粪便浆液在匀质器400(seward，沃辛，英国)中以230rpm搅拌3分钟。将10ml这种悬浮液转移到带有酚醛帽的硼硅酸盐玻璃管中。
先前已添加以下每种化合物：
-阴性对照：10ml发酵缓冲液；
-previpecttm200：200mgprevipecttm稀释于10ml发酵缓冲液中；
-previpecttm600：600mgprevipecttm稀释于10ml发酵缓冲液中；
-pectin200：200mg苹果果胶(solgar，马德里，西班牙)稀释于10ml发酵缓冲液中；
-previpecttm pectin200：200mg苹果果胶加200mgprevipecttm均稀释于10ml发酵缓冲液中。
预先将装有底物的管在100℃下高压灭菌10分钟以进行脱气。使发酵管密闭，并在轻微搅拌下在37℃下孵育。
72小时后，将试管转移至无菌塑料试管中，然后在4℃下以4500×g离心30分钟。将上清液转移到另一个试管中，并在4℃下以4500×g再次离心15分钟。最后，将上清液在-20℃下储存在封闭小瓶中。
使用来自每个志愿者的一个独特的粪便样品，然而仅将一个健康对象作为实验的内部对照。但是，由于实验中报道的变化，在每个实验中都将该对象视为不同的对象。
4.dna提取
离心之前，使用
5.短链脂肪酸(scfa)的分析
使来自粪便培养物中的2ml上清液通过0.22μl无菌过滤器进入新试管。添加85ml巴豆酸(10000ppm)作为内标，每1.5ml样品中添加100μl的85％磷酸以转化为非电离样品。将小瓶放入gc-fid系统(agilent，ca，美国)的db-ffap色谱柱(agilent，ca，美国)中。测得的短链脂肪酸如下：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸。
6.从粪便样品中提取的dna的定量实时pcr(qpcr)
通过定量实时pcr分析来自粪便培养物的dna。更具体地讲，我们评估普氏粪杆菌(fpra)、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)、人罗斯拜瑞氏菌(ros)、b46(变异罕见小球菌)和真细菌(eub)的总量。使用定量实时pcr，通过基于taqmantm探针的检测对fpra、pghi、pghii和eco细菌序列进行定量，同时通过
表a：用于qpcr测定的引物和探针：
样品在同一板中运行，一式两份。对于数据分析，使用一式两份定量的平均值。每个样品的细菌丰度均表示为相对于总dna浓度标准化的ct，其中ct值(循环阈值)定义为荧光信号越过阈值所需的q-pcr循环数。ct水平与样品中靶核酸浓度的对数成反比。实时测定进行40个扩增循环。
所有定量pcr均使用ariamxpcr系统(stratagene，agilent，santaclara，ca，美国)进行，并使用ariamx软件1.2版(stratagene，agilent，santaclara，ca，美国)分析。
7.统计分析方法
通过kolmogorov-smirnov检验分析数据的统计学正态分布。根据数据是否具有统计学正态分布，使用了足够的统计检验来比较以下各组。标准t检验用于比较正态分布的组，而mann-whitney非参数检验用于比较无正态分布的组。
结果
为了确定由添加previpecttm引起的肠道微生物群的潜在改善，在与5种不同的的底物孵育后，对这些患者中的真细菌、b46、人罗斯拜瑞氏菌、普氏粪杆菌、遗传谱系i、遗传谱系ii和大肠杆菌的丰度进行了研究。细菌物种的定量结果示于图1a至6c。还定量了短链脂肪酸(scfa)(例如丁酸、己酸、异丁酸、异戊酸、丙酸、戊酸和乙酸)的浓度，以评估添加previpecttm后能够产生scfa的微生物群预期增加的代谢活性。scfa定量结果示于图7a至13c中。
在三个不同样品组(健康(h)对象、克罗恩氏病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)患者)的5种处理之间进行了统计比较。数据未显示正态分布，因此，使用mann-whitney非参数检验来对处理进行比较。
统计比较结果
健康(h)对象
表1.比较与不同底物孵育的来自健康对象的粪便样品中的真细菌(eub)、b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)的总丰度。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
在比较阴性对照(不含底物)与previpecttm200mg和previpecttm600mg时，观察到产丁酸盐物种，例如b46、人罗斯拜瑞氏菌、普氏粪杆菌，尤其是普氏粪杆菌遗传谱系ii通常增加。此外，比较previpecttm600mg与pectin200mg(即苹果果胶)时，可观察到人罗斯拜瑞氏菌丰度增加。
表2.比较来自健康对象的粪便样品中的b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)相对于以真细菌(eub)呈现的总细菌的相对水平。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
当确定了相对于真细菌的相对水平时，对于previpecttm200mg和previpecttm600mg(相对于阴性对照)，观察到人罗斯拜瑞氏菌和遗传谱系ii丰度保持统计学显著增加。类似地，当确定了相对于真细菌的相对水平时，在比较previpecttm600mg与pectin200mg时，观察到人罗斯拜瑞氏菌丰度保持增加。
表3.比较来自健康对象的粪便中的以下有机短链脂肪酸(scfa)的浓度：丁酸、己酸、异丁酸、异戊酸、丙酸、戊酸和乙酸。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各scfa的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
已发现previpecttm代谢丰富。尤其是，对previpecttm200mg和previpecttm600mg与阴性对照进行比较时，观察到丁酸和乙酸浓度增加。此外，在比较previpecttm600mg与pectin200mg(即苹果果胶)时，观察到丁酸和乙酸产量在统计学上显著增加。
benusr.等人已经将丁酸浓度的增加描述成为结肠细胞提供了更好的环境。(“associationbetweenfaecalibacteriumprausnitziianddietaryfibreincolonicfermentationinhealthyhumansubjects”,britishjournalofnutrition.2010,104:693-70)。同样地，乙酸浓度增加也是有利的，因为这会导致肠道微生物群中其他梭菌属细菌(如梭菌属xiv)的营养素浓度更高。据报道，梭菌xiv族占肠道微生物群中细菌总数的很大一部分(10％至40％)。梭菌通过与其他常驻微生物种群相互作用，以及通过提供特定的基本功能，在肠道稳态中发挥关键作用(lopetusoetal.,“commensalclostridia:leadingplayersinthemaintenanceofguthomeostasis”gutpathogen2013,5:23)。
溃疡性结肠炎(uc)患者
表4.比较来自溃疡性结肠炎患者的粪便样品中的真细菌(eub)、b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)的总丰度。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
在比较previpecttm200mg与阴性对照时，观察到包括特定指标例如b46、普氏粪杆菌，特别是被描述为uc患者中缺乏的普氏粪杆菌遗传谱系ii的微生物群丰度增加。
表5.比较来自溃疡性结肠炎患者的粪便样品中的b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)相对于以真细菌(eub)呈现的总细菌的相对水平。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
当与阴性对照比较，相对于previpecttm600mg的真细菌丰度表示丰度值时，遗传谱系ii保持统计学上显著增加。
表6.比较来自溃疡性结肠炎患者的粪便样品中的以下有机短链脂肪酸(scfa)的浓度：丁酸、己酸、异丁酸、异戊酸、丙酸、戊酸和乙酸。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时各scfa的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
已发现previpecttm代谢丰富。尤其是，在对previpecttm200mg和previpecttm600mg与阴性对照进行比较时，观察到丁酸和乙酸浓度增加。此外，在比较previpecttm600与pectin200时，观察到乙酸的产量增加。
克罗恩氏病(cd)患者
表7.比较来自克罗恩氏病患者的粪便样品中的真细菌(eub)、b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)的总丰度。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
在比较previpecttm200mg与阴性对照时，观察到特定物种(罗斯拜瑞氏菌和普氏粪杆菌)增加。
表8.比较来自克罗恩氏病患者的粪便样品中的b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)相对于以真细菌(eub)呈现的总细菌相比的相对水平。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
当相对于真细菌丰度表示丰度水平时，在不同底物之间没有观察到统计学上显著的差异。
表9.比较来自克罗恩氏病患者的粪便样品中的以下有机短链脂肪酸(scfa)的浓度：丁酸、己酸、异丁酸、异戊酸、丙酸、戊酸和乙酸。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时各scfa的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
已发现previpecttm代谢丰富。尤其是，对previpecttm200mg和previpecttm600mg与阴性对照进行比较时，观察到丁酸和乙酸浓度增加。
实施例3.-previpecttm与来自ibs患者和健康对象的粪便样品的体外孵育
材料与方法
1.患者、临床数据和采样
从3名健康对象(h)和3名被诊断为肠易激综合征(ibs)的患者中获得粪便样品。这些志愿者由dr.joseptrueta大学医院(girona，西班牙)的胃肠科服务处招募。
根据ibs的romeiv标准对招募作为ibs患者的对象进行了诊断，这些标准是：在过去3个月中，每周至少平均有1天出现腹痛，并伴有以下情况中的两种或更多种：
(1)与排便有关
(2)与频繁大便的改变有关
(3)与大便形态(稠度)的改变有关；和
症状必须至少在6个月前已经开始(lacyetal.,gastroenterology2016,150(6),1393-1407)。
根据临床标准招募由没有任何已知的胃肠疾病的健康对象组成的对照组。
2.样品收集、保存和储存
每个对象提供一个粪便样品。这些是在dr.joseptrueta大学医院胃肠科服务处收集的。简而言之，将样品收集在无菌尿壶(sarstedt，布雷希特，德国)中，保持室温并在沉积后不到4小时内使用新鲜的样品。将来自所有对象的所有样品均质化并立即用于实验。
3.粪便培养
如上所述，用从ibs和健康对象获得的人新鲜粪便进行粪便发酵。在实验室中，粪便样品转移至匀质器无菌塑料袋，添加5:1的发酵缓冲液(0.1mkh2po4，0.05mmnaoh；ph7.0)后，仔细地挤压该袋以混合内容物。将混合物或粪便浆液在匀质器400(seward，沃辛，英国)中以230rpm搅拌3分钟。将10ml这种悬浮液转移到带有酚醛帽的硼硅酸盐玻璃管中。
先前已添加以下每种化合物：
-阴性对照：10ml发酵缓冲液；
-previpecttm200：200mgprevipecttm稀释于10ml发酵缓冲液中；
-圆苞车前200：200mg圆苞车前(cinfa，西班牙)稀释于10ml发酵缓冲液中；
-pectin200：在提供足够的样品时，将200mg苹果果胶(solgar，马德里，西班牙)稀释于10ml发酵缓冲液中。
预先将装有底物的管在100℃下高压灭菌10分钟以进行脱气。使发酵管密闭，并在轻微搅拌下在37℃下孵育。
72小时后，将试管转移至无菌塑料试管中，然后在4℃下以4500×g离心30分钟。将上清液转移到另一个试管中，并在4℃下以4500×g再次离心15分钟。最后，将上清液在-20℃下储存在封闭小瓶中。
使用来自每个患者的一个独特的粪便样品。健康对象的所有样品均由同一人提供。但是，由于实验中报道的变化，在每个实验中都将该对象视为不同的对象。
4.dna提取
离心之前，使用
5.从粪便样品中提取的dna的定量实时pcr(qpcr)
通过定量实时pcr分析来自粪便培养物的dna。更具体地讲，我们评估普氏粪杆菌(fpra)、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)、普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)、人罗斯拜瑞氏菌(ros)、b46(变异罕见小球菌)、嗜粘蛋白艾克曼菌(akkermansiamuciniphila，akk)和真细菌(eub)的总量。使用定量实时pcr，通过基于taqmantm探针的检测对fpra、pghi、pghii和eco细菌序列进行定量，同时通过
表b：用于qpcr测定的引物和探针：
样品在同一板中运行，一式两份。对于数据分析，使用一式两份定量的平均值。每个样品的细菌丰度均表示为相对于总dna浓度标准化的ct，其中ct值(循环阈值)定义为荧光信号越过阈值所需的q-pcr循环数。ct水平与样品中靶核酸浓度的对数成反比。实时测定进行40个扩增循环。
所有定量pcr均使用ariamxpcr系统(stratagene，agilent，santaclara，ca，美国)进行，并使用ariamx软件1.2版(stratagene，agilent，santaclara，ca，美国)分析。
6.统计分析方法
通过kolmogorov-smirnov检验分析数据的统计学正态分布。根据数据是否具有统计学正态分布，使用了足够的统计检验来比较以下各组。标准t检验用于比较正态分布的组，而mann-whitney非参数检验用于比较无正态分布的组。
结果
为了确定由添加previpecttm引起的肠道微生物群的潜在改善，在与5种不同的的底物孵育后，对这些患者中的真细菌、b46、人罗斯拜瑞氏菌、嗜粘蛋白艾克曼菌、普氏粪杆菌、遗传谱系i、遗传谱系ii和大肠杆菌的丰度进行了研究。细菌物种的定量结果示于图14a至21b。嗜粘蛋白艾克曼菌是一种已被描述为可降解粘蛋白聚合物的粘蛋白营养型(muconutritive)细菌(derrienetal.,internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology(2004),54,1469–1476)。
在两个不同样品组(健康(h)对象和肠易激综合征(ibs)患者)的4种处理之间进行了统计比较。数据未显示正态分布，因此，使用mann-whitney非参数检验来对处理进行比较。
统计比较结果
健康(h)对象
表10.比较与不同底物孵育的来自健康对象的粪便样品中的真细菌(eub)、b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)和人罗斯拜瑞氏菌(ros)和嗜粘蛋白艾克曼菌(akk)的总丰度。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。表格中的数字表示p值，将p值<0.05视为具有统计学意义。当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，与第一底物(左第一栏)相比各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
在比较阴性对照(无底物)与previpecttm200mg和圆苞车前200mg时，观察到产丁酸盐物种人罗斯拜瑞氏菌增加。在比较previpecttm200mg与pectin200mg时，观察到人罗斯拜瑞氏菌减少。此外，在比较阴性对照(不含底物)与previpecttm200mg、plantagoovata200mg和pectin200mg(即苹果果胶)时，观察到粘蛋白艾克曼菌的丰度降低。
表11.比较来自健康对象的粪便样品中的b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)、人罗斯拜瑞氏菌(ros)和嗜粘蛋白艾克曼菌(akk)相对于以真细菌(eub)呈现的总细菌的相对水平。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
当确定了相对于真细菌的相对水平时，对于previpecttm200mg(相对于阴性对照)，观察到人罗斯拜瑞氏菌丰度保持统计学显著增加，而相对于previpect200mg，在pectin200mg下人罗斯拜瑞氏菌丰度保持显著减少。类似地，在确定了相对于真细菌的相对水平时，比较阴性对照与previpecttm200mg、圆苞车前200mg和pectin200mg时观察到嗜粘蛋白艾克曼菌保持减少。此外，在确定了相对于真细菌的相对水平时，比较阴性对照与previpecttm200mg时，大肠杆菌减少。
肠易激综合征(ibs)患者
表12.比较来自溃疡性结肠炎患者的粪便样品中的真细菌(eub)、b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)、人罗斯拜瑞氏菌(ros)和嗜粘蛋白艾克曼菌(akk)的总丰度。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
在比较previpecttm200mg、圆苞车前200mg和pectin200mg与阴性对照时，观察到包括丁酸盐生产者(例如b46、普氏粪杆菌和人罗斯拜瑞氏菌)在内的微生物群丰度增加。此外，在比较previpecttm200mg与圆苞车前200mg时，观察到嗜粘蛋白艾克曼菌减少。
表13.比较来自溃疡性结肠炎患者的粪便样品中的b46、普氏粪杆菌(fpra)、遗传谱系i(phgi)、遗传谱系ii(phgii)、大肠杆菌(eco)、人罗斯拜瑞氏菌(ros)和嗜粘蛋白艾克曼菌(akk)相对于以真细菌(eub)呈现的总细菌的相对水平。表格中的数字表示p值，p值<0.05视为具有统计学意义。对比与第一底物(左第一栏)一起孵育时，当粪便样品与第二底物(左第二栏)一起孵育时，各物种的丰度在统计学上显著增加的以“灰色”高亮表示，而统计学上显著减少以粗体标记。
当相对于真细菌丰度表示丰度值时，与阴性对照相比，未观测到任何处理使统计学显著增加得以维持。在确定了相对于真细菌的相对水平时，比较圆苞车前200mg和pectin200mg与阴性对照时观察到嗜粘蛋白艾克曼菌的丰度降低。在比较previpecttm200mg与阴性对照时，未观察到嗜粘蛋白艾克曼菌丰度在统计学上显著下降。此外，在比较previpecttm200mg与圆苞车前200mg时，还观察到嗜粘蛋白艾克曼菌减少。
实施例4.previpecttm与粪便样品的体外培养–分析不同对象的生态失调指数
材料与方法
为了检查previpecttm对健康对象和肠疾病患者结肠中存在的微生物群影响，进行了两个不同的实验。两种实验所使用的材料和方法均相同。计算了三个不同的指数，以观察被分析对象的初始生态失调，以及孵育样品后不同底物的作用。
患者、临床数据和采样
从16名健康对象(h)和14名被诊断为肠疾病的患者获得粪便样品。11名患者被诊断为患有炎性肠疾病(ibd)：5名被诊断为克罗恩氏病(cd)，6名被诊断为溃疡性结肠炎(uc)；3名患者被诊断为患有肠易激综合征(ibs))。这些志愿者由dr.joseptrueta大学医院(girona，西班牙)的胃肠科服务处招募。
已根据标准的临床、病理和内窥镜标准对招募为ibd患者的对象进行了诊断，所有患者在炎症反应方面均处于活动性疾病之中(钙卫蛋白水平超过250μg/g或c蛋白反应(pcr)水平超过0.5μg/l)。根据临床标准招募由没有任何已知的胃肠疾病的健康对象组成的对照组。
根据ibs的romeiv标准对招募的作为ibs患者的对象进行了诊断，这些标准是：“在过去3个月中，每周至少平均有1天出现腹痛，并伴有以下情况中的两种或更多种：
(1)与排便有关
(2)与频繁大便的改变有关
(3)与大便形态(稠度)的改变有关；和
症状必须至少在6个月前已经开始。”
根据临床标准招募由没有任何已知的胃肠疾病的健康对象组成的对照组。
指数计算
计算了三个不同的指数：
-普氏粪杆菌/大肠杆菌之比(fe指数)：该值越低，对象的生态失调程度越高。
-产丁酸盐细菌/促炎细菌之比(bp指数)：产丁酸盐细菌通过普氏粪杆菌、普氏粪杆菌phgi、普氏粪杆菌phgii、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌的总丰度的总和来计算，促炎细菌通过大肠杆菌的总丰度来计算。该值越低，对象的生态失调程度越高。
-丁酸盐/产丁酸盐细菌之比(bb指数)：产丁酸盐细菌通过普氏粪杆菌、普氏粪杆菌phgi、普氏粪杆菌phgii、人罗斯拜瑞氏菌和变异罕见小球菌的总丰度的总和来计算，丁酸盐是发酵管中获得的丁酸盐的浓度。数值越低，产丁酸盐细菌的活性就越差。
三个指数优选具有较高的数值。
与样品收集、保存和储存；粪便培养、dna提取、短链脂肪酸(scfa)分析和对从粪便样品中提取的dna定量实时pcr(qpcr)有关的方案如上文所述那样进行。
结果
实验4.1：previpecttm与来自健康对象、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的粪便样品的体外孵育。
用于比较来自溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的粪便样品中的previpecttm的化合物如下：
-初始样品：未经孵育处理的样品的初始状态。
-阴性对照：不含底物的10ml发酵缓冲液
-previpecttm200：200mgprevipecttm稀释于10ml发酵缓冲液中；
-previpecttm600：600mgprevipecttm稀释于10ml发酵缓冲液中；
-pectin200：200mg苹果果胶(solgar，马德里，西班牙)稀释于10ml发酵缓冲液中；
-previpecttm pectin200：200mg苹果果胶加200mgprevipecttm均稀释于10ml发酵缓冲液。
表14.fe指数的计算。针对每个对象并针对每种底物，在孵育后计算该值。显示了健康对象、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的平均值。
可以观察到，在健康对象和溃疡性结肠炎中，孵育任何底物期间，fe指数均增加，意味着纠正了生态失调的程度。然而，在克罗恩氏病患者中，与所有底物一起孵育后，fe指数降低。为了观察所使用的底物之间的显著差异，进行了kruskall-wallis统计检验。在健康对象中，分析fe指数时发现了显著差异(p＝0.035)，但是在溃疡性结肠炎或克罗恩氏病患者中观察到的差异并不显著(p＝0.110和p＝0.597)。
表15.通过mann-whitney检验分析对每种处理的指数fe逐个进行比较获得的统计结果。p值小于0.05表示第一栏中所写的处理之间在统计学有显著性的结果。
与阴性对照相比，将pectin以及previpect和pectin的组合用于粪便样品培养时，发现对于健康对象存在显著差异。同样，发现对于溃疡性结肠炎患者也有显著差异。与阴性对照和previpecttm200相比，果胶孵育呈现出更好的结果。比较与previpecttm孵育的样品与其他样品，发现对于克罗恩氏病患者无显著差异。
表16.产丁酸盐细菌与促炎细菌之比的计算。针对每个对象并针对每种底物，在孵育后计算该值。显示了健康对象、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的平均值。
可以观察到，在健康对象、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者中孵育任何底物过程中，bp指数均增加。在健康对象中，previpect是具有更高能力来纠正生态失调程度的底物，呈现出的值最高。对于溃疡性结肠炎，previpect和pectin呈现出相似的纠正生态失调程度的能力。但是，在克罗恩氏病患者中，通过previpect孵育获得的bp指数最低。为了观察使用的底物之间的显著差异，进行了kruskall-wallis统计检验。在健康对象中，分析bp指数时发现了显著差异(p＝0.006)，但是在溃疡性结肠炎或克罗恩氏病患者中观察到的差异并不显著(分别为p＝0.277和p＝0.837)。
表17.通过mann-whitney检验分析对每种处理的指数bp进行逐个比较获得的统计结果。p值小于0.05表示第一栏中所写的处理之间在统计学有显著性的结果。
previpecttm pectin200对比pectin2000.3830.3300.895
与阴性对照相比，当粪便样品与previpect、previpect与pectin的组合以及pectin孵育时，发现对于健康对象存在显著差异。此外，当与previpect和pectin孵育的组合相比时，观察到previpect具有更好的结果。在比较与previpecttm孵育的样品与其他样品时，发现对于克罗恩氏病患者无显著差异。
表18.丁酸盐与产丁酸盐细菌之比的计算。针对每个对象并针对每种底物，在孵育后计算该值。显示了健康对象、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的平均值。
可以观察到，在健康对象、溃疡性结肠炎(pectin除外)和克罗恩氏病患者中，孵育任何底物期间，bb指数均增加，这意味着底物使样品中的产丁酸盐细菌的生产率提高。在所有对象(健康对象、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者)中，在进行previpect孵育后，发现bb指数最高。为了观察所使用的底物之间的显著差异，进行了kruskall-wallis统计检验。在溃疡性结肠炎患者中，分析bb指数时发现存在显著差异(p＝0.023)，但是，在健康对象或克罗恩氏病患者中观察到的差异并不显著(分别为p＝0.253和p＝0.630)。
表19.通过mann-whitney检验分析对每种处理的指数bb逐个进行比较获得的统计结果。p值小于0.05表示在第一栏所写的处理之间在统计学有显著性的结果。
previpecttm pectin200对比pectin2000.6500.0120.598
与阴性对照进行比较，当previpect在粪便样品中孵育时，发现健康对象中存在显著差异。此外，与pectin和阴性对照进行比较，当粪便样品用previpect孵育时，发现对于溃疡性结肠炎患者也存在显著差异。使用previpect孵育可获得更高的结果。
结论：previpect可以降低健康对象和溃疡性结肠炎患者的生态失调的程度(指数bp)。此外，previpect是具有更大的增加bb指数的能力从而增强结肠中的丁酸产量的被分析的底物。
实验4.2：previpecttm与来自健康对象和肠易激综合征患者的粪便样品的体外孵育。
用于比较来自肠易激综合征患者的粪便样品中的previpecttm的化合物如下：
-阴性对照：10ml发酵缓冲液；
-previpecttm200：200mgprevipecttm稀释于10ml发酵缓冲液中；
-圆苞车前200：200mg圆苞车前(cinfa，西班牙)稀释于10ml发酵缓冲液中；
-pectin200：200mg果胶稀释于10ml发酵缓冲液中。
表20计算普氏粪杆菌对比大肠杆菌的指数。针对每个对象并针对每种底物，在孵育后计算该值。显示了健康对象和肠易激综合征患者的平均值。
可以观察到，在健康对象中，孵育任何底物期间，fe指数均增加，在previpect孵育后呈现最高值。在肠易激综合征患者中，仅在圆苞车前孵育中，fe指数更高。为了观察所使用的底物之间的显著差异，进行了kruskall-wallis统计检验。但是，在对健康对象或对肠易激综合征患者分析fe指数时，均未发现显著差异(分别为p＝0.492和p＝0.282)，然而，在健康对象或克罗恩氏病患者中观察到的差异并不显著(p>0.05)。
表21.通过mann-whitney检验分析对每种处理的指数fe逐个进行比较获得的统计结果。p值小于0.05表示第一栏中所写的处理之间在统计学上有显著性的结果。
圆苞车前200对比pectin2000.5190.126
与pectin进行比较，当粪便样品与previpect孵育时，发现对于肠易激综合征患者存在显著差异。pectin孵育获得了更高的结果。
表22.产丁酸盐细菌与促炎细菌之比的计算。针对每个对象并且针对每种底物，在孵育后计算该值。显示了健康对象和肠易激综合征患者的平均值。
可以观察到，在健康对象中孵育任何底物和在肠易激综合征患者中孵育几乎所有底物期间，bp指数均增加。在所有处理中，在健康对象中，previpect处理呈现出最高的bp指数。但是，在肠易激综合征患者中，previpect的bp指数最低。为了观察所使用的底物之间的显著差异，进行了kruskall-wallis统计检验。但是，不论对健康对象还是对肠易激综合征患者分析bp指数时，均未发现显著差异(分别为p＝0.587和p＝0.576)。
表23.通过mann-whitney检验分析对每种处理的指数bp逐个进行比较获得的统计结果。p值小于0.05表示第一栏中所写的处理之间在统计学上有显著性的结果。
当粪便样品与previpect一起孵育时，对于健康对象或肠易激综合征患者，发现均未发现显著差异。
表24.丁酸盐与产丁酸盐细菌之比的计算。针对每个对象并针对每种底物，在孵育后计算该值。显示了健康对象和肠易激综合征的平均值。
可以观察到，在健康对象中，孵育previpect和圆苞车前期间，bb指数增加，这意味着样品中的产丁酸盐细菌的生产率提高。另外，果胶似乎不具有提高丁酸盐生产率的能力。对于肠易激综合征患者，圆苞车前是唯一具有提高丁酸盐生产能力的底物。为了观察所使用的底物之间的显著差异，进行了kruskall-wallis统计检验。在健康对象中观察到显著差异(p＝0.002)，但在分析肠易激综合征患者的bb指数时未发现显著差异(p＝0.120)。
表25.通过mann-whitney检验分析对每种处理的指数bb逐个进行比较获得的统计结果。p值小于0.05表示第一栏中所写的处理之间在统计学上有显著性的结果。
与圆苞车前比较，当粪便样品与previpect孵育时，发现对于健康对象存在显著差异。然而，与圆苞车前孵育可获得更高的结果。
结论：previpect以及果胶能够选择性增加健康对象中的产丁酸物种及其生产率。在肠易激综合征患者中，当涉及生产率时，previpect呈现与果胶相似的作用，但并未呈现对该指数产生任何重要改变。
1.分离的葡萄皮的用途，所述分离的葡萄皮用于治疗对象的肠生态失调的预防性或治疗性方法中，其中，所述肠生态失调的特征是产丁酸盐细菌的水平降低和/或活性降低，其中产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)和普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)组成的组。
2.根据权利要求1所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述方法是治疗肠生态失调的预防性方法。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述对象不表现出肠疾病的体征和/或症状。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述对象患有选自由溃疡性结肠炎、克罗恩氏病或肠易激综合征组成的组中的肠道疾病。
5.分离的葡萄皮的用途，所述分离的葡萄皮用于治疗对象的肠疾病的预防性或治疗性方法中，所述肠疾病选自由溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和肠易激综合征组成的组，其中，所述对象患有以产丁酸盐细菌的水平降低和/或活性降低为特征的肠生态失调，其中，所述产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)和普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)组成的组。
6.根据权利要求5所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述方法是预防性方法，并且所述对象不表现出肠疾病的体征和/或症状。
7.根据权利要求5所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述肠疾病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
8.根据权利要求5所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述肠道疾病是肠易激综合征。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述对象是人类对象。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，通过以下方法确定产丁酸盐细菌减少：
a.确定所述对象的肠样品中产丁酸盐细菌的水平，所述肠样品优选粪便样品；
b.将所述对象样品中的所述产丁酸盐细菌的水平与参考样品中的水平进行比较，优选地，其中所述参考样品是未患有肠疾病的对象或对象组的样品；
其中当所述对象样品中的水平低于所述参考样品中的水平时，则所述产丁酸盐细菌减少；
其中优选地，通过定量pcr确定所述产丁酸盐细菌的水平。
11.根据权利要求10所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述产丁酸盐细菌选自由普氏粪杆菌、普氏粪杆菌遗传谱系i(phgi)和普氏粪杆菌遗传谱系ii(phgii)组成的组，所述产丁酸盐细菌的各水平通过包括使用以下中的一种或多种的方法来确定：
-用于测定普氏粪杆菌的水平的选自由seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3组成的组中的多核苷酸和与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3具有至少85％同一性的多核苷酸；
-用于确定phgi水平的由seqidno:6组成的多核苷酸或与seqidno:6具有至少85％同一性的多核苷酸，任选地，与seqidno:4和/或seqidno:5组合，或和与seqidno:4和/或seqidno:5具有至少85％同一性的多核苷酸组合；
-用于确定phgii水平的由seqidno:7组成的多核苷酸或与seqidno:7具有至少85％同一性的多核苷酸，任选地，与seqidno:4和/或seqidno:5组合，或和与eqidno:4和/或seqidno:5具有至少85％同一性的多核苷酸组合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述葡萄皮来自葡萄物种酿酒葡萄(vitisvinifera)，优选地来自白葡萄品种。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的分离的葡萄皮的用途，其特征在于，所述葡萄皮是以水含量等于或小于20％为特征的脱水葡萄皮。
14.包含根据权利要求1至12中任一项所定义的分离的葡萄皮的组合物在根据权利要求1至13中任一项中的用途。
15.根据权利要求14所述的组合物的用途，其特征在于，所述组合物还包含选自由益生元、单一的益生菌物种和益生菌物种群组成的组中的的化合物。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的组合物的用途，其特征在于，配制所述组合物以用于口服或直肠给药。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的组合物的用途，其特征在于，所述组合物是延迟释放的口服形式。
技术总结