本发明具体涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体及muc1嵌合抗原受体t细胞的制备方法。
背景技术：
黏蛋白1(muc1)是一种高分子量细胞表面跨膜糖蛋白，在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、肾癌等原发性恶性肿瘤中，muc1均存在过度表达。muc1蛋白已被证实在促进肿瘤细胞生长、干细胞特性增强、药物抵抗等方面起关键作用，因而是肿瘤生物治疗的重要靶点之一。
muc1蛋白在胞外区的海胆精子蛋白、肠激酶和集聚蛋白(sea)结构域中的gsvvv基序被切割后而形成两个亚基，muc1-n(α亚基)和muc1-c(β亚基)。muc1-n端由信号肽、可变串联重复序列区(vntr)和sea结构域组成。vntr区包含20至125个串联重复的20个氨基酸，其中丝氨酸和苏氨酸是潜在的o-糖基化位点。同时，muc1-n和muc1-c也含有少量的n-糖基化位点。muc1-c由含58个氨基酸的胞外结构域、28个氨基酸的跨膜结构域和72个氨基酸的胞质结构域组成。在正常生理条件下，通过非共价键形成的muc1-n和muc1-c异二聚体定位于质膜(plasmamembrane)。在肿瘤发生和进展过程中，大量muc1-n从细胞表面脱落，muc1-n如何从细胞表面脱落的分子机理尚不清楚。
研发靶向muc1的抗体用于肿瘤治疗已有35年的历史，迄今还没有fda批准的靶向muc1的治疗抗体药物。所有临床试验中的muc1抗体都只识别muc1-n中的抗原决定簇，临床试验效果都不理想，原因之一是因为muc1-n往往从肿瘤细胞表面脱落并在细胞外基质和外周血中自由循环，游离的muc1-n可以中和大部分的muc1抗体，这就限制了可以靶向到肿瘤细胞表面上muc1蛋白的抗体量。
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)是一种融合蛋白，由位于胞外的结合肿瘤相关抗原的单链抗体scfv、跨膜区和位于胞内的t细胞的活化基序所组成。car-t细胞疗法是通过血液分离术收集患者外周血中的t细胞，对t细胞进行离体基因修饰，使t细胞膜上表达识别特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体car，然后将car-t细胞输回患者体内，car-t细胞在特异靶向肿瘤细胞表面抗原(不需要主要组织相容性复合体递呈)的同时被激活，并能够在体内肿瘤细胞刺激下扩增，从而高效杀死癌细胞。
由于car-t细胞在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了令人鼓舞的进展,美国食品药品监督管理局(fda)已批准了两种car-t疗法。第一种被批准的car-t细胞疗法是诺华公司的kymriah(靶向cd19抗原称为ctl019),最初被批准用于治疗25岁以下，难治性或两次或多次复发的b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)患者，前期临床疗效评估中kymriah对复发/难治b细胞all患者的完全缓解率(cr)达到了60到90％。随后，另一种被批准的是kitepharma公司的抗cd19car-t(yescarta)细胞疗法，用于治疗大b细胞淋巴瘤患者，这些患者都是曾接受了至少两次其他治疗，但没有出现缓解，或是疾病出现复发。在多个中心的临床试验中yescarta对难治性b细胞淋巴瘤患者的完全缓解率达到51％，其中一些患者缓解已持续三年以上。
最近，fda进一步批准kymriah用于两种或两种以上治疗且疾病发生进展，或没有反应的复发或难治性大b细胞淋巴瘤的成人患者，包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、highgradeb细胞淋巴瘤以及滤泡性淋巴瘤引起的dlbcl。除all和dlbcl外，car-t细胞在其他血液系统恶性肿瘤的早期临床试验中也显示出良好的效果，包括抗bcmacar-t细胞治疗多发性骨髓瘤。
这些临床试验已清楚地表明car-t细胞有效治疗恶性肿瘤的作用，到目前为止car-t细胞免疫疗法在治疗b细胞恶性肿瘤等血液肿瘤方面已取得令人鼓舞的结果，但对实体瘤患者的缓解率较差。
实体肿瘤中car-t细胞免疫疗法面临的一些重大挑战包括：(1)缺乏肿瘤独特的靶抗原，(2)只有数量有限的car-t细胞浸润到肿瘤基质中，(3)肿瘤异质性和相关抗原缺失，(4)肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用等。
因此，寻找理想肿瘤靶抗原，开发更具靶向性、低副作用并能高效杀伤肿瘤细胞的car-t细胞制备技术，将为治疗实体肿瘤提供新的有效疗法。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体及muc1嵌合抗原受体t细胞的制备方法，只识别肿瘤细胞表面muc1，不识别游离于血液中的muc-1n端,能更有效靶向治疗muc1阳性肿瘤。
本发明采用的技术解决方案是：一种靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体,所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体由位于胞外的结合肿瘤细胞表面muc1的单链抗体scfv、跨膜区和位于胞内的t细胞的活化基序所组成，构建新型融合基因anti-muc1-scfv-cd28-cd137-cd3ζ。
一种靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)muc1.28.bb.zcar基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定；
(2)新型抗muc1car重组慢病毒的制备；
(3)新型muc1.28.bb.zcar-t细胞的制备。
所述的步骤(1)muc1.28.bb.zcar基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定由以下步骤组成：
(a)muc1.28.bb.zcar融合基因的设计：融合基因结构为ecori-kozak序列-igκ信号肽-vl-linker-vh-cd8hinge-cd28跨膜区-cd28胞内区-cd137/4-1bb-cd3ζ-bamhi，其中igκ信号肽、cd8基因的hinge、cd28基因的跨膜区和胞内区、cd137基因、cd3ζ基因的序列均参考genebank(ncbi)，vl和vh为人源化muc1抗体scfv中的可变区轻链和可变区重链序列部分。
(b)慢病毒表达质粒的构建：muc1.28.bb.zcar融合基因dna片段经ecori和bamhi双酶切后插入plvx-ef1α-ires.zsgreen慢病毒表达质粒中，产生的plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen质粒经过ecori和bamhi双酶切鉴定后，经测序确证。
所述的步骤(2)新型抗muc1car重组慢病毒的制备由以下步骤组成：
(a)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的包装：在10cm培养皿中接种7x106个293t17细胞，培养液用含有1％青霉素-链霉素和8％胎牛血清的dmem培养基，37℃，5％co2培养过夜，16-24小时后，10cm皿中293t17细胞覆盖率达到70-80％时进行转染，转染前2小时换成6ml无青霉素-链霉素的培养液，转染时按照目的质粒:包装质粒：包膜质粒质量比例为4：3：1，分别取重组慢病毒表达质粒plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen1、pspax2和pmd2g加入1.5ml离心管中，再加入转染试剂聚乙烯亚胺(pei)，质粒：pei＝1：3，充分混匀后静置20min，再将上述混合物逐滴加入10cm皿中，37℃，5％co2培养过夜。转染后16小时换成5ml新鲜培养液；
(b)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的浓缩、纯化：换液24小时后，收集第一次病毒上清液于50ml离心管中，加入5ml新鲜培养液于被转染的293t17细胞中。3000rpm,10分钟低速离心病毒上清液以除去细胞碎片，再用0.45μm低蛋白吸附滤膜过滤除去杂质，存放于4℃，待进行病毒浓缩。24小时后收集第二次病毒上清液进行与上述同样处理，将上述经过初步处理的病毒液加入含有20％蔗糖溶液的超速离心管中，蔗糖：病毒液＝1:4,82700g，4℃离心2小时，弃上清，病毒沉淀块用1/100病毒原液体积的rpmi-1640培养基重悬。然后将浓缩病毒液移至1.5ml离心管中，14000rpm离心1分钟，进一步纯化。吸取上清液即可用于转导细胞，或分装储存于-80℃保存。
(c)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的滴度测定：在24孔培养板每孔铺1.5x105个293t17细胞，500ul培养液，共设置8个孔，1孔用做转导前细胞计数，1孔用做未转导对照孔，其余6孔分别用作vector和muc1.28.bb.zcar病毒转导的倍比稀释孔，细胞覆盖率为30-40％时进行转导，转导后24小时换液，转导后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，选取绿色荧光蛋白gfp表达阳性率介于5％-20％的稀释倍数孔做流式检测。
所述的步骤(3)新型muc1.28.bb.zcar-t细胞的制备由以下步骤组成：
①人外周血单核细胞(pbmc)的分离：抽取200ml外周血，分装到50ml离心管中，每管50ml,700g,20分钟离心尽量吸去血浆，加pbs至50ml，在离心管中加入25ml的ficoll淋巴细胞分离液，再加入25ml经pbs稀释后的血液900g,离心15分钟，离心缓升缓降，离心后吸取白膜层单核细胞至新离心管中，加pbs离心洗涤细胞500g,10分钟。细胞沉淀一部分用rpmi-1640培养液重悬,另外一部分用冻存液，dmso:fbs＝1：9，重悬，分装储存于-80℃,过夜后转入液氮。
②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增：将100μlcd2-biotin，100μlcd3-biotin，100μlcd28-biotin加入到2ml离心管中充分混匀，将磁珠涡旋充分重悬，取500μl磁珠1×108加入，再加入200μl配制好的缓冲液，此时体积整好为1ml，4℃摇床放置2小时进行抗体的充分包被，2小时后拿出，4℃保存可以稳定4个月，取包被好的5μl磁珠5×105个与提前准备好的基础rpmi-1640混合，水平离心300g,5分钟，洗两次后用100μl的t细胞培养液重悬磁珠。将1×106个pbmc细胞与磁珠2:1充分混匀，接种至24孔培养板中，37℃培养箱中培养2天。
③重组慢病毒转导人外周血t细胞及muc1.28.bb.zcar阳性率的检测：重组慢病毒以不同感染复数moi值转导人外周血t细胞后5-8天,用流式检测细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率；取上述新鲜制备的或冻存的浓缩病毒，按照感染复数moi值为20加入已经活化两天的t细胞培养孔中，并加入终浓度为8ug/ml的聚凝胺1200-1500g，37℃离心2小时后,放置在培养箱中，16小时后换液，第一次转导后24小时，重组慢病毒二次转导人外周血t细胞，条件同第一次转导，慢病毒转导人外周血t细胞后5-8天，流式细胞检测t细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率。
所述的步骤(c)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的滴度测定中，培养液采用dmem培养基 8％胎牛血清 1％青霉素-链霉素。
所述的步骤②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增中，活化t细胞的最佳浓度为抗体终浓度10μg/ml。
所述的步骤②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增中的缓冲液通过加入胎牛血清,edta于ph＝7.2的pbs中，使胎牛血清终浓度为0.5％，edta终浓度为2mm,充分混匀后4℃保存得到。
所述的步骤②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增中t细胞培养液由gtt551培养液 10％胎牛血清 300iu/mlil-2配制而成。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体及muc1嵌合抗原受体t细胞的制备方法,解决了目前所有临床试验中muc1抗体因识别从细胞上脱落而游离血液中的muc-1n端，而不能有效靶向肿瘤细胞和靶向治疗muc1阳性肿瘤的技术缺陷，本专利制备技术中人源化的hzmuc1抗体只识别肿瘤细胞表面muc1，不识别游离于血液中的muc-1n端,能更有效靶向治疗muc1阳性肿瘤，新型muc1.28.bb.zcar-t细胞与muc1阳性肿瘤细胞共培养后，杀伤靶细胞效能显著，将为增强抗muc1car-t细胞的肿瘤免疫治疗效果打下基础，对muc1阳性实体肿瘤的免疫治疗具有实际指导意义。
附图说明
图1为hzmuc1抗体不识别胰腺癌患者外周血中的muc1蛋白。
图2为新型muc1.28.bb.zcar设计结构示意图。
图3为重组慢病毒表达质粒plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen1的图谱。
图4为重组慢病毒表达质粒中muc1.28.bb.zcar融合基因dna测序结果以及融合基因中不同dna片段编码car中不同功能区域。
图5为重组慢病毒表达质粒plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen1与包装质粒pspax2、pmd2g共转染293t17细胞16、40、64小时后可见光与荧光显微镜视野下细胞对比图(100×)。
图6为流式检测浓缩muc1.28.bb.zca慢病毒液转导293t17细胞后绿色荧光蛋白gfp阳性率以及病毒液滴度的计算结果。
图7为新型muc1.28.bb.zcar重组慢病毒转导t细胞后流式检测t细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率。
图8为蛋白印迹(westernblot)检测乳腺癌细胞株中的muc1的表达水平。
图9图10为新型muc1.28.bb.zcar-t细胞与muc1高表达的细胞hcc1954和hcc70和muc1低表达的细胞mb231和hs578t细胞的结合能力观察。
图11为ldh方法检测表明新型muc1.28.bb.zcar-t细胞对muc1表达高的乳腺肿瘤细胞有高效的杀伤作用。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一、muc1.28.bb.zcar基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定
(a)muc1.28.bb.zcar融合基因的设计
新型抗muc1嵌合抗原受体结构图，融合基因结构为ecori-kozak序列-igκ信号肽-vl-linker-vh-cd8hinge-cd28跨膜区-cd28胞内区-cd137/4-1bb-cd3ζ-bamhi。其中igκ信号肽、cd8基因的hinge、cd28基因的跨膜区和胞内区、cd137基因、cd3ζ基因的序列均参考genebank(ncbi)。vl和vh为人源化muc1抗体scfv中的可变区轻链和可变区重链序列部分(见图2)。muc1.28.bb.zcar融合基因由苏州金唯智生物科技有限公司化学合成。
(b)慢病毒表达质粒的构建
muc1.28.bb.zcar融合基因dna片段经ecori和bamhi双酶切后插入plvx-ef1α-ires.zsgreen慢病毒表达质粒中，产生的plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen质粒经过ecori和bamhi双酶切鉴定后，由苏州金唯智生物科技有限公司测序确证(见图4)。
二、重组慢病毒的制备
(a)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的包装
在10cm培养皿中接种7x106个293t17细胞，培养液用含有1％青霉素-链霉素和8％胎牛血清的dmem培养基，37℃，5％co2培养过夜。16-24小时后，10cm皿中293t17细胞覆盖率达到70-80％时进行转染。转染前提前2小时换成6ml无青霉素-链霉素的培养液，转染时按照目的质粒：包装质粒：包膜质粒质量比例为4：3：1，分别取重组慢病毒表达质粒plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen1、pspax2和pmd2g加入1.5ml离心管中，再加入转染试剂聚乙烯亚胺(pei)(质粒：pei＝1：3)，充分混匀后将上述混合物逐滴加入10cm皿中，37℃，5％co2培养过夜。转染后16小时换液，加入5ml新鲜培养液。
(b)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的浓缩、纯化
(1)收集重组慢病毒及初步纯化
换液24小时后，收集第一次病毒上清液于50ml离心管中，加入5ml新鲜培养液于被转染的293t17细胞中。3000rpm,10分钟低速离心病毒上清液以除去细胞碎片，再用0.45μm低蛋白吸附滤膜过滤除去杂质，存放于4℃，待进行病毒浓缩。24小时后收集第二次病毒上清液进行与上述同样处理。
(2)重组慢病毒的超速离心浓缩及进一步纯化
将上述经过初步处理的病毒液加入含有20％蔗糖溶液的超速离心管中(蔗糖：病毒液＝1:4),82700g，4℃离心2小时。弃上清，病毒沉淀块用1/100病毒原液体积的rpmi-1640培养基重悬。然后将浓缩病毒液移至1.5ml离心管中，14000rpm离心1分钟，进一步纯化。吸取上清液即可用于转导细胞，或分装储存于-80℃保存。
(c)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的滴度测定
24孔培养板每孔铺1.5x105个293t17细胞，500ul培养液(dmem培养基 8％胎牛血清 1％青霉素-链霉素)。共设置8个孔，1孔用做转导前细胞计数，1孔用做未转导对照孔，其余6孔分别用作vector和muc1.28.bb.zcar病毒转导的倍比稀释孔。细胞覆盖率为30-40％时进行转导，转导后24小时换液，转导后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，选取绿色荧光蛋白gfp表达阳性率介于5％-20％的稀释倍数孔做流式检测。
按t＝(p×n)/(d×v)进行滴度计算。t：titer(tu/ml)，p：gfp阳性细胞％，n：转导时的每孔细胞数，d：所加病毒的稀释倍数，v：每孔加入的稀释的病毒体积。
三、新型muc1.28.bb.zcar-t细胞的制备
①人外周血单核细胞(pbmc)的分离
用一次性采血袋(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司)抽取200ml健康志愿者外周血。分装到50ml离心管中，每管50ml，700g,20分钟离心尽量吸去血浆，加pbs至50ml。在离心管中加入25mlficoll淋巴细胞分离液，再加入25ml经pbs稀释后的血液，900g,离心15分钟，离心缓升缓降。离心后吸取白膜层单核细胞至新离心管中，加pbs离心洗涤细胞,500g,10分钟。细胞沉淀一部分用rpmi-1640培养液重悬,另外一部分用冻存液(dmso:fbs＝1：9)重悬，分装储存于-80℃,过夜后转入液氮。
②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增
(1)活化t细胞磁珠包被
将100μlcd2-biotin，100μlcd3-biotin，100μlcd28-biotin(德国美天旎公司)加入到2ml离心管中充分混匀(抗体终浓度为10μg/ml是最佳活化t细胞的浓度)。将磁珠涡旋充分重悬，取500μl磁珠(1×108)加入，再加入200μl配制好的缓冲液(缓冲液:加入胎牛血清,edta于ph＝7.2的pbs中，使胎牛血清终浓度为0.5％，edta终浓度为2mm,充分混匀后4℃保存)此时体积整好为1ml。4℃摇床放置2小时进行抗体的充分包被。2小时后拿出，4℃保存可以稳定4个月。
(2)人外周血t细胞的激活(以刺激1×106个pbmc细胞为例)
取包被好的磁珠5μl(5×105个)与提前准备好的基础rpmi-1640混合，水平离心300g,5分钟，洗两次后用100μl的t细胞培养液(gtt551培养液 10％胎牛血清 300iu/mlil-2)重悬磁珠。将1×106个pbmc细胞与磁珠2:1充分混匀，接种至24孔培养板中，37℃培养箱中培养2天。
③重组慢病毒转导人外周血t细胞及muc1.28.bb.zcar阳性率的检测
(1)重组慢病毒转导的优化
重组慢病毒以不同感染复数moi值(5、10、15、20、25)转导人外周血t细胞后5-8天,用流式检测细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率。
(2)重组慢病毒转导人外周血t细胞
取上述新鲜制备的或冻存的浓缩病毒，按照感染复数moi值为20加入已经活化两天的t细胞培养孔中，并加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺，1200-1500g，37℃离心2小时,然后置培养箱中。16小时后换液，第一次转导后24小时，重组慢病毒二次转导人外周血t细胞，条件同第一次转导。
(3)人外周血t细胞muc1.28.bb.zcar阳性率的检测
慢病毒转导人外周血t细胞后5-8天，流式细胞检测t细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率。
四、新型muc1.28.bb.zcar-t细胞的体外杀伤乳腺肿瘤细胞的效能检测
1、新型muc1.28.bb.zcar-t细胞与靶细胞共培养检测结合能力
将vector-t(即空载体病毒感染的t细胞)、anti-muc1car-t(muc1.28.bb.zcar病毒感染的t细胞)分别与靶细胞hcc1954(高表达muc1的her2阳性乳腺癌细胞)、hcc70(高表达muc1的三阴性乳腺癌细胞)、mb231(低表达muc1的三阴性乳腺癌细胞)、hs578t细胞(未检测到muc1表达的三阴性乳腺癌细胞)、mcf10a(正常乳腺上皮细胞)共培养18小时，用倒置相差显微镜观察muc1.28.bb.zcar-t细胞与靶细胞的结合能力。
2、ldh方法检测muc1.28.bb.zcar-t细胞对靶细胞的杀伤作用
96孔培养板中接种靶细胞，设置无细胞的培养液(背景空对照孔)，未处理的对照细胞(样品对照孔)，未处理的后续裂解细胞(样品最大酶活性对照孔)，和实验组(不同效靶比)，采用东仁化学科技有限公司的cytotoxicityldhassaykit检测在不同效靶比情况下muc1.28.bb.zcar-t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实验结果：
图1抗muc1抗体(hzmuc1)不识别胰腺癌患者外周血中的muc1蛋白。muc1高表达乳腺癌细胞株zr75-1得到细胞裂解液；lane1,正常人外周血血清；lane2,胰腺癌患者血清。(a)使用研究领域中常用的抗muc1-nt抗体蛋白印迹检测muc1-n端蛋白表达情况。(b)使用抗muc1-nt抗体和hzmuc1抗体进行免疫沉淀，蛋白印迹用抗muc1-nt抗体，检测抗muc1抗体识别人外周血中游离的muc1蛋白情况。
结果显示：胰腺癌患者血清中存在游离的muc1-n端，且zr75-1细胞表达muc1-n端(a)。免疫沉淀实验结果显示抗muc1-nt抗体结合zr75-1细胞表达的muc1及胰腺癌患者血清中muc1，而抗muc1抗体只结合zr75-1细胞表达的muc1，不结合胰腺癌患者血清中muc1(b)。
图5重组慢病毒质粒plvx-anti-muc1car.ires.zsgreen1与包装质粒共转染293t17细胞16、40、64小时后可见光与荧光显微镜下细胞对比图(100×)。其中第1、3列为可见光视野照片，第2、4列荧光视野照片，第1列与第2列为同一视野，第3列与第4列为同一视野,bar:200um。
图6流式细胞仪检测浓缩muc1.28.bb.zcar慢病毒液转导293t17细胞后绿色荧光蛋白gfp阳性率以及病毒液滴度的计算结果。第一横排用0.7μlvector病毒感染293t17细胞，转导前计数细胞数量为3.5x105个，gfp阳性率为27.9％，故滴度计算结果为1.4x108tu/ml，第二横排用0.7μlmuc1.28.bb.zcar病毒感染293t-17细胞，转导前计数细胞数量为3.5x105个，gfp阳性率为19.3％，故滴度计算结果9.6x107tu/ml。
图7新型muc1.28.bb.zcar重组慢病毒转导t细胞后流式检测muc1.28.bb.zcar-t细胞gfp阳性率。vector-t细胞的gfp阳性率为38％，muc1.28.bb.zcar-t细胞gfp阳性率为30％。
图9新型muc1.28.bb.zcar-t细胞与hcc1954细胞(高表达muc1的her2阳性乳腺癌细胞)、mb231细胞(低表达muc1的三阴性乳腺癌细胞)的结合能力观察(200x)。vector-t细胞和muc1.28.bb.zcar-t以2：1和4：1的效靶比与hcc1954、mb231细胞共培养18小时后用倒置相差显微镜观察拍照。效靶比为t细胞与肿瘤靶细胞数量的比值。第1列为vector-t与hcc1954共培养照片，第2列为muc1.28.bb.zcar-t与hcc1954共培养照片,第3列为vector-t与mb231共培养照片，第4列为muc1.28.bb.zcar-t与mb231共培养照片。第一横排效靶比为2:1，第二横排效靶比为4:1，标尺:100μm。
结果显示：倒置相差显微镜观察证实muc1.28.bb.zcar-t细胞与muc1高表达靶细胞hcc1954能较紧密地结合而成团，但与muc1低表达细胞mb231没有明显结合而成团现象。
图10新型muc1.28.bb.zcar-t细胞与hcc70细胞(高表达muc1的三阴性乳腺癌细胞)、hs578t细胞(未检测到muc1表达的三阴性乳腺癌细胞)的结合能力观察(200x)。vector-t细胞和muc1.28.bb.zcar-t以8：1的效靶比与hcc70、hs578t细胞共培养18小时后用倒置相差显微镜观察拍照。左上为vector-t与hcc70共培养照片，右上为与muc1.28.bb.zcar-t细胞与hcc1954共培养照片,左下为vector-t与hs578t共培养照片，右下为muc1.28.bb.zcar-t细胞与hs578t共培养照片。效靶比均为8:1，标尺:100μm。
结果显示：倒置相差显微镜观察证实muc1.28.bb.zcar-t细胞与muc1高表达靶细胞hcc70能较紧密地结合而成团，但与muc1阴性细胞hs578t没有明显结合而成团现象。
图11ldh方法检测表明新型muc1.28.bb.zcar-t细胞对muc1表达高的乳腺肿瘤细胞有高效的杀伤作用。vector-t细胞和muc1.28.bb.zcar-t以4：1和8：1的效靶比与hcc1954、mb231、mcf10a细胞共培养18小时(上图)，或以4：1效靶比与hs578t、hcc70细胞共培养18小时(下图)，然后用ldh方法定量检测t-细胞杀伤肿瘤细胞的效能。hcc1954：高表达muc1的her2阳性乳腺癌细胞；hcc70：高表达muc1的三阴性乳腺癌细胞；mb231：低表达muc1的tnbc型乳腺癌细胞；hs578t：未检测到muc1表达的tnbc型乳腺癌细胞；mcf10a:正常乳腺上皮细胞；**：p＜0.01，***：p＜0.001。
结果显示：muc1.28.bb.zcar-t细胞与muc1高表达靶乳腺癌细胞hcc1954、hcc70细胞共培养后，杀伤靶细胞效能显著(70-80％杀伤率)，但与muc1表达低的mb231、muc1阴性的hs578t乳腺癌细胞株以及正常乳腺上皮细胞mcf10a共培养后，杀伤细胞效能都不显著。此外vector-t细胞对muc1表达低和高的乳腺癌细胞株以及正常乳腺上皮细胞均无明显杀伤效能。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
1.一种靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体,其特征在于，所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体由位于胞外的结合肿瘤细胞表面抗原muc1的单链抗体scfv、跨膜区和位于胞内的t细胞的活化基序所组成，构建新型融合基因anti-muc1-scfv-cd28-cd137/4-1bb-cd3ζ。
2.一种靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)muc1.28.bb.zcar基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定；
(2)新型抗muc1car重组慢病毒的制备；
(3)新型muc1.28.bb.zcar-t细胞的制备。
3.根据权利要求2所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)muc1.28.bb.zcar基因的设计、重组慢病毒真核表达质粒的构建及鉴定由以下步骤组成：
(a)muc1.28.bb.zcar融合基因的设计：融合基因结构为ecori-kozak序列-igκ信号肽-vl-linker-vh-cd8hinge-cd28跨膜区-cd28胞内区-cd137/4-1bb-cd3ζ-bamhi，其中igκ信号肽、cd8基因的hinge、cd28基因的跨膜区和胞内区、cd137/4-1bb基因、cd3ζ基因的序列均参考genebank(ncbi)，vl和vh为人源化muc1抗体scfv中的可变区轻链和可变区重链序列部分；
(b)慢病毒表达质粒的构建：muc1.28.bb.zcar融合基因dna片段经ecori和bamhi双酶切后插入plvx-ef1α-ires.zsgreen慢病毒表达质粒中，产生的plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen质粒经过ecori和bamhi双酶切鉴定后，经测序确证。
4.根据权利要求2所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)新型抗muc1car重组慢病毒的制备由以下步骤组成：
(a)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的包装：在10cm培养皿中铺7x106个293t17细胞，培养液用含有1％青霉素-链霉素和8％胎牛血清的dmem培养基，37℃，5％co2培养过夜，16-24h后，10cm皿中293t17细胞覆盖率达到70-80％时进行转染，转染前提前2h换成6ml无青霉素-链霉素的培养液，转染时按照目的质粒，包装质粒：包膜质粒质量比例为4：3：1，分别取重组慢病毒表达质粒plvx-ef1α-anti-muc1car.ires.zsgreen1、pspax2和pmd2g加入1.5ml离心管中，再加入转染试剂聚乙烯亚胺(pei)，质粒：pei＝1：3，充分混匀后将上述混合物逐滴加入10cm皿中，37℃，5％co2培养过夜。转染后16小时换液，加入5ml新鲜培养液；
(b)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的浓缩、纯化：换液24h后，收集第一次病毒上清液于50ml离心管中，加入5ml新鲜培养液于被转染的293t17细胞中。3000rpm,10min低速离心病毒上清液以除去细胞碎片，再用0.45um低蛋白吸附滤膜过滤除去杂质，存放于4℃，待进行病毒浓缩。24h后收集第二次病毒上清液进行与上述同样处理，将上述经过初步处理的病毒液加入含有20％蔗糖溶液的超速离心管中，蔗糖：病毒液＝1:4,82700g，4℃离心2h，弃上清，病毒沉淀块用1/100病毒原液体积的rpmi-1640培养基重悬。然后将浓缩病毒液移至1.5ml离心管中，14000rpm离心1分钟，进一步纯化。吸取上清液即可用于转导细胞，或分装储存于-80℃保存；
(c)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的滴度测定：在24孔培养板每孔铺7x104个293t-17细胞，500ul培养液，共设置8个孔，1孔用做转导前细胞计数，1孔用做未转导对照孔，其余6孔分别用作vector和muc1.28.bb.zcar病毒转导的倍比稀释孔，细胞覆盖率为30-40％时进行转导，转导后24h换液，转导后72h荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白gfp的表达，选取绿色荧光蛋白gfp表达阳性率介于5％-20％的稀释倍数孔做流式检测。
5.根据权利要求2所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)新型muc1.28.bb.zcar-t细胞的制备由以下步骤组成：
①人外周血单核细胞(pbmc)的分离：抽取200ml外周血，分装到50ml离心管中，每管50ml,700g,20min离心尽量吸去血浆，加pbs至50ml，在离心管中加入25mlficoll淋巴细胞分离液，再加入25ml经pbs稀释后的血液900g,离心15min，离心缓升缓降，离心后吸取白膜层单核细胞至新离心管中，加pbs离心洗涤细胞500g,10min。细胞沉淀一部分用rpmi-1640培养液重悬,另外一部分用冻存液，dmso:fbs＝1：9，重悬，分装储存于-80℃,过夜后转入液氮；
②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增：将100μlcd2-biotin，100μlcd3-biotin，100μlcd28-biotin加入到2ml离心管中充分混匀，将磁珠涡旋充分重悬，取500μl磁珠1×108加入，再加入200μl配制好的缓冲液，此时体积整好为1ml，4℃摇床放置2h进行抗体的充分包被，2h后拿出，4℃保存可以稳定4个月，取包被好的5μl磁珠5×105个与提前准备好的基础rpmi-1640混合，水平离心300g,5min，洗两次后用100μl的t细胞培养液重悬磁珠。将1×106个pbmc细胞与磁珠2:1充分混匀，接种至24孔培养板中，37℃培养箱中培养2天；
③重组慢病毒转导人外周血t细胞及muc1.28.bb.zcar阳性率的检测：重组慢病毒以不同感染复数moi值转导人外周血t细胞后5-8天,用流式检测细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率；取上述新鲜制备的或冻存的浓缩病毒，按照感染复数moi值为20加入已经活化两天的t细胞培养孔中，并加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺1200-1500g，37℃离心2h,然后置培养箱中，16h后换液，第一次转导后24h，重组慢病毒二次转导人外周血t细胞，条件同第一次转导，慢病毒转导人外周血t细胞后5-8天，流式细胞检测t细胞绿色荧光蛋白gfp阳性率。
6.根据权利要求4所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤(c)muc1.28.bb.zcar重组慢病毒的滴度测定中，培养液采用dmem培养基 8％胎牛血清 1％青霉素-链霉素。
7.根据权利要求5所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增中，活化t细胞的最佳浓度为抗体终浓度10μg/ml。
8.根据权利要求5所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增中的缓冲液通过加入胎牛血清,edta于ph＝7.2的pbs中，使胎牛血清终浓度为0.5％，edta终浓度为2mm,充分混匀后4℃保存得到。
9.根据权利要求5所述的靶向肿瘤细胞表面抗原muc1的新型嵌合抗原受体t细胞的制备方法，其特征在于，所述的步骤②人外周血t淋巴细胞的激活和扩增中t细胞培养液由gtt551培养液 10％胎牛血清 300iu/mlil-2配制而成。
技术总结