本发明涉及一种用于治疗卵巢癌的嵌合抗原受体，同时涉及相应的制备方法和应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，也是女性第五大最常见的恶性肿瘤。由于其早期无特异性表现，仅为超声等影像学异常，故约70％的患者发现时已至中晚期阶段。目前，卵巢癌的治疗以手术治疗联合化学治疗为主，据研究显示五年生存率不到40％，甚至可低至20％。为改善卵巢癌的预后情况，急需进一步探索更有效的治疗方法。目前，过继性免疫治疗被认为是一种具有靶向性和个体化的免疫治疗方法，在转移性黑色素瘤的治疗中已取得突破性进展。其中非常具有代表性的是嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcell,简称为car-t)治疗技术，该技术主要功能是胞外段识别肿瘤细胞上特异性表达的抗原，经铰链区和跨膜区将信号传递至胞内，胞内域将信号转化为活化信号，激活t细胞进行增殖释放细胞因子和穿孔素等杀伤肿瘤细胞。car-t技术已在血液肿瘤中取得明显进展。
目前在采用car-t技术治疗卵巢癌的相关研究中，普遍采用单一靶点或双靶点，即选定一种或两种肿瘤过表达抗原作为靶点，构建相应配体的car-t细胞，特异性识别具有抗原的细胞作为攻击目标，常用的靶抗原有fshr、epcam及msln。car-t治疗实体瘤技术的缺陷是(1)免疫逃逸，因为抗原表达量的降低或缺失，car-t细胞无法正常识别靶细胞造成靶细胞免疫逃逸。(2)易出现脱靶，car-t细胞在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也存在一定杀伤性。(3)免疫抑制。程序性死亡受体1(programmedcelldeath-1，简称为pd-1)与其配体pd-l1(programmedcelldeath-ligand1，简称为pd-l1)组成的pd-1/pd-l1信号通路是最典型的t细胞免疫抑制。pd-1是一种表达于活化的t细胞、b细胞、抗原提呈细胞及巨噬细胞表面的免疫共抑制分子，属于cd28/细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(cytotoxictlymphocyte-associatedantigen-4，简称为ctla-4)家族。但选择pd-1作为car-t靶点也存在技术问题，在实验中发现卵巢癌特异性抗原连接含有pd-1的靶点构建的car-t细胞治疗效果并不理想甚至是无效。
如何得到一种car-t嵌合抗原受体，以期在治疗中有效减少t细胞脱靶、提高细胞因子释放水平并避免免疫逃逸以得到良好的治疗效果，仍然是本领域技术人员研究的热点。
技术实现要素：
本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种对卵巢癌细胞具有明显杀伤作用，有效避免治疗中t细胞免疫逃逸、脱靶及肿瘤细胞免疫抑制发生的嵌合抗原受体。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述嵌合抗原受体的制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体，包括具有与pd-l1配体结合的结构域、muc16单链抗体、铰链区、跨膜域和胞内域；其中，
所述与pd-l1配体结合的结构域为pd-1etco，其氨基酸序列如seqidno.1所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.1所示序列功能的衍生序列；
所述muc16单链抗体是针对卵巢癌细胞表面肿瘤抗原muc16设计的特异性抗原结合域，其由muc16单链抗体重链4h11-vh及muc16单链抗体轻链4h11-vl构成，所述muc16单链抗体重链4h11-vh氨基酸序列如seqidno.2所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.2所示序列功能的衍生序列；所述muc16单链抗体轻链4h11-vl氨基酸序列如seqidno.3所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.3所示序列功能的衍生序列。
其中较优地，所述胞内域包括共刺激信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。
其中较优地，上述嵌合受体的具体结构为：
自氨基端到羧基端依次由所述pd-1etco、连接肽、muc16单链抗体重链4h11-vh、连接肽、所述muc16单链抗体轻链4h11-vl、所述铰链区、所述跨膜域、所述共刺激信号传导结构域、所述cd3ζ信号传导结构域。
其中较优地，所述的连接肽为(gly4ser)3连接肽，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno.8，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.8所示序列功能的衍生序列。
其中较优地，所述铰链区为ctla4的铰链区、cd28的铰链区、cd7的铰链区、igg1的铰链区、igg4的铰链区、igd的铰链区、cd8α的铰链区和pd-1的铰链区中的一种或多种。
其中较优地，所述铰链区为含有cd8α的铰链区cd8αhinge，其氨基酸序列如seqidno.4所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.4所示序列功能的衍生序列。
其中较优地，所述跨膜域为cd4的跨膜域、cd7的跨膜域、cd8α的跨膜域、cd28的跨膜域、cd134的跨膜域、cd137的跨膜域、fcεriγ的跨膜域和h2-kb的跨膜域中的一种或多种。
其中较优地，所述跨膜域为cd8α的跨膜域cd8tm，其氨基酸序列如seqidno.5所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.5所示序列功能的衍生序列。
其中较优地，所述共刺激信号传导结构域为cd28、41bb、icos、ox40、cd244、fcεriγ、cd8α、btla、cd27、cd30、gitr、hvem、dap10、cd2、nkg2c、light和dap12中的一种或多种。
其中较优地，所述共刺激信号传导结构域为41bb，其氨基酸序列如seqidno.6所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.6所示序列功能的衍生序列。
其中较优地，所述cd3ζ信号传导结构域为cd3zeta，其核苷酸序列如seqidno.7所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.7所示序列功能的衍生序列。
本发明实施例提供的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno.9所示。
编码上述的嵌合抗原受体的基因，其中，所述基因如seqidno.10所示。
编码所述pd-l1配体结合的结构域pd-1etco的基因的核苷酸序列如seqidno.11所示。编码所述muc16单链抗体重链4h11-vh的基因的核苷酸序列如seqidno.12所示。编码所述muc16单链抗体轻链4h11-vl的基因的核苷酸序列如seqidno.13所示。编码所述cd8α的铰链区cd8αhinge基因的核苷酸序列如seqidno.14所示。编码所述跨膜域cd8tm的基因的核苷酸序列如seqidno.15所示。编码所述共刺激信号传导结构域41bb的基因的核苷酸序列如seqidno.16所示。编码所述cd3ζ信号传导结构域cd3zeta的基因的核苷酸序列如seqidno.17所示。编码所述连接肽(gly4ser)3的基因的核苷酸序列如seqidno.18所示。
含有seqidno.10所述基因的重组载体、重组细胞、重组病毒及表达系统也属于本发明保护范围。
上述重组细胞能够表达seqidno.9所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
上述重组病毒为能够表达seqidno.9所述嵌合抗原受体，且能够侵染免疫效应细胞的病毒。所述免疫效应细胞为细胞毒性t淋巴细胞、nkt细胞、nk细胞或辅助性t细胞。
本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t细胞的制备方法，其中，包括在t细胞上表达seqidno.9所述嵌合抗原受体的步骤。
进一步，所述方法包括如下步骤：所述方法包括如下步骤：用重组表达载体转染t细胞，从转染后的细胞中获得表达所述pd1-antimuc16特异性嵌合抗原受体的t细胞；所述重组表达载体为已经基因工程改造为含有如seqidno.14所示的cd8α铰链区、如seqidno.15所示的cd8跨膜区、如seqidno.16所示的41bb共刺激信号区及如seqidno.17所示的cd3zeta四部分结构的慢病毒表达载体的酶切位点ecori和mlui之间的小片段替换为scfv片段后得到的重组质粒；所述scfv片段为利用如seqidno.18所示连接肽(gly4ser)3将seqidno.12所示4h11-vh、seqidno.13所示4h11-vl和seqidno.11所示pd-1etco连接得到的dna片段。
本发明提出的制备方法为较佳制备方法，根据本发明实施例提供的嵌合抗原受体结构，本领域技术人员也可以选择其他本领域公知制备方法进行制备，不影响本发明技术效果。
本发明实施例提供的的嵌合抗原受体或seqidno.10所述的基因或上述的重组载体或上述的重组细胞或上述的重组病毒或上述的表达系统在如下任意一项中的应用：
(1)制备用于治疗卵巢癌的产品；
(2)制备用于杀伤表达muc16抗原肽及表达pd-l1的肿瘤细胞的产品。
本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t细胞对构建的各种ovcar3细胞均有较高的杀伤活性。本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t细胞相较于没有car的t细胞与各种靶细胞接触后il-2、ifn-γ和tnf-α三种因子的释放量均显著增加。本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t细胞在动物实验中表现出了极优异的对卵巢癌ovcar3细胞的治疗作用，肿瘤杀伤及抑制效果显著，且小鼠生存率高，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为滴度检测实验染proteinl结果图；
图2为滴度检测实验染pe-f(ab)2结果图；
图3为滴度检测实验percp-cy5.5anti-pd1结果图；
图4为感染率测试实验染proteinl结果图；
图5为感染率测试实验染pe-f(ab)2结果图；
图6为感染率测试实验percp-cy5.5anti-pd1结果图；
图7为本发明实施例提供的嵌合抗原受体结构图；
图8为过表达pdl1的ovcar3细胞流式检测结果图；
图9为过表达muc16的ovcar3细胞流式检测结果图；
图10为过表达muc16和pdl1的ovcar3细胞流式检测结果图；
图11为pd1和anti-muc16片段凝胶电泳检测图；
图12为pd1-anti-muc16car慢病毒表达质粒电泳图；
图13为单双靶点car慢病毒滴度检测图；
图14为单双靶点car-t阳性率检测图；
图15为单双靶点car-t细胞对多种靶细胞杀伤率图；
图16为单双靶点car-t细胞与多种靶细胞接触后细胞因子释放量图；
图17为动物实验小鼠成瘤后成像图；
图18为小鼠治疗7天活体成像图；
图19为小鼠治疗14天活体成像图；
图20为小鼠治疗21天活体成像图；
图21为小鼠治疗28天活体成像图；
图22为动物实验小鼠生存曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更为清楚的了解本发明的技术方案和技术效果，现利用具体实施方式对本发明技术方案详细描述如下，本发明具体实施方式不作为对本发明的限定，任何可以实现本发明目的的相似或等同的技术手段均属于本发明保护范围。下述实施例中所使用的的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用材料、试剂等如无特殊说明，均可以从商业途径得到。
肿瘤表面抗原有多种，部分肿瘤抗原在肿瘤细胞中高表达的同时在其他正常组织中也表达，极易出现脱靶等情况。相较其他卵巢癌表面抗原，muc16在正常组织中几乎不表达，而在超过80％的oc细胞中高表达，另外在子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌细胞中也有过表达。muc16在肿瘤细胞中存在剪切机制，胞外段ca125糖类抗原(carbohydrateantigen125，ca125)经剪切后被释放可在血浆中被检测到。ca125作为oc免疫标记标志物检测中的重要参考指标，超过90％的oc患者血清中ca125的表达上调，而术后患者体内ca125表达高者复发率高达85％～93％。因此muc16可作为car-t治疗中理想的靶点。
发明人进行muc16单car实验，实验结果表达阳性率和体外效果很好，但是动物实验结果与体外不一致，有效率远不及预期。分析可能与肿瘤细胞免疫逃逸有关，免疫检验点可抑制受体和抑制信号通路，正常情况下能抑制t细胞的功能，同时在肿瘤组织中可能被肿瘤利用形成免疫逃逸。免疫检验点有：程序性死亡分子-1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞相关抗原(ctla-4)、b/t细胞衰减器(btla)、淋巴细胞活化基因-3(lag-3)、nk细胞表面存在杀伤抑制受体(kirs)。研究发现cd8 t细胞分别与pd-l1高表达和pd-l1低表达的卵巢癌细胞共培养时，pd-l1高表达的卵巢癌细胞周围的cd8 t细胞聚集明显少于pd-l1低表达的卵巢癌细胞。由此认为pd-1/pd-l1信号通路能抑制细胞免疫。
本实验选择muc16和pdl1作为目标靶点，muc16-pd1、pd1-muc16、muc16、pd1car-t细胞，检测其对k562-pdl1-luc、ovcar3-luc细胞杀伤情况及细胞因子释放情况，根据实验结果选择嵌合抗原受体最佳结构方式。进一步，pd1-antimuc16car-t细胞、pd1car-t细胞和antimuc16car-t细胞，分别与靶细胞共培养进行杀伤实验和细胞因子释放实验，探求双靶点car-t与单靶点car-t细胞在体外实验中是否存在差异。本实验中选择ovcar3-luc(atcc)作为靶细胞，因靶细胞表面pdl1天然表达率低，与t细胞接触后呈现pdl1高表达，同时muc16缺少相应抗体检测，故本实验同时构建ovcar3-pdl1-luc、ovcar3-muc16(307)-gfp-luc和ovcar3-muc16(307)-gfp-pd1-luc细胞模拟卵巢癌患者体内卵巢癌细胞抗原表达情况同时便于检测。
实施例1muc16和pd1car-t构建研究及功效验证实验
一.实验目的
研究muc16和pd1的位置关系及构建方式对k562-pdl1-luc、ovcar3-luc细胞因子释放情况。本实验构建muc16-pd1、pd1-muc16、muc16、pd1pd1car-t细胞，检测其对k562-pdl1-luc、ovcar3-luc细胞因子释放情况。
二.实验耗材试剂
dmem及dmem完全培养基、opti-mem、病毒包装培养基、t细胞感染培养基、t完全培养基、il2、三代包装质粒、007plv-ires-mcherry质粒、fbs、pei、计数仪、流式细胞仪、protein-l,、293t细胞，12孔细胞培养板、6孔板、台盼蓝、近岸磁珠等。
三.实验步骤：
1.滴度检测
检测方法：利用293t细胞进行病毒滴度检测
(1)293t细胞铺种于十二孔板
状态良好，汇合度70％～90％的293t细胞，消化后，用dmem培养基重悬，取样计数，并调整细胞密度为0.6m/ml，加入polybren至终浓度为0.8μg/ml；每种慢病毒需检测3个梯度(每个梯度1孔，另需一孔作为空白对照)，计算所需铺种的孔数；将上述细胞悬液按照0.5ml/孔加到12孔板中。
(2)慢病毒稀释
将浓缩后的慢病毒进行10倍倍比稀释(三个梯度)：取出3个0.6mlep管，每个ep管中加入54mlpolybrene终浓度为0.8ug/ml的dmem培养基，在第一个ep管中加入6μl病毒浓缩液混匀后取出6μl混合液加入到第二个ep管中、混匀后取出6μl混合液至第三个ep管中，分别取50μl混合液加到三个不同的孔中，即加入的病毒体积为5μl、0.5μl、0.05μl；慢病毒感染293t细胞6h后，每孔加入2mldmem完全培养基，继续培养；
(3)慢病毒感染48h后，阳性率检测
感染48h的293t细胞，吸弃培养基，每孔加入1mlpbs，轻轻吹打，将细胞吹起重悬，并转移到1.5mlep管中，细胞用pbs清洗2遍后200μlpbs重悬；进行进行抗体染色和流式检测阳性率。
(4)慢病毒滴度计算
选择合适梯度的阳性率，按以下公式计算慢病毒滴度：
滴度tu/ml＝(感染时293t细胞数×阳性率)/病毒体积ml
要求：选择用于计算滴度的梯度，阳性率需在1～20％，若有两个梯度的阳性率都在此范围内，则以更接近10％的一组为选定标准。
2.感染率检测
检测方法：
(1)准备：抗体percp-cy5.5-anti-hpd-1，每样品使用量5μl；proteinl，每样品使用量10μl；
(2)取感染后4～5天的car-t细胞各1m于ep管中，离心1min，弃上清，用pbs洗两次后，用50-90μlpbs重悬细胞；
(3)配制抗体mix：按所检样品数量，配制抗体mix。混匀后加入样品管中，总体积100～150μl。
(4)4℃避光孵育30min——pbs洗两次—100μlpbs重悬。
(5)流式细胞仪，上机检测。
四.实验结果：
1.滴度检测结果：
染proteinl结果见图1所示。染pe-f(ab)2结果如图2所示。
percp-cy5.5anti-pd1结果如图3所示。
表1染fitc-protienl感染率％
表2染f(ab)2感染率％
表3染percp-cy5.5-pd-1感染率％
表4汇总滴度染色结果
上述滴度结果表明，plv-muc16-pd1只能利用f(ab)2染出。对于muc16部分，proteinl和f(ab)2的感染率结果不一致。
2.感染率检测结果
染proteinl结果见图4所示。染pe-f(ab)2结果见图5所示。
percp-cy5.5anti-pd1结果见图6所示。
表5汇总感染率检测结果
上述图示和表5所示，f(ab)2无法染出cart上muc16部分，这与第一次第二次实验的结果相符。由于muc16-pd1没有检测出pd1和muc16部分的表达，因此不用于杀伤检测。
通过上述滴度检测和抗感染检测发现，antimuc16-pd1没有检测出pd1和muc16部分的表达，故排除其进行后续实验。而pd1-antimuc16可检出pd1有39.3％的表达和muc16有47％的表达，故选择该car设计为有效结构，进行后续功效实验。
实施例2本发明实施例提供的嵌合抗原受体的结构
本发明实施例提供的嵌合抗原受体，即car。其结构包括具有与pd-l1配体结合的结构域、muc16单链抗体、铰链区、跨膜域和胞内域。本发明实施例提供的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno.9所示.
与pd-l1配体结合的结构域为pd-1etco，其氨基酸序列如seqidno.1所示。编码所述pd-l1配体结合的结构域pd-1etco的基因的核苷酸序列如seqidno.11所示。
muc16单链抗体由muc16单链抗体重链4h11-vh及muc16单链抗体轻链4h11-vl构成，所述muc16单链抗体重链4h11-vh氨基酸序列如seqidno.2所示。muc16单链抗体轻链4h11-vl氨基酸序列如seqidno.3所示。
铰链区为含有cd8α的铰链区cd8αhinge，其氨基酸序列如seqidno.4所示。
跨膜域为cd8α的跨膜域cd8tm，其氨基酸序列如seqidno.5所示。
共刺激信号传导结构域为41bb，其氨基酸序列如seqidno.6。
cd3ζ信号传导结构域为cd3zeta，其核苷酸序列如seqidno.7所示。
本发明实施例提供的嵌合抗原受体的结构如图7所示。
具体结构为：pd-1etco—(g4s)3—4h11-vh—(g4s)3—4h11-vl-cd8αhinge—cd8tm—41bb—cd3zeta。
编码上述的嵌合抗原受体的基因如seqidno.10所示。
实施例3本发明实施例提供的嵌合抗原受体的构建方法及鉴定
1.材料和方法
1.1材料
人卵巢癌细胞株ovcar-3(atcc，美国)，lentix-293t细胞(atcc，美国)，脐血单个核细胞(umbilicalbloodmononuclearcells，ubmc)(atcc，美国)均由本实验室保存。表达载体质粒plv-efla-ires-mcherry(addgene公司，美国)，三包质粒pmd2.g、pmdlgprre、prsv-rev(addgene公司，美国)。
限制性核酸内切酶ecori、mlui(neb公司，北京)，opti-mem培养基(gibco公司,美国),rpmi-1640培养基(hyclone公司，美国)，dmem高糖培养基(hyclone公司，美国)，gt-t551h3培养基(takara公司，日本)，pbs平衡盐(hyclone公司，美国)，胰蛋白酶(hyclone公司，美国)，steadyglo(promega公司，美国)，novonectin(近岸，中国)，fitc-proteinl(acro公司，美国)，percp-cy5.5anti-humanpd-1(bd公司,美国)，f(ab’)2fragmentspecific(jacksonimmuno，美国)，pestreptavidin(ebioscience，美国)，人白介素-2(近岸，中国)，humanifn-γelisakit(达科为，深圳)，humanil-2elisakit(达科为，深圳)，无缝克隆试剂盒(生工，中国)，seakemle琼脂糖(lonzapromega，瑞士)，1kbdnamarker(天根，中国)，apcanti-humanpdl1(biolegend，美国)，cd3/cd28磁珠(近岸，中国)，0.45μm滤器(pμll公司,北京)，移液器(bbi,上海)，青链霉素(hyclone公司，美国)，胰岛素(gibco公司,美国)。
1.2方法
1.2.1过表达muc16和pdl1的ovcar3-luc细胞系构建
本步骤引物设计软件：snapgene2.3.2
1.2.1.1过表达muc16的ovcar3-luc细胞系构建
(1)引物合成，合成引物序列为：
seqidno.19in-muc16-307-f1
tcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtaccagataaatttccac
seqidno.20in-muc16-114-f2
ggatccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc
seqidno.21in-muc16-114-r2
gctgaagttagtagcttgcagatcctccaggtc
seqidno.22casi007-ef1a-f:
cgtgaggaattagcttggtacgaattcgccaccatggccttaccagtgaccgcc
(2)提取靶细胞ovcar的mrna，然后反转录成cdna以反转的cdna为模板，以引物in-muc16-307-f1和in-muc16-114-r2扩增片段956bp，命名为muc16-1；
以muc16-1为模板，以引物in-muc16-114-f2和in-muc16-114-r2扩增片段993bp，命名为muc16-2；以muc16-2为模板，以引物casi007-ef1a-f和in-muc16-114-r2扩增片段1014bp，命名为muc16-3；
(3)载体plvx-ef1a-mcherry用内切酶ecori和mlui双酶切，37度，过夜；
(4)将上述获得muc16-3片段重组到ecori和mlui双酶切后的plv-efla-ires-gfp载体上，转化，挑单克隆，菌液pcr，测序，获得plv-muc16-gfp载体质粒。
(5)载体质粒plv-muc16-gfp和三包质粒(pmd2.g，pmdlg/prre，prsv-rev)经pei转染入lentix293t细胞进行慢病毒包装，获得慢病毒。收集24h细胞培养上清，用100kd超滤管进行2000rpm15min离心浓缩。浓缩后病毒与待感染的ovcar3-luc细胞，在含polybrene的单纯的1640培养基中共孵育，37℃共孵育4小时后，沿孔壁轻柔加入2.5ml/孔1640细胞完全培养基置于培养箱中静置培养。3天后检测gfp阳性细胞比率。用流式细胞仪检测ovcar-3-muc16-luc细胞感染率并进行单克隆分选。
1.2.1.2过表达pdl1的ovcar3-luc细胞系构建
(1)引物的合成
seqidno.23in-pdl1-f
aattagcttggtacgaattcgccaccatgaggatatttgctgtc
seqidno.24in-pdl1-r
ttagttccagacgcgtttacgtctcctccaaatg
(2)以载体plvx-ef1a-pdl1-t2a-luc为模板，以引物in-pdl1-f和in-pdl1-r，扩增片段大小915bp；胶回收pcr扩增片段；
(4)用ecori和mlui双酶切载体plvx-ef1a-mcherry，37℃，过夜，胶回收载体大片段；
(5)将载体大片段和pcr扩增片段无缝连接，转化；
(6)挑单克隆，菌液pcr，测序；获得plv-pdl1载体质粒序列如seqidno.25所示。
(7)plv-pdl1载体质粒和三包质粒(pmd2.g，pmdlg/prre，prsv-rev)经pei转染入lentix293t细胞进行慢病毒包装，检测病毒滴度为2.64×107tu/ml。收集24h细胞培养上清，用100kd超滤管进行2000rpm15min离心浓缩。浓缩后病毒与待感染的ovcar3-luc细胞，在含polybrene的单纯的1640培养基中共孵育，37℃共孵育4小时后，沿孔壁轻柔加入2.5ml/孔1640细胞完全培养基置于培养箱中静置培养。3天后检测阳性细胞比率；单克隆分选获得ovcar3-pdl1-luc单克隆细胞。
再按照上述方法将三包质粒(pmd2.g，pmdlg/prre，prsv-rev)和载体质粒(plv-pdl1)与lentix293t细胞共培养进行慢病毒包装，分别于24h和48h后收集病毒并感染经单克隆分选得ovcar-3-muc16-(307)-luc细胞，用apcanti-humanpdl1抗体检测pdl1阳性率，流式细胞学技术单克隆分选后扩大培养，即可获得ovcar3-pdl1-muc16(307)-gfp-luc细胞。
1.2.2pd1-antimuc16car慢病毒表达质粒的构建
引物合成
seqidno.26：in-pd1-muc16-f1:
tagcttggtacgaattcgccaccatgcagatcccacaggcg
seqidno.27：in-pd1-muc16-r1:
gctgcccccaccgccgtgggctgtgggcacttc
seqidno.28：in-pd1-muc16-f2:
ggcggtgggggcagcggcggtggcgggagtggaggcggcggcagtgtgaagctgcaggagtca
seqidno.29：in-pd1-muc16-r2:
tgattgttccagacgcgtttagcgagggggcagggc
载体构建流程：
①将质粒用ecor1mlu1双酶切，可切下1500bp条带，以cip处理2小时质粒酶切；
②以casi011a为模板，以引物in-pd1-muc16-f1和in-pd1-muc16-r1，扩增片段pd1，510bp左右；
③以plv-anti-muc16为模板，以引物in-pd1-muc16-f2和in-pd1-muc16-r2，扩增片段muc16，1500bp左右；
④将酶切载体和片段pd1和muc16用重组的方法连接，转化；
根据pcr原理设计引物扩增4h11-vh、4h11-vl、pd-1etco序列，并用辅助连接肽(gly4ser)3将其连接，使用即用无缝克隆试剂盒完成car结构中scfv的拼接，共构建三种car结构分别为pd1-antimuc16car、antimuc16car和pd1car，三种car结构的scfv段分别命名为pd-1etco-(gly4ser)3-4h11-vh-(gly4ser)3-4h11-vl、cd8leader-4h11-vh-(gly4ser)3-4h11-vl和pd-1etco。使用ecori和mlui双酶切慢病毒质粒，该质粒已经基因工程改造为含有cd8a铰链区、cd8跨膜区、41bb共刺激信号区及cd3zeta四部分结构。将三种scfv片段分别与酶切后的慢病毒质粒重组，后进行菌液pcr鉴定，经琼脂糖凝胶电泳挑选出阳性克隆送测序分析。
1.2.3单双靶点car慢病毒包装及表达鉴定
用pei转染法将三包质粒和载体质粒与293t细胞共培养，分别于转染后24h和48h收集病毒上清液。经0.45μm滤器过滤至超滤管中，2500rpm离心20分钟，取上层浓缩液至ep管中于4℃暂存。
四种病毒浓缩液(分别是pd1，antimuc16，pd1-antimuc16和antimuc16-pd1)按5μl、0.5μl、0.05μl三个梯度于十二孔板中分别与293t细胞在dmem完全培养基中共同培养，转染48h后用抗体perp-cy5.5antihumanpd-1和抗体fitc-proteinl经流式细胞仪检测病毒滴度。
1.2.4单双靶点car-t细胞制备
cd3/cd28磁珠激活48h后得脐血单个核细胞ubmc经gt-t551h3培养基调整细胞密度为2m/ml，取三种病毒浓缩液和对照组ck分别与2mt细胞混合并加入到提前24h预铺的novonectin板中，置于培养箱培养，6h后加入2mlt细胞完全培养基(gt-gtt551h3 5％fbs 40iu/mlil-2)，24h后二次感染t细胞。二次感染96h后流式细胞仪检测car阳性率。
1.2.5单双靶点car-t细胞杀伤作用实验
靶细胞t:ovcar3-luc细胞、ovcar3-pdl1-luc细胞、ovcar3-muc16(307)-gfp-luc细胞、ovcar3-pdl1-muc16(307)-gfp-luc细胞，以上靶细胞用gt-t551h3培养基调整密度为0.2m/ml加入96孔板中；效应细胞e：pd1-antimuc16car-t细胞、antimuc16car-t细胞、pd-1car-t细胞、controlt细胞。
实验步骤：
(1)准备：无菌加样槽、黑色底透96孔板、足量steadyglo试剂。排枪、perkinelmer确认可正常使用；
(2)实验分组：设置效靶比20:1，10:1，5:1，1:1；
分别检测pd1-antimuc16，antimuc16，pd-1cart细胞对以上靶细胞的杀伤。
(3)取一定靶细胞，pbs洗一次后，用单纯的gt-t551h3培养基重悬，调整密度为0.2m/ml，50μl/孔，用排枪按布板表加入黑色底透96孔板中；
(4)取约7mt细胞(表中所需5.04m)，pbs洗一次后，用单纯的gt-t551h3培养基重悬，调整密度为4m/ml，并在孔板中，依此稀释，准备密度为2m/ml，1m/ml和0.2m/ml的样品。
(5)充分混匀后，按布板表，利用排枪加入黑色杀伤96孔板中，50μl/孔；
(6)在单纯靶细胞的孔中补加50μlgt-t551h3，使所有孔的终体积为100μl；布板；
(7)37摄氏度，孵育6h；
(8)检测：用排枪每个检测孔中加入70μlsteadyglo原液——避光，摇床孵育15min—perkinelmerluc检测仪，上机检测。
1.2.6单双靶点car-t细胞与各种ovcar3-luc细胞共培养后细胞因子ifn-γ的释放量检测实验
(1)准备：无菌加样槽、v底96孔板。排枪、酶标仪确认可正常使用。
(2)与杀伤布板同时进行。将效靶细胞调整为0.1m/ml的细胞悬液，使用v底96孔板，实验分组设置1:1效靶比，每孔补gt-t551h3培养基至总体积200μl。实验孔周围的空孔补200μlpbs；布板；
(3)37℃，孵育24h；
(4)封口膜封住板子，250g，离心5min，取上清，用ifn-γ、il-2和tnf-αelisakit检测ifn-γ释放量；
1.3统计学方法
使用spss23.0软件进行统计学分析，用均数±标准差表示，因不满足正态分布，方差不齐，故采用秩和检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1过表达muc16和pdl1的ovcar3-luc细胞系构建
plv-pdl1载体质粒和三包质粒(pmd2.g，pmdlgprrre，prsv-rev)经pei转染入lentix293t细胞进行慢病毒包装，如图8所示，图8为过表达pdl1的ovcar3细胞流式检测结果图；病毒滴度为2.64×107tu/ml，检测ovcar3-pdl1-lucpool中pdl1阳性率为41％(图8a)，经流式细胞仪分选后检测3#单克隆pdl1阳性率为100％(图8b)。同法可将muc16-gfp构建在ovcar3-luc细胞上，如图9所示，图9为过表达muc16的ovcar3细胞流式检测结果，流式细胞仪检测病毒滴度1.24×108tu/ml，ovcar3-muc16-gfp-lucpool中muc16-gfp阳性率94.7％，流式分选单克隆阳性率99.93％。成功构建ovcar3-pdl1-luc细胞和ovcar3-muc16-gfp-luc细胞后，将plv-pdl1载体构建在ovcar3-muc16-gfp-luc细胞上，即可获得同时过表达muc16和pdl1的靶细胞，如图10所示，图10为过表达muc16和pdl1的ovcar3细胞流式检测结果图，检测病毒滴度为2.52×107tu/ml，检测ovcar3-muc16-gfp-lucpool中pdl1阳性率为84.68％(图10a)，经流式细胞仪分选后检测3#单克隆pdl1阳性率为99.75％(图10b)。
2.2单双靶点car慢病毒表达质粒的构建结果
上述方法中获得anti-muc16和pd1目的片段，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测显示1500bp和510bp有目的条带。利用重叠pcr和重组方法将目的片段构建到ecori和mlui双酶切后的plv-ef1a-ires-mcherry载体上，转化后挑单克隆进行菌液pcr验证，凝胶电泳检测显示7500bp和2000bp左右有目的条带，选取阳性克隆送测序，测序结果与设计序列一致。
如图11所示，pd1和anti-muc16片段凝胶电泳图，a：m为1kbmaker，1、2均为pd1片段；b：m为1kbmaker；1、2均为anti-muc16片段。
如图12所示，pd1-anti-muc16慢病毒表达质粒电泳图，m为1kbmaker；1为载体plvx-pd1-anti-muc16；2为ecori和mlμl双酶切载体plvx-pd1-anti-muc16，酶切后的pd1-anti-muc16片段约为2000kb，载体骨架约7500bp。
2.3单双靶点car慢病毒包装及表达鉴定结果
设置感染组plv-pd1-anti-muc16、plv-anti-muc16和plv-pd1共三组，将三组载体质粒分别与三包质粒(pmd2.g，pmdlg/prre，prsv-rev)共同转染lentix293t细胞完成慢病毒包装。24小时后第一次收病毒感染ubmc，同时取6μl病毒再次感染lentix293t细胞用于三种慢病毒滴度检测。感染lentix293t细胞48小时后用5μlpercp-cy5.5-pd-1抗体检测pd1，10μlfitc-proteinl抗体检测anti-muc16，加入抗体后避光孵育30分钟，流式细胞仪检测三种慢病毒滴度。
如图13所示，图13为三种car慢病毒滴度检测结果，a、b：分别用proteinl和pd1抗体检测pd1-antimuc16慢病毒滴度；c：pd1抗体检测pd1慢病毒滴度；d：proteinl抗体检测anti-muc16慢病毒滴度。pd1-anti-muc16、pd1、anti-muc16三种病毒滴度分别为6.6×107tu/ml、2.1×107tu/ml、1.11×108tu/ml(滴度tu/ml＝(感染细胞数×阳性率)/病毒体积μl*1000)。
2.4单双靶点car-t细胞制备结果
病毒包装后分别于24小时和48小时收病毒，感染已被磁珠激活的ubmc，感染96小时候分别取1×106个pd1-anti-muc16cart细胞、pd1cart细胞、anti-muc16cart细胞置于ep管中，另设置对照组ck(未感染病毒的ubmc)，用pbs洗2次后加入percp-cy5.5-pd-1抗体和fitc-proteinl抗体，避光孵育30分钟，后流式细胞仪检测pd1-anti-muc16cart细胞、pd1cart细胞、anti-muc16cart三种car的感染率。
如图14所示，a：proteinl抗体检测anti-muc16car-t阳性率；bpd1抗体检测pd1car-t阳性率；c：proteinl抗体和pd1抗体检测pd1-anti-muc16car-t阳性率。pd1-anti-muc16cart细胞、pd1cart细胞、anti-muc16cart三种car的感染率分别为52.36％、46.03％和86.24％，
2.5单双靶点car-t细胞对ovcar3-muc16-pd1-luc细胞的杀伤作用
如图15所示，a：单双靶点car-t对ovcar3-muc16-pdl1-1uc细胞的杀伤作用图；b：单双靶点car-t对ovcar3-muc16-1uc细胞的杀伤作用图；c：单双靶点car-t对ovcar3-pdl1-1uc细胞的杀伤作用图；d：单双靶点car-t对ovcar3-1uc细胞的杀伤作用图。选取pd1-anti-muc16car-t细胞、pd1car-t细胞、anti-muc16car-t和controlt细胞四种细胞作为效应细胞，选取ovcar3细胞、ovcar3-muc16-pdl1细胞、ovcar3-muc16细胞和ovcar3-pdl1细胞四种细胞作为靶细胞，当e:t为1：1、4：1、8：1、16：1时pd1-anti-muc16car-t细胞对ovcar3-muc16-pdl1细胞的杀伤率分别为(12.03±1.98)％、(38.29±0.13)％、(65.16±0.95)％、(84.96±0.53)％，杀伤率明显高于无car结构的对照组controlt(p＜0.05)，并且杀伤率随效靶比的升高而升高(p＜0.05)，如图15a所示。三种car-t细胞对四种靶细胞的杀伤率均高于对应的controlt细胞(p＜0.05)，在ovcar3-muc16-pdl1细胞的杀伤实验中可见pd1-anti-muc16cart细胞与anti-muc16cart杀伤率大致相同，均略高于pd1car-t细胞(p＞0.05)。在ovcar3-muc16-luc细胞实验和ovcar3-pdl1-luc细胞实验中，pd1-anti-muc16car-t细胞与anti-muc16car-t细胞对于靶细胞的杀伤率相似(图15bc)。pd1-anti-muc16car-t细胞在不同靶细胞杀伤实验中的杀伤率均略高于pd1car-t，但杀伤效果没有显著差异(p＞0.05)。综上，单双靶点car-t细胞相较于controlt细胞对各种靶细胞均具有较高杀伤能力(p＜0.05)。
2.6双靶点car-t细胞与各种ovcar3-luc细胞共培养后细胞因子的释放量
同样设置效应细胞为pd1-anti-muc16cart细胞、pd1cart细胞、anti-muc16cart和controlt细胞四种细胞，靶细胞为ovcar3细胞、ovcar3-muc16-pdl1细胞、ovcar3-pdl1-muc16细胞、ovcar3-muc16细胞和ovcar3-pdl1细胞五种细胞，将四种效应细胞和四种靶细胞分别培养，另设置只有效应细胞onlyt组，分别检测il-2、ifn-γ和tnf-α三种细胞因子释放量。单
如图16所示，图16中a：单双靶点car-t与多种靶细胞接触后il-2释放量图；b：单双靶car-t与多种靶细胞接触后ifn-γ释放量图；c：单双靶点car-t与多种靶细胞接触后tnf-α释放量图。结果证明，本发明实施例提供的双靶点car-t细胞在ovcar3-muc16-pdl1、ovcar3-pdl1-muc16、ovcar3-muc16和ovcar3-pdl1四种靶细胞中il-2、ifn-γ和tnf-α三种细胞因子的释放水平均高于ovcar3细胞和onlyt细胞(p＜0.05),anti-muc16cart细胞在四种过表达muc16和(或)pdl1靶细胞中释放il-2和ifn-γ量高于双靶点car-t细胞(p＜0.05)。pd1car-t和anti-muc16car-t细胞在三种过表达muc16和(或)pdl1靶细胞中释放ifn-γ量高于双靶点car-t细胞(p＜0.05)。单双靶点car-t细胞与不同靶细胞接触后释放tnf-α的量没有明显差异(p＞0.05)。
综上，单双靶点相较于没有car的t细胞与各种靶细胞接触后il-2、ifn-γ和tnf-α三种因子的释放量均显著增加。
实施例3本发明实施例提供的car-t细胞和单靶car-t细胞动物实验及结果
一.实验方法
1.从维通达生物科济有限公司订购6～7周龄雌鼠，设置3个实验组，分别为pd1car-t治疗组，antimuc16car-t治疗组和pd1-antimuc16car-t治疗组，1个对照组(未转染的tcells)，每组5只小鼠。另备5只备用。各治疗组car-t构建方法如上述实施例所述。
2.按每只小鼠3×106个肿瘤细胞的量准备ovcar3-muc16-pdl1-luc，用dpbs重悬至60m/ml，最终，取50μl细胞悬液与50μlmatrigel混合后腹腔注射入每只小鼠。注射瘤细胞72小时后，每只小鼠腹腔注射100μl浓度为15mg/ml的萤光素酶底物，6分钟后进行异氟烷麻醉2～3分钟、perkinelmer萤光活体成像仪成像，捕获生物发光量子强度和面积，统计每只小鼠肿瘤的平均光量子强度。选取平均光量子强度数值相近的小鼠进行随机分组，剔除平均光量子强度值差异较大小鼠，尽量使每组的平均荧光值相近。按照分组，每只小鼠腹腔回输1×107个car-t细胞及为转染的t细胞。然后每7day进行一次成像，统计平均萤光强度值。
二.实验结果
1.成瘤后结果如图17所示，小鼠编号说明见表6。
表6小鼠编号说明
2.治疗后第7天活体成像，如图18所示；本发明实施例提供的pd1-antimuc16双靶点car-t细胞起效快，在治疗第7天即表现出优异的肿瘤杀伤效果，效果远优于pd-1和anti-muc16。
3.治疗后第14天活体成像，如图19所示；治疗第14天可见pd-1和anti-muc16肿瘤抑制效果差，而本发明实施例提供的pd1-antimuc16双靶点car-t细胞仍保持极高的肿瘤杀伤及抑制效果。
4.治疗后第21天活体成像，如图20所示；对照组及pd-1和anti-muc16组小鼠均有死亡，且从图中可明显看出pd-1和anti-muc16小鼠治疗效果不明显，几乎无治疗作用。本发明实施例提供的pd1-antimuc16双靶点car-t细胞仍保持极高的肿瘤杀伤及抑制效果。
5.治疗后第28天活体成像，如图21所示；对照组及pd-1和anti-muc16组小鼠死亡率高，本发明实施例提供的pd1-antimuc16双靶点car-t细胞组小鼠生存率高，肿瘤杀伤效果及抑瘤作用显著。
6.小鼠生存曲线，如图22所示，小鼠活体成像实验数据显示，相比t细胞对照组，cart相比展示出不同的抗肿瘤效果，本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t显著好于pd1car-t和antimuc16car-t，小鼠60天生存率100％。pd1car-t又比单独的antimuc16car-t效果稍好。生存曲线进一步展示了本发明实施例提供的car-t的肿瘤抑制效果，再次证明本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t在肿瘤抑制方面表现出显著的功效。
三.实验结论
pd1-antimuc16双靶点car-t细胞在ovcar-3-luc荷瘤小鼠模型中表现出优异的肿瘤杀伤作用。单、双靶点car-t细胞回输至荷瘤小鼠体内后，分别于第7天、14天、21天和28天进行活体成像检测，双靶点car-t细胞对荷瘤小鼠有明显的治疗作用，肿瘤细胞数量较治疗前明显减少(p＜0.05)。双靶点car-t治疗后第一次、第二次、第三次和第四次活体成像显示肿瘤细胞较治疗前分别减少91.82％、63.81％、51.77％和61.77％。实验表明，双靶点car-t细胞对ovcar-3-luc荷瘤小鼠有显著治疗作用，治疗后7天达到对肿瘤细胞的最大杀伤率，此后肿瘤细胞继续缓慢增殖。pd1car-t细胞组、antimuc16car-t细胞组和对照t细胞组对ovcar-3-luc荷瘤小鼠不具有明显的治疗作用(p＞0.05)，治疗后第一次活体成像显示对照t细胞组和anti-muc16car-t细胞组对荷瘤小鼠不具有治疗作用，但是anti-muc16car-t细胞组相较于对照t细胞组对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用(p＜0.05)，pd1car-t细胞组荷瘤小鼠相较治疗前肿瘤无明显进展(p＞0.05)，与对照t细胞组相比有明显差异(p＜0.05)；治疗后第二次、第三次和第四次活体成像显示pd1car-t细胞组、antimuc16car-t细胞组和对照t细胞组肿瘤细胞继续增殖，两个单靶点car-t细胞组肿瘤细胞增殖速度与对照t细胞组相比没有明显差异(p＞0.05)。
pd1-antimuc16car-t细胞组、pd1car-t细胞组、antimuc16car-t细胞组和对照t细胞组小鼠平均生存时间为63、45.2±6.34、23±1.55和19.8±2.14，其中两两比较均具有明显差异(p＜0.05)，因此从生存期角度单、双靶点car-t细胞均能延长荷瘤小鼠生存时间，双靶点car-t细胞相较两组单靶点car-t细胞更加明显的延长了小鼠的生存时间(p＜0.05)，pd1单靶点car-t细胞与antimuc16单靶点car-t细胞相比能明显延长荷瘤小鼠生存时间(p＜0.05)。
综上所述，本发明实施例提供的pd1-antimuc16car-t细胞与两种单靶点car-t细胞在体外实验中的杀伤作用比较未显示明显差异，可能与样本数小、实验时间较短有关，也可能因体外实验无法真实模拟体内肿瘤微环境。在动物实验中，pd1-antimuc16双靶点car-t细胞对ovcar-3-luc荷瘤小鼠有显著且优异的治疗作用，显著延长荷瘤小鼠生存期，小鼠生存率高，本发明具有广泛的应用前景。
序列表
<110>首都医科大学北京妇产医院
<120>用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体及制备方法与应用
<150>2019112755240
<151>2019-12-12
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325330335
leuasnserargthrarglysasnglnleualatrptyrglnglnlys
340345350
proglyglnserprogluleuleuiletyrtrpalaserthrarggln
355360365
serglyvalproaspargphethrglyserglyserglythraspphe
370375380
thrleuthrileserservalglnalagluaspleualavaltyrtyr
385390395400
cysglnglnsertyrasnleuleuthrpheglyproglythrlysleu
405410415
gluvallysargthrthrthrproalaproargproprothrproala
420425430
prothrilealaserglnproleuserleuargproglualacysarg
435440445
proalaalaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacys
450455460
aspiletyriletrpalaproleualaglythrcysglyvalleuleu
465470475480
leuserleuvalilethrleutyrcyslysargglyarglyslysleu
485490495
leutyrilephelysglnprophemetargprovalglnthrthrgln
500505510
glugluaspglycyssercysargpheproglugluglugluglygly
515520525
cysgluleuargvallyspheserargseralaaspalaproalatyr
530535540
glnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarg
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gluglutyraspvalleuasplysargargglyargaspproglumet
565570575
glyglylysproargarglysasnproglngluglyleutyrasnglu
580585590
leuglnlysasplysmetalaglualatyrsergluileglymetlys
595600605
glygluargargargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleu
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serthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleu
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proproarg
<210>10
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcgg60
ccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagcc120
ctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcg180
gagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggcc240
gccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactg300
cccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacc360
tacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggca420
gagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccacggtggcggtggctcg480
ggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgtgaagctgcaggagtcagggggaggcttc540
gtgaagcctggagggtccctcaaagtctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagc600
tatgccatgtcctgggttcgcctgagtccggagatgaggctggagtgggtcgcaaccatt660
agcagtgctggtggttacatcttctattctgacagtgtgcagggacgattcaccatttcc720
agagacaatgccaagaacaccctgcacctgcaaatgggcagtctgaggtctggggacacg780
gccatgtattactgtgcaaggcagggatttggtaactacggtgattactatgctatggac840
tactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctcgggcggtggt900
gggtcgggtggcggcggatctgacattgagctcacccagtctccatcctccctggctgtg960
tcagcaggagagaaggtcactatgagctgcaaatccagtcagagtctgctcaacagtaga1020
acccgaaagaaccagttggcttggtaccagcaaaaaccaggacagtctcctgaactgctg1080
atctactgggcatccactaggcaatctggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatct1140
gggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattac1200
tgccagcaatcttataatctactcacgttcggtcctgggaccaagctggaggtcaaacgg1260
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg1320
tccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctg1380
gacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctc1440
ctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattc1500
aaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccga1560
tttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagac1620
gcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaaga1680
gaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccg1740
agaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggag1800
gcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctt1860
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ccccctcgctaa1932
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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ctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcg180
gagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggcc240
gccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactg300
cccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacc360
tacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggca420
gagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccac465
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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gtgaagctgcaggagtcagggggaggcttcgtgaagcctggagggtccctcaaagtctcc60
tgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcctgggttcgcctgagtccg120
gagatgaggctggagtgggtcgcaaccattagcagtgctggtggttacatcttctattct180
gacagtgtgcagggacgattcaccatttccagagacaatgccaagaacaccctgcacctg240
caaatgggcagtctgaggtctggggacacggccatgtattactgtgcaaggcagggattt300
ggtaactacggtgattactatgctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtc360
tcctca366
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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gacattgagctcacccagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcact60
atgagctgcaaatccagtcagagtctgctcaacagtagaacccgaaagaaccagttggct120
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caatctggagtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcacc240
atcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgccagcaatcttataatcta300
ctcacgttcggtcctgggaccaagctggaggtcaaacgg339
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accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg60
tccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctg120
gacttcgcctgtgat135
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatc60
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aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaa60
actactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgt120
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agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc60
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tgattgttccagacgcgtttagcgagggggcagggc36
1.一种用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于包括具有与pd-l1配体结合的结构域、muc16单链抗体、铰链区、跨膜域和胞内域；其中，
所述与pd-l1配体结合的结构域为pd-1etco，其氨基酸序列如seqidno.1所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.1所示序列功能的衍生序列；
所述muc16单链抗体是针对卵巢癌细胞表面肿瘤抗原muc16设计的特异性抗原结合域，其由muc16单链抗体重链4h11-vh及muc16单链抗体轻链4h11-vl构成，所述muc16单链抗体重链4h11-vh氨基酸序列如seqidno.2所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.2所示序列功能的衍生序列；所述muc16单链抗体轻链4h11-vl氨基酸序列如seqidno.3所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.3所示序列功能的衍生序列。
2.如权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述胞内域包括共刺激信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。
3.如权利要求2所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于所述嵌合受体的具体结构为：
自氨基端到羧基端依次由所述pd-1etco、连接肽、muc16单链抗体重链4h11-vh、连接肽、所述muc16单链抗体轻链4h11-vl、所述铰链区、所述跨膜域、所述共刺激信号传导结构域、所述cd3ζ信号传导结构域。
4.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述的连接肽为(gly4ser)3连接肽，所述连接肽的氨基酸序列如seqidno.8，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.8所示序列功能的衍生序列。
5.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述铰链区为ctla4的铰链区、cd28的铰链区、cd7的铰链区、igg1的铰链区、igg4的铰链区、igd的铰链区、cd8α的铰链区和pd-1的铰链区中的一种或多种。
6.如权利要求5所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述铰链区为含有cd8α的铰链区cd8αhinge，其氨基酸序列如seqidno.4所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.4所示序列功能的衍生序列。
7.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述跨膜域为cd4的跨膜域、cd7的跨膜域、cd8α的跨膜域、cd28的跨膜域、cd134的跨膜域、cd137的跨膜域、fcεriγ的跨膜域和h2-kb的跨膜域中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述跨膜域为cd8α的跨膜域cd8tm，其氨基酸序列如seqidno.5所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.5所示序列功能的衍生序列。
9.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述共刺激信号传导结构域为cd28、41bb、icos、ox40、cd244、fcεriγ、cd8α、btla、cd27、cd30、gitr、hvem、dap10、cd2、nkg2c、light和dap12中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述共刺激信号传导结构域为41bb，其氨基酸序列如seqidno.6所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.6所示序列功能的衍生序列。
11.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述cd3ζ信号传导结构域为cd3zeta，其核苷酸序列如seqidno.7所示，或经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留seqidno.7所示序列功能的衍生序列。
12.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno.9所示。
13.编码权利要求12所述的嵌合抗原受体的基因，其特征在于：
所述基因如seqidno.10所示。
14.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述pd-l1配体结合的结构域pd-1etco的基因的核苷酸序列如seqidno.11所示。
15.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述muc16单链抗体重链4h11-vh的基因的核苷酸序列如seqidno.12所示。
16.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述muc16单链抗体轻链4h11-vl的基因的核苷酸序列如seqidno.13所示。
17.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述cd8α的铰链区cd8αhinge基因的核苷酸序列如seqidno.14所示。
18.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述跨膜域cd8tm的基因的核苷酸序列如seqidno.15所示。
19.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述共刺激信号传导结构域41bb的基因的核苷酸序列如seqidno.16所示。
20.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述cd3ζ信号传导结构域cd3zeta的基因的核苷酸序列如seqidno.17所示。
21.如权利要求13所述的基因，其特征在于：
编码所述连接肽(gly4ser)3的基因的核苷酸序列如seqidno.18所示。
22.含有权利要求13所述基因的重组载体。
23.含有权利要求13所述基因的重组细胞，其特征在于：
所述重组细胞能够表达权利要求12所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。
24.含有权利要求13所述基因的重组病毒，其特征在于：
所述重组病毒为能够表达权利要求12所述嵌合抗原受体，且能够侵染免疫效应细胞的病毒。
25.如权利要求24所述的重组病毒，其特征在于：
所述免疫效应细胞为细胞毒性t淋巴细胞、nkt细胞、nk细胞或辅助性t细胞。
26.含有权利要求13所述基因的表达系统。
27.一种pd1-antimuc16car-t细胞的制备方法，其特征在于包括在t细胞上表达权利要求12所述嵌合抗原受体的步骤。
28.如权利要求27所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
用重组表达载体转染t细胞，从转染后的细胞中获得表达所述pd1-antimuc16特异性嵌合抗原受体的t细胞；所述重组表达载体为已经基因工程改造为含有如seqidno.14所示的cd8α铰链区、如seqidno.15所示的cd8跨膜区、如seqidno.16所示的41bb共刺激信号区及如seqidno.17所示的cd3zeta四部分结构的慢病毒表达载体的酶切位点ecori和mlui之间的小片段替换为scfv片段后得到的重组质粒；所述scfv片段为利用如seqidno.18所示连接肽(gly4ser)3将seqidno.12所示4h11-vh、seqidno.13所示4h11-vl和seqidno.11所示pd-1etco连接得到的dna片段。
29.权利要求1或12所述的嵌合抗原受体或权利要求13所述的基因或权利要求22所述的重组载体或权利要求23所述的重组细胞或权利要求24所述的重组病毒或权利要求26所述的表达系统在如下任意一项中的应用：
(1)制备用于治疗卵巢癌的产品；
(2)制备用于杀伤表达muc16抗原肽及表达pd-l1的肿瘤细胞的产品。
技术总结