背景技术：
黄龙病(hlb)，也称为柑橘属绿化，是最具破坏性的柑橘属植物病害之一。仅在美国，这种柑橘属植物病害每年就造成数十亿美元的损失。根据来自佛罗里达大学食品与农业科学研究所(theinstituteoffoodandagriculturalsciencesattheuniversityofflorida)的研究，自2005年在佛罗里达州检测到hlb以来，佛罗里达州已经失去了约162,200英亩的柑橘属植物和7,513个工作岗位。来自美国国家科学院协会(thenationalassociationofacademiesofscience)的最新预测预测，2016年至2017年的柑橘属产量比1997年至1998年的最高产量水平低约70％。此外，hlb在得克萨斯州和加利福尼亚州也迅速蔓延。最近，在加利福尼亚州南部已经报告了超过400例确认的hlb感染树木病例。hlb是由韧皮部限制性的韧皮杆菌属(liberibacter)革兰氏阴性细菌物种引起的，例如，候选韧皮部杆菌属(candidatusliberibacter)物种(例如，候选韧皮部杆菌亚洲种(candidatusliberibacterasiaticus(ca.l.asiaticus))，其通过木虱科(psyllidae)的昆虫，例如，亚洲柑橘木虱(asiancitruspsyllids(acp))传播。
由韧皮杆菌物种引起的另一重要病害是马铃薯斑马片(zc)病，也称为马铃薯斑马复合病。zc病与通过马铃薯木虱(例如，马铃薯线角木虱(bactericeracockerelli))传播的茄科候选韧皮部杆菌(candidatusliberibactersolanacearum(ca.l.solanacearum)有关。zc病于2006年在德克萨斯州北部达到流行水平，并已传播到亚利桑那州、加利福尼亚州、科罗拉多州、爱达荷州、俄勒冈州、堪萨斯州、内布拉斯加州和新墨西哥州。zc病给美国西南部，尤其是德克萨斯州的马铃薯产业造成了数百万美元的损失。除马铃薯外，其他茄属作物，包括番茄、茄子和胡椒，也可能受到感染。在本领域中存在对创新性组合物和方法的需求以治疗由韧皮杆菌属物种(例如，候选韧皮部杆菌属物种)引起的植物病害。
发明概述
本公开提供了稳定的抗微生物(例如，抗细菌或抗真菌或者二者)的肽(samp)，其可用于预防或治疗植物(例如，柑橘属植物或马铃薯植物)中的如由革兰氏阴性细菌引起的那些的细菌性病害，例如，韧皮杆菌属病害(例如，柑橘绿化病(也被称为黄龙病(hlb))或马铃薯斑马片病)的方法。本文中公开的samp可以是热稳定的，以及在植物提取物和/或植物溶解产物(例如，柑橘属溶解产物)中稳定的。本文中描述的samp可有效抑制/杀灭不同的细菌物种，如革兰氏阴性细菌物种，例如，韧皮杆菌属物种，例如，感染柑橘属的候选韧皮部杆菌亚洲种(c.las)、感染所有茄属植物的茄科候选韧皮部杆菌，以及新月韧皮杆菌(liberibactercrescens)，其是一种感染木瓜的可培养的细菌。新月韧皮杆菌可以用作不可培养的候选韧皮部杆菌属物种(例如，c.las)的替代物。此外，本文中公开的samp还可以抑制和杀灭其他的细菌病原体(例如，其他的革兰氏阴性细菌病原体)，如根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)(也称为放射型根瘤菌(rhizobiumradiobacter))和丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)菌株。根癌农杆菌可在超过140种双子叶植物物种中引起冠瘿病或肿瘤。不同的丁香假单胞菌菌株可以在许多双子叶和单子叶作物上引起细菌性溃疡或瘟病。
在一个方面，本公开的特征在于分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌或抗真菌或二者)的肽(samp)，其包含与seqidno:1-13和35-37中的任何一个的序列具有基本上相同的(例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)序列。在一些实施方案中，所述肽包含与seqidno:1-13和35-37中的任一个的序列具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的序列。在特定的实施方案中，所述肽包含与seqidno:1和2中的任一个的序列具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的序列。
在另一方面，本公开的特征在于包含如下序列的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)：
x1gx2x3vsx4enx5x6qgfx7hx8fex9tfx10sx11egx12aeyx13x14hpx15hvex16anx17x18lx19x20lekx21lx22x23dykpx24tx25rv(seqidno:27)，其中x1是r、k或w；x2是k或e；x3是n或d；x4是t或i；x5是l、f或r；x6是h或q；x7是p或t；x8是i、l或v；x9是s或f；x10是e或d；x11是t或l；x12是v或i；x13是v或i；x14是s,a或d；x15是s、a或v；x16是y或f；x17是l或t；x18是f,m或l；x19是a、p或t；x20是n或q；x21是v或f；x22是v或i；x23是v或i；x24是t、e或q；并且x25是v、e、l。
在该方面的一些实施方案中，分离的samp包含seqidno:27的序列，其中seqidno:27中的x1是r；x2是k；x3是n；x4是i；x5是l；x6是h；x10是e；x11是t；x12是v；x13是v；x16是y；x17是l；x18是f；x19是a；x20是n；x21是v；x22是v，x23是i；并且x24是t。
在另一方面，本公开的特征在于包含本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)的农业组合物。农业组合物还可以包含以下中的至少一种：除草剂、除草剂安全剂、表面活性剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物激活剂、增效剂、植物生长调节剂、驱虫剂、杀螨剂、软体动物杀灭剂或肥料。
在另一方面，本公开的特征在于编码本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)的核酸分子。还提供了包含可操作地与核酸分子连接的启动子(任选地，其中所述启动子对于核酸分子是异源的)的多核苷酸。本公开的特征还在于包含先前方面所述的核酸分子的细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物(例如，人)细胞。在特定的实施方案中，细胞是植物细胞。
在另一方面，本公开的特征在于包含本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或上述的核苷酸或编码本文中描述的分离的samp的核酸分子的植物。在一些实施方案中，植物是柑橘属植物或茄属植物。在一些实施方案中，相比其中缺失amp的对照植物(其他方面相同)，植物更耐受细菌病原体。
在另一方面，本公开的特征在于包含原位改变的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)的植物，所述肽包含至少一个对应于如seqidno:27中所示的位置x1至x25中的任一个处的氨基酸的氨基酸取代，其中突变的samp为植物提供了韧皮杆菌属病害(例如，黄龙病(hlb))抗性或韧皮杆菌属病害(例如，hlb)耐受性、假单胞菌属病害(例如，细菌溃疡或瘟病)抗性或假单胞菌属病害耐受性或农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)抗性或农杆菌属病害耐受性。
在另一方面，本公开的特征在于包含可操作地与编码本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)的多核苷酸连接的启动子的表达盒，其中在植物中引入表达盒造成植物具有增强的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)抗性或韧皮杆菌属病害(例如，hlb)耐受性、假单胞菌属病害(例如，细菌性溃疡或瘟病)抗性或假单胞菌属病害耐受性或农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)抗性或农杆菌属病害耐受性。在一些实施方案中，表达盒的启动子对于多核苷酸是异源的。在一些实施方案中，启动子是可诱导的。在一些实施方案中，启动子是植物组织特异性的(例如，韧皮部特异的、块茎特异的、根特异的、茎特异的、主干特异的或叶特异的。在一些实施方案中，韧皮部特异的启动子是蔗糖转运蛋白suc2启动子。
在另一方面，本公开的特征在于包含先前方面所述的表达盒的转基因植物，其中相比缺少表达盒的对照植物，所述植物具有增强的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)抗性或韧皮杆菌属病害(例如，hlb)耐受性、假单胞菌属病害(例如，细菌性溃疡或瘟病)抗性或假单胞菌属病害耐受性或农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)抗性或农杆菌属病害耐受性。在一些实施方案中，转基因植物是柑橘属植物或茄属植物。
在另一方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或包含分离的samp的农业组合物接触而预防或治疗植物中的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)、假单胞菌属病害(例如，细菌性溃疡或瘟病)，或农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)的方法。在这些方面的一些实施方案中，将分离的肽或农业组合物注射至植物的主干内。在一些实施方案中，将分离的肽或农业组合物注射至植物的茎内。在其他的实施方案中，将分离的肽或农业组合物经叶喷施到植物上。在其他的实施方案中，将分离的肽或农业组合物施用于植物的根部。在其他的实施方案中，将分离的肽或农业组合物通过滴灌至根部而施用于植物。在其他的实施方案中，将分离的肽或农业组合物通过激光烧蚀施用。
在另一方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或包含分离的samp的农业组合物接触而预防或治疗植物中的马铃薯斑马片(zc)病的方法。在又一个方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的samp或包含分离的samp的农业组合物接触而预防或治疗植物中的由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)引起的细菌感染的方法。在又一个方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的samp或包含分离的samp的农业组合物接触而预防或治疗植物中的由农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)引起的细菌感染的方法。在又一个方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的samp或包含分离的samp的农业组合物接触而预防或治疗植物中的由假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)引起的细菌感染的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或包含分离的samp的农业组合物接触而抑制植物中的韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)生长或杀灭植物中的韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)的方法。在又一个方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或包含分离的samp的农业组合物接触而抑制植物中的农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)生长或杀灭植物中的农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)的方法。在又一个方面，本公开的特征在于通过使植物与本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或包含分离的samp的农业组合物接触而抑制植物中的假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)生长或杀灭植物中的假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文中描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒)，而预防或治疗植物中的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)或预防或治疗植物中的由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，候选韧皮部杆菌亚洲种、候选韧皮部杆菌非洲种(candidatusliberibacterafricanus)和候选韧皮部杆菌美洲种(candidatusliberibacteramericanus)或新月韧皮杆菌)引起的细菌感染的方法。在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文中描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文描述的分离的samp的多核苷酸连接的启动子的表达盒)，而预防或治疗植物中的马铃薯zc病或预防或治疗植物中的由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum))或新月韧皮杆菌)引起的细菌感染的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒)，而预防或治疗植物中的假单胞菌属病害(例如，细菌性溃疡或瘟病)或预防或治疗植物中的由假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)引起的细菌感染的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文中描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒)，而预防或治疗植物中的农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)或预防或治疗植物中的由农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)引起的细菌感染的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒)而抑制植物中的韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)生长或杀灭植物中的韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒)而抑制植物中的农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)生长或杀灭植物中的农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物中引入本文描述的表达盒(例如，包含可操作地与编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒)而抑制植物中的假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)生长或杀灭植物中的假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)的方法。
在另一方面，本公开的特征在于通过以下方式产生具有增强的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)抗性或韧皮杆菌属病害(例如，hlb)耐受性的植物的方法：在多株植物中引入本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽或包含可操作地与编码分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒；以及从多株植物中选择包含分离的肽或表达多核苷酸的植物。
在另一方面，本公开的特征在于通过以下方式产生具有增强的马铃薯zc病害抗性或马铃薯zc病害耐受性的植物的方法：在多株植物中引入本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)或包含可操作地与编码分离的samp的多核苷酸连接的启动子的表达盒；以及从多株植物中选择包含分离的肽或表达多核苷酸的植物。
在另一方面，本公开的特征在于通过以下方式产生具有增强的假单胞菌属病害(例如，细菌性溃疡或瘟病)抗性或假单胞菌属病害(例如，细菌性溃疡或瘟病)耐受性的植物的方法：在多株植物中引入本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽或包含可操作地与编码分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒；以及从多株植物中选择包含分离的肽或表达多核苷酸的植物。
在另一方面，本公开的特征在于通过以下方式产生具有增强的农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)抗性或农杆菌属病害(例如，冠瘿病或肿瘤)耐受性的植物的方法：在多株植物中引入本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽或包含可操作地与编码分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸连接的启动子的表达盒；以及从多株植物中选择包含分离的肽或表达多核苷酸的植物。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物的多核苷酸中引入突变而产生具有增强的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)抗性或韧皮杆菌属病害(例如，hlb)耐受性(即对由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，候选韧皮部杆菌亚洲种、候选韧皮部杆菌非洲种和候选韧皮部杆菌美洲种)或新月韧皮杆菌)引起的细菌感染的增强的抗性或耐受性)的植物的方法，其中所述突变的多核苷酸编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(例如，与seqidno:1或2的序列具有至少75％的序列同一性的分离的samp)。在另一方面，本公开的特征在于通过向植物的多核苷酸中引入突变而产生具有增强的马铃薯zc病害抗性或马铃薯zc病害耐受性(即对由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum))或新月韧皮杆菌引起的细菌感染的增强的抗性或耐受性)的植物的方法，其中所述突变的多核苷酸编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)(例如，与seqidno:1或2的序列具有至少75％的序列同一性的分离的samp)。在这些方面的一些实施方案中，引入原位发生在植物细胞的基因组中。在特定的实施方案中，引入包括成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/cas基因组编辑。在这些方面的一些实施方案中，植物是柑橘属植物或茄属植物(例如，马铃薯植物)。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物的多核苷酸中引入突变而产生具有增强的农杆菌属病害抗性或农杆菌病害耐受性(即对由农杆菌属细菌引起的细菌感染(例如，由农杆菌属菌株引起的冠瘿病或肿瘤)的增强的抗性或耐受性)的植物的方法，其中所述突变的多核苷酸编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)(例如，与seqidno:1或2的序列具有至少75％的序列同一性的分离的samp)。在这些方面的一些实施方案中，引入原位发生在植物细胞的基因组中。在特定的实施方案中，引入包括成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/cas基因组编辑。在这些方面的一些实施方案中，植物是双子叶植物。
在另一方面，本公开的特征在于通过向植物的多核苷酸中引入突变而产生具有增强的假单胞菌属病害抗性或假单胞菌属病害耐受性(即对由假单胞菌属细菌引起的细菌感染(例如，由假单胞菌属菌株引起的细菌性溃疡或瘟病)的增强的抗性或耐受性)的植物的方法，其中所述突变的多核苷酸编码本文描述的分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)(例如，与seqidno:1或2的序列具有至少75％的序列同一性的分离的samp)。在这些方面的一些实施方案中，引入原位发生在植物细胞的基因组中。在特定的实施方案中，引入包括成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/cas基因组编辑。在这些方面的一些实施方案中，植物是单子叶植物或双子叶植物(例如，番茄植物)。
在本公开中描述的任何组合物或方法中，植物可以是来自柑橘属的物种(例如，柚(citrusmaxima)、香橼(citrusmedica)、大翼橙(citrusmicrantha)、宽皮柑橘(citrusreticulate)、莱姆(citrusaurantiifolia)、酸橙(citrusaurantium)、塔西提莱檬(citruslatifolia)、柠檬(citruslimon)、黎檬(citruslimonia)、葡萄柚(citrusparadise)、甜橙(citrussinensis)和大红桔(citrustangerine))，或者来自茄科的的物种(例如，茄属植物(solanumspp.)、辣椒属植物(capsicumspp.)和烟草属植物(nicotianaspp.))。来自茄属的物种包括例如，马铃薯(solanumtuberosum)、番茄(solanumlycopersicum)、茄(solanummelongena)、澳洲茄(solanumaviculare)、毛叶冬珊瑚(solanumcapsicastrum)、星花茄(solanumcrispum)、澳洲茄(solanumlaciniatum)、素馨叶白英(solanumlaxum)、珊瑚樱(solanumpseudocapsicum)、蓝花茄(solanumrantonnetii)、藤茄(solanumseaforthianum)和天堂花(solanumwendlandii)。来自辣椒属的物种包括例如，墨西哥辣椒(capsicumannuum)、风铃辣椒(capsicumbaccatum)、曲梗滨林椒(capsicumcampylopodium)、沙参花辣椒(capsicumcardenasii)、枸杞果辣椒(capsicumchacoense)、角冠滨林椒(capsicumcornutum)、杜森尼辣椒(capsicumdusenii)、恩科斯谬辣椒(capsicumeximium)、紫花滨林椒(capsicumfriburgense)、小米辣椒(capsicumfrutescens)、孪叶黄裙椒(capsicumgeminifolium)、capsicumhavanense、紫裙椒(capsicumlanceolatum)、莱森素德辣椒(capsicumlycianthoides)、细籽柳叶辣椒(capsicumminutiflorum)、莫斯提卡姆辣椒(capsicummositicum)、茸毛椒(capsicumpubescens)、匀斑滨林椒(capsicumrecurvatum)、沙棘果滨林椒(capsicumschottianum)、capsicumspina-alba、托瓦辣椒(capsicumtovarii)和毛滨林椒(capsicumvillosum)。来自烟草属的物种包括例如，尖叶烟草(nicotianaacuminate)、本氏烟草(nicotianabenthamiana)、粉蓝烟草(nicotianaglauca)、长花烟草(nicotianalongiflora)、黄花烟草(nicotianarustica)、红花烟草(nicotianatabacum)和西方烟草(nicotianaoccidentalis)。
在特定的实施方案中，植物选自：宽皮柑橘、甜橙、克莱门柚(citrusclementina)、墨西哥辣椒、马铃薯、番茄、茄和本氏烟草。在特定的实施方案中，植物是甜橙植物(甜橙)。在特定的实施方案中，植物是克莱门氏小柑橘植物(克莱门柚)。在特定的实施方案中，植物是马铃薯植物(马铃薯)。在一些实施方案中，植物是产蔬菜或水果的植物。
在本文中描述的本公开的任何方面，在一些实施方案中，samp是热稳定的(hs)肽。
此外，在本文中描述的本公开的任何方面，在一些实施方案中，samp还可以提供对由其他细菌病原体，如根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)和丁香假单胞菌引起的细菌性病害的抗性或耐受性。
定义
如本文中所用的术语“韧皮杆菌属病害”是指由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)引起的病害(例如，感染)。韧皮杆菌属病可以感染植物，如柑橘属植物(例如，橙、葡萄柚、橘子、柠檬、青柠(line)、青柠檬(keyline)、大翼橙、香橼和柚子)和茄属植物(例如，马铃薯、番茄、茄子和胡椒)。黄龙病(hlb)是一类感染柑橘属植物的韧皮杆菌属病害。
如本文中所用的术语“柑橘绿化病”和“黄龙病(hlb)”是指由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，候选韧皮部杆菌亚洲种、候选韧皮部杆菌非洲种和候选韧皮部杆菌美洲种)或新月韧皮杆菌)引起的植物(例如，柑橘属植物)的细菌感染。该感染是由亚洲柑橘属木虱柑橘木虱(diaphorinacitri)和非洲柑橘属木虱非洲木虱(triozaerytreae)作为媒介和传播的。目前已知有3种不同类型的hlb：耐热的亚洲形式以及热敏感型的非洲和美洲形式。
如本文中所用的术语“马铃薯斑马片(zc)病”是指由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum))或新月韧皮杆菌)引起的植物(例如，马铃薯植物)的细菌感染。该感染是由马铃薯木虱(例如，马铃薯线角木虱)作为媒介和传播的。
如本文中所用的术语“农杆菌属病害”是指由农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种，也称为放射型根瘤菌)引起的病害(例如，感染)。农杆菌属病可以包括在超过140种双子叶植物物种中的冠瘿病或肿瘤。
如本文中所用的术语“假单胞菌属病害”是指由假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)引起的病害(例如，感染)。假单胞菌属病可以包括在许多双子叶植物和单子叶植物作物上的细菌性溃疡或瘟病(例如，番茄细菌性斑点、番茄细菌性疮痂和番茄细菌性溃疡)。
如本文中所用的术语“病害抗性”是指植物不受韧皮杆菌属病害(例如，hlb)、农杆菌属病或假单胞菌属病；或者韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)、农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)或假单胞菌属细菌(例如，丁香假单胞菌物种)感染影响的能力。
如本文中所用的术语“病害耐受性”是指尽管被细菌(例如，革兰氏阴性细菌，如韧皮杆菌属细菌、农杆菌属细菌或假单胞菌属细菌)感染，但植物仍连续生长和存活的能力。
如本文中所用的术语“韧皮杆菌属病害抗性”是指植物不受韧皮杆菌属病害(例如，hlb)或韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)感染影响的能力。
如本文中所用的术语“韧皮杆菌属病害耐受性”是指尽管被韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)感染或患有韧皮杆菌属病害(例如，hlb)，但植物仍连续生长和存活的能力。在一些实施方案中，患有韧皮杆菌属病害(例如，hlb)的植物可能表现出轻微的病害症状，如叶片发黄、叶片斑驳、缺锌样斑驳、萎黄和果实产量减少，尽管有感染，但仍然能够生长或产果。
如本文中所用的术语“马铃薯zc病害抗性”是指植物不受马铃薯zc病或韧皮杆菌属(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum))或新月韧皮杆菌)细菌感染影响的能力。
如本文中所用的术语“马铃薯zc病害耐受性”是指尽管被韧皮杆菌属(例如，候选韧皮部杆菌属物种(例如，茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum))或新月韧皮杆菌)细菌感染或患有马铃薯zc病，但植物仍连续生长和存活的能力。在一些实施方案中，患有马铃薯zc病的植物可能会表现出轻微的马铃薯zc病症状，如萎黄、叶片灼热、结节肿胀、维管组织褐变、叶片卷曲、匍匐枝倒塌、皮孔扩大、维管组织褐变、髓射线变色和块茎组织坏死斑点，尽管受到感染，但仍然能够生长或产生马铃薯。
如本文中所用的术语“农杆菌属病害抗性”是指植物不受农杆菌属病害(例如，冠瘿病)或农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种，也称为放射型根瘤菌)感染影响的能力。
如本文中所用的术语“农杆菌属病害耐受性”是指尽管被农杆菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种，也称为放射型根瘤菌)感染或患有农杆菌属病害(例如，冠瘿病)，植物仍连续生长和存活的能力。
如本文中所用的术语“假单胞菌属病害抗性”是指植物不受假单胞菌属病害(例如，番茄细菌性斑点、番茄细菌性疮痂和番茄细菌性溃疡)或假单胞菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)感染影响的能力。
如本文中所用的术语“假单胞菌属病害耐受性”是指尽管被假单胞菌属细菌(例如，根癌农杆菌物种)感染或患有假单胞菌属病害(例如，番茄细菌性斑点、番茄细菌性疮痂和番茄细菌性溃疡)，植物仍连续生长或存活的能力。
如本文中所用的术语“稳定的抗微生物肽”或“samp”是指在抵抗/耐受韧皮杆菌属病害(例如，抵抗/耐受hlb)的植物中鉴定的肽。相比韧皮杆菌属病害易感(例如，hlb易感)的植物，这样的肽在抵抗/耐受韧皮杆菌属病害(例如，抵抗/耐受hlb)的植物中以更高的水平表达。可以将这些samp注射至植物中，以预防或治疗韧皮杆菌属病害(例如，hlb)。在一些实施方案中，本文中公开的分离的samp具有抗细菌或抗真菌或二者的特性。在一些实施方案中，本文中公开的分离的samp是热稳定的(例如，热稳定的(hs)肽)。在一些实施方案中，本文中公开的分离的samp在植物提取物中也是稳定的。在其他实施方案中，本文中公开的分离的samp在植物溶解产物(例如，柑橘属溶解产物)中也是稳定的。
如本文中所用的术语“农业组合物”是指配制以施用于植物或植物部分(例如，种子、切断、芽等)的组合物。农业组合物通常为液体形式，例如，以通过喷雾或浸泡施用，但也可以为粉末形式以用于再水合或施用(撒粉或干法涂布)，或者气态形式(例如，用于封闭环境)。例如，可以将农业组合物浓缩，以用于稀释或水或其他溶剂。农业组合物还可以包含多于一种的活性成分，例如单独的或与杀真菌剂、除草剂、肥料等组合的本文描述的samp(例如，hs肽)。
如本文中所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”植物中的韧皮杆菌属病害(例如，hlb或马铃薯zc病)是指通过本文描述的方法减轻或根除由韧皮杆菌属病害引起的症状。hlb的症状包括但不限于：叶片发黄、叶片斑驳、缺锌样斑驳、严重的萎黄和果实产量减少。马铃薯zc病的症状包括但不限于：萎黄、叶片灼热、结节肿胀、维管组织褐变、叶片卷曲、匍匐枝倒塌、皮孔增大、维管组织褐变、髓射线变色和块茎组织坏死斑点。在一些实施方案中，所公开的方法不一定导致根除或治愈韧皮杆菌属病害(例如，hlb或马铃薯zc病)，但可以显著减轻病害引起的症状。
如本文中所用的术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”植物中的韧皮杆菌属病害(例如，hlb或马铃薯zc病)是指防止存在病害风险的植物发展病害或降低植物可能发展病害的风险。可以在植物发展病害或显示病害迹象前，使植物与本文中描述的samp(例如，hs肽)接触。
如本文中所用的术语“植物”包括完整的植物、发芽的植物器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)，以及以上的后代。可以视为本文描述的植物包括，例如，柑橘属植物(例如，橙、葡萄柚、橘子、柠檬、青柠(line)、青柠檬(keyline)、大翼橙、香橼和柚子)和茄属植物(例如，马铃薯、番茄、茄子和胡椒)。
术语“植物”还包括天然存在的突变体和遗传改良的植物。“遗传改良的植物”或“转基因植物”是指对其基因组进行了操纵从而使其不同于相同物种、品种或栽培品种的野生型植物的植物，例如以添加基因或遗传元件、去除基因或遗传元件、突变基因或遗传元件、改变染色质结构、改变基因或蛋白质表达水平等。转基因植物可能包含表达载体或表达盒。表达盒通常包含可操作地与合适的可诱导的或允许多肽表达或调控核酸的组成性调控序列连接(即，在其调控控制下)的多肽编码序列或调控核酸(例如，反义、sirna或核酶)。可以通过转化或通过亲本植物转化后的育种将表达盒引入植物中。这样的方法可以用于完整植物，包括籽苗和成熟植物，以及用于植物的一部分，如种子、果实、叶或根、植物组织、植物细胞或任何其他植物物质，例如，植物外植体，以及用于其后代，和用于模拟细胞中的生化或细胞成分或过程的体外系统。在本公开的上下文中，遗传改良的植物可以包括编码samp(例如，hs肽)的基因的遗传改良。在一些实施方案中，遗传改良的植物中的改良的基因可以编码本文描述的samp(例如，hs肽)(例如，相对于seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1和2)的序列具有至少75％的序列同一性或至少一个氨基酸取代的samp)。
“表达盒”是指当被导入宿主细胞时分别导致rna或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。
如本文中所用的术语“多核苷酸”是指寡核苷酸或核苷酸及其片段或部分，以及基因组或合成来源的dna或rna，其可以是单链或双链的，并且代表有义或反义链。单个多核苷酸被翻译成单个多肽。
如本文中所用的术语“肽”和“多肽”可互换使用，并且描述单个聚合物，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。多肽旨在涵盖天然存在的、重组的或合成产生的任何氨基酸序列。
如本文中所用的在核酸或多肽的上下文中使用的术语“实质的同一性”或“基本上相同的”是指与参考序列具有至少50％的序列同一性的序列。可选地，同一性百分比可以是50％至100％间的任何整数。在一些实施方案中，如果序列与参考序列具有如使用本文描述的方法，优选如下所述的使用标准参数的blast确定的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，则序列与参考序列基本相同。本公开的实施方案提供了与seqidno:1-13和35-37中的任一个(seqidno:1和2)基本上相同的samp(例如，hs肽)。
对于序列比较，通常将一条序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代性的参数。然后，基于程序参数，序列比较算法将计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
比较窗包括参考多个连续位置中的任何一个的片段，例如，至少10个残基的片段。在一些实施方案中，比较窗具有10-600个残基，例如，约10至约30个残基、约10至约20个残基、约50至约200个残基或约100至约150个残基，其中可以在两条序列最佳对齐后，将序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。
适合确定序列同一性百分比和序列相似性的算法是blast和blast2.0算法，其分别在altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-410和altschuletal.(1977)nucleicacidsres.25:3389-3402中有描述。可通过国家生物技术信息中心(thenationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)网站公开获得进行blast分析的软件。算法包括首先通过识别查询序列中长度为w的短字来识别高分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字对齐时，它们匹配或满足某个正值的阈值分t。t被称为邻近字分数阈值(altschuletal,同上)。这些最初的邻近字命中充当启动搜索以查找包含它们的较长hsp的种子。然后将字命中沿着每条序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终>0)和n(错配残基的罚分；始终<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止字命中在每个方向上的延伸：累积对齐分数比其最大实现值减少数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积分数变为零或以下；或到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定了比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用的字长(w)为28，期望(e)为10，m＝1，n＝-2，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用的字长(w)为3，期望(e)为10，以及blosum62打分矩阵(参见henikoff&henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))。
blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，karlin&altschul,proc.nat'l.acad.sci.usa90:5873-5787(1993))。blast算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(p(n))，它提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试氨基酸序列与参考氨基酸序列的比较中，最小的总和概率小于约0.01，更优选小于约10-5，并且最优选小于约10-20，则认为氨基酸序列与参考序列相似。
附图说明
图1a和图1b是显示易感hlb的和耐受hlb的植物中的稳定的抗微生物肽(samp)的表达水平的条形图。图1c显示了耐受hlb的柑橘属品种或表达升高的samp水平的近亲属。
图2a-图2c是显示samp的两个α-螺旋之间的环中的关键氨基酸的肽结构。通过swiss模型利用atsamp1作为模板(pdbid:1q4r)来进行肽结构的预测。cghsampa(在本文中也称为sampa)和cghsampb(在本文中也称为sampb)的序列示出在表1中。
图3a示出了利用cghsampa(sampa)或cghsampb(sampb)肽或模拟(mock)溶液处理的感染茄科候选韧皮部杆菌的nb植物的照片。
图3b示出了利用cghsampa(sampa)或cghsampb(sampb)肽或模拟溶液处理的感染茄科候选韧皮部杆菌的nb植物的细菌滴度。
图4a-图4b示出了samp有效抑制hlb阳性的柑橘属植物中c.las(候选韧皮部杆菌亚洲种)的生长并且新的芽没有hlb症状。图4a示出了通过主干注射，利用缓冲液(模拟)或samp(以100nm或10μm)将具有相似c.las滴度的hlb阳性的柑橘属植物处理一次。在处理的第5周采集照片。图4b示出了通过pcr对从来自每种模拟或samp处理的柑橘属植物的8片新的叶子分离的基因组dna测量c.las的滴度。
图5a-图5c示出了在通过马铃薯木虱饲喂进行c.lso(茄科候选韧皮部杆菌)感染后，samp预处理的马铃薯植物生长更好且产生产生更多的块茎。图5a示出了利用samp(10μm)或仅缓冲液(模拟)预处理马铃薯植物，然后暴露至c.lso阳性的马铃薯木虱5天。植物为感染后3周。图5b示出了从模拟或samp预处理的植物收获的马铃薯块茎。图5c示出了从samp或模拟预处理的感染c.lso的植物和健康的植物收获的马铃薯块茎的油炸测试。
图6a-图6b示出了在通过马铃薯木虱饲喂进行c.lso感染后，samp预处理的番茄植物生长更好。图6a示出了利用samp或仅缓冲液(模拟)预处理番茄植物，然后暴露至c.lso阳性的马铃薯木虱5天。植物为感染后4周。图6b示出了samp预处理的番茄植物的地表以上的生物量。
图7示出了利用cghsampa或cghsampb肽或模拟溶液处理的感染茄科候选韧皮部杆菌的番茄植物的细菌滴度。
图8a-图8c表明samp对柑橘属植物具有激发效应，并且可以用于苗圃籽苗的疫苗接种。
图9a和图9b表明samp对柑橘属叶子具有低植物毒性活性。
图10表明samp在澳洲指橘、澳洲沙漠青柠、柠檬和枳(poncirustrifoliate)(普通根状茎)的果实中高度表达。
图11表明samp对人蛋白酶胃蛋白酶(一种主要的胃酶)敏感。
图12表明samp在室温下储存24小时或60℃下储存24小时或100℃储存20分钟后保持稳定，并且保持杀灭新月韧皮杆菌的活性，如通过用于可视化活的和死的细菌细胞(dmao(绿色)：一种用于可视化活细菌的可透过膜的dna染料，和ethd-iii(红色)：一种用于可视化死的细菌的不可透过膜的dna染料)的活力/细胞毒性测定所显示的。
图13表明samp在柑橘属细胞溶解产物中稳定，这表明它们在树中也是稳定的。
图14a和图14b表明samp在琼脂扩散测定中显示针对革兰氏阴性细菌病原体丁香假单胞菌和根癌农杆菌的抗微生物活性。
图15表明samp在4℃、室温或60℃下储存24小时后仍保持杀灭根癌农杆菌的活性，如通过用于可视化活的和死的细菌细胞(dmao(绿色)：一种用于可视化活细菌的可透过膜的dna染料，和ethd-iii(红色)：一种用于可视化死的细菌的不可透过膜的dna染料)的活力/细胞毒性测定所显示的。
发明详述
i.简介
由候选韧皮部杆菌属细菌引起的柑橘绿化病或“黄龙病”(hlb)是一类特异性感染柑橘属植物的韧皮杆菌属病害。hlb是柑橘属最具破坏性的病害之一。韧皮杆菌属(例如，候选韧皮部杆菌属物种(ca.liberibacter或ca.l.)或新月韧皮杆菌)是受限于该问题的革兰氏阴性细菌病原体。hlb导致柑桔质量和数量大大下降，每年导致柑桔产品数十亿美元的损失，并严重影响了柑桔行业的生存能力。目前治疗hlb的方法主要涉及清除感染的植物和对昆虫媒介进行化学处理，且仅引起对病害的部分控制。尚未发现针对hlb的可持续的病害控制方法。病害的广泛和快速传播至众多位置已使彻底清除受感染树木成为不切实际的策略。
为了鉴定和表征重要的柑橘属防御调节剂，对抵抗hlb的和耐受hlb的杂交品种与易感hlb的品种之间的小rna(srna)和srna靶基因进行比较分析。在抵抗hlb的和耐受hlb的杂交品种，但非易感hlb的品种中鉴定出了独特响应于ca.l.感染的数种柑橘属防御调控因子。在已鉴定的柑橘属防御调节因子中，与易感hlb的品种相比，发现在抵抗hlb的和耐受hlb的杂交品种中，编码稳定的抗微生物蛋白质的公认的抗细菌基因以高得多的水平表达。抵抗hlb的和耐受hlb的杂交根茎来自完全不同的地理和遗传背景。
在鉴定这些提供hlb抗性或hlb耐受性的稳定的抗微生物蛋白质之后，在通过马铃薯木虱传播感染茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum)的茄科植物本氏烟草(nb)中进行了这些稳定的抗微生物蛋白质的功能分析(实施例2)。结果表明施用samp至感染的植物可以有效抑制或杀灭韧皮杆菌属物种(例如，候选韧皮部杆菌属物种)并实现植物保护。
本公开提供了分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)(例如，热稳定的(hs)肽)、包含这样的肽的农业组合物、包含这样的肽的植物、表达这样的肽的转基因植物、使用这样的肽预防或治疗细菌性病害，如由革兰氏阴性细菌引起的那些病害，例如，韧皮杆菌属病害(例如，hlb或马铃薯zc病)、由根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)引起的细菌性病害和由丁香假单胞菌引起的细菌性病害的方法，以及产生包含这样的肽或表达这样的肽的植物的方法。本文中公开的samp可以抑制和杀灭细菌病原体，如革兰氏阴性细菌病原体，例如，韧皮杆菌属物种、根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)和丁香假单胞菌菌株。本文中公开的samp还可以为植物提供对细菌性病害，如由革兰氏阴性细菌引起的那些病害，例如，由韧皮杆菌属物种、根癌农杆菌和丁香假单胞菌菌株引起的细菌性病害的抗性或耐受性。
ii.稳定的抗微生物肽(samp)
本公开提供了稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)，其可被注射至植物中以预防或治疗细菌性病害，如革兰氏阴性细菌性病害，例如，韧皮杆菌属病害(例如，hlb)。本文中公开的samp还可以用于预防或治疗由其他细菌病原体，如根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)和丁香假单胞菌菌株引起的细菌性病害。植物也可以经遗传改良以表达本文描述的一种或多种samp。本公开鉴定了植物中的编码在抵抗/耐受韧皮杆菌属病害(例如，抵抗/耐受hlb)的植物和易感韧皮杆菌属病害(例如，易感hlb)的植物中差异表达的samp的基因。在一些实施方案中，本文中公开的samp是热稳定的(例如，热稳定的(hs)肽)。在一些实施方案中，本文中公开的samp在植物提取物中也是稳定的。在其他实施方案中，本文中公开的samp在植物溶解产物(例如，柑橘属溶解产物)中也是稳定的。如图1a和图1b中所示的，相比易感韧皮杆菌属病害(例如，易感hlb)的植物，这些samp在抵抗/耐受韧皮杆菌属病害(例如，抵抗/耐受hlb)的植物中以高得多的水平表达。通过比较来自不同的柑橘属植物和茄属植物的samp的氨基酸序列，发现在一些抵抗/耐受hlb的柑橘属植物和胡椒(ca：墨西哥辣椒)中表达的samp更短，而在易感hlb的茄属植物中表达的samp更长。下表1提供了不同的杂种植物、柑橘属植物和茄属植物中的samp的氨基酸序列。
表1
此外，相比易感韧皮杆菌属病害(例如，易感hlb)的植物中的相应的氨基酸，来自抵抗/耐受韧皮杆菌属病害(例如，抵抗/耐受hlb)的植物的samp(例如，hs肽)在α-β桶结构域中包含数个不同的氨基酸。在samp的两个α-螺旋之间的环中鉴定了抵抗/耐受韧皮杆菌属病害(例如，抵抗/耐受hlb)的植物和易感韧皮杆菌属病害(例如，易感hlb)的植物之间的两个关键的氨基酸差异(图2a-图2c)。这两个氨基酸位置在seqidno:1-13和35-37的序列比对中以加粗和下划线示出。
特别地，本文中公开的samp以下序列：
枳(poncirustrifoliata)飞龙1,kryder55-5,南京
mccnrgknvsienlhqgfthifestfestegvaeyvahpahveyansflanlekvlvidykpttvrv(seqidno:35)
枳(poncirustrifoliata)飞龙2
mccnrgknvsienlhqgfthifestfestegvaeyvahpahveytnsflanlekvlvidykpttvrv(seqidno:36)
指橙(microcitrusaustralasica)和枳(poncirustrifoliate)(德克萨斯州)：
mccnrgknvsienlhqgfthifestfestegvaeyvshpahveyanlflanlekvlvidykpttvrv(seqidno:37)
澳洲沙漠青柠澳沙檬(eremocitrusglauca)1
mccnrgknvsienlhqgfthifestfestegvaeyvshpshveyanlflanlekvlvidykpttvrv(seqidno:1)
本公开提供了分离的稳定的抗微生物(例如，抗细菌)的肽(samp)(例如，hs肽)，其包含与seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1-5和9)的序列基本上相同的(例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)的序列。在一些实施方案中，分离的肽包含与seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1-5和9)的序列具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的序列。在特定的实施方案中，分离的肽包含与seqidno:1和2中的任一个的序列具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)的序列。
本公开提供了分离的samp(例如，hs肽)，其包含相对于seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1-5和9)的序列，具有至少一个氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代)的序列。在特定的实施方案中，分离的肽包含相对于seqidno:1和2中的任一个的序列，具有至少一个氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代)的序列。
本公开的分离的samp(例如，hs肽)还可以包含
x1gx2x3vsx4enx5x6qgfx7hx8fex9tfx10sx11egx12aeyx13x14hpx15hvex16anx17x18lx19x20lekx21lx22x23dykpx24tx25rv(seqidno:27)的序列，其中x1是r、k或w；x2是k或e；x3是n或d；x4是t或i；x5是l、f或r；x6是h或q；x7是p或t；x8是i、l或v；x9是s或f；x10是e或d；x11是t或l；x12是v或i；x13是v或i；x14是s、a或d；x15是s、a或v；x16是y或f；x17是l或t；x18是f、m或l；x19是a、p或t；x20是n或q；x21是v或f；x22是v或i；x23是v或i；x24是t、e或q；并且x25是v、e、l。在分离的包含seqidno:27的序列的samp(例如，hs肽)的特定实施方案中，x1可以是r；x2可以是k；x3可以是n；x4可以是i；x5可以是l；x6可以是h；x10可以是e；x11可以是t；x12可以是v；x13可以是v；x16可以是y；x17可以是l；x18可以是f；x19可以是a；x20可以是n；x21可以是v；x22可以是v，x23可以是i；和/或x24可以是t。
在某些实施方案中，本公开还提供了通过向植物的多核苷酸中引入突变而产生具有增强的韧皮杆菌属病害抗性(例如，hlb抗性)或韧皮杆菌属病害耐受性(例如，hlb耐受性)(即增强的对由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种)或新月韧皮杆菌引起的细菌感染的抗性或耐受性)的植物(例如，柑橘属植物)的方法，其中所述突变的多核苷酸编码本公开的samp，如上述的samp(例如，相对于seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1-5和9)的序列，具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或至少一个氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代)的samp。特别地，突变的多核苷酸可以编码相对于seqidno:1和2中的任一个的序列，具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或至少一个氨基酸取代(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代)的samp。
在其他的实施方案中，可以通过向植物的多核苷酸中引入一个或多个突变来实现产生具有增强的韧皮杆菌属病害抗性(例如，hlb抗性)或韧皮杆菌属病害耐受性(例如，hlb耐受性)(即增强的对由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种)或新月韧皮杆菌引起的细菌感染的抗性或耐受性)的植物(例如，柑橘属植物)的方法，其中所述突变特异性地改变植物的天然samp中的对应于以上示出的序列对齐中的两个加粗和有下划线的氨基酸的氨基酸。例如，植物中编码天然samp的多核苷酸序列中的对应于以上示出的序列对齐中的两个加粗和有下划线的氨基酸的位置可被突变为编码s、a或d来作为两个加粗和有下划线的氨基酸中的第一个，并突变为编码s、a或v来作为两个加粗和有下划线的氨基酸中的第二个。
在一些实施方案中，本领域技术人员可以进行植物中的编码天然samp的多核苷酸序列和编码有效samp(例如，seqidno:14或15)的多核苷酸序列的序列比对，以确定植物的多核苷酸中需要被突变的特定核酸，使得产生的植物中的突变的多核苷酸编码与有效samp(例如，seqidno:14或15)基本上相同的多核苷酸序列。
本公开还提供了通过使植物与上述的samp(例如，相对于seqidno:1-13和35-37中的任一个的序列，具有至少75％的序列同一性或至少一个氨基酸取代的samp(例如，seqidno:1-5和9(例如，seqidno:1和2)))接触，而预防或治疗植物中的韧皮杆菌属病害(例如，hlb)和/或预防或治疗植物中的由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)引起的细菌感染的方法。不受到任何理论的束缚，samp(例如，hs肽)可以靶向和破坏细菌细胞，和/或诱导植物中的防御反应，因而促进植物的韧皮杆菌属病害抗性或韧皮杆菌属病害耐受性。如本文描述的可以治疗或预防的由韧皮杆菌属细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)引起的细菌感染的实例是马铃薯斑马片病。例如，可以治疗或预防马铃薯或番茄植物中的马铃薯斑马病。
iii.农业组合物
本公开还提供了将包含本文描述的一种或多种samp(例如，hs肽)的农业组合物用于预防或治疗植物中的细菌性病害(例如，韧皮杆菌属病害(hlb)或马铃薯斑马片病和其他细菌性病害如由根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)和丁香假单胞菌引起的那些病害)。在一些实施方案中，农业组合物还包括以下中的至少一种：除草剂、除草剂安全剂、表面活性剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物激活剂、增效剂、植物生长调节剂、驱虫剂、杀螨剂、软体动物杀灭剂或肥料。
包含本文描述的一种或多种samp(例如，hs肽)的农业组合物还可以包括以下中的一种或多种：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、润湿剂、摄食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、uv防护剂、缓冲剂、助留剂、肥料、固氮剂、微量营养素供体或影响植物生长的其他制剂。农业组合物还可以包括一种或多种农用化学品，包括：除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、软体动物杀灭剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料，以上物质也可以与适用于农用化学品的载体、表面活性剂或佐剂组合使用。合适的载体和助剂可以是固体或液体，并对应于配制技术中通常采用的物质，例如，天然或再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或肥料。本公开的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可以施用于待处理的作物区域、植物或种子。例如，本公开的组合物可以在生长、播种或储存期间施用。
可以与本文描述的samp(例如，hs肽)一起使用的表面活性剂包括：阴离子化合物，如羧酸盐，例如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；n-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单或二酯或者此类酯的盐；脂肪醇硫酸盐，如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐，如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐，例如，丁基萘磺酸盐；磺化萘甲醛缩合物的盐；磺化酚甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐，如酰胺磺酸盐，例如，油酸和n-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸酯，例如，磺酸钠或琥珀酸二辛酯。非离子型试剂包括：脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪烷基或链烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物、多元醇醚的脂肪酯，例如，脱水山梨醇脂肪酸酯、此类酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物、炔二醇，如2,4,7,9-四乙基-5-癸炔-4,7-二醇或乙氧基化炔二醇。阳离子表面活性剂的实例包括，例如，脂族单胺、二胺或多胺，如乙酸盐、环烷酸酯或油酸酯；或含氧的胺，如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二或多胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。
可以使用的惰性物质或惰性载体的实例包括但不限于：无机矿物，如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或植物性物质，如软木、粉状玉米芯、花生壳、稻壳和核桃壳。
可以与本文描述的samp(例如，hs肽)一起使用的除草剂包括杀死或抑制不需要的植物，通常是不同于所需植物或作物的植物的子集的生长或复制的化合物。作用方式有几种：acc酶抑制、类胡萝卜素生物合成抑制、细胞壁合成抑制、als抑制、esp合酶抑制、谷氨酰胺合酶抑制、hppd抑制、微管组装抑制、ppo抑制等。可商购的除草剂的实例包括：
杀虫剂(例如，杀线虫剂、软体动物杀灭剂、杀昆虫剂、杀螨剂/杀螨剂)可与本文公开的samp(例如，hs肽)组合使用，以杀死或减少影响植物的不需要的害虫的种群。杀虫剂也可以与驱虫剂或信息素一起使用，以破坏交配行为。杀虫剂是针对昆虫的杀虫剂，并且包括例如植物来源的那些杀虫剂(例如，蒜素、尼古丁、氧化苦参碱、茉莉菊酯i和ii、苦木、闹羊花毒素iii和柠檬烯)、氨基甲酸酯类杀虫剂(例如，西维因、克百威、丁硫克百威、杀线威、戊氰威、cpmc、empc、仲丁威)、氟杀虫剂、甲脒杀虫剂、熏蒸剂(例如，环氧乙烷、甲基溴、二硫化碳)、几丁质合成抑制剂、大环内酯杀虫剂、新烟碱类杀虫剂、有机磷酸盐杀虫剂、尿素和硫脲杀虫剂等。杀线虫剂会影响线虫，并且包括有机磷杀线虫剂(例如，除线特(diamidafos)、噻唑膦、速杀硫磷(heterophos)、phsphamidon、三唑磷)、熏蒸剂杀线虫剂(例如，二硫化碳、甲基溴、甲基碘)、阿维菌素、香芹酚、氨基甲酸酯杀线虫剂(例如，苯菌灵、草氨酰)等。软体动物杀灭剂针对蛞蝓和蜗牛，并且包括例如，蒜素、溴乙酰胺、thiocarb、蜗螺净(trifenmorph)、三苯锡、硫酸铜等。许多杀虫剂针对多于一种类型的害虫，使得可以选择一种或两种来针对昆虫、软体动物、线虫、有丝分裂原等。
肥料通常以植物或植物相关生物可以利用的形式提供大量和微量营养素。这些包括，例如，氮、磷、钾、硫、钙、钾、硼、氯、铜、铁、锰、钼、锌、镍和硒。肥料通常被定制为针对特定的土壤条件或用于特定的作物或植物。可以使用的肥料包括天然存在的、改性的、浓缩的和/或化学合成的物质，例如，粪肥、骨粉、堆肥、鱼粉、木片等，或者可以是化学合成的uan、无水硝酸铵、尿素、钾碱等。供应商包括
杀真菌剂是可以杀死真菌或抑制真菌生长或复制的化合物。可以与本公开的samp(例如，hs肽)一起使用的杀真菌剂包括接触、透层和系统性杀真菌剂。实例包括硫磺、印楝油、迷迭香油、荷荷巴油、茶树油、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、细基格孢属(ulocladium)、肉桂醛等。
本公开的农业组合物可以是直接施用的合适形式，也可以是需要在施用前用适量的水或其他稀释剂稀释的主要组合物的浓缩物。农业组合物中samp(例如，hs肽)的浓度将根据特定配方的性质而变化，具体来说，其是浓缩物还是直接使用、植物的类型，以及在某些情况下，根据使用的性质，例如，用于预防存在韧皮杆菌属病害(例如，hlb)的风险的植物或用于治疗已感染韧皮杆菌属病害(例如，hlb)的植物。
iv.预防或治疗细菌性病害的方法
如本文描述的，samp可用于预防或治疗细菌性病害，例如，革兰氏阴性细菌性病害。韧皮杆菌属病害是指由韧皮杆菌属中的革兰氏阴性细菌(例如，候选韧皮部杆菌属物种或新月韧皮杆菌)引起的感染。韧皮杆菌属病可以感染植物如柑橘属植物(例如，橙、葡萄柚、橘子、柠檬、青柠(line)、青柠檬(keyline)、大翼橙、香橼和柚子)和茄属植物(例如，马铃薯、番茄、茄子和胡椒)、黄龙病(hlb)是一类感染柑橘属植物的韧皮杆菌属病害。马铃薯斑马片(zc)病害是一类感染马铃薯植物的韧皮杆菌属病害。感染由马铃薯木虱(例如，马铃薯线角木虱)作为媒介和传播。利用本文中公开的samp的方法也可用于预防或治疗其他的细菌性病害(例如，其他的革兰氏阴性细菌性病害)，如由根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)和丁香假单胞菌引起的那些病害。
hlb
本公开还提供了预防或治疗植物中的hlb的方法。在方法的一些实施方案中，可使患hlb的植物与本文描述的samp(例如，hs肽)(例如，包含与seqidno:1或2的序列的至少75％的序列同一性的samp)或包含本文描述的一种或多种samp(例如，hs肽)的农业组合物接触。在一些实施方案中，可将samp或农业组合物注射至植物的主干中。在其他的实施方案中，可将samp或农业组合物注射至植物的茎中。在其他的实施方案中，可将samp或农业组合物经叶喷施至植物上。在其他实施方案中，可将samp或农业组合物通过滴灌施用至植物。一旦植物与本文中描述的samp(例如，hs肽)接触，肽即可提高植物的hlb抗性或hlb耐受性，因而预防或治疗植物中的hlb。
本文中描述的方法可用于减轻hlb引起的症状，包括叶片发黄、叶片斑驳、缺锌样斑驳、严重萎黄和果实产量减少。应当理解，hlb的症状根据感染的时间、病害的阶段、树木物种和树木成熟度等而变化。还将理解的是，在一些实施方案中，所公开的方法不一定导致根除或治愈感染，但是可以显著减轻由hlb引起的症状。
因此，在一些实施方案中，本文中提供的方法通过减少叶片发黄、造成更绿的外观、增加植物的生长速率和/或增加植物的果实产量而减轻了hlb的症状。因此，在一些实施方案中，相比未根据所述方法处理的植物，果实产量提高了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更多。在一些实施方案中，果实产量增加至未感染hlb的类似植物产量的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
本文中描述的方法还可用于预防植物中的hlb感染。例如，可以通过如本公开的方法中描述的一种或多种samp(例如，hs肽)接触尚未感染hlb，但存在感染风险(即植物位于已在周围植物中鉴定出hlb的区域)的植物。存在hlb风险的植物也可被遗传改良，以表达本文描述的一种或多种samp(例如，hs肽)以预防hlb。
马铃薯zc病
本公开还提供了预防或治疗马铃薯植物中的马铃薯zc病的方法。在方法的一些实施方案中，可以使患马铃薯zc病的植物与本文描述的samp(例如，hs肽)(例如，包含与seqidno:1或2的序列的至少75％的序列同一性的samp)或包含本文描述的一种或多种samp(例如，hs肽)的农业组合物接触。在一些实施方案中，可将samp或农业组合物注射至植物的块茎中。在其他的实施方案中，可将samp或农业组合物施用于植物的根部。在其他实施方案中，可将samp或农业组合物经叶喷施至植物上。一旦植物与本文描述的samp(例如，hs肽)接触，肽即可提高植物的马铃薯zc病害抗性或马铃薯zc病害耐受性，因而预防或治疗植物中的马铃薯zc病。
本文中描述的方法可用于减轻马铃薯zc病引起的症状，包括萎黄、叶片灼热、结节肿胀、维管组织褐变、叶片卷曲、匍匐枝倒塌、皮孔扩大、维管组织褐变、髓射线变色和块茎组织坏死斑点。应当理解，马铃薯zc病的症状根据感染的时间、病害的阶段、植物物种和成熟度等而变化。还将理解的是，在一些实施方案中，所公开的方法不一定导致根除或治愈感染，但是可以显著减轻由马铃薯zc病引起的症状。
因此，在一些实施方案中，本文中提供的方法减轻了如上所述的马铃薯zc病的症状，造成更健康的外观，增加植物的生长速率，和/或增加植物的产量。因此，在一些实施方案中，相比未根据所述方法处理的植物，产量提高了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更多。在一些实施方案中，产量增加至未感染马铃薯zc病的类似植物产量的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
本文中描述的方法也可用于预防植物中的马铃薯zc病感染。例如，可以通过如本公开的方法中描述的一种或多种samp(例如，hs肽)接触尚未感染马铃薯zc病，但存在感染风险(即植物位于已在周围植物中鉴定出马铃薯zc病的区域)的植物。存在马铃薯zc病风险的植物也可被遗传改良以表达本文中描述的一种或多种samp(例如，hs肽)以预防马铃薯zc病。
v.包含samp的植物的产生
在另一方面，本公开提供了包含用于在植物中表达如本文描述的samp(例如，hs肽)的重组表达盒的转基因植物。在一些实施方案中，产生了包含来源于非转基因植物物种的物种的多核苷酸的全部或部分序列的转基因植物。应当认识到，转基因植物包括其中引入了表达盒的植物或植物细胞，以及此类包含表达盒的植物或植物细胞的后代，包括具有稳定整合在染色体中的表达盒的后代。
可以通过各种常规技术将包含由异源启动子驱动的samp(例如，hs肽)编码序列的重组表达载体引入所需植物宿主的基因组中。例如，可以使用诸如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体的技术将dna构建体直接引入植物细胞的基因组dna中，或者可以使用弹道方法如dna颗粒轰击将dna构建体直接引入植物组织中。示例性载体是可以在植物中表达和任选复制的病毒载体。示例性的病毒载体可以包括，例如用于以韧皮部限制性的方式在柑橘属中表达肽的柑橘衰退病毒(ctv)，或者用以在马铃薯或其他植物中表达抗微生物肽的烟草脆裂病毒(trv)。可选地，可以将dna构建体与合适的t-dna侧翼区组合，并引入常规的根癌农杆菌宿主载体中。当细胞被细菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒力功能将指导构建体和邻近标记物插入植物细胞dna中。虽然本公开涵盖了组成型活性samp的瞬时表达，但通常，本公开构建体的表达将来自基因组中插入的表达盒，例如，使得至少一些植物后代也包含整合的表达盒。
显微注射技术也可用于此目的。这些技术是本领域熟知的，并且在文献中有详尽的描述。在paszkowskietal.emboj.3:2717-2722(1984)中描述了使用聚乙二醇沉淀引入dna构建体。在frommetal.proc.natl.acad.sci.usa82:5824(1985)中描述了电穿孔技术。在kleinetal.nature327:70-73(1987)中描述了弹道变换技术。
科学文献中充分描述了根癌农杆菌介导的转化技术，包括解毒(disarming)和使用二元载体。参见，例如，horschetal.science233:496-498(1984)和fraleyetal.proc.natl.acad.sci.usa80:4803(1983)。
可以培养通过上述任何一种转化技术获得的转化植物细胞，以再生出具有转化基因型并因此具有所需表型，例如，对韧皮杆菌属病害(例如，hlb)的抗性或耐受性的完整植物。这样的再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操纵，通常依赖于已与所需核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记。在evansetal.,protoplastsisolationandculture,handbookofplantcellculture,第124-176页,macmillilanpublishingcompany,newyork,1983；和binding,regenerationofplants,plantprotoplasts,第21-73页,crcpress,bocaraton,1985中描述了培养的原生质体的植物再生。还可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这样的再生技术在kleeetal.ann.rev.ofplantphys.38:467-486(1987)中有概述。
本领域技术人员将认识到表达盒被稳定地整合到转基因植物中并被证实是可操作的之后，可以通过性杂交将其引入其他植物中。可以使用多种标准育种技术中的任何一种，具体取决于要杂交的物种。
本公开的表达盒和其他构建体可用于对基本上任何植物赋予韧皮杆菌属病害抗性或耐受性。因此，本公开可用于大量的植物上，包括来自柑橘属的物种(例如，柚、香橼、大翼橙、宽皮柑橘、莱姆、酸橙、塔西提莱檬、柠檬、黎檬、葡萄柚、甜橙和大红桔)或来自茄科的物种(例如，茄属植物(solanumspp.)、辣椒属植物(capsicumspp.)和烟草属植物(nicotianaspp.)。来自茄属的物种包括，例如，马铃薯、番茄、茄、澳洲茄(solanumaviculare)、毛叶冬珊瑚、星花茄、澳洲茄(solanumlaciniatum)、素馨叶白英、珊瑚樱、蓝花茄、藤茄和天堂花。来自辣椒属的物种包括，例如，墨西哥辣椒、风铃辣椒、曲梗滨林椒、沙参花辣椒、枸杞果辣椒、角冠滨林椒、杜森尼辣椒、恩科斯谬辣椒、紫花滨林椒、小米辣椒、孪叶黄裙椒、capsicumhavanense、紫裙椒、莱森素德辣椒、细籽柳叶辣椒、莫斯提卡姆辣椒、茸毛椒、匀斑滨林椒、沙棘果滨林椒、capsicumspina-alba、托瓦辣椒和毛滨林椒。来自烟草属的物种包括，例如，尖叶烟草、本氏烟草、粉蓝烟草、长花烟草、黄花烟草、红花烟草和西方烟草。
在特定的实施方案中，植物选自：宽皮柑橘、甜橙、克莱门柚、墨西哥辣椒、马铃薯、番茄、茄和本氏烟草。在特定的实施方案中，植物是甜橙植物(甜橙)。在特定的实施方案中，植物是克莱门氏小柑橘植物(克莱门柚)。在特定的实施方案中，植物是马铃薯植物(马铃薯)。在一些实施方案中，植物是产蔬菜或水果的植物。
技术人员将认识到，许多植物物种可以用作模型以预测其他植物中转基因表达的表型效应。例如，广泛认可的是，烟草(烟草属)和拟南芥属(arabidopsis)植物都是转基因表达的有用模型，特别是在其他双子叶植物中。
在一些实施方案中，相比除表达samp外在其他方面相同的植物，本公开的植物具有增强的samp介导的表型，例如增强的对细菌性病害(例如，韧皮杆菌属病害(例如，hlb和zc)和其他细菌性病害如由根癌农杆菌(也称为放射型根瘤菌)和丁香假单胞菌)引起的那些病害的抗性或耐受性。
crispr/cas
现在，可以使用crispr/cas9基因组编辑方法在非转基因生物体中精确定制植物基因操作。在该细菌抗病毒和转录调控系统中，两种小rnas-crispr-rna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)的复合体将核酸酶(cas9)导引至与crrna互补的特定dna序列(jinek,m.,etal.science337,816–821(2012))。这些rnas与cas9的结合涉及rna中的特定序列和二级结构。这两种rna成分可以简化为单一元件，即单一向导rna(sgrna)，其可以从包含用户定义的靶序列的盒中转录而来(jinek,m.,etal.science337,816–821(2012))。该系统已被用于人类、斑马鱼、果蝇、小鼠、线虫、细菌、酵母和植物的基因组编辑(hsu,p.d.,etal.,cell157,1262–1278(2014))。在该系统中，核酸酶在sgrna编程的靶区域处产生双链断裂。这些可以通过非同源重组来修复，其通常会产生失活的突变。断裂也可以通过同源重组来修复，其使得系统可以用于基因靶向的基因置换(li,j.-f.,etal.nat.biotechnol.31,688-691,2013；shan,q.,etal.nat.biotechnol.31,686-688,2013)。在本公开的方法的一些实施方案中，可以使用cas9/crispr系统来改良植物中编码野生型或内源性samp的基因，以匹配编码本文描述的samp的多核苷酸序列(例如，编码相对于seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1和2)的序列具有至少75％的序列同一性或至少一个氨基酸取代的samp的多核苷酸序列)。在一些实施方案中，可以使用cas9/crispr系统改良植物中编码野生型或内源性samp的基因，以匹配seqidno:14-26、28-34和38-40中的任一个(例如，seqidno:14和15)的多核苷酸序列。
因此，在一些实施方案中，与产生转基因植物相反，可以原位改变植物或植物细胞中的天然samp编码序列，以产生携带编码本文描述的samp(例如，相对于seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1和2)的序列具有至少75％的序列同一性或至少一个氨基酸取代的samp)的多核苷酸的植物或植物细胞。例如，在一些实施方案中，crispr技术被用于将一个或多个核苷酸改变原位引入samp编码序列中，以改变适当的密码子，从而进行对应于如seqidno:27的序列中所示的位置x1至x25的改变。crispr/cas系统已被改进以用于原核和真核系统，以用于基因组编辑和转录调控。“crispr/cas”系统是指一类广泛分布的用于防御外来核酸的细菌系统。在各种各样的真细菌和古细菌生物体中都发现了crispr/cas系统。crispr/cas系统包括i型、ii型和iii型亚型。野生型ii型crispr/cas系统利用rna介导的与引导和激活rna复合的核酸酶cas9来识别和切割外来核酸。在各种各样的真细菌中发现了cas9同系物，包括但不限于以下分类群的细菌：放线菌(actinobacteria)、产水菌(aquificae)、拟杆菌-绿菌(bacteroidetes-chlorobi)、衣原体-疣微菌(chlamydiae-verrucomicrobia)、绿弯菌(chlroflexi)、蓝细菌(cyanobacteria)、厚壁菌(firmicutes)、变形菌(proteobacteria)、螺旋体(spirochaetes)和热袍菌(thermotogae)。示例性的cas9蛋白是酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9蛋白。另外的cas9蛋白及其同系物在例如，chylinksi,etal.,rnabiol.2013年5月1日；10(5):726-737；nat.rev.microbiol.2011年6月；9(6):467-477；hou,etal.,procnatlacadsciusa.2013年9月24日；110(39):15644-9；sampsonetal.,nature.2013年5月9日；497(7448):254-7；和jinek,etal.,science.2012年8月17日；337(6096):816-21中有描述。
因此，在一个方面，本文提供了使用crispr/cas9向植物细胞中引入至少一个突变的方法。在一些实施方案中，本文提供了改变编码植物中的samp的(例如，天然的)核酸的方法。在一些实施方案中，方法包括向包含并表达具有编码samp的靶核酸的dna分子的植物细胞中引入改造的、非天然存在的成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)—crispr相关的(cas)(crispr-cas)系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统包含一个或多个包含以下成分的载体：a)可在可操作地与至少一个编码与靶序列杂交的crispr-cas系统导引rna的核苷酸序列连接的植物细胞中的操作的第一调控原件，和b)可在可操作地与编码ii型cas9蛋白的核苷酸序列连接的植物细胞中操作的第二调控原件，其中组件(a)和(b)位于系统的相同的或不同的载体上，借此导引rna靶向靶序列且cas9蛋白切割dna分子，借以在编码samp的靶核酸中引入至少一个突变，即在编码samp的靶核酸中引入一个或多个突变，以改变靶核酸的序列，从而匹配编码具有seqidno:1-13和35-37中的任一个(例如，seqidno:1和2)的序列的抗微生物(例如，抗细菌)的肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，samp选自seqidno:1-5和9中的任一个或其基本上相同的多肽。
在一些实施方案中，使用crispr/cas9技术向编码samp的(例如，天然的)核酸中引入至少一个突变的方法可适用于大量的植物，包括来自柑橘属的物种(例如，柚、香橼、大翼橙、宽皮柑橘、莱姆、酸橙、塔西提莱檬、柠檬、黎檬、葡萄柚、甜橙和大红桔)或来自茄科的物种(例如，茄属植物、辣椒属植物和烟草属植物)。来自茄属的物种包括例如，马铃薯、番茄、茄、澳洲茄(solanumaviculare)、毛叶冬珊瑚、星花茄、澳洲茄(solanumlaciniatum)、素馨叶白英、珊瑚樱、蓝花茄、藤茄和天堂花。来自辣椒属的物种包括例如，墨西哥辣椒、风铃辣椒、曲梗滨林椒、沙参花辣椒、枸杞果辣椒、角冠滨林椒、杜森尼辣椒、恩科斯谬辣椒、紫花滨林椒、小米辣椒、孪叶黄裙椒、capsicumhavanense、紫裙椒、莱森素德辣椒、细籽柳叶辣椒、莫斯提卡姆辣椒、茸毛椒、匀斑滨林椒、沙棘果滨林椒、capsicumspina-alba、托瓦辣椒和毛滨林椒。来自烟草属的物种包括例如，尖叶烟草、本氏烟草、粉蓝烟草、长花烟草、黄花烟草、红花烟草和西方烟草。在特定的实施方案中，植物选自：宽皮柑橘、甜橙、克莱门柚、墨西哥辣椒、马铃薯、番茄、茄和本氏烟草。在特定的实施方案中，植物是甜橙植物(甜橙)。在特定的实施方案中，植物是克莱门氏小柑橘植物(克莱门柚)。在特定的实施方案中，植物是马铃薯植物(马铃薯)。在一些实施方案中，植物是产蔬菜或水果的植物。
在一些实施方案中，引入靶核酸序列中的突变改变了序列中的合适的密码子，以制造对应于如seqidno:27的序列所示的位置x1至x25的改变。例如，在向靶核酸中引入突变以改变合适的密码子后，改良的核酸序列在其相应的位置处编码如seqidno:27的位置x1至x25所示的一个或多个氨基酸。还提供为从上述方法产生的植物或植物细胞。这样的植物将包含编码samp的非天然存在的核酸序列。
vi.表达盒
在一些实施方案中，本公开提供了包含编码本公开的samp(例如，hs肽)的多核苷酸的表达盒，其中向植物中引入表达盒造成转基因植物表达samp。在一些实施方案中，启动子可以可操作地与编码samp的多核苷酸连接。启动子可以对于多核苷酸是异源的。在一些实施方案中，启动子可以是可诱导的。在一些实施方案中，启动子可以是植物组织特异性的(例如，韧皮部特异的、块茎特异的、根特异的、茎特异的、主干特异的或叶子特异的)。
本领域熟知的许多方式中的任何一种都可以用来驱动植物中的samp表达。任何器官都可以被靶向，如芽植物器官/结构(例如叶子、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实。可选地，可以在一个或多个器官中的某些细胞和/或组织类型(例如，叶子中的使用保卫细胞特异性的启动子的保卫细胞)中特异性地表达编码本文描述的samp(例如，hs肽)的多核苷酸。可选地，可以组成性地表达(例如，使用camv35s启动子)编码本文描述的samp(例如，hs肽)的多核苷酸。
为了在以上技术中使用编码本文描述的samp(例如，hs肽)的多核苷酸，制备了适于转化植物细胞的重组dna载体。用于转化多种高等植物物种的技术是熟知的，并且在技术和科学文献中有描述。参见，例如，weisingetal.ann.rev.genet.22:421-477(1988)。优选地，编码samp的dna序列将与转录和翻译起始调控序列组合，其将指导来自转化植物的预期组织中的基因的序列的转录。
例如，植物启动子片段可用于指导samp(例如，hs肽)在转基因植物的所有组织中的表达。这样的启动子在本文中被称为“组成型”启动子，并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(camv)35s转录起始区域、来源于根癌农杆菌(agrobacteriumtumafaciens)的t-dna的1'或2'启动子，以及其他来自本领域技术人员已知的各种植物基因的转录起始区域。
可选地，植物启动子可以指导samp(例如，hs肽)在特定组织中的表达(组织特异性的启动子)，或者否则可以在更精确的环境控制下(可诱导的启动子)表达。在发育控制下的组织特异性的启动子的实例包括仅在某些组织，如韧皮部、块茎、茎、主干、叶或保卫细胞中启动转录的启动子。可通过可诱导的启动子影响转录的环境条件的实例包括但不限于厌氧条件、高温和光的存在。
在一些实施方案中，可以包括在samp的编码区的3'端的聚腺苷酸化区。聚腺苷酸化区可以来源于天然存在的samp基因，来自多种其他的植物基因或来自t-dna。
包含多核苷酸序列(例如，启动子或samp编码区)的载体可以包括赋予植物细胞选择性表型的标记基因。例如，标记可以编码杀生物剂抗性，特别是抗生素抗性，如对卡那霉素、g418、博来霉素、潮霉素的抗性，或者除草剂抗性，如对氯磺隆或basta的抗性。
在一些实施方案中，编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸在植物细胞中重组表达。可以制备各种不同的表达构建体，如适于植物细胞转化的表达盒和载体。用于转化多种高等植物物种的技术是熟知的，并且在技术和科学文献中有描述。参见，例如，weisingetal.ann.rev.genet.22:421-477(1988)。可以将编码本文描述的samp(例如，hs肽)的dna序列与顺式作用(启动子)和反式作用(增强子)转录调控序列组合，以指导转化植物的预期组织中的时序、组织类型和转录水平。也可以使用翻译控制元件。
本公开的实施方案还提供了可操作地与在一些实施方案中能够驱动植物中的samp编码序列的转录的启动子连接的编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸。启动子可以例如来源于植物或病毒来源。启动子可以是例如组成活性的、可诱导的或组织特异性的。在构建本公开的重组表达盒、载体、转基因中，可以选择不同的启动子并用于差异性指导基因表达，例如在植物或动物的一些或全部组织中。
组成型启动子
片段可被用于在所有转化的细胞或组织，例如转基因植物的转化的细胞或组织中指导编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸的表达。术语“组成型调控元件”是指向相对独立于表达组成型调控元件的细胞或组织类型的可操作连接的核酸分子赋予表达水平的调控元件。在植物中表达的组成型调控元件通常在许多细胞和组织类型中广泛表达。在生理条件下连续驱动表达的启动子被称为“组成型”启动子，并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下具有活性。
用于转基因植物中的异位表达的多种组成型调控元件是本领域熟知的。花椰菜花叶病毒35s(camv35s)启动子，例如，是一种被良好定征的组成型调控元件，其可在所有植物组织中产生高水平的表达(odelletal.,nature313:810-812(1985))。camv35s启动子由于其在众多不同的植物物种中的活性(benfey和chua,science250:959-966(1990)；futtereretal.,physiol.plant79:154(1990)；odelletal.,同上,1985)而可能特别有用。与未修饰的35s启动子相比，其中固有的启动子元件已被复制的串联的35s启动子孵育了更高的表达水平(kayetal.,science236:1299(1987))。其他有用的组成型调控元件包括，例如，花椰菜花叶病毒19s启动子；figwort花叶病毒启动子；和胭脂碱合酶(nos)基因启动子(singeretal.,plantmol.biol.14:433(1990)；an,plantphysiol.81:86(1986))。
另外的组成型调控元件，包括用于在单子叶植物中有效表达的那些组成型调控元件，在本领域也是已知的，例如，pemu启动子和基于稻肌动蛋白-15'区域的启动子(lastetal.,theor.appl.genet.81:581(1991)；mcelroyetal.,mol.gen.genet.231:150(1991)；mcelroyetal.,plantcell2:163(1990))。组合了来自不同基因的元件的嵌合的调控元件也可用于异位表达编码本文描述的samp(例如，hs肽)的核酸分子(comaietal.,plantmol.biol.15:373(1990))。
组成型启动子的其他实例包括：来源于根癌农杆菌的t-dna的1'或2'启动子(参见，例如，mengiste(1997)同上；o'grady(1995)plantmol.biol.29:99-108)；肌动蛋白启动子，如拟南芥肌动蛋白基因启动子(参见，例如，huang(1997)plantmol.biol.199733:125-139)；醇脱氢酶(adh)基因启动子(参见，例如，millar(1996)plantmol.biol.31:897-904)；来自拟南芥的act11(huangetal.plantmol.biol.33:125-139(1996))、来自拟南芥的cat3(genbankno.u43147,zhongetal.,mol.gen.genet.251:196-203(1996))、编码来自欧洲油菜(brassicanapus)的硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(genbankno.x74782,solocombeetal.plantphysiol.104:1167-1176(1994))、来自玉米的gpc1(genbankno.x15596,martinezetal.j.mol.biol208:551-565(1989))、来自玉米的gpc2(genbankno.u45855,manjunathetal.,plantmol.biol.33:97-112(1997))、来自技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区域。也参见holtorfplantmol.biol.29:637-646(1995)。
可诱导的启动子
可选地，植物启动子可以在变化的环境条件或发育条件的影响下指导编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸的表达。可能通过可诱导的启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件、高温、干旱或光照的存在。这样的启动子在本文中称为“可诱导的”启动子。在一些实施方案中，可诱导的启动子是通过一个或多个环境应激源，包括但不限于干旱、冻冷和高盐诱发的启动子。例如，本公开可以包括干旱特异性的启动子，如玉米的干旱可诱导的启动子(例如，玉米rab17干旱可诱导的启动子(vilardelletal.(1991)plantmol.biol.17:985-993；vilardelletal.(1994)plantmol.biol.24:561-569))；或者可选地来自马铃薯(kirch(1997)plantmol.biol.33:897-909)或来自拟南芥(例如，rd29a启动子(kasugaetal.(1999)naturebiotechnology17:287-291)的寒冷、干旱和高盐可诱导的启动子。其他的环境压力可诱导的启动子包括来自以下基因的启动子：稻中的rab21、wsi18、lea3、uge1、dip1和r1g1b(yietal.(2010)planta232:743-754)。
在一些实施方案中，植物启动子是一种应力可诱导的启动子(例如，干旱、寒冷或盐可诱导的启动子)，其包含脱水响应元件(dre)和/或aba响应元件(abre)，包括但不限于rd29a启动子。
可选地，在暴露于植物激素如植物生长素后可诱导的植物启动子被用于表达编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸。例如，本公开可以使用大豆(glycinemaxl.)中的植物生长素响应元件e1启动子片段(auxres)(liu(1997)plantphysiol.115:397-407)；生长素响应性拟南芥gst6启动子(也对水杨酸和过氧化氢响应)(chen(1996)plantj.10:955-966)；来自烟草的生长素可诱导的parc启动子(sakai(1996)37:906-913)；植物生物素响应元件(streit(1997)mol.plantmicrobeinteract.10:933-937)；以及响应应激激素脱落酸的启动子(sheen(1996)science274:1900-1902)。
在暴露于可以施用于植物的化学试剂如除草剂或抗生素后可诱导的植物启动子也可用于表达编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸。例如，可以使用通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米in2-2启动子(deveylder(1997)plantcellphysiol.38:568-577)；不同的除草剂安全剂的应用可诱导不同的基因表达模式，包括在根部、排水器和顶端分生组织的表达。samp(例如，hs肽)编码序列也可以位于例如四环素可诱导的启动子的控制下，例如，如关于包含avenasatival.(燕麦)精氨酸脱羧酶基因(masgrau(1997)plantj.11:465-473)；或水杨酸响应元件(stange(1997)plantj.11:1315-1324；uknesetal.,plantcell5:159-169(1993)；bietal.,plantj.8:235-245(1995))的转基因烟草植物所述的。
有用的可诱导的调控元件的实例包括铜可诱导的调控元件(mettetal.,proc.natl.acad.sci.usa90:4567-4571(1993)；furstetal.,cell55:705-717(1988))；四环素和氯-四环素可诱导的调控元件(gatzetal.,plantj.2:397-404(1992)；
组织特异性的启动子
可选地，植物启动子可以指导特定组织(组织特异性的启动子)中的编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸的表达。组织特异性启动子是仅在植物发育过程中的特定时间的特定细胞或组织中有活性的转录控制元件。
在发育控制下的组织特异性的启动子的实例包括仅(或主要仅)在某些组织，如植物组织，例如，根或叶或生殖组织，如果实、胚珠、种子、花粉、柱头(pistol)、花或任何胚性组织或表皮或叶肉中启动转录的启动子。生殖组织特异性的启动子可以是例如，胚珠特异的、胚芽特异的、胚乳特异的、珠被特异的、种子和种皮特异的、花粉特异的、花瓣特异的、花萼特异的或以上的一些组合。在一些实施方案中，启动子是细胞类型特异的，例如，守卫细胞特异的。
表皮特异的启动子包括例如，拟南芥ltp1启动子(thomaetal.(1994)plantphysiol.105(1):35-45)、cer1启动子(aartsetal.(1995)plantcell7:2115-27)和cer6启动子(hookeretal.(2002)plantphysiol129:1568-80)，以及直系同源的番茄lecer6(voggetal.(2004)j.expbot.55:1401-10)。
保卫细胞特异的启动子包括例如，dgp1启动子(lietal.(2005)sciencechinaclifesci.48:181-186)。
其他组织特异性的启动子包括种子启动子。合适的种子特异的启动子来源于以下基因：来自玉米的mac1(sheridan(1996)genetics142:1009-1020)；来自玉米的cat3(genbankno.l05934,abler(1993)plantmol.biol.22:10131-1038)；来自拟南芥的vivparous-1(genbankno.u93215)；来自拟南芥的atmyc1(urao(1996)plantmol.biol.32:571-57；conceicao(1994)plant5:493-505)；来自欧洲油菜的napa(genbankno.j02798,josefsson(1987)jbl26:12196-1301)；以及来自欧洲油菜的napin基因家族(sjodahl(1995)planta197:264-271)。
在植物组织如叶、茎、根和块茎中具有特异性活性的多种启动子也可用于表达编码本文中描述的samp(例如，hs肽)的多核苷酸。例如，可以使用控制patatin(马铃薯块茎的主要储存蛋白)的启动子，参见例如，kim(1994)plantmol.biol.26:603-615；martin(1997)plantj.11:53-62。也可以使用在根中显示高活性的来自发根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)的orf13启动子(hansen(1997)mol.gen.genet.254:337-343。其他有用的植物组织特异性的启动子包括：编码来自一种主要的芋头(芋头实(colocasiaesculental.schott))球茎蛋白质家族tarin的球蛋白的基因的tarin启动子(bezerra(1995)plantmol.biol.28:137-144)；在芋头球茎发育过程中有活性的curculin启动子(decastro(1992)plantcell4:1549-1559)，以及烟草根特异性的基因tobrb7的启动子，其表达局限于根分生组织和未成熟的中心柱区域(yamamoto(1991)plantcell3:371-382)。
也可以使用叶特异性的启动子，如二磷酸核酮糖羧化酶(rbcs)启动子。例如，番茄rbcs1、rbcs2和rbcs3a基因在叶子和光生长的籽苗中表达，仅rbcs1和rbcs2在发育的番茄果实中表达(meier(1997)febslett.415:91-95)。可以使用如matsuoka(1994)plantj.6:311-319所述的几乎仅仅在叶片和叶鞘的叶肉细胞中以高水平表达的二磷酸核酮糖羧化酶启动子。另一叶特异性的启动子是集光的叶绿素a/b结合蛋白基因启动子，参见例如，shiina(1997)plantphysiol.115:477-483；casal(1998)plantphysiol.116:1533-1538。如li(1996)febslett.379:117-121描述的拟南芥(arabidopsisthaliana)myb相关的基因启动子(atmyb5)是叶特异性的。atmyb5启动子在幼小莲座丛和茎生叶边缘的正在发育的叶片毛状体、托叶和表皮细胞以及未成熟种子中表达。atmyb5mrna出现在受精和胚胎发育的16细胞阶段之间，并持续到超过心形期。也可以使用由busk(1997)plantj.11:1285-1295在玉米中鉴定的叶启动子。
另一类有用的植物组织特异性的启动子是分生组织(根尖和苗端)启动子。例如，可以使用dilaurenzio(1996)cell86:423-433；和long(1996)nature379:66-69描述的“shootmeristemless”和“scarecrow”启动子，它们在发育中的芽或根尖分生组织中有活性。另一种有用的启动子是控制3-羟基-3甲基戊二酰辅酶a还原酶hmg2基因表达的启动子，其表达仅限于分生组织和花(柱头的分泌区、成熟的花粉粒、雌蕊维管组织和受精的胚珠)组织(参见，例如，enjuto(1995)plantcell.7:517-527)。来自玉米和表现分生组织特异性表达的其他物种的kn1相关的基因也是可用的，参见例如，granger(1996)plantmol.biol.31:373-378；kerstetter(1994)plantcell6:1877-1887；hake(1995)philos.trans.r.soc.lond.b.biol.sci.350:45-51。例如，拟南芥knat1启动子(参见，例如，lincoln(1994)plantcell6:1859-1876)。
技术人员将认识到组织特异性的启动子可能会驱动目标组织以外的组织中可操作地连接的序列的表达。因此，如本文中所用的组织初始的启动子是优先驱动靶组织中的表达的组织，但也可能引起在其他组织中的一些表达。
在另一个实施方案中，通过转座因子表达编码samp(例如，hs肽)的多核苷酸。这允许组成性活性多肽的组成性的，但周期性的和不频繁的表达。本公开还提供了使用来源于病毒的组织特异性的启动子，包括例如，烟草花叶病毒亚基因组启动子(kumagai(1995)proc.natl.acad.sci.usa92:1679-1683；水稻东格鲁杆状病毒(rtbv)，其仅在受感染水稻植物的韧皮部细胞中复制，其启动子驱动较强的韧皮部特异的报道基因表达；木薯叶脉花叶病毒(cvmv)启动子，其在维管元件、叶肉细胞和根尖中具有最高的活性(verdaguer(1996)plantmol.biol.31:1129-1139)。
在另一实施方案中，本公开提供了包含本公开的(例如，如本文描述的)表达盒的表达载体。
vii.植物
在一些实施方案中，植物是柑橘属植物。在一些实施方案中，柑橘属植物是橙树、柠檬树、青柠树或葡萄柚树。在一个实施方案中，柑橘属植物是脐橙、瓦伦西亚橙、甜橙、柑橘(mandarinorange)或酸橙。在一个实施方案中，柑橘属植物是柠檬树。在一个实施方案中，柑橘属植物是青柠树。在一些实施方案中，植物是柑橘属植物的亲缘植物，如月橘(orangejasmine)、青柠莓(limeberry)和枳橙。在一些实施方案中，植物是马铃薯植物。
在一些实施方案中，本公开提供了包含表达盒的植物(或植物细胞、种子、花、叶、果实或来自这些植物的其他植物部分或来自这些植物的加工的食品或食品成分)，所述表达盒包含可操作地与编码本公开(例如，如本文中描述的)samp(例如，hs肽)的多核苷酸连接的启动子。在一些实施方案中，植物具有降低的ubc表达或活性和/或增加的pi转运蛋白表达或活性。
实施例
实施例1–抗微生物samp基因的表达
通过定量rt-pcr检测易感hlb的和耐受hlb的植物中samp的表达水平。将柑橘属肌动蛋白的表达水平用作内部对照。相比其相应的hlb敏感型近亲属，在来自完全不同的地理和遗传背景的两种不同的耐受/抵抗hlb的品种(印度酸桔(cleopatramandarin)(宽皮柑橘)和枳us942的杂交种，以及澳沙檬杂交种)中，samp的表达水平更高(图1a和图1b)。
实施例2–samp在抑制茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum)感染中的效果
茄科植物本氏烟草(nb)通常用于抗病原体感染的基因功能研究。nb可以通过滋生茄科候选韧皮部杆菌阳性的马铃薯木虱而被茄科候选韧皮部杆菌感染，其是一种与马铃薯zc病和柑橘属hlb高度相似的病理系统。使用nb/马铃薯木虱/茄科候选韧皮部杆菌病理系统测试了两种samp，cghsampa和cghsampb(分别为seqidno:1和2，其为来自澳洲沙漠青柠(citrusglauca)与柑橘属物种(citrussp.)杂交的杂交种)的效应。在大肠杆菌(e.coli)中表达并纯化了cghsampa和cghsampb肽。通过茎注射用30μm的cghsampa或cghsampb肽或模拟溶液处理茄科候选韧皮部杆菌感染的nb植物。图3a中的照片是在处理3周后采集的。图3a表明，用samp处理的被感染植物比接受模拟处理的植物能够生长得好得多。图3b和图7进一步表明，与用模拟溶液处理的植物相比，用cghsampa和cghsampb肽处理的植物具有低得多的细菌滴度。结果证明，来自抵抗/耐受性的柑橘属根茎的两种samp显著控制了nb植物中茄科候选韧皮部杆菌的滴度并促进植物生长。
实施例3–经主干递送所递送的samp的效应
我们已经测试了使用主干递送方法对hlb阳性的柑橘属植物进行了有效的samp处理，并且所有处理过的树的细菌滴度都大大降低了，降至约1/30-1/100。在处理过的树中未检测到细菌。来自处理过的树的所有新芽和叶子都不再有症状，并且来自模拟处理过的植物的新芽和叶子仍然具有黄色斑块症状(图4)。
实施例4–samp在抑制马铃薯和番茄中的茄科候选韧皮部杆菌(ca.l.solanacearum)感染中的效果
我们也对c.lso感染的马铃薯进行了有效的samp处理。病害症状被明显抑制，且块茎产量增加。(图5)
我们还测试了samp对c.lso感染的番茄的有效性，并且病害症状也大幅减轻。(图6)
实施例5–samp在柑橘属植物中的效果
通过用5％南方银甲基化种子油(mso)经叶喷施来将samp施用到1年龄籽苗上。处理后，通过qrt-pcr用泛素基因作为内部对照评估了防御反应标记基因cspr1、cspr2和capal的长达7天的表达水平。图8a-图8c表明，samp引发了柑橘属植物具有增加的防御反应标记基因表达。
此外，将不同浓度的samp溶液渗入甜橙叶中。用30μm处理未观察到细胞死亡。图9a和图9b表明，samp对柑橘属叶子具有较低的植物毒性活性。
此外，mrna表达分析(图10)证明，samp在已经被人类食用了数百年的澳洲指橘、澳洲沙漠青柠、柠檬和枳(普通根状茎)的果实中高度表达。
实施例6–samp的蛋白酶消化
图11表明，samp对人蛋白酶胃蛋白酶(一种主要的胃酶)敏感。在37℃下，用于10mmhcl中的0.4％的胃蛋白酶溶液孵育20μg的samp。用18％sds-page凝胶分析反应，并用考马斯蓝染色可视化。samp在45分钟内被完全消化。
实施例7–samp的稳定性
将samp在室温(rt)下孵育24小时，在60℃下孵育24小时或在100℃下孵育20分钟。随后，将samp用于活力/细胞毒性测定。通过将107个细胞/ml的新月韧皮杆菌与预处理samp或仅作为模拟处理的缓冲液一起孵育2小时来进行测定。然后将样品用dmao(绿色)和ethd-iii(橙色)染色，其分别代表活细胞和死细胞。图12表明，samp在高达100℃的温度下是稳定的。
此外，为了研究samp在柑桔属植物中的稳定性，于室温下将20μg的samp与200μg新鲜的柑桔属溶解产物一起在1xpbs缓冲液中孵育。用18％sds-page凝胶分析反应，并用考马斯蓝染色可视化。图13表明，samp在柑橘属细胞溶解产物中是稳定的，这表明它们在树中也是稳定的。
实施例8–samp的另外的抗微生物活性
测试了samp对其他革兰氏阴性细菌病原体的抗微生物活性。具体地，通过琼脂扩散测定法验证了对丁香假单胞菌和根癌农杆菌的活性，分别为图14a和图14b。每个测定都是通过在具有细菌的培养基上施加10μlsamp来完成的，其中samp的浓度分别为丁香假单胞菌100μm和根癌农杆菌150μm。将培养板在28℃下孵育，并在24小时后观察。没有细菌生长的环证实了抗微生物活性。
另外，将samp在4℃下孵育24小时，在rt下孵育24小时或在60℃下孵育24小时。随后，将samp用于活力/细胞毒性测定。通过通过用预处理的samp或仅作为模拟处理的缓冲液将107个细胞/ml的根癌农杆菌孵育2小时来进行测定。然后将样品用dmao(绿色)和ethd-iii(橙色)染色，其分别代表活细胞和死细胞。图15表明，samp是稳定的，并且在高达60℃的温度下具有对根癌农杆菌的抗微生物活性。
在不脱离本公开的范围的情况下，可以将来自本文中描述的任何实施方案的或附图中的一个或多个特征与附图中的本文中描述的任何其他的实施方案的一个或多个特征组合。
在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，就如各个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入本文。尽管出于清楚理解的目的，已经通过图示和实例的方式对前述公开进行了一定程度的详细描述，但是根据本公开的教导，对于本领域普通技术人员来说易于显而易见的是，可以对其进行某些改变和变化，而不脱离所附权利要求的精神或范围。
1.分离的稳定的抗微生物肽(samp)，其包含与seqidno:1-13和35-37中的任一个的序列基本上相同的序列。
2.如权利要求1所述的分离的samp，其中所述肽包含与seqidno:1-13和35-37中的任一个的序列具有至少75％的序列同一性的序列。
3.如权利要求2所述的分离的samp，其中所述肽包含与seqidno:1和2中的任一个的序列具有至少75％的序列同一性的序列。
4.分离的稳定的抗微生物肽(samp)，其包含序列
x1gx2x3vsx4enx5x6qgfx7hx8fex9tfx10sx11egx12aeyx13x14hpx15hvex16anx17x18lx19x20lekx21lx22x23dykpx24tx25rv(seqidno:27)，
其中x1是r、k或w；x2是k或e；x3是n或d；x4是t或i；x5是l、f或r；x6是h或q；x7是p或t；x8是i、l或v；x9是s或f；x10是e或d；x11是t或l；x12是v或i；x13是v或i；x14是s、a或d；x15是s、a或v；x16是y或f；x17是l或t；x18是f、m或l；x19是a、p或t；x20是n或q；x21是v或f；x22是v或i；x23是v或i；x24是t、e或q；并且x25是v、e、l。
5.如权利要求4所述的分离的samp，其中x1是r；x2是k；x3是n；x4是i；x5是l；x6是h；x10是e；x11是t；x12是v；x13是v；x16是y；x17是l；x18是f；x19是a；x20是n；x21是v；x22是v，x23是i；并且x24是t。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的samp，其中所述分离的samp是热稳定的(hs)肽。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的samp，其中所述分离的samp是在植物提取物和/或植物溶解产物中稳定的。
8.农业组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的分离的samp。
9.如权利要求8所述的农业组合物，其还包含以下中的至少一种：除草剂、除草剂安全剂、表面活性剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、植物激活剂、增效剂、植物生长调节剂、驱虫剂、杀螨剂、软体动物杀灭剂或肥料。
10.核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的分离的samp。
11.细胞，其包含权利要求10所述的核酸分子。
12.如权利要求11所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
13.植物，其包含权利要求1-7中任一项所述的分离的samp或权利要求10所述的核酸分子。
14.如权利要求13所述的植物，其中所述植物是柑橘属植物。
15.如权利要求13所述的植物，其中所述植物是茄属植物。
16.转基因植物，其包含原位突变的稳定的抗微生物肽(samp)，所述抗微生物肽(samp)包含至少一个氨基酸取代，所述氨基酸取代对应于如seqidno:27中所示的位置x1至x25中的任何一个处的氨基酸，其中所述突变的samp为所述转基因植物提供了病害抗性或病害耐受性。
17.如权利要求16所述的转基因植物，其中所述病害是韧皮杆菌属(liberibacter)病害。
18.如权利要求16所述的转基因植物，其中所述病害是农杆菌属(agrobacterium)或丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)病害。
19.如权利要求16所述的转基因植物，其中所述韧皮杆菌属病害是黄龙病(hlb)。
20.如权利要求16或17所述的转基因植物，其中所述samp是热稳定的(hs)肽。
21.表达盒，其包含与编码权利要求1-7中任一项所述的分离的samp的多核苷酸可操作地连接的启动子，其中在植物中引入所述表达盒导致植物具有增强的病害抗性或病害耐受性。
22.如权利要求21所述的表达盒，其中所述病害是韧皮杆菌属病害。
23.如权利要求21所述的表达盒，其中所述病害是农杆菌属或丁香假单胞菌病害。
24.如权利要求22所述的表达盒，其中所述韧皮杆菌属病害是hlb。
25.如权利要求21所述的表达盒，其中所述启动子对于所述多核苷酸是异源的。
26.如权利要求21或25所述的表达盒，其中所述启动子是可诱导的。
27.如权利要求21或25所述的表达盒，其中所述启动子是组织特异性的启动子。
28.如权利要求27所述的表达盒，其中所述组织特异性的启动子是韧皮部特异的启动子。
29.如权利要求28所述的表达盒，其中韧皮部特异的启动子是蔗糖转运蛋白suc2启动子。
30.转基因植物，其包含权利要求21-29中任一项所述的表达盒，其中所述植物相比缺少所述表达盒的对照植物具有增强的病害抗性或病害耐受性。
31.如权利要求30所述的转基因植物，其中所述病害是韧皮杆菌属病害。
32.如权利要求30所述的转基因植物，其中所述病害是农杆菌属或丁香假单胞菌病害。
33.如权利要求31所述的转基因植物，其中所述韧皮杆菌属病害是hlb。
34.如权利要求16或30所述的转基因植物，其中所述植物是柑橘属植物。
35.如权利要求16或30所述的转基因植物，其中所述植物是茄属植物。
36.预防或治疗植物病害的方法，其包括使所述植物与权利要求1-7中任一项所述的分离的samp或权利要求8或9所述的农业组合物接触。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述病害是韧皮杆菌属病害。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述病害是农杆菌属或丁香假单胞菌病害。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述韧皮杆菌属病害是hlb。
40.预防或治疗植物中的由韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属(pseudomonas)细菌引起的细菌感染的方法，其包括使所述植物与权利要求1-7中任一项所述的分离的samp或权利要求8或9所述的农业组合物接触。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述韧皮杆菌属是候选韧皮部杆菌属(candidatusliberibacter)。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述韧皮杆菌属细菌是新月韧皮杆菌(liberibactercrescens)。
43.如权利要求36所述的方法，其中将所述分离的samp或农业组合物注射至所述植物的主干中。
44.如权利要求36所述的方法，其中将所述分离的samp或农业组合物注射至所述植物的茎中。
45.如权利要求36所述的方法，其中将所述分离的samp或农业组合物经叶喷施至所述植物上，或通过滴灌至根部而施用于所述植物，或通过激光烧蚀而施用于所述植物。
46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其中所述细菌感染引起马铃薯斑马片病害。
47.预防或治疗植物中的韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属病害的方法，其包括在所述植物中引入权利要求21-29中任一项所述的表达盒。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述韧皮杆菌属病害是hlb。
49.预防或治疗植物中的由韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属细菌引起的细菌感染的方法，其包括在所述植物中引入权利要求21-29中任一项所述的表达盒。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述韧皮杆菌属是候选韧皮部杆菌属。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述韧皮杆菌属细菌是新月韧皮杆菌。
52.产生具有增强的韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属病害抗性或者韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属病害耐受性的植物的方法，包括：
在多株植物中引入权利要求1-7中任一项所述的分离的samp或权利要求21-29中任一项所述的表达盒；以及
从所述多株植物中选择包含所述分离的samp或表达所述多核苷酸的植物。
53.产生具有增强的韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属病害抗性或者韧皮杆菌属、农杆菌属或假单胞菌属病害耐受性的植物的方法，包括向所述植物的多核苷酸中引入突变，其中突变的多核苷酸编码权利要求1-7中任一项所述的分离的samp。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述引入原位发生在植物细胞的基因组中。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述引入包括成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/cas基因组编辑。
56.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述植物抵抗或耐受韧皮杆菌属细菌引起的细菌感染。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述韧皮杆菌属是候选韧皮部杆菌属。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述韧皮杆菌属细菌是新月韧皮杆菌。
59.如权利要求52-58中任一项所述的方法，其中所述韧皮杆菌属病害是hlb。
60.如权利要求36-55中任一项所述的方法，其中所述植物是柑橘属植物。
61.如权利要求36-55中任一项所述的方法，其中所述植物是茄属植物。
技术总结