相关申请
本申请要求2017年10月27日提交的美国临时申请号62/577,932和2018年6月21日提交的美国临时申请号62/687,905的权益，其全部内容通过引用并入本文并用于所有目的。
序列表
写于文件053151-503001wo_sequence_listing_st25.txt中的序列表(创建于2018年10月25日，5,694字节，机器格式ibm-pc，ms-windows操作系统)通过引用并入本文。
背景技术：
对于许多恶性肿瘤，死亡率源自广泛转移，例如向骨转移。骨转移还与严重的发病率、疼痛和功能障碍有关。目前尚无单一或组合的治疗方法可有效地降低发病率或治愈骨转移。
前列腺癌(pc)是影响全世界男性的最常见的癌症之一，其具有很强的骨转移倾向，传统治疗方法难以治疗(1)。目前，晚期pc不可治愈，导致显著的疾病发病率和死亡率(2)。骨转移开始于肿瘤细胞向骨扩散、粘附骨髓细胞、渗透/侵入骨髓至矿物质基质以及生长微转移病灶(3)。骨骼中癌细胞的定殖(colonization)受到多种因素的调节，这些因素决定了癌细胞与骨髓(特别是成骨细胞和破骨细胞)结合和交流的程度，而成骨细胞和破骨细胞是肿瘤骨塑建(bonemodeling)的两个主要成分(4)。了解影响这一多步过程和相关信号通路的分子因素对于设计抑制和治疗骨转移的有效疗法仍然至关重要。
技术实现要素：
鉴于前述，需要预防和治疗癌症的骨转移的改进方法。本公开提供了解决此需求并同时提供附加益处的方法和组合物。
在一些方面，本公开提供了一种预防患癌受试者中向骨转移的方法。在一些方面，本公开提供了一种治疗患癌受试者的骨转移的方法。在实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的包含mda-7/il-24蛋白的组合物。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为成熟蛋白。在实施方式中，施用包括向所述受试者的骨骼施用。在实施方式中，癌症为前列腺癌。在实施方式中，前列腺癌包含癌细胞，相对于正常前列腺细胞，所述癌细胞的mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加。在实施方式中，组合物还包含mcl-1抑制剂，例如bi-97d6。在实施方式中，该组合物还包含磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂，例如ly294002。在实施方式中，有效量为对原代骨髓细胞或正常原代人前列腺上皮细胞基本上无毒的量。在实施方式中，有效量为抑制破骨细胞分化的量。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少90％序列同一性(例如，至少95％序列同一性)的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白能够活化受试者癌细胞的il-20/il-22受体复合物。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了一种组合物。在实施方式中，组合物包含mda-7/il-24蛋白并包含mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为成熟蛋白。在实施方式中，组合物包含mcl-1抑制剂(例如，bi-97d6)。在实施方式中，组合物包含pi3k抑制剂(例如，ly294002)。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少90％序列同一性(例如，至少95％序列同一性)的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白能够活化癌细胞的il-20/il-22受体复合物。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。在实施方式中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在实施方式中，组合物用于预防或治疗患癌受试者的骨转移。在实施方式中，癌症为前列腺癌。在实施方式中，前列腺癌包含癌细胞，相对于正常前列腺细胞，所述癌细胞的mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加。
在一些方面，本公开提供了本文所述的组合物在药物生产中的用途。在实施方式中，药物用于预防或治疗患癌受试者的骨转移。在实施方式中，药物根据本文所述的方法使用。
在一些方面，本公开提供了一种试剂盒。在实施方式中，试剂盒包含本文所述的mda-7/il-24蛋白并包含本文所述的mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。
附图说明
图1a显示了用于产生有his标签的mda-7/il-24蛋白的示例方法的示意图。
图1b显示了证实mda-7/il-24蛋白产生的示例蛋白质印迹。
图1c是显示了通过mtt测定法测量mda-7/il-24蛋白对pc3-ml细胞增殖的影响的示例结果的柱状图。这些结果表明，mda-7/il-24蛋白显著抑制细胞增殖。
图1d显示了一个示例蛋白质印迹，显示了相对于未经处理的对照(“对照”)，用mda-7/il-24蛋白处理的细胞(“mda-7”)中的下游mda-7/il-24信号级联分子p27、beclin-1和bip/grp78的表达上调。ef1α表示上样对照。
图1e是显示了用不同前列腺癌细胞(一式三份)进行的集落形成测定的示例结果的柱状图，其比较了用mda-7/il-24蛋白处理的细胞(“mda-7”)和未经处理的对照(“对照”)。大约铺板200个细胞，用his-mda-7/il-24处理，处理后2周，用结晶紫染色。计数集落数量并绘制数据。数据表示两次独立实验的平均值±标准差；**，p<0.01；***，p＜0.001vs对照。
图2a-e显示了mda-7/il-24蛋白的抗转移活性和对破骨细胞分化的抑制。图2a提供了显示体内骨转移测定(评估his-mda-7对骨转移发展的影响)的示例结果的图像，其中，经处理的小鼠(“mda-7”)每周两次接受5mg/kg的his-mda-7蛋白，持续3周(每组n＝5)。图2b是定量图2a的小鼠中荧光素酶强度的柱状图。图2c是显示mda-7/il-24蛋白处理对患癌小鼠存活的增强作用的示例存活图。数据表示两个独立实验的平均值±标准差：**，p<0.01vs对照。图2d和2e是比较对照和经mda-7/il-24处理的小鼠的骨髓细胞中的破骨细胞数量(d)和破骨细胞活性(e)的柱状图。每组重复五次，数据表示两次独立实验的平均值±标准差；*，p<0.05；***，p＜0.001vs对照。
图3a-c显示了mda-7/il-24蛋白对raw264.7细胞中信号级联反应的示例影响。细胞未经处理(“c”)或经指定试剂处理。试剂包括：mda-7/il-24蛋白(“mda-7”；10μg/ml)、核因子κb配体的受体激活剂(“rankl”；100ng/ml)、ly294002(“ly”；10μmol/l)和编码akt的组成型活性形式的质粒(“myr-akt”)。磷酸化-gsk3β(phosphor-gsk3β)、nfatc1和mcl-1的表达随组成型活性akt的过表达而增加，经his-mda-7处理后磷酸化-gsk3β、nfatc1和mcl-1的表达则受到抑制。ef1α用作上样对照。
图4a-d显示了his-mda-7和bi-97d6在前列腺癌向骨转移和破骨细胞分化中的组合作用。图4a提供的图像显示了体内骨转移测定(评估his-mda-7和bi-97d6的作用)的示例结果。图4b是图4a所示成像小鼠的荧光素酶强度的柱状图，一式三份进行定量。该图显示，mda-7/il-24处理的动物中的荧光素酶强度受到显著抑制。bi-97d6的加入进一步增强了mda-7/il-24对骨转移发展的抑制作用。图4c和4d是比较对照和处理小鼠的骨髓细胞中破骨细胞数量(c)和破骨细胞活性(d)的柱状图。破骨细胞用trap染色试剂盒染色，破骨细胞活性使用tracp酶分析试剂盒进行测量。每组重复四次。数据表示两次独立实验的平均值±标准差；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p＜0.001vs对照。
图5a-e显示了akt表达对前列腺癌骨转移的影响以及对mda-7/il-24和破骨细胞分化的响应。图5a显示了示例蛋白质印迹，其比较了对照pc3-ml细胞(“c”)和稳定过量表达ca-akt的pc3-ml细胞(“pc3-mlakt”)中的磷酸化-akt表达。图5b提供了显示体内骨转移测定的示例结果的图像，显示akt的组成型活化降低了mda-7/il-24蛋白对前列腺癌的骨转移的抑制作用。图5c是图5b所示成像的小鼠的荧光素酶强度的柱状图。图5d和5e是比较对照和处理小鼠的骨髓细胞中的破骨细胞活性(d)和破骨细胞数量(e)的柱状图。收集来自小鼠的骨髓细胞，诱导5×105个细胞的破骨细胞分化。数据表示两次独立实验的平均值±标准差；*，p<0.05；***，p＜0.001vs对照。
图6是通过调节骨微环境，mda-7/il-24介导的对前列腺癌衍生骨转移进展的抑制的示例示意图。
图7是显示了接受各种剂量的mda-7/il-24蛋白和/或bi-97d6的小鼠的体内骨转移测定的示例结果的图像。小鼠接受pc3-mlluc细胞(1×105)的心内注射，并且如所示地，在用或不用bi-97d6(1.5mg/kg，i.p.)处理的情况下用重组mda-7蛋白(i.v.)处理(两者共6剂，研究时长为3周)。小鼠通过
图8提供了说明mda-7/il-24对正常原代小鼠骨髓细胞的作用的细胞图像。分离来自小鼠骨髓的原代细胞，在mda-7/il-24蛋白的存在下进行培养。进行活-死(细胞)测定，捕获图像，显示了mda-7/il-24对原代骨髓细胞无影响。
图9a-c显示了mda-7/il-24蛋白对破骨细胞分化的示例作用。图9a提供了在不含mda-7/il-24蛋白(“对照”)或存在10μg/ml的mda-7/il-24蛋白(“mda-7”)的情况下，被诱导破骨细胞分化的正常小鼠骨髓细胞的图像。图9b-c是比较对照和经处理小鼠的骨髓细胞中的破骨细胞数量(b)和破骨细胞活性(c)的柱状图。5天后，通过trap染色试剂盒对分化的破骨细胞进行染色，一式三份地测量破骨细胞活性。在his-mda-7处理的细胞中，破骨细胞数量显著减少。同样，在his-mda-7处理的细胞中，tracp酶促活性显著更低。
图10a-c显示了mda-7/il-24蛋白对破骨细胞基因调控模式和raw264.7细胞和du-145细胞生长的示例影响。图10a显示了trap、组织蛋白酶k(ctsk)和降钙素r(ctr)基因的表达水平的柱状图，其通过rq-pcr测量经mda-7/il-24蛋白(10μg/ml)或rankl(100ng/ml)中的一种或两种处理5天后分离出的rna(与未经处理的对照细胞相比)。图10b-c提供了与未经处理的对照相比，经mda-7/il-24蛋白处理的raw264.7细胞(b)和du-145细胞(c)的增殖测定结果的柱状图。将2000个细胞铺在96孔板中(一式四份)，用his-mda-7(10μg/ml)处理，5天后进行mtt分析。数据表示两次独立实验的平均值±标准差；**，p<0.01；***，p<0.001vs对照。
图11a-c是分别显示了图3a-3c中所示结果的p-akt/akt、p-gsk3β/gsk3β、nfatc1/ef1α和mcl-1/ef1α的光密度定量的柱状图(n＝3)。通过非配对t检验进行统计分析。a.p＜0.05，vs对照；b.p＜0.05，vsrankl(a)、ly(b)和myr-akt(c)；ns＝不显著。
图12a-b是显示了mcl-1抑制剂和mda-7/il-24蛋白对破骨细胞分化的示例作用的柱状图。图12a显示了两种mcl-1抑制剂(bi-97c1和bi-97d6)的结果。收集小鼠的骨髓细胞，在指定剂量的抑制剂存在或不存在的情况下，诱导5×105个细胞进行破骨细胞分化(一式四份)。图12b显示了经mda-7/il-24和/或bi-97d6处理的被诱导破骨细胞分化的原代骨髓细胞的结果。数据表示两次独立实验的平均值±标准差；*，p<0.05；***，p＜0.001vs对照。
图13a-b是显示了akt和mcl-1表达对破骨细胞分化的示例作用的柱状图。图13a显示了与未经处理的对照组相比，当分离小鼠骨髓中的原代细胞并在mcsf(10ng/ml)和rankl(100ng/ml)的存在下进行培养(一式三份)并用mda-7/il-24蛋白(10μg/ml)和/或指定量的pi3k抑制剂ly294002进行处理时，所得破骨细胞数量。图13b显示了raw264.7细胞中的破骨细胞活性(一式三份地测量)，其中所述raw264.7细胞被组成型akt(ca-akt)、显性阴性akt(dn-akt)或mcl-1过表达质粒(mcl1)稳定转染并被诱导经历破骨细胞分化。
图14显示了示例蛋白质印迹，其显示了与对照细胞(“c”)相比，在过表达akt的稳定pc3-ml细胞(“cl.1”和“cl.2”)中的下游信号传导级联。克隆1(“cl.1”)显示出p-akt、p-gsk3β和cyclin-d1表达的显著上调。
图15是接受心内注射pc3-ml荧光素酶细胞(1×105)且未经mda-7/il-24蛋白处理(对照)或经6剂的mda-7/il-24蛋白(5mg/kg)处理的小鼠的图像。小鼠通过
具体实施方式
尽管在此示出和描述了本发明的各种实施方式和方面，但对本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式和方面仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在能想到许多变型、改变和替换。应理解，本文所述的本发明的实施方式的各种替代方案可用于实施本发明。
本文所用章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和专论，其全部内容通过引入明确并入本文以用于任何目的。
定义
除非另有定义，否则本文中所用技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。参见例如，singleton等,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，第二版，j.wiley&sons(纽约,ny1994)；以及，sambrook和green,molecularcloning:alaboratorymanual,第4版(2012)。类似或等同于本文所述的那些的方法、装置和材料可用于实施本发明。提供以下定义以促进对本文中经常使用的某些术语的理解，以下定义并不旨在限制本公开的范围。
如本文所用，术语“约”指包括指定值的值的范围，本领域普通技术人员会认为该范围合理地类似于指定值。在实施方式中，术语“约”指在使用本领域通常可接受的测量的标准偏差内。在实施方式中，“约”指扩展到指定值的 /-10％的范围。在实施方式中，“约”指指定值。
应注意，除非上下文另外明确指出，在本说明书和所附权利要求中，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数个(种)所指对象。还应注意的是，权利要求书可被撰写为排除任何可选的要素。因此，此说明旨在为如下用词提供支持：权利要求中的与权利要求构成要素有关的排他性术语的陈述(诸如“单独”、“仅”等)，或“负面”限制的使用，诸如“其中[具体特征或要素]缺失”或“除了[具体特征或要素]”或“其中[具体特征或要素]不存在(包括在内，等)……”。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸低聚物”、“寡核苷酸”、“核酸序列”、“核酸片段”和“多核苷酸”可互换使用，并且旨在包括但不限于共价连接在一起的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸可具有各种长度，为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物、衍生物或修饰物。不同的多核苷酸可具有不同的三维结构，可执行各种已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括：基因，基因片段，外显子，内含子，基因间dna(包括但不限于异染色质dna)，信使rna(mrna)，转移rna，核糖体rna，核糖酶(ribozyme)，cdna，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，分离的序列dna，分离的序列rna，核酸探针和引物。可用于本公开方法的多核苷酸可包含天然核酸序列及其变体、人工核酸序列或此类序列的组合。多核苷酸可包含一个以上经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。可在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰(如果存在)。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。
术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和r基团连接的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methioninemethylsulfonium)。此类类似物具有修饰的r基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构但以与天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”指在自然界中不存在的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
本文中氨基酸可用它们公知的三字母符号或iupac-iub生化命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可用它们普遍接受的单字母代码来表示。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指任何长度的氨基酸残基的聚合物。该聚合物可为直链或支链，它可包含修饰的氨基酸，并且可被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，例如与标记组分缀合。“融合蛋白”指编码两个以上不同的蛋白序列的嵌合蛋白，其重组表达为单个部分。
在两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“同一的”或“同一性”百分数指：使用具有下文所述默认参数的blast或blast2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查测量，两个以上的序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应时，在指定区域具有约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)(参见例如ncbi网站www.ncbi.nlm.nih.gov/blast等)。在实施方式中，“基本上同一”的序列具有至少80％、90％、95％、99％或更高的同一性。在核酸的情况下，同一性百分比也可指或可应用于检测序列的互补序列。如下所述，优选算法可解决空位(gap)等。在实施方式中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为50个至100个氨基酸或核苷酸的区域上。
“序列同一性的百分比”通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定；其中，与参考序列相比(不包含添加或缺失)，比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失，以实现两个序列的最佳比对。百分比计算如下：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位点数以得到匹配位点的数量，用匹配位点的数量除以比较窗口(例如，相对于参考序列)中的位点总数，然后将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。确定序列同一性的程序是本领域技术人员已知的，包括但不限于：blast(如上所述，可选地使用默认参数)、needleman-wunsch算法(例如参见www.ebiac.uk/tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上的embossneedlealigner，可选地使用默认设置)。
术语“mda-7”、“il-24”或“mda-7/il-24”指具有mda-7活性的蛋白质(包括同系物、同种型及其功能片段)。该术语包括维持mda-7活性(例如，与野生型mda-7相比，活性为至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)的mda-7的任何重组或天然存在形式或其变体、同系物或同种型。在实施方式中，该变体、同系物或同种型在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)中与天然存在的mda-7蛋白具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施方式中，mda-7蛋白与登录号np_006841识别的蛋白(或与其具有实质同一性(substantialidentity)的变体或同系物)基本上相同。在实施方式中，mda-7蛋白与uniprotq13007识别的蛋白(或与其具有实质同一性的变体或同系物)基本上相同。在实施方式中，il-24基因与refseq(mrna)nm_006850中列出的核酸序列(或与其具有实质同一性的变体或同系物)基本上相同。在实施方式中，il-24基因与ensembl参考号ensg00000162892中列出的核酸序列(或与其具有实质同一性的变体或同系物)基本上相同。在实施方式中，氨基酸序列或核酸序列是在提交本申请时已知的序列。在实施方式中，蛋白质是mda-7的成熟形式，mda-7的成熟形式中缺失该蛋白质的前体形式n-末端的信号序列。成熟形式可从含有信号序列的前体形式翻译后产生，或者可直接从编码成熟形式的多核苷酸翻译而来，而没有相对于成熟mda-7的信号序列n端。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：2或保持mda-7活性的seqidno：2的变体、同系物或同种型。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3或保持mda-7活性的seqidno：3的变体、同系物或同种型。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白不包含seqidno：2的前49个氨基酸。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：4或保持mda-7活性的seqidno：4的变体、同系物或同种型。
本领域技术人员将认识到，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或氨基酸序列的小百分比的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体是本公开的多态变体、种间同系物和等位基因的补充，并且不排除本公开的多态变体、种间同系物和等位基因。以下八个组各自包含彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(a)，甘氨酸(g)；
2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；
3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；
4)精氨酸(r)，赖氨酸(k)；
5)异亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，蛋氨酸(m)，缬氨酸(v)；
6)苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)；
7)丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；以及
8)半胱氨酸(c)，蛋氨酸(m)
(参见例如creighton,proteins(1984))
某些氨基酸可代替蛋白质结构中的其他氨基酸而不会明显丧失杀肿瘤作用。由于蛋白质的生物学功能活性是由蛋白质的相互作用能力和性质所决定，可在蛋白质序列中(当然也可在其dna编码序列中)进行某些氨基酸取代，但仍可获得具有类似特性的蛋白质。因此预期，可对本公开的多肽序列或编码所述多肽的相应dna序列进行各种改变，同时至少保留它们的一些生物活性。可通过各种技术(例如本文实施例中所述测定法)来评估此种生物活性。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“经纯化的”指该核酸或蛋白质基本上不含在天然状态或全细胞裂解物中与之结合的一种以上其他细胞成分。例如，它可为均质状态或与一种以上其他化合物混合，也可为干燥或水溶液形式。mda-7/il-24蛋白可从细胞裂解物中纯化出，然后与一种以上其他试剂(例如，mcl-1抑制剂和/或pi3k抑制剂)组合。这样，包含经纯化的mda-7/il-24蛋白的组合物可包含除mda-7/il-24蛋白之外的化合物，但通常缺乏存在于裂解液或培养基(从中最初分离出mda-7/il-24蛋白)中的一种或多种杂质或存在于裂解液或培养基(从中最初分离出mda-7/il-24蛋白)中的一种或多种杂质有所减少。纯度和均质性(homogeneity)通常使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定。制剂中存在的主要种类的蛋白质是基本上经纯化的。
如本文所用，术语“癌症”指在哺乳动物(例如人)中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括：白血病、淋巴瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)和肉瘤。可用本文提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包括：脑癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、头癌、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤。可用本文提供的化合物或方法治疗的示例性癌症包括：甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌和子宫癌。其他实例包括：甲状腺癌、胆管癌、胰腺癌、皮肤黑色素瘤、结肠腺癌、直肠腺癌、胃腺癌、食道癌、头颈部鳞状细胞癌、乳腺浸润癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶性皮肤病、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓样恶性上皮肿瘤、黑色素瘤、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌或前列腺癌。在实施方式中，癌症为向骨转移的癌症。在实施方式中，癌症为前列腺癌，例如前列腺癌衍生的骨转移。
如本文所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可互换使用，指增殖性疾病或病症(例如癌症)从一个器官或另一非相邻器官或身体部位的扩散。“转移性癌症”也称为“iv期癌症”。癌症发生在起源部位(例如前列腺)，该部位称为原发性肿瘤，例如原发性前列腺癌。原发性肿瘤或起源部位中的某些癌细胞具有穿透和浸润局部区域的周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统壁或血管系统壁、通过系统循环到身体的其他部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二种临床上可检测的肿瘤称为转移性肿瘤或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的那些相似。因此，如果前列腺癌向骨转移，则骨部位的继发性肿瘤由异常前列腺细胞而非异常骨细胞组成。骨中的继发性肿瘤称为转移性骨癌。因此，短语“转移性癌症”指受试者患有或曾经患有原发性肿瘤并患有一种以上继发性肿瘤的疾病。短语“非转移性癌症”或患有非转移性癌症的受试者指：受试者患有原发性肿瘤但未患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌指患有原发性肺部肿瘤或具有原发性肺部肿瘤的病史并且在第二个位置或多个位置(例如在骨中)患有一种以上继发性肿瘤的受试者中的疾病。
术语“破骨细胞分化”和“破骨细胞形成”指破骨细胞前体(祖细胞)从造血室中募集，然后增殖并向成熟破骨细胞分化的过程。在此多步分化过程中，有丝分裂后的破骨细胞前体会逐渐表达破骨细胞相关标志物，例如组织蛋白酶k、mmp-9、降钙素受体和抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)，同时失去它们的某些巨噬细胞特性。然后，单核破骨细胞融合在一起形成多核的巨细胞。破骨细胞终末分化最终得到活性破骨细胞(bone-resorbingcell)。一旦形成，破骨细胞可称为大型破骨细胞，其通常特征在于几个核(例如，多达几十个)，或包含很少核(例如，少至三个)的小型破骨细胞。
如本文所用，“受试者”可为哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在实施方式中，受试者是人。在实施方式中，受试者是患有或可能患有本文所述的癌症(例如转移性癌症)的哺乳动物(例如，人)。在实施方式中，受试者是有患本文所述的癌症(例如转移性癌症)的风险的哺乳动物(例如人)。
如本文所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”广泛地包括用于在受试者的病症中获得有益或期望结果(包括临床结果)的任何方法。有益或期望的临床结果可包括但不限于：减轻或改善一种以上症状或病症，减轻疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态，延缓或减慢疾病进展，改善或减轻疾病状态，减少疾病复发以及部分或全部缓解以及可检测或不可检测的缓解。换言之，本文所用的“治疗”包括疾病的任何治愈或改善。治疗可缓解疾病的症状、完全或部分消除疾病的根本原因、缩短疾病的持续时间或这些的结合。在癌症的情况下，治疗可包括减缓、停止或逆转癌细胞的增殖(例如，如在肿瘤的生长中，通过肿瘤大小或其变化率来测量)。
如本文所用，“预防”指患者中一种以上疾病症状的发生或发生率的降低。预防可为完全(无可检测症状)或部分预防，使得观察到的症状少于缺少治疗时可能出现的症状。预防包括预防性治疗。
治疗期的长度取决于多种因素，例如病情的严重程度、患者的年龄、活性剂的浓度、用于治疗的组合物的活性或它们的组合。还应理解，用于治疗或预防的药剂的有效剂量可在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。剂量变化可通过本领域已知的标准诊断测定法得到并变得明显。在某些情况下，可能需要长期施用。例如，将组合物以足以治疗患者的量和持续时间施用于受试者。在实施方式中，施用本公开的组合物既治疗受试者的癌症(例如，转移性骨癌)，又预防进一步的疾病系统(例如，骨转移瘤)。
本文所述的组合物可与已知可用于治疗癌症的其他活性剂(例如抗癌剂)彼此组合使用。“抗癌剂”按照其普通的普通含义使用，指具有抗肿瘤性质或抑制癌细胞生长或增殖能力的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在实施方式中，抗癌剂是化学治疗剂。在实施方式中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中有用的药剂。在实施方式中，抗癌剂是经fda或美国以外国家的类似监管机构批准的用于治疗癌症的药剂。
如本文所用，术语“施用”涵盖向受试者口服施用、作为栓剂施用、局部接触施用、静脉内施用、腹膜内施用、肌内施用、病灶内施用、鞘内施用、鼻内施用或皮下施用，或植入缓释装置(例如微型渗透泵)。施用可通过任何途径进行，包括肠胃外和经粘膜施用(例如，颊部施用、舌下施用、腭部施用、牙龈施用、鼻施用、阴道施用、直肠施用或经皮施用)。肠胃外施用包括：例如，静脉内施用、肌内施用、小动脉内(intra-arteriole)施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、心室内施用和颅内施用。其他递送方式包括但不限于：脂质体制剂的使用、静脉内输注、透皮贴剂等。“共同施用”指本文所述的组合物与一种以上其他疗法(例如，癌症疗法，如化学疗法、激素疗法、放射疗法或免疫疗法)同时施用、在其之前或之后立即施用。本发明的化合物可单独施用或可共同施用给患者。共同施用旨在包括单独或组合化合物(一种以上化合物)的同时或顺序施用。因此，视需要，制剂也可与其他活性物质(例如以减少代谢降解)组合。在实施方式中，“施用”蛋白质或包含蛋白质的组合物指，施用蛋白质本身(例如，mda-7/il-24蛋白质)而非编码该蛋白质的多核苷酸。
“有效量”是与不存在该化合物时相比，足以使化合物实现所述目的(例如，达到它所施用的效果、治疗疾病、降低酶活性、增加酶活性、减少信号通路或减少疾病或病症的一种以上症状)的量。“有效量”的实例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的症状的量，也可称为“治疗有效量”。症状的“减轻”(及此短语的语法等价形式)指减轻症状的严重程度或频率，或消除症状。药物的“预防有效量”是当施用于受试者时具有预期的预防效果的药物的量，例如，预防或延迟损伤、疾病、病理或病症的发作(或复发)，或减少损伤、疾病、病理或病状或其症状发作(或复发)的可能性。完全预防作用不一定通过一次剂量施用而发生，可能仅在一系列剂量施用后才发生。因此，可施用一次以上来施用预防有效量。如本文所用，“活性降低量”指相对于不存在拮抗剂而降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所用，“功能破坏量”指相对于不存在拮抗剂而破坏酶或蛋白质的功能所需的拮抗剂的量。确切的量将取决于治疗的目，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如lieberman,pharmaceuticaldosageforms(1-3卷，1992)；lloyd,theart,scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding(1999)；pickar,dosagecalculations(1999)；以及remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第20版,2003,gennaro,ed.,lippincott,williams&wilkins)。
对于本文所述的任何化合物，治疗有效量可由细胞培养实验初始确定。如使用本文所述的方法或本领域已知方法所测量的，目标浓度将是能够实现本文所述的方法的活性化合物的那些浓度。
如本领域众所周知，还可由动物模型确定用于人类的治疗有效量。例如，可配制用于人的剂量以达到已发现对动物有效的浓度。如上所述，可通过监测化合物的有效性并向上或向下调节剂量来调节用于人类的剂量。基于上述方法和其他方法调整剂量以在人类中获得最大功效完全在普通技术人员的能力范围内。
如本文所用，如上所述，术语“治疗有效量”指足以减轻疾病的治疗剂的量。例如，对于给定参数，治疗有效量将显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。治疗功效也可表示为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量相对于对照可具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的效果。
剂量可根据患者和所用化合物的需要而变化。在本公开的情况下，给患者施用的剂量应足以随时间变化在患者中产生有益的治疗反应。剂量的大小也将由任何不良副作用的存在、性质和程度决定。确定用于特定情况的适当剂量在从业者的技术范围内。通常，以少于化合物最佳剂量的较小剂量开始治疗。此后，以小增量增加剂量，直到达到特定情况下的最佳效果。剂量和间隔可单独调节，以提供对所治疗的特定临床适应症有效的施用化合物的水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相称的治疗方案。
如本文所用，“组合协同量(combinedsynergisticamount)”指产生协同效应(即大于叠加效应的效应)的第一量(例如，mda-7/il-24重组蛋白的量)和第二量(例如，mcl-1的量)之和。因此，本文可互换使用的术语“协同作用(synergy)”、“协同作用(synergism)”、“协同的”、“组合协同量”和“协同治疗作用”指组合施用的化合物的测量作用，其中该测量作用大于每个化合物单独作为单一药剂施用的单独作用的总和。
在实施方式中，当与第二量(例如，mcl-1抑制剂)分开使用时，组合协同量为第一量(例如，mda-7/il-24蛋白)的量的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％％、82％％、83％％、84％％、85％％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在实施方式中，当与第一量(例如，mda-7/il-24蛋白)分开使用时，组合协同量为第二量(例如，mcl-1抑制剂)的量的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6，4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6，9.7％、9.8％、9.9％、10.0％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31，32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如本文所述，关于蛋白质-抑制剂相互作用的术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”等指相对于不存在抑制剂时蛋白质的活性或功能，负面地影响(例如降低)蛋白质的活性或功能。在实施方式中，抑制指相对于不存在抑制剂时蛋白质的浓度或水平，负面地影响(例如降低)蛋白质的浓度或水平。在实施方式中，抑制指疾病或疾病症状的减轻。在实施方式中，抑制指特定蛋白质靶标的活性降低。因此，抑制包括至少部分地、部分地或完全地阻断刺激，减少、防止或延迟激活，或使信号转导或酶活性或蛋白质的量失活、脱敏或下调。在实施方式中，抑制指由于直接相互作用(例如，抑制剂与靶蛋白结合)导致的靶蛋白活性的降低。在实施方式中，抑制指由于间接相互作用(例如，抑制剂与激活靶蛋白的蛋白结合，从而阻止靶蛋白的激活)引起的靶蛋白活性的降低。“mcl-1抑制剂”包括相对于不存在抑制剂时mcl-1信号通路中涉及的mcl-1或信号通路成分(例如蛋白质，基因)的活性或功能，负面地影响(例如降低)mcl-1的活性或功能或mcl-1信号通路中涉及的其他信号通路组分(例如蛋白质、基因)的化合物。在实施方式中，mcl-1抑制剂是直接结合并抑制mcl-1活性的试剂。
如本文所用，术语“信号通路”指细胞组分和可选的细胞外组分(例如蛋白质、核酸、小分子、离子、脂质)之间的一系列相互作用，其将一个组分的改变传达给一个以上其他组分，这些组分继而可将改变传达给另外的组分，改变可选地传播到其他信号路径组分。例如，mcl-1与本文所述的化合物(例如，mcl-1抑制剂)的结合可降低mcl-1催化的反应产物的水平或该产物的下游衍生物的水平，或该结合可减少mcl-1或mcl-1反应产物与下游效应子或信号通路组分之间的相互作用，从而导致细胞生长、增殖或存活的变化。
术语“抑制剂”、“阻遏物”或“拮抗剂”或“下调剂”可互换地指能够可检测地降低给定基因或蛋白质的表达或活性的物质。与不存在拮抗剂的对照相比，拮抗剂可使表达或活性降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些情况下，表达或活性比不存在拮抗剂时的表达或活性低1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或低更多。
术语“药学上可接受的盐”指包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于本文所述的化合物上发现的特定取代基。当本公开的化合物包含相对酸性的官能度(functionality)时，可通过使这种化合物的中性形式与纯的或在合适的惰性溶剂中的足够量的所需碱接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括：钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本公开内容的化合物包含相对碱性的官能度时，可通过使这种化合物的中性形式与纯的或在合适的惰性溶剂中的足够量的所需酸接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括：衍生自无机酸的那些，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等；以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，有机酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等。还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及有机酸(如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐(参见例如，berge等,“pharmaceuticalsalts”,journalofpharmaceuticalscience,1977,66,1-19)。本公开的某些特定化合物同时包含碱性和酸性官能度，其允许化合物转化成碱加成盐或酸加成盐。
本公开的化合物可以以盐形式存在，例如与药学上可接受的酸一起存在。本公开包括此类盐。此类盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、丙酸盐、酒石酸盐(例如( )-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或它们的混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐和与氨基酸(例如谷氨酸)的盐和季铵盐(例如碘甲烷、碘乙烷等)。这些盐可通过本领域技术人员已知的方法来制备。
优选地，通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物，来再生化合物的中性形式。化合物的母体形式在某些物理性质(例如在极性溶剂中的溶解度)方面可能与各种盐形式不同。
除盐形式外，本公开还提供前药形式的化合物。本文所述的化合物的前药是在生理条件下容易经历化学变化从而提供本公开的化合物的那些化合物。本文所述的化合物的前药可在施用后在体内转化。此外，前药可在离体环境中(例如当与合适的酶或化学试剂接触时)通过化学或生化方法转化为本公开的化合物。
本公开的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并涵盖在本公开的范围内。本公开的某些化合物可以多种结晶形式或无定形形式存在。通常，所有物理形式对本公开所预期的用途是等同的，并旨在落入本公开的范围内。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”指有助于活性剂向受试者施用并被受试者吸收的物质，并且可被包含在本公开的组合物中而不会对患者产生明显的不良毒理作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括：水、nacl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液(lactatedringer’s)、生理蔗糖、生理葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如林格氏液)、醇、油、明胶、碳水化合物(例如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和色素等。可对此类制剂进行灭菌，视需要，可将此类制剂与不会与本公开的化合物发生有害反应的辅助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香族物质等)混合。本领域技术人员将认识到，其他药物赋形剂可用于本公开。
术语“制剂”旨在包括具有包封材料作为载体的活性化合物的制剂，该制剂提供胶囊，在胶囊中具有或不具有其他载体的活性成分被载体包围，因此与之缔合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、散剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合口服的固体剂型。
可选地，药物制剂为单位剂型。以此种形式，将制剂细分为包含适当量的活性成分的单位剂量。单位剂型可为包装的制剂，该包装包含离散量的制剂，例如小瓶或安瓿中的包装的片剂、胶囊和散剂。同样，单位剂型本身可为胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂，或者它可为适当数量的包装形式的任何这些。单位剂型可为冷冻分散体。
方法
在各个方面，本公开提供了预防患癌受试者的骨转移的方法，以及治疗患癌受试者的骨转移的方法。在实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的包含mda-7/il-24蛋白的组合物。在施用之前，受试者的癌症可能已经转移或可能未转移。在实施方式中，在尚未检测到骨转移的受试者中预防骨转移。在实施方式中，受试者患有一种以上骨转移，预防向骨转移包括预防进一步的骨转移。在实施方式中，受试者患有一种以上骨转移，治疗骨转移包括减缓、停止或逆转一种以上此类转移的生长。在实施方式中，所述受试者处于发展转移性癌症的风险中或处于发展另外的骨转移的风险中；相对于在没有此种预防的情况下的风险或预期发生率而言，预防向骨转移包括降低此类转移的风险或发生率。
在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为重组产生的蛋白。有多种产生重组蛋白的方法。非限制性实例包括体外翻译和在宿主细胞中产生。在实施方式中，用于产生重组蛋白的宿主细胞表达编码该蛋白或其前体的多核苷酸。此类多核苷酸可被瞬时转染到宿主细胞中(例如，通过质粒或病毒载体)，或者可被稳定地整合到宿主细胞的基因组中。有多种合适的宿主细胞。在实施方式中，宿主细胞是永生化的人胚胎初级星形胶质细胞(im-phfa，immortalizedprimaryhumanfetalastrocyte)。
在实施方式中，产生mda-7/il-24蛋白包括用包含编码mda-7/il-24蛋白的多核苷酸的病毒转染宿主细胞。在实施方式中，病毒是腺病毒。可使用多种合适的腺病毒。可用于产生mda-7/il-24蛋白的腺病毒的非限制性实例包括wo2018089995a1、wo2017062708a1、us20180243382a1、us20160008413a1和dash等,cancerres2014；74:563-74中描述的那些。
在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。可使用多种纯化方法，这些纯化方法部分地取决于生产方法。例如，如果使用宿主细胞且宿主细胞未分泌蛋白质，则纯化可包括裂解宿主细胞以释放蛋白质的步骤。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白由宿主细胞分泌，纯化可包括不进行细胞裂解的纯化。纯化方式还将取决于所产生蛋白质的性质。例如，宿主细胞产生的mda-7/il-24蛋白可包含其他成分，例如有助于纯化的蛋白标签(例如，his、flag或ha标签)。蛋白质标签有助于使用可粘附至底物的同源结合伴侣(例如，在his标签的情况下为镍)进行纯化。在实施方式中，在给受试者施用之前，对最初用纯化标签产生的mda-7/il-24蛋白进行处理以除去标签。在实施方式中，由宿主细胞产生的mda-7/il-24蛋白不包含纯化标签。在这种情况下，纯化可包括使用与mda-7/il-24蛋白结合的试剂(例如，粘附于底物的抗体)进行纯化。在实施方式中，纯化包括除去mda-7/il-24蛋白以外的培养基或裂解物的组分。例如，可将裂解物或细胞悬液离心，产生细胞或细胞碎片的沉淀，将上清液分离到不同的容器中，从而通过分离此类细胞或细胞碎片来纯化mda-7/il-24蛋白。
在实施方式中，mda-7/il-24蛋白保留生物活性。作为细胞因子和il-10细胞因子基因家族的成员，mda-7/il-24通过由r1型受体和r2型受体(il-20r1和il-20r2；il-22r1和il-20r2)组成的受体二聚体或由两个r1型受体(il-20r1和il-22r1)组成的独特受体对天然地发出信号，以激活下游信号传导事件。测量此类活性的测定法是可获得的(参见例如wo2018089995a1)。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为保留seqidno：2或seqidno：3的mda-7/il-24蛋白的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多的生物活性的变体、同系物或同种型。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白保留seqidno：3的mda-7/il-24蛋白的至少80％的生物活性。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白保留seqidno：3的mda-7/il-24蛋白的至少90％的生物活性。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白能够活化受试者的癌细胞或参考细胞系(例如du-145细胞)的il-20/il-22受体复合物。
在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为包含信号序列的前体蛋白。例如，mda-7/il-24蛋白可包含seqidno：2的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：2具有至少80％、85％、90％、95％或更高同一性的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白由seqidno：2的多肽组成或基本上由seqidno：2的多肽组成。
在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为成熟的mda-7/il-24蛋白。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少80％、85％、90％、95％或更高同一性的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白由seqidno：3的多肽组成或基本上由seqidno：3的多肽组成。
在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为保留生物活性的截短形式的mda-7/il-24蛋白。例如，mda-7/il-24蛋白可能缺失seqidno：3的前54个氨基酸。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含seqidno：4。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：4具有至少80％、85％、90％、95％或更高同一性的氨基酸序列。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白由seqidno：4的多肽组成或基本上由seqidno：4的多肽组成。
在实施方式中，施用包含mda-7/il-24蛋白的组合物包括向靶组织(例如肿瘤)、手术切除肿瘤的部位和/或受试者的骨施用。在实施方式中，向靶组织施用包括注射到靶组织中或邻近靶组织注射，或局部施用于靶组织。在实施方式中，将组合物远端递送至靶组织，但组合物被配制为将mda-7/il-24蛋白运输至靶组织。在实施方式中，运输到特定组织(例如癌组织和/或骨组织)的部分与mda-7/il-24蛋白复合。可直接与靶标部分复合，例如mda-7/il-24蛋白与靶标部分之间的共价或非共价相互作用。复合可为间接的，使得mda-7/il-24蛋白和靶标部分被一个以上通过共价或非共价相互作用将两者结合的其他分子隔开。通常，靶标部分是能够以比一种或多种非靶标生物实体(例如，一种或多种不同组织的细胞表面成分)更高的亲和力结合生物实体(例如，膜成分、细胞表面受体、细胞特异性膜抗原等)或以其他方式与生物实体(例如，膜成分、细胞表面受体、细胞特异性膜抗原等)缔合的部分。靶标部分通常可使货物(例如，mda-7/il-24蛋白)定位在特定靶标部位上的程度高于在受试者体内其他部位，或者与不存在靶标部分的情况相比以更高的程度定位在特定的靶标位置处。靶标部分的非限制性实例包括：抗体、抗原结合抗体片段、适体、肽、激素、生长因子、配体(例如受体配体)、小分子等。us20120028350a1、us20160052968a1、us20040038946a1和us20180208650a1中描述了向骨运输的靶标部分的说明性实例。
在实施方式中，施用包括超声靶向的微泡破坏(utmd)，从而允许将mda-7/il-24蛋白定向递送至靶组织。例如，本公开的组合物可与微泡复合、静脉内施用，然后通过在靶组织上施加超声而在靶组织处释放。us20180243382a1提供了微泡递送技术的说明性实例。
在实施方式中，治疗或预防了多种癌症中任何一种的骨转移。一些癌症具有向骨转移的更高倾向。实例包括但不限于：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌和甲状腺癌。在实施方式中，癌症为前列腺癌。各种基因表达标志物可用于区分癌细胞与非癌细胞、一种组织的癌症与另一种组织的癌症，以及转移性癌症与非转移性癌症。在实施方式中，癌症为相对于正常前列腺细胞(例如参考前列腺细胞系或患有前列腺癌的受试者的非癌性前列腺细胞)，mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加的前列腺癌。
在实施方式中，包含mda-7/il-24蛋白的组合物还包含一种以上其他试剂，或与一种以上其他试剂共同施用。在实施方式中，一种以上其他试剂为akt抑制剂、mcl-1抑制剂或它们的组合。在实施方式中，一种以上其他试剂为磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂、mcl-1抑制剂或它们的组合。在实施方式中，其他试剂为pi3k抑制剂(例如，ly294002)。在实施方式中，其他试剂为mcl-1抑制剂(例如，bi-97d6)。
可获得多种akt抑制剂，其可细分为几类。第一类包含akt的atp竞争性抑制剂，包括抑制akt2和akt1的化合物，例如cct128930和gdc-0068。此类别还包括泛akt激酶抑制剂，例如gsk2110183(afuresertib)、gsk690693和at7867。第二类包含基于脂质的akt抑制剂，其通过抑制pi3k的pip3产生而起作用。磷脂酰肌醇类似物(例如calbiochemakt抑制剂i、ii和iii)或其他pi3k抑制剂(例如px-866)采用这种机制。此类别还包括例如perifosine(krx-0401)(aeternazentaris/keryx)的化合物。第三类包含称为假底物(pseudosubstrate)抑制剂的一组化合物。这些包括例如aktide-2t和foxo3杂化物的化合物。第四类由akt激酶结构域的变构抑制剂组成，包括例如mk-2206(8-[4-(1-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-2h-[1,2,4]三唑[3,4-f][1,6]萘啶-3-酮；二盐酸盐)的化合物(merck&co.)(参见例如，美国专利号7,576,209)。第五类包括抗体，例如gst-抗akt1-mts。第六类包括与akt的ph结构域相互作用的化合物，包括曲西立滨(triciribine)和px-316。充当akt抑制剂的其他化合物包括：例如，gsk-2141795(glaxosmithkline)、vqd-002、米替福新(miltefosine)、azd5363、gdc-0068、rx-0201(反义寡核苷酸)、pbi-05204、sr13668和api-1。
可获得多种pi3k抑制剂，其中一些如上所述。其他实例包括但不限于：渥曼青霉素(pi3k的不可逆抑制剂)、脱甲绿胶酶素(渥曼青霉素的衍生物)、ly294002(pi3k的可逆抑制剂)；bkm120(布帕利司(buparlisib))、艾拉利司(idelalisib)(pi3kδ抑制剂)、度维利司(duvelisib)(ipi-145，pi3kδ和pi3kγ的抑制剂)、阿培利司(alpelisib)(byl719，α特异性pi3k抑制剂)、tgr1202(也称为rp5264，口服pi3kδ抑制剂)、考泮利司(copanlisib)(bay80-6946，pi3kα、pi3kδ抑制剂)、bez235、rp6530、tgr1201、sf1126、ink1117、gdc-0941、xl147(sar245408)、xl765(sar245409)、palomod529、gsk1059615、zstk474、pwt33597、ic87114、tg100-115、cal263、rp6503、pi-103、gne-477、cudc-907、aezs-136、gdc-0980和gdc-0032。在实施方式中，pi3k抑制剂是ly294002。
多种mcl-1抑制剂是可获得的。mcl-1抑制剂的非限制性实例包括：bi97c10、bi112d1、棉子酚(at-101，ascentatherapeutics)、奥巴妥拉(obatoclax)(gx15-070，cephalon)、mg-132、mim1、sabutoclax(bi97c1，oncothyreon)和tw-37。varadarajan等(celldeathdiffer.2013nov；20(11):1475–1484),tanaka等(jmedchem56(23):9635-9645(2013)),friberg,等(jmedchem56(1):15-30(2013))、us20150045357a1、us20150051249a1、us20130035304a1、us20090054402a1和us20110112112a1中公开了mcl-1抑制剂的其他实例。在实施方式中，mcl-1抑制剂是bi-97d6。
在实施方式中，有效量为有效预防或治疗骨转移的组合物的量。在实施方式中，有效量包括对原代骨髓细胞或正常原代人前列腺上皮细胞基本上无毒的组合物(或其组分，例如mda-7/il-24蛋白)的量。在实施方式中，当化合物的量相对于不存在该化合物时诱导的细胞死亡没有增加时，或化合物的量相对于不存在该化合物时诱导的细胞死亡的任何增加小于20％、15％、10％、5％或更低时，该化合物的量对原代骨髓细胞是基本上无毒的。例如，毒性作用可使用市售的活-死细胞染色实验产品来测量。
在实施方式中，有效量包括抑制破骨细胞分化的量的组合物(或其组分，例如mda-7/il-24蛋白)的量。在实施方式中，抑制破骨细胞分化包括：分化为破骨细胞的骨髓细胞的数量减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％或更多。在实施方式中，骨髓细胞向破骨细胞的分化减少至少25％。例如，可通过比较培养中经处理的细胞和未经处理的细胞，或通过比较来自经处理受试者的骨髓样品中的破骨细胞数量与未经处理受试者的相当的骨髓样品中的破骨细胞数量，来测量对破骨细胞分化的影响。本文描述了用于测量对破骨细胞分化的影响(包括对破骨细胞数量的影响和对破骨细胞活性的影响)的实验的实例。
在实施方式中，向受试者施用的mda-7/il-24蛋白的量为至少0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg中的一种以上剂量。在实施方式中，向受试者施用的mda-7/il-24蛋白的量为0.5mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至10mg/kg或2.5mg/kg至7.5mg/kg的一种以上剂量。在实施方式中，向受试者施用的mda-7/il-24蛋白的量为约5mg/kg。在实施方式中，有效量以单次施用或以多个剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或更多剂量)施用。多个剂量可以以规则或不规则的时间间隔来施用，例如每周一次以上(例如，每周2、3、4、5或多次)、每几周一次(例如，每周或每2、3、4、5或更多周一次)，或每几天一次(例如每天或每2、3、4、5或更多天一次)。在实施方式中，以一定间隔施用所述组合物，直到获得期望的治疗结果(例如，一段时间内不存在骨转移)。
在实施方式中，向受试者施用包含一定量mcl-1抑制剂(例如，bi-97d6)的组合物，例如至少约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.25mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg的抑制剂。在实施方式中，向受试者施用0.1mg/kg至5mg/kg、0.2mg/kg至3mg/kg或0.5mg/kg至2mg/kg。在实施方式中，所述组合物包含约1.5mg/kg剂量的mcl-1抑制剂。在实施方式中，mcl-1抑制剂与mda-7/il-24蛋白分开施用，但遵循相同的剂量方案。
组合物
在各个方面，本发明提供了用于本文所述的方法或通过本文所述方法生产的组合物，以及用于制造用于本文所述方法的药物的组合物，包括关于上述各种实施方式中的任何一个。本公开的组合物可包含本文所述的任何一个或多个成分。在实施方式中，本公开提供了用于预防患癌受试者的骨转移的组合物，以及用于治疗患癌受试者的骨转移的组合物。
在实施方式中，组合物包含mda-7/il-24蛋白和一种以上mcl-1抑制剂、akt抑制剂或pi3k抑制剂。在实施方式中，所述组合物包含mda-7/il-24蛋白并包含mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为本文所述的mda-7/il-24蛋白，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，akt抑制剂是本文所述的akt抑制剂，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，pi3k抑制剂是本文所述的pi3k抑制剂(例如，ly294002)，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，mcl-1抑制剂是本文所述的mcl-1抑制剂(例如，bi-97d6)，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，该组合物是药物组合物。在实施方式中，该组合物包含药学上可接受的赋形剂。
试剂盒
在各个方面，本公开提供了用于本文所述的任何方法中的试剂盒，包括关于上述各种所述实施方式中的任何一种。在实施方式中，试剂盒包含一种以上本文所述的组合物。试剂盒的成分可以以任何量和/或组合(例如，在同一试剂盒或同一容器中)提供。在一些实施方式中，试剂盒包含用于根据本文所述方法的其他试剂。在实施方式中，试剂盒包含mda-7/il-24蛋白并包含mcl-1抑制剂、akt抑制剂或pi3k抑制剂中的一种以上。在实施方式中，试剂盒包含mda-7/il-24蛋白并包含mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。在实施方式中，mda-7/il-24蛋白为本文所述的mda-7/il-24蛋白，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，akt抑制剂是本文所述的akt抑制剂，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，pi3k抑制剂是本文所述的pi3k抑制剂(例如，ly294002)，例如关于本公开的各种方法。在实施方式中，mcl-1抑制剂是本文所述的mcl-1抑制剂(例如，bi-97d6)，例如关于本公开的各种方法。
序列
seqidno：1(编码mda-7/il-24蛋白的核苷酸序列)
atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccagacccttctgccctcctttgctggcgacagcctctcaaatgcagatggttgtgctcccttgcctgggttttaccctgcttctctggagccaggtatcaggggcccagggccaagaattccactttgggccctgccaagtgaagggggttgttccccagaaactgtgggaagccttctgggctgtgaaagacactatgcaagctcaggataacatcacgagtgcccggctgctgcagcaggaggttctgcagaacgtctcggatgctgagagctgttaccttgtccacaccctgctggagttctacttgaaaactgttttcaaaaactaccacaatagaacagttgaagtcaggactctgaagtcattctctactctggccaacaactttgttctcatcgtgtcacaactgcaacccagtcaagaaaatgagatgttttccatcagagacagtgcacacaggcggttcctgctattccggagagcatttaaacagttggacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacattcttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga
seqidno：2(mda-7/il-24蛋白的氨基酸序列)
mnfqqrlqslwtlarpfcppllatasqmqmvvlpclgftlllwsqvsgaqgqefhfgpcqvkgvvpqklweafwavkdtmqaqdnitsarllqqevlqnvsdaescylvhtllefylktvfknyhnrtvevrtlksfstlannfvlivsqlqpsqenemfsirdsahrrfllfrrafkqldveaaltkalgevdilltwmqkfykl
seqidno：3(mda-7/il-24蛋白的氨基酸序列)
qgqefhfgpcqvkgvvpqklweafwavkdtmqaqdnitsarllqqevlqnvsdaescylvhtllefylktvfknyhnrtvevrtlksfstlannfvlivsqlqpsqenemfsirdsahrrfllfrrafkqldveaaltkalgevdilltwmqkfykl
seqidno：4(mda-7/il-24蛋白的氨基酸序列)
escylvhtllefylktvfknyhnrtvevrtlksfstlannfvlivsqlqpsqenemfsirdsahrrfllfrrafkqldveaaltkalgevdilltwmqkfykl
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，根据本文所述的实施例和实施方式，本领域技术人员可以联想到各种变型或变化，并且这些变型或变化将被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文以用于所有目的。
实施例
实施例1：重组mda-7/il-24抑制前列腺癌的骨转移
前列腺癌(pc)是男性中癌症相关发病率的主要原因。尽管局部pc患者的5年存活率接近100％，但转移后存活率急剧下降。骨是弥散性pc细胞定殖的优选部位，改变骨稳态的平衡导致骨弱且脆。当前，尚无有疗效的方法可用于pc骨转移。尚未研究经纯化的mda-7/il-24重组蛋白在pc或转移中的治疗特性。
在本实施例中，检测了作为重组蛋白递送的mda-7/il-24的抗癌特性。使用骨转移实验模型，与对照组相比，用重组mda-7/il-24处理的动物在其股骨具有显著更少的转移病灶。mda-7/il-24对骨转移的抑制作用是由于pc选择性杀伤和对破骨细胞分化(其在骨吸收中起作用)的抑制。获得功能和丧失功能的遗传方法表明，促存活的akt和mcl-1通路在mda-7/il-24的抗骨转移活性中至关重要。mcl-1小分子抑制剂与mda-7/il-24协同作用，并诱导稳健的抗骨转移活性。这些结果扩展了mda-7/il-24作为抗癌分子的潜在应用，并在临床前动物模型中证明了经纯化的重组蛋白是无毒的且对骨转移具有很强的抑制作用，并且当与mcl-1抑制性小分子组合使用可进一步增强此抑制作用。
细胞系、质粒和mcl-1抑制剂：如先前描述地，培养pc细胞系pc3的转移变体pc3-ml(20)。该细胞系用于在无胸腺雄性裸鼠中产生pc诱导的骨转移。du-145、pc3、rwpe-1(永生化的正常人前列腺上皮细胞)和raw264.7细胞(鼠巨噬细胞)细胞获自atcc(美国模式培养物保藏所，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，并按照厂商的建议进行保存。arcap-e和arcap-m细胞系和特定培养基购自novicurebiotechnology(美国阿拉巴马州伯明翰)。对于破骨细胞分化测定，使用了raw264.7细胞系。如先前描述地，培养和保存永生化的人胚胎初级星形胶质细胞(im-phfa)(21)。所有来自atcc和其他供应商的细胞系均在2012年至2016年期间购买，并使用str(短串联重复序列)分析进行了验证。实验用早期传代细胞来进行。使用支原体检测试剂盒(sigma-aldrich,inc.，美国密苏里州圣路易斯)常规地监测细胞的污染(包括支原体)。myr-akt、dn-akt和mcl-1质粒来自addgene(美国马萨诸塞州坎布里奇)。ly294002是磷脂酰肌醇3-激酶(pi3激酶)的抑制剂，购自sigma-aldrich,inc.(美国密苏里州圣路易斯)。如先前描述地，合成和评估mcl-1抑制剂即bi-97d6化合物(22,23)，并由mauriziopellecchia博士(加州大学河滨分校，加利福尼亚州)提供。bi-97d6抑制bh3肽与bcl-2、bcl-xl和mcl-1的结合(22)。
重组his-mda-7蛋白的纯化：使用公开的方案，用ad.5-his-mda-7感染im-phfa细胞(24)。将细胞上清液与ni-nta(镍-次氮基三乙酸)酸浆液混合，以使mda-7/il-24与ni-nta磁珠结合。孵育24小时后，收集、洗涤ni-nta磁珠，在咪唑缓冲液中洗脱纯化的mda-7/il-24蛋白。使用抗mda-7抗体(genhuntercorporation，美国田纳西州那什维尔)通过westernblotting验证该蛋白。通过mtt测定法检查pc3-ml细胞的生物活性(25)。
mtt细胞增殖和克隆测定：如先前所述地，进行细胞增殖测定(25)。简言之，将2,000个细胞接种在96孔板的各个孔中，使其贴附过夜。用存在或不存在不同浓度的mda-7/il-24蛋白的完全培养基处理细胞。在适当的时间点，用mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯基溴化四唑)试剂进一步孵育细胞。最后，用dmso溶解蓝色的盐，测量560nm下的od(25)。为测定长期作用，如先前所述地进行了集落形成(克隆)测定(26)。简言之，将200个细胞铺板，在存在或不存在mda-7/il-24的情况下生长另外15天。每周一次用含有mda-7/il-24蛋白的新鲜培养基更换培养基，总共两次。
体内转移研究：所有动物研究均由机构动物护理和使用委员会(弗吉尼亚联邦大学)批准。对于实验性骨转移测定，通过心内途径对6至8周龄的雄性无胸腺裸鼠(购自美国harlan)注射1×105个稳定表达萤火虫荧光素酶基因的pc3-ml细胞。对于测定mda-7/il-24蛋白的治疗活性，在植入细胞一天后，小鼠接受静脉注射重组蛋白(5mg/kg)。用治疗剂对动物进行总共6次处理(前3周每周2次)。在组合治疗研究中，分别通过尾静脉和腹膜内途径递送mda-7/il-24蛋白(5mg/kg)和bi-97d6(1.5mg/kg)。使用
实时q-pcr：使用qiagen(美国加利福尼亚州瓦伦西亚)的rna分离试剂盒从细胞分离总rna。使用taqman探针和appliedbiosystems(美国加利福尼亚州福斯特市)的预混液进行rq-pcr。使用graphpadprism软件分析数据。
活-死细胞测定：按照制造商的说明，用活/死染色试剂(invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)染色后，通过共聚焦激光显微镜(zeiss，德国)观察活细胞和死细胞。通过zeiss软件分析图像。
westernblotting：遵循标准方案进行westernblotting测定(24，27)。使用的主要抗体为pakt、akt、pgsk3β、gsk3β、nfatc1、cyclind1(cellsignalingtechnology，美国马萨诸塞州丹佛斯)和ef1α(abcam，英国剑桥)。合适的二抗购自sigma-aldrich,inc.(美国密苏里州圣路易斯)。
破骨细胞形成测定：使用先前所述的方案，诱导骨髓细胞进行破骨细胞分化(28)。简言之，将骨髓细胞在含有10％胎牛血清和mcsf(10ng/ml)的最小必需培养基(α-mem)中培养24小时。随后将它们用rankl(100ng/ml)处理5天。对培养的细胞进行固定并进行trap(抗酒石酸盐的酸性磷酸酶)染色。按照试剂盒(sigma-aldrich,inc.，美国密苏里州圣路易斯)提供的特定方案进行trap染色。在明场显微镜下，对认为是分化的破骨细胞的多核细胞进行手动计数。按照制造商的说明(r&d，美国明尼苏达州明尼阿波利斯)来进行tracp酶法测定。
统计分析：使用graphpadprism软件进行统计分析。使用学生t检验比较两组之间的平均差异。
重组mda-7/il-24选择性抑制pc细胞生长：如图1a所示，使用如上所述的基于his的蛋白质纯化系统对重组mda-7/il-24进行纯化。纯化后，使用抗mda-7抗体通过westernblotting确认了纯化蛋白的质量(图1b)。为确认生物活性，用mda-7/il-24蛋白处理pc3-ml细胞，分别通过mtt测定法和westernblotting分析评估抗增殖和潜在的分子变化(图1c和1d)。在mda-7/il-24处理后，细胞增殖显著受损(图1c)。观察到p27、grp78和beclin-1水平显著增加(图1d)，这与使用腺病毒递送mda-7/il-24的研究一致(25)。接下来，为评估mda-7/il-24对细胞增殖的长期影响，在各种pc细胞系中进行了集落形成(克隆)分析。图1e所示的结果表明，mda-7/il-24蛋白显著降低了pc细胞的增殖而未影响永生化的正常人原代前列腺上皮细胞(rwpe-1)的增殖能力。
重组mda-7/il-24减少体内pc骨转移：使用实验性转移模型，检测重组mda-7/il-24蛋白抑制pc骨转移的用途。在该模型中，将稳定表达荧光素酶的pc3-ml细胞通过心内途径注射到雄性无胸腺裸鼠中，产生骨转移。通过
mda-7/il-24抑制rankl诱导的破骨细胞分化：为测定用治疗剂处理或未经处理的荷瘤动物中的破骨细胞活性，从股骨中分离出骨髓细胞，通过实验诱导破骨细胞分化。与对照组相比，经mda-7/il-24处理的动物的破骨细胞显著减少。这通过计数破骨细胞的数量(图2d)来量化，并且也测量了tracp破骨酶活性(图2e)。这些初步结果表明mda-7/il-24在调节破骨细胞分化中的潜在功能。
为研究mda-7/il-24对破骨细胞分化的影响，在存在或不存在mda-7/il-24蛋白的情况下，分离无胸腺裸鼠的骨髓细胞并用rankl诱导分化。rankl诱导后五天，通过计数多核细胞来测量破骨细胞的分化。在光学显微镜下对trap阳性染色的细胞和多核细胞进行定量(图9a)。与对照相比，经mda-7/il-24处理的组的破骨细胞数量及其活性显著降低(图9b-c)。为提供有关这种抑制作用的分子观察，我们使用小鼠巨噬细胞系raw264.7，其与rankl孵育后可被诱导分化为破骨细胞(32)。使用raw264.7细胞，监测与破骨细胞分化相关的不同遗传标记(33)。用rankl或mda-7/il-24单独处理或组合处理raw264.7细胞。处理5天后分离出rna，用实时pcr定量trap、组织蛋白酶k(ctsk)和降钙素受体(ctr)基因的表达。rankl诱导trap、ctsk和ctr基因的表达。添加mda-7/il-24蛋白减弱了rankl诱导的对这些基因的调节(图10a)。这些数据证实了mda-7/il-24可介导rankl诱导的破骨细胞分化的抑制的假设。进行mtt测定以确定mda-7/il-24是否引起此细胞系的任何生长抑制。raw264.7的增殖不受mda-7/il-24的影响，进一步说明了该细胞因子的肿瘤特异性(图10b)。du-145(pc)细胞用作阳性对照(图10c)。
mda-7/il-24调节小鼠巨噬细胞中的akt信号传导：为了在我们的模型系统中确定mda-7/il-24蛋白是否对akt激活产生任何影响，在存在或不存在rankl的情况下，用mda-7/il-24蛋白对raw264.7细胞进行处理。观察到rankl诱导raw264.7细胞中akt激活，此激活的akt受到mda-7/il-24蛋白抑制(图3a和11a)。该数据表明akt抑制在mda-7/il-24介导的破骨细胞分化下调中的可能作用。还在涉及nfat、mcl-1和akt的信号级联中研究了pi3k激酶抑制剂(ly294002)对akt的抑制作用(图3b和11b)。该数据说明了由rankl和mda-7/il-24介导的akt通路相关基因的细胞信号传导。
还检测了akt的组成型活性形式(myr-akt)。用myr-akt转染细胞，用mda-7/il-24对细胞进行处理。如图3c和11c所示，mda-7/il-24处理显著抑制了mcl-1表达，而mcl-1表达通过组成型活性akt(myr-akt)的过表达得以挽救。这些结果说明了akt在破骨细胞分化中mda-7/il-24介导的抑制中的作用。
mcl-1抑制剂(bi-97d6)与mda-7/il-24协同抑制pc骨转移：在通过心内途径注射pc3-ml细胞的雄性无胸腺裸鼠(作为骨转移模型)中检测mda-7/il-24蛋白与bi-97d6(一种小分子mcl-1抑制剂)组合的作用。通过尾静脉注射mda-7/il-24蛋白三周(共6剂，剂量为5mg/kg)对动物进行处理。通过腹膜内途径以1.5mg/kg体重施用bi-97d6共6剂(图4a)。对照组中明显有显著骨转移水平，而mda-7/il-24蛋白处理使得转移性病灶显著更少(图4a)。单独用bi-97d6进行治疗也显示出对骨转移发展的抑制作用。然而，当bi-97d6与mda-7/il-24组合时，观察到骨转移发展的显著抑制，表明mda-7/il-24蛋白与mcl-1抑制剂在骨转移中的联合治疗作用(图4a)。荧光素酶强度在图4b中示出。此种组合还减少了破骨细胞分化。剂量反应实验表明，当原代骨髓细胞用mcsf和rankl诱导并用mcl-1抑制剂处理时，破骨细胞的数量下调(图12a)。在用mda-7/il-24和bi-97d6的组合治疗后，在抑制破骨细胞分化方面的协同作用也很明显(图12b)。
还使用体内转移模型评估了对破骨细胞分化的抑制(图4c)。处死小鼠后分离骨髓细胞，诱导破骨细胞分化。与对照组相比，经mda-7/il-24或bi-97d6处理的动物组破骨细胞显著减少。从mda-7/il-24和bi-97d6动物中分离出的骨髓细胞在用rankl诱导后形成了统计上更少的破骨细胞。这通过计数破骨细胞(图4c)以及通过测量tracp破骨酶活性(图4d)而变得明显。
akt调节体内pc细胞的骨转移：为评估akt在pc骨转移中的作用，使用pi3激酶抑制剂ly294002抑制akt的活性(38)，确定其对破骨细胞分化的影响。pi3激酶抑制剂ly294002与mda-7/il-24蛋白协同作用来减少破骨细胞分化(图13a)。此外，用ly294002与mda-7/il-24蛋白的联合处理使得下游分子(包括nfat和mcl-1)的表达降低(图3b和11b)。作为进一步测试，用ca-akt、dn-akt和mcl-1稳定转染raw264.7细胞，测定破骨细胞的分化。与对照相比，过表达akt和mcl-1的克隆形成更多的破骨细胞，而过表达dn-akt的raw264.7细胞形成较少的破骨细胞(图13b)。综上所述，这些结果表明了mda-7/il-24蛋白与pi3k抑制剂或akt抑制剂的组合具有协同作用。
为评估体内akt的作用，通过心内途径将过表达携带萤火虫荧光素酶的组成型活性akt(pc3-mlakt)(图5a)的转移性pc3-ml细胞和pc3-ml细胞注射入雄性无胸腺裸鼠。克隆1用于体内研究，通过westernblotting验证下游通路基因表达的akt表达(图14)。通过
这些结果说明，经纯化的mda-7/il-24重组蛋白抑制pc细胞向骨转移。体内实验模型中，重组mda-7/il-24的处理显著减少了骨转移的发生，并且当与mcl-1抑制剂组合使用时，这种作用更为强烈。体外研究表明，部分地通过抑制磷酸化的akt和mcl-1，mda-7/il-24减少了rankl诱导的破骨细胞分化。因此，mda-7/il-24蛋白和靶向mcl-1的小分子抑制剂具有作为对抗pc骨转移的有效疗法的潜力。此外，上述结果表明，重组mda-7/il-24可在小鼠中全身性地反复递送而不会提升毒性，并且能抑制pc骨转移的发展。
还观察到带有his标签的mda-7/il-24对转移的影响更具有普遍性，因为接受心内递送pc3-ml细胞的动物处理也抑制了肺转移的发展(图15)。同样，考虑到mda-7/il-24蛋白对骨的作用，进一步预期其他癌症类型(例如，肺癌和乳腺癌)的向骨转移同样被预防/治疗。
参考文献
1.rigaudj,tiguertr,lenormandl,karamg,glemainp,buzelinjm,etal.prognosticvalueofbonescaninpatientswithmetastaticprostatecancertreatedinitiallywithandrogendeprivationtherapy.jurol2002；168:1423-6.
2.yel,kynastonhg,jiangwg.bonemetastasisinprostatecancer:molecularandcellularmechanisms(review).intjmolmed2007；20:103-11.
3.coghlinc,murraygi.currentandemergingconceptsintumourmetastasis.jpathol2010；222:1-15.
4.tanakay,nakayamadas,okaday.osteoblastsandosteoclastsinboneremodelingandinflammation.currentdrugtargetsinflammationandallergy2005；4:325-8.
5.quinnba,dashr,azabb,sarkars,dassk,kumars,etal.targetingmcl-1forthetherapyofcancer.expertopiniononinvestigationaldrugs2011；20:1397-411.
6.beroukhimr,mermelch,porterd,weig,raychaudhuris,donovanj,etal.thelandscapeofsomaticcopy-numberalterationacrosshumancancers.nature2010；463:899-905.
7.sutherlandka,rogershl,toshd,rogersmj.ranklincreasesthelevelofmcl-1inosteoclastsandreducesbisphosphonate-inducedosteoclastapoptosisinvitro.arthritisresther2009；11:r58.
8.masudah,hirosej,omatay,tokuyaman,yasuit,kadonoy,etal.anti-apoptoticbcl-2familymembermcl-1regulatescellviabilityandbone-resorbingactivityofosteoclasts.bone2014；58:1-10.
9.weij,kitadas,regamf,stebbinsjl,zhaid,cellittij,etal.apogossypolderivativesaspan-activeinhibitorsofantiapoptoticb-celllymphoma/leukemia-2(bcl-2)familyproteins.jmedchem2009；52:4511-23.
10.weij,kitadas,regamf,emdadia,yuanh,cellittij,etal.apogossypolderivativesasantagonistsofantiapoptoticbcl-2familyproteins.molcancerther2009；8:904-13.
11.weij,regamf,kitadas,yuanh,zhaid,risboodp,etal.synthesisandevaluationofapogossypolatropisomersaspotentialbcl-xlantagonists.cancerlett2009；273:107-13.
12.kitadas,kresscl,krajewskam,jial,pellecchiam,reedjc.bcl-2antagonistapogossypol(nsc736630)displayssingle-agentactivityinbcl-2-transgenicmiceandhassuperiorefficacywithlesstoxicitycomparedwithgossypol(nsc19048).blood2008；111:3211-9.
13.jial,cowardlc,kerstner-woodcd,corkrl,gormangs,nokerpe,etal.comparisonofpharmacokineticandmetabolicprofilingamonggossypol,apogossypolandapogossypolhexaacetate.cancerchemotherpharmacol2008；61:63-73.
14.weij,stebbinsjl,kitadas,dashr,placzekw,regamf,etal.bi-97c1,anopticallypureapogossypolderivativeaspan-activeinhibitorofantiapoptoticb-celllymphoma/leukemia-2(bcl-2)familyproteins.jmedchem2010；53:4166-76.
15.azabb,dashr,dassk,bhutiask,shenxn,quinnba,etal.enhanceddeliveryofmda-7/il-24usingaserotypechimericadenovirus(ad.5/3)incombinationwiththeapogossypolderivativebi-97c1(sabutoclax)improvestherapeuticefficacyinlowcarcolorectalcancercells.journalofcellularphysiology2012；227:2145-53.
16.dashr,azabb,shenxn,sokhiuk,sarkars,suzz,etal.developinganeffectivegenetherapyforprostatecancer:newtechnologieswithpotentialtotranslatefromthelaboratoryintotheclinic.discovmed2011；11:46-56.
17.dashr,azabb,quinnba,shenx,wangxy,dassk,etal.apogossypolderivativebi-97c1(sabutoclax)targetingmcl-1sensitizesprostatecancercellstomda-7/il-24-mediatedtoxicity.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2011；108:8785-90.
18.dashr,dmitrievi,suzz,bhutiask,azabb,vozhillan,etal.enhanceddeliveryofmda-7/il-24usingaserotypechimericadenovirus(ad.5/3)improvestherapeuticefficacyinlowcarprostatecancercells.cancergenether2010；17:447-56.
19.dassk,sarkars,dashr,dentp,wangxy,sarkard,etal.chapterone---cancerterminatorvirusesandapproachesforenhancingtherapeuticoutcomes.advcancerres2012；115:1-38.
20.bhatnagara,wangy,measerc,gabrielsonm,sysap,minni,etal.aeg-1promoter-mediatedimagingofprostatecancer.cancerres2014；74:5772-81.
21.suz,emdadl,sauanem,lebedevaiv,sarkard,guptap,etal.uniqueaspectsofmda-7/il-24antitumorbystanderactivity:establishingaroleforsecretionofmda-7/il-24proteinbynormalcells.oncogene2005；24:7552-66.
22.weij,stebbinsjl,kitadas,dashr,zhaid,placzekwj,etal.anopticallypureapogossypolonederivativeaspotentpan-activeinhibitorofanti-apoptoticbcl-2familyproteins.frontoncol2011；1:28.
23.sarkars,quinnba,shenxn,dashr,dassk,emdadl,etal.therapyofprostatecancerusinganovelcancerterminatorvirusandasmallmoleculebh-3mimetic.oncotarget2015；6:10712-27.
24.dashr,bhoopathip,dassk,sarkars,emdadl,dasguptas,etal.novelmechanismofmda-7/il-24cancer-specificapoptosisthroughsariinduction.cancerres2014；74:563-74.
25.pradhanak,talukdars,bhoopathip,shenxn,emdadl,dassk,etal.mda-7/il-24mediatescancercell-specificdeathviaregulationofmir-221andthebeclin-1axis.cancerres2017；77:949-59.
26.dashr,richardsje,suzz,bhutiask,azabb,rahmanim,etal.mechanismbywhichmcl-1regulatescancer-specificapoptosistriggeredbymda-7/il-24,anil-10-relatedcytokine.cancerres2010；70:5034-45.
27.pradhanak,mohapatraad,nayakkb,chakrabortys.acetylationoftheproto-oncogeneevi1abrogatesbcl-xlpromoterbindingandinducesapoptosis.plosone2011；6:e25370.
28.bradleyew,ourslermj.osteoclastcultureandresorptionassays.methodsinmolecularbiology2008；455:19-35.
29.menezesme,bhatias,bhoopathip,dassk,emdadl,dasguptas,etal.mda-7/il-24:multifunctionalcancerkillingcytokine.advexpmedbiol2014；818:127-53.
30.fisherpb.ismda-7/il-24a"magicbullet"forcancer？cancerres2005；65:10128-38.
31.yinjj,pollockcb,kellyk.mechanismsofcancermetastasistothebone.cellres2005；15:57-62.
32.collin-osdobyp,osdobyp.rankl-mediatedosteoclastformationfrommurineraw264.7cells.methodsinmolecularbiology2012；816:187-202.
33.takeshitas,kajik,kudoa.identificationandcharacterizationofthenewosteoclastprogenitorwithmacrophagephenotypesbeingabletodifferentiateintomatureosteoclasts.jboneminerres2000；15:1477-88.
34.moonjb,kimjh,kimk,younbu,koa,leesy,etal.aktinducesosteoclastdifferentiationthroughregulatingthegsk3beta/nfatc1signalingcascade.jimmunol2012；188:163-9.
35.liousf,hsujh,linil,homl,hsupc,chenlw,etal.kmup-1suppressesrankl-inducedosteoclastogenesisandpreventsovariectomy-inducedboneloss:rolesofmapks,akt,nf-kappabandcalcium/calcineurin/nfatc1pathways.plosone2013；8:e69468.
36.inoues,branchcd,gallickge,chadas,rameshr.inhibitionofsrckinaseactivitybyad-mda7suppressesvascularendothelialgrowthfactorexpressioninprostatecarcinomacells.molther2005；12:707-15.
37.valerov,3rd,wingateh,chadas,liuy,palalonf,millsg,etal.mda-7resultsindownregulationofaktconcomitantwithapoptosisandcellcyclearrestinbreastcancercells.cancergenether2011；18:510-9.
38.vlahoscj,matterwf,huiky,brownrf.aspecificinhibitorofphosphatidylinositol3-kinase,2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4h-1-benzopyran-4-one(ly294002).jbiolchem1994；269:5241-8.
39.riihimakim,thomsenh,brandta,sundquistj,hemminkik.whatdoprostatecancerpatientsdieof？oncologist2011；16:175-81.
40.cunninghamcc,chadas,merrittja,tonga,senzern,zhangy,etal.clinicalandlocalbiologicaleffectsofanintratumoralinjectionofmda-7(il24；ingn241)inpatientswithadvancedcarcinoma:aphaseistudy.molther2005；11:149-59.
41.nishikawat,rameshr,munshia,chadas,meynre.adenovirus-mediatedmda-7(il24)genetherapysuppressesangiogenesisandsensitizesnsclcxenografttumorstoradiation.molther2004；9:818-28.
42.rameshr,mhashilkaram,tanakaf,saitoy,branchcd,siegerk,etal.melanomadifferentiation-associatedgene7/interleukin(il)-24isanovelligandthatregulatesangiogenesisviatheil-22receptor.cancerres2003；63:5105-13.
43.bhutiask,dashr,dassk,azabb,suzz,leesg,etal.mechanismofautophagytoapoptosisswitchtriggeredinprostatecancercellsbyantitumorcytokinemelanomadifferentiation-associatedgene7/interleukin-24.cancerres2010；70:3667-76.
44.rameshr,itoi,gopalanb,saitoy,mhashilkaram,chadas.ectopicproductionofmda-7/il-24inhibitsinvasionandmigrationofhumanlungcancercells.molther2004；9:510-8.
45.dentp,yacouba,grants,curieldt,fisherpb.mda-7/il-24regulatesproliferation,invasionandtumorcellradiosensitivity:anewcancertherapy？jcellbiochem2005；95:712-9.
46.sauanem,suzz,guptap,lebedevaiv,dentp,sarkard,etal.autocrineregulationofmda-7/il-24mediatescancer-specificapoptosis.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2008；105:9763-8.
47.sauanem,gopalkrishnanrv,chooht,guptap,lebedevaiv,yacouba,etal.mechanisticaspectsofmda-7/il-24cancercellselectivityanalysedviaabacterialfusionprotein.oncogene2004；23:7679-90.
48.leversonjd,zhangh,chenj,tahirsk,phillipsdc,xuej,etal.potentandselectivesmall-moleculemcl-1inhibitorsdemonstrateon-targetcancercellkillingactivityassingleagentsandincombinationwithabt-263(navitoclax).celldeath&disease2015；6:e1590.
49.minagawan,kruglovea,dranoffja,robertme,goresgj,nathansonmh.theanti-apoptoticproteinmcl-1inhibitsmitochondrialca2 signals.jbiolchem2005；280:33637-44.
50.bhoopathip,leen,pradhanak,shenxn,dassk,sarkard,etal.mda-7/il-24inducescelldeathinneuroblastomathroughanovelmechanisminvolvingaifandatm.cancerres2016；76:3572-82.
实施方式
实施方式1：一种预防患癌受试者的骨转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含mda-7/il-24蛋白的组合物。
实施方式2：一种治疗患癌受试者的骨转移的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含mda-7/il-24蛋白的组合物。
实施方式3：根据实施方式1或2所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。
实施方式4：根据实施方式1至3中任一项所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白为成熟蛋白。
实施方式5：根据实施方式1至4中任一项所述的方法，其中，所述施用包括向所述受试者的骨骼施用。
实施方式6：根据实施方式1至5中任一项所述的方法，其中，所述癌症为前列腺癌。
实施方式7：根据实施方式6所述的方法，其中，所述前列腺癌包含癌细胞，相对于正常前列腺细胞，所述癌细胞的mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加。
实施方式8：根据实施方式1至7中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包含mcl-1抑制剂。
实施方式9：根据实施方式8所述的方法，其中，所述mcl-1抑制剂是bi-97d6。
实施方式10：根据实施方式1至9中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包含磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂。
实施方式11：根据实施方式10所述的方法，其中，所述pi3k抑制剂是ly294002。
实施方式12：根据实施方式1至11中任一项所述的方法，其中，所述有效量为对原代骨髓细胞或正常原代人前列腺上皮细胞基本上无毒的量。
实施方式13：根据实施方式1至12中任一项所述的方法，其中，所述有效量为抑制破骨细胞分化的量。
实施方式14：根据实施方式1至13中任一项所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式15：根据实施方式14所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式16：根据实施方式14或15所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白能够活化所述受试者的癌细胞的il-20/il-22受体复合物。
实施方式17：根据实施方式14所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。
实施方式18：一种组合物，所述组合物包含mda-7/il-24蛋白并包含mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。
实施方式19：根据实施方式18所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。
实施方式20：根据实施方式18或19所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白为成熟蛋白。
实施方式21：根据实施方式18至20中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含mcl-1抑制剂。
实施方式22：根据实施方式21所述的组合物，其中，所述mcl-1抑制剂是bi-97d6。
实施方式23：根据实施方式18至22中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含pi3k抑制剂。
实施方式24：根据实施方式23所述的组合物，其中，所述pi3k抑制剂是ly294002。
实施方式25：根据实施方式18至24中任一项所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式26：根据实施方式25所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方式27：根据实施方式25或26所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白能够活化癌细胞的il-20/il-22受体复合物。
实施方式28：根据实施方式25所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。
实施方式29：根据实施方式18至28中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
实施方式30：根据实施方式18至29中任一项所述的组合物，所述组合物用于预防或治疗患癌受试者的骨转移。
实施方式31：根据实施方式26所述的组合物，其中，所述癌症为前列腺癌。
实施方式32：根据实施方式31所述的组合物，其中，所述前列腺癌包含癌细胞，相对于正常前列腺细胞，所述癌细胞的mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加。
实施方式33：实施方式18至29中任一项所述的组合物在制备用于预防或治疗患癌受试者的骨转移的药物中的用途。
实施方式34：实施方式18至29中任一项所述的组合物在根据实施方式1至17中任一项所述的方法制备用于预防或治疗骨转移的药物中的用途。
实施方式35：一种试剂盒，所述试剂盒包含实施方式18至29中任一项所述的组合物的mda-7/il-24蛋白并包含实施方式18至29中任一项所述的组合物的mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。
sequencelisting
<110>弗吉尼亚联邦大学（virginiacommonwealthuniversity）
<120>包含mda-7/il-24蛋白的组合物和使用方法
<130>053151-503001wo
<150>62/577,932
<151>2017-10-27
<150>62/687,905
<151>2018-06-21
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>621
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>合成多核苷酸
<400>1
atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccagacccttctgccctcct60
ttgctggcgacagcctctcaaatgcagatggttgtgctcccttgcctgggttttaccctg120
cttctctggagccaggtatcaggggcccagggccaagaattccactttgggccctgccaa180
gtgaagggggttgttccccagaaactgtgggaagccttctgggctgtgaaagacactatg240
caagctcaggataacatcacgagtgcccggctgctgcagcaggaggttctgcagaacgtc300
tcggatgctgagagctgttaccttgtccacaccctgctggagttctacttgaaaactgtt360
ttcaaaaactaccacaatagaacagttgaagtcaggactctgaagtcattctctactctg420
gccaacaactttgttctcatcgtgtcacaactgcaacccagtcaagaaaatgagatgttt480
tccatcagagacagtgcacacaggcggttcctgctattccggagagcatttaaacagttg540
gacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacattcttctgacctggatg600
cagaaattctacaagctctga621
<210>2
<211>206
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>合成多肽
<400>2
metasnpheglnglnargleuglnserleutrpthrleualaargpro
151015
phecysproproleuleualathralaserglnmetglnmetvalval
202530
leuprocysleuglyphethrleuleuleutrpserglnvalsergly
354045
alaglnglyglngluphehispheglyprocysglnvallysglyval
505560
valproglnlysleutrpglualaphetrpalavallysaspthrmet
65707580
glnalaglnaspasnilethrseralaargleuleuglnglngluval
859095
leuglnasnvalseraspalaglusercystyrleuvalhisthrleu
100105110
leugluphetyrleulysthrvalphelysasntyrhisasnargthr
115120125
valgluvalargthrleulysserpheserthrleualaasnasnphe
130135140
valleuilevalserglnleuglnproserglngluasnglumetphe
145150155160
serileargaspseralahisargargpheleuleupheargargala
165170175
phelysglnleuaspvalglualaalaleuthrlysalaleuglyglu
180185190
valaspileleuleuthrtrpmetglnlysphetyrlysleu
195200205
<210>3
<211>157
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>合成多肽
<400>3
glnglyglngluphehispheglyprocysglnvallysglyvalval
151015
proglnlysleutrpglualaphetrpalavallysaspthrmetgln
202530
alaglnaspasnilethrseralaargleuleuglnglngluvalleu
354045
glnasnvalseraspalaglusercystyrleuvalhisthrleuleu
505560
gluphetyrleulysthrvalphelysasntyrhisasnargthrval
65707580
gluvalargthrleulysserpheserthrleualaasnasnpheval
859095
leuilevalserglnleuglnproserglngluasnglumetpheser
100105110
ileargaspseralahisargargpheleuleupheargargalaphe
115120125
lysglnleuaspvalglualaalaleuthrlysalaleuglygluval
130135140
aspileleuleuthrtrpmetglnlysphetyrlysleu
145150155
<210>4
<211>103
<212>prt
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>合成多肽
<400>4
glusercystyrleuvalhisthrleuleugluphetyrleulysthr
151015
valphelysasntyrhisasnargthrvalgluvalargthrleulys
202530
serpheserthrleualaasnasnphevalleuilevalserglnleu
354045
glnproserglngluasnglumetpheserileargaspseralahis
505560
argargpheleuleupheargargalaphelysglnleuaspvalglu
65707580
alaalaleuthrlysalaleuglygluvalaspileleuleuthrtrp
859095
metglnlysphetyrlysleu
100
1.一种预防患癌受试者的骨转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含mda-7/il-24蛋白的组合物。
2.一种治疗患癌受试者的骨转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含mda-7/il-24蛋白的组合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白为成熟蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述施用包括向所述受试者的骨施用。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述癌症为前列腺癌。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述前列腺癌包含癌细胞，相对于正常前列腺细胞，所述癌细胞的mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包含mcl-1抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述mcl-1抑制剂是bi-97d6。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包含磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)抑制剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述pi3k抑制剂是ly294002。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述有效量为对原代骨髓细胞或正常原代人前列腺上皮细胞基本上无毒的量。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述有效量为抑制破骨细胞分化的量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白能够活化所述受试者的癌细胞的il-20/il-22受体复合物。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。
18.一种组合物，所述组合物包含mda-7/il-24蛋白并包含mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白为经纯化的蛋白。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白为成熟蛋白。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含mcl-1抑制剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述mcl-1抑制剂是bi-97d6。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含pi3k抑制剂。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述pi3k抑制剂是ly294002。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含与seqidno：3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求25或26所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白能够活化癌细胞的il-20/il-22受体复合物。
28.根据权利要求25所述的组合物，其中，所述mda-7/il-24蛋白包含seqidno：3的氨基酸序列。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的组合物，其中，所述组合物用于预防或治疗患癌受试者的骨转移。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中，所述癌症为前列腺癌。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中，所述前列腺癌包含癌细胞，相对于正常前列腺细胞，所述癌细胞的mcl-1、rankl、bcl-2、bcl-xl和akt中的一种以上表达增加。
33.权利要求18至29中任一项所述的组合物在制备用于预防或治疗患癌受试者的骨转移的药物中的用途。
34.权利要求18至29中任一项所述的组合物在根据权利要求1至17中任一项所述的方法制备用于预防或治疗骨转移的药物中的用途。
35.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求18至29中任一项所述的组合物的mda-7/il-24蛋白并包含权利要求18至29中任一项所述的组合物的mcl-1抑制剂和pi3k抑制剂中的一种或两种。
技术总结