本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其发病率高，死亡率可高达100％，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行。2018年8月3日，中国确诊首例非洲猪瘟疫情，我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位。
2005年7月，国际病毒分类委员会(ictv)最新病毒分类第八次报告中指出，非洲猪瘟病毒属于dna病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性dna病毒。非洲猪瘟病毒是由病毒基因组、完成基因早期转录所必须的酶以及一些dna结合蛋白组成，结构蛋白较多，其中p72是主要的结构蛋白之一，根据p72基因末端一段478bp的核酸序列，非洲猪瘟可分为23个基因型，如benin97/1为基因i型，malawili20/1为基因viii型，东非埃塞尔比亚分离株属于基因xxiii型。非洲猪瘟病毒基因组变异频繁，表现出明显的遗传多样性。非洲猪瘟病毒不能够诱导产生中和抗体，因此还没有对血清型进行分类。
目前全球尚无非洲猪瘟商品化疫苗，正在研究和曾经研究的疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗。
传统病毒疫苗可通过病毒灭活和病毒致弱两种方法进行制备。迄今为止，采用多种传统方法制备的asf灭活疫苗均不能对强毒攻击提供有效的免疫保护。虽然用asf灭活疫苗免疫后可产生高效价的抗体，但很难检测到中和抗体的存在。blome等研究表明，即使用新型佐剂polygentm或
减毒活疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，但生物安全是其使用的主要限制因素。减毒活疫苗的毒株来源主要有传代致弱毒株和天然致弱毒株。传代致弱asfv毒株可经过猪骨髓来源细胞、vero和cos-1等细胞系传代致弱。传代过程中，asfv致病力逐渐下降，同时病毒免疫原性和稳定性也随之下降。在西班牙和葡萄牙，使用传代致弱毒株免疫动物后产生了灾难性的后果，免疫动物呈现出肺炎、流产和死亡等副作用，在田间多次感染和异源强毒株存在的条件下，许多免疫动物呈现asf慢性感染临床症状。传代致弱的asfv安全性较差且很难提供较好免疫保护。采用天然致弱asfv毒株免疫动物后可造成诸多副反应，包括肺炎、流产、死亡等。免疫nh/p68毒株后25％～47％的猪呈现慢性感染；免疫ourt88/3后可导致发热、关节肿胀等症状。总之，天然致弱毒株导致的诸多副反应以及存在散毒的可能性等生物安全隐患限制了其在实际生产中的进一步应用。因此，一种改进的非洲猪瘟疫苗是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白呈三聚体结构，具有较好的免疫原性。
本发明的第二目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的制备方法，该方法操作简单，适合大规模生产。
本发明的第三目的在于提供一种上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白以及和其相关的生物材料，或上述制备方法的应用。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和gcn4片段，所述gcn4片段的氨基酸序列如seqidno.1所示。
根据本发明的一个方面，本发明提供了编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白和/或含有编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的制备方法，括在宿主中表达编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因、所述生物材料或所述制备方法的应用。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因和所述生物材料中的至少一种。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因和所述生物材料中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白。该融合蛋白含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和gcn4片段。p72蛋白片段抗原性佳，病毒感染后能够产生高滴度的抗p72抗体；gcn4片段的序列为mkqiedkieeilskiyhieneiarikkliger，能够促进p72蛋白形成三聚体结构。本发明提供的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白通过其中的p72蛋白使该蛋白具有良好的免疫原性，可以作为疫苗的活性物质。同时通过融合gcn4片段使p72蛋白形成三聚体结构，使该融合蛋白的结构更接近天然的p72蛋白，从而进一步提高了融合蛋白的免疫原性，并且使该融合蛋白的免疫机制与天然的p72蛋白更一致。以非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、编码其的基因和与非洲猪瘟病毒p72融合蛋白相关的生物材料作为主要活性物质的疫苗生物学活性高，且能够缓解减毒活疫苗在接种后存在潜伏感染和毒力返强的生物安全问题。
由于上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白具有更接近天然猪瘟病毒p72的三聚体结构，因此将该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白用于检测猪瘟病毒抗体，能够实现充分的模拟天然蛋白从而更好的与抗体结合。同时基于该融合蛋白与天然蛋白结构相似的优点，利用该融合蛋白制备得到的抗体也能够更好的与天然p72蛋白结合，从而用于检测样本中的猪瘟病毒抗原，以及检测猪瘟病毒。同时基于本发明提供的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白和天然蛋白结构的相似性，其也能有效的激发机体的免疫反应，以作为疫苗抗原，或抗原的主要或辅助成分。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为asfvp72融合蛋白示意图；
图2为收集细胞株培养上清，asfvp72融合蛋白表达的sds-page图；
图3为实施例4中asfvp72融合蛋白westernblot检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，以下简称asfvp72融合蛋白。该asfvp72融合蛋白含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和gcn4片段。本发明提供的asfvp72融合蛋白中p72蛋白片段和gcn4片段可以直接连接，也可以之间相隔若干个氨基酸残基，本发明对此不作限制。
p72蛋白是非洲猪瘟病毒主要的结构蛋白之一，占病毒总蛋白量的1/3，而且该蛋白序列保守，抗原性佳，病毒感染后能够产生高滴度的抗p72抗体，因此常被用作非洲猪瘟的血清学诊断。含有p72蛋白的融合蛋白具有良好的免疫原性，能促进免疫对象免疫asfvp72融合蛋白后产生高滴度抗体，可以作为疫苗中的活性成分。p72蛋白片段氨基酸序列优选如seqidno.2所示。
本发明提供的asfvp72融合蛋白中gcn4片段的序列为mkqiedkieeilskiyhieneiarikkliger(seqidno.1)，将gcn4片段与p72蛋白融合能使p72蛋白在没有其他蛋白辅助的条件下形成三聚体，使p72蛋白与天然p72蛋白相似，提高了p72蛋白的免疫原性。
在一些优选的实施方式中，gcn4片段融合于p72蛋白片段的n端能有效的促进p72蛋白形成三聚体。并且更优选的实施方式是，将p72蛋白片段和gcn4片段通过第一连接肽连接。连接肽能够提高融合蛋白的稳定性、表达量和生物活性，并且通过优选连接肽的序列，也能够促进p72更好的形成三聚体。使用如seqidno.3所示序列的第一连接肽连接p72蛋白片段和gcn4片段，能够促进p72蛋白形成三聚体。
在一些优选的实施方式中，asfvp72融合蛋白还融合有信号肽，信号肽能协助asfvp72融合蛋白在宿主中向分泌通路转移，促进asfvp72融合蛋白作为分泌蛋白被宿主分泌至胞外，促进蛋白高表达，降低蛋白纯化难度。信号肽优选如seqidno.3所示氨基酸序列的信号肽，并优选将信号肽融合于asfvp72融合蛋白的n端。
在一些优选的实施方式中，asfvp72融合蛋白中还含有标签，标签能使asfvp72融合蛋白更容易分离和纯化。标签可选择本领域常规的蛋白标签，标签可以添加在asfvp72融合蛋白的氨基端和/或羧基端，本发明对此不作限制。在一些优选的实例中，标签优选包括strepⅱ标签(wshpqfek，seqidno.4)和his标签(hhhhhh，seqidno.5)。strepⅱ标签能够结合在抗生物素蛋白链菌素的生物素结合口袋，his标签可以与ni 结合，且这两种标签长度较短，对asfvp72融合蛋白的结构影响较小，且具有较好的纯化效果。优选将strepⅱ标签和his标签依次融合于非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的c端，且优选将strepⅱ标签和his标签使用连接肽连接，以避免两个标签之间相互影响。用于连接strepⅱ标签和his标签的第二连接肽的氨基酸序列优选如seqidno.6所示。
在一些优选的实施方式中，asfvp72融合蛋白优选为由哺乳动物表达系统表达的蛋白。由于非洲猪瘟病毒的宿主是哺乳动物，因此哺乳动物表达的蛋白经翻译加工后结构更接近天然的p72蛋白。
在一些优选的实施方式中，asfvp72融合蛋白由cho细胞表达系统(chinesehamsterovarycellsystem,cho)表达。cho细胞表达系统具有准确的转录后修饰功能，使cho表达的蛋白的结构、理化性质和生物学功能更接近于天然蛋白。cho细胞表达系统，具有重组基因的高效扩增和表达能力，还具有外源蛋白的整合稳定，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化等优点。相对于其他哺乳动物细胞表达体系，cho细胞具有更明确的转染机制，转染稳定且效率高，可以在染色体活跃位点整合较长的dna片段，同时还具有长而稳定的基因表达期。cho细胞系优选cho细胞的亚克隆cho-k1细胞系，cho-k1能够使目的蛋白发生转录后糖基化修饰，提高生物学活性。
在一些优选的实施方式中，由n端至c端依次为信号肽、gcn4片段、第一连接肽、p72蛋白片段、strepⅱ标签、第二连接肽和his标签。上述各片段可以直接连接，也可以相隔一个或多个碱基，本发明对此不作限制。具有该结构的asfvp72融合蛋白能够形成三聚体，与天然p72蛋白相似，具有较佳的免疫原性；同时在哺乳动物表达系统中具有较高的表达量，容易纯化。具有上述结构的asfvp72融合蛋白的氨基酸序列优选为seqidno.7所示序列，免疫原性好，能够在cho细胞中可溶性表达。核苷酸序列优选为seqidno.8所示序列。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码上述asfvp72融合蛋白的基因。所述基因优选为如seqidno.8所示序列，或为和seqidno.8所示序列90％以上同源性的序列。和seqidno.8所示序列90％以上同源性的序列指的是通过核苷酸的缺失、突变、减少或增加导致序列与seqidno.8所示序列有一定的差异，但是至少90％以上相似，且具有相同功能的核酸序列。所述同源性例如可以为但不限于为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。编码asfvp72融合蛋白的基因为优选如seqidno.8所示序列。seqidno.8所示序列是经密码子优化的序列，适合在哺乳动物细胞中高效表达。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种。所述生物材料能够表达asfvp72融合蛋白，和/或含有编码asfvp72融合蛋白的基因。所述生物材料例如为含有上述编码asfvp72融合蛋白的基因的表达盒；或者例如为含有编码asfvp72融合蛋白的基因的载体，使上述编码asfvp72融合蛋白的基因能够在宿主中进行复制或者表达，或者能够将上述基因整合进入宿主细胞中的介质，载体的实例包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体和病毒基因组。载体优选使用真核表达载体ucoe，该载体能够有效防止基因沉默，持续稳定、高水平地表达目的基因，进而提高asfvp72融合蛋白在宿主中的表达量。所述生物材料还可以为重组微生物，所述重组微生物中含有编码asfvp72融合蛋白的基因的载体，所述基因能够在微生物中克隆，以增加基因的拷贝量。所述生物材料还可以为细胞系，所述细胞系中含有编码asfvp72融合蛋白的基因的表达载体，所述细胞系能够表达asfvp72融合蛋白。所述细胞系优选cho细胞系，更优选cho-k1细胞系。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了asfvp72融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述asfvp72融合蛋白的基因。该方法操作简单，适合大规模生产asfvp72融合蛋白。为了使asfvp72融合蛋白的结构更接近天然蛋白，优选使用哺乳动物表达系统表达蛋白。
在一些优选的实施方式中，以使用cho-k1细胞制备asfvp72融合蛋白为例，优选按照如下方法制备：
(a)提供含编码asfvp72融合蛋白基因的真核表达载体ucoe。
(b)将含有编码asfvp72融合蛋白基因的重组质粒线性化，转染cho-k1贴壁细胞。
(c)通过细胞培养，以及加压筛选、单克隆化和悬浮驯化，得到高效稳定表达asfvp72融合蛋白的悬浮细胞株。
(d)发酵培养并工艺放大步骤(c)中悬浮细胞株，纯化后得到asfvp72融合蛋白。
步骤(a)中使用含有ucoe转录调控元件的真核双表达载体ucoe，能够有效防止目的基因沉默，极大地提高了哺乳动物细胞中蛋白表达量，减少筛选工作量，节省人力物力。步骤(c)中，加压筛选能够促进宿主细胞表达外源asfvp72融合蛋白。单克隆化能够筛选出高效表达asfvp72融合蛋白的细胞，同时只增殖这些细胞。单克隆化能够提高asfvp72融合蛋白的产量。悬浮驯化能够使贴壁的宿主细胞悬浮培养，提高细胞的比表面积，提高生物反应器中的传质和传热的效率，以及提高生物反应器空间使用效率，降低生产成本。在一些可选的实施方式中，根据宿主细胞的特性，加压筛选、单克隆化和悬浮驯化也可以择一使用，也可以同时应用多种处理方式。上述实施方式提供的制备方法能够稳定、高效、质量可控生产asfvp72融合蛋白，且生产成本较低。
由于上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白具有更接近天然猪瘟病毒p72的三聚体结构，因此将该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白用于检测猪瘟病毒抗体，能够实现充分的模拟天然蛋白从而更好的与抗体结合。同时基于该融合蛋白与天然蛋白结构相似的优点，利用该融合蛋白制备得到的抗体也能够更好的与天然p72蛋白结合，从而用于检测样本中的猪瘟病毒抗原，以及检测猪瘟病毒中。同时基于本发明提供的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白和天然蛋白结构的相似性，其也能有效的激发机体的免疫反应，以作为疫苗抗原，或抗原的主要或辅助成分。因此上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、编码上述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因、所述生物材料或所述制备方法可以应用于如下几个方面：
(x1)制备用于检测非洲猪瘟抗体的试剂盒；
(x2)制备非洲猪瘟抗体；
(x3)制备用于检测非洲猪瘟抗原的试剂盒；
(x4)制备用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(x5)制备非洲猪瘟疫苗。
根据本发明的另一个方面，本发明还提了一种试剂盒，该试剂盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、所述基因和所述生物材料中的至少一种。在一些实施例中，所述试剂盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，以用于检测非洲猪瘟抗体，该试剂盒可选的为elisa试剂盒，因此所述试剂盒还可以包含用于进行elisa实验的实际和耗材等。在一些实施例中，所述试剂盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，该试剂盒可以用于检测非洲猪瘟病毒或其抗原，或非洲猪瘟抗体，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白用于作为标准品或对照品。在一些实施例中，所述试剂盒包含所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，或包含能够表达该非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的细胞，该试剂盒可以用于生产非洲猪瘟病毒p72抗体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗以上述asfvp72融合蛋白、编码asfvp72融合蛋白的基因或上述生物材料中的至少一种作为疫苗的活性物质。一些疫苗的实例例如可以为但不限于亚单位疫苗，所述疫苗以asfvp72融合蛋白为主要活性物质；dna疫苗，所述疫苗以编码asfvp72融合蛋白的基因为主要活性物质，或以含有编码asfvp72融合蛋白的基因的质粒为主要活性物质。疫苗除含有上述asfvp72融合蛋白、基因和上述生物材料中的至少一种外，还可以含有其他致病性微生物的抗原，或者能够表达其他致病性微生物的抗原的物质等，以作为多联疫苗。本发明提供的疫苗还可以包括本领域的常规辅料，例如免疫佐剂、稳定剂和保护剂等，本发明对此不作限制。
在一些优选的实施方式中，疫苗是以asfvp72融合蛋白作为主要活性物质的亚单位疫苗，asfvp72融合蛋白生物学活性高，且能够克服减毒活疫苗在接种后存在潜伏感染和毒力返强的生物安全问题。作为疫苗活性物质的asfvp72融合蛋白的氨基酸序列优选如seqidno.7所示，且优选采用cho细胞表达的seqidno.7所示序列的asfvp72融合蛋白。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。试剂及药品的来源列单如下：
cho-k1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；
细胞培养基购自美国hyclone公司；
细胞培养血清购自我国北京全式金生物技术(transgenbiotech)有限公司；
真核表达载体ucoe购自merck公司；
lipofectamine3000试剂购自美国invitrogen公司；
嘌呤霉素、潮霉素均购自美国gibco公司。
实施例1表达asfvp72融合蛋白的重组表达载体的构建
非洲猪瘟病毒b646l(p72)基因合成及重组质粒ucoe-puro-p72和ucoe-h-p72的构建：在n端添加sp信号肽9个核苷酸序列，与重组asfvb646l基因序列融合，n端再通过第一连接肽融合gcn4片段。asfvp72融合蛋白由n端至c端依次为信号肽、gcn4片段、第一连接肽、p72蛋白片段、strepⅱ标签、第二连接肽和his标签，如图1所示。经偏嗜性密码子优化后得到编码其的核苷酸序列如seqidno.8所示。在基因两端插入酶切位点nhei和sali，送往公司进行基因合成，同时将这个序列亚克隆入载体ucoe中，获得重组质粒ucoe-puro-p72和ucoe-h-p72。
实施例2asfvp72融合蛋白在cho-k1细胞中的表达检测
(1)cho-k1贴壁细胞转染：生物安全柜紫外灭菌30min；培养基(含2.5％血清的dme/f-12和含10％血清的dme/f-12)和pbs预热至37℃。从37℃培养箱中取出细胞(t25细胞培养瓶)，弃培养基，取预热的pbs5ml润洗细胞。弃去pbs后每个t25细胞培养瓶中加入500μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，至细胞皱缩变圆，间隙变大，并呈单个细胞。吸弃胰酶然后终止消化反应，使用5ml含有10％fbs的dme/f-12培养基终止消化反应，然后吹散细胞。将细胞悬液和台盼蓝染液按照1:1比例混合后计数。待细胞活力≥90％时，稀释细胞至1.5×105/ml，将细胞接种至6孔板中，每孔接种2ml，将接种后的6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。培养至细胞汇合率达到50％左右时即可开始转染，转染前将培养基更换成含有2.5％fbs的dme/f-12，1.5ml/孔。使用lipofectamine3000转染重组表达载体，转染按照lipofectamine3000使用说明书进行，转然后将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。
(2)加压筛选：在转染48h后对细胞进行加压处理。弃去细胞培养基，然后加入含有10％fbs、2μg/mlpuromycin和200μg/mlhygromycinb的dme/f-12，每孔加入2ml，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养至细胞铺满单层，然后将细胞传代至t25细胞培养瓶中继续培养，加压细胞传代2-3次，至阴性对照无细胞存活。
(3)将加压筛选后的细胞利用有限稀释法进行单克隆筛选：吸弃细胞培养上清后每个t25细胞培养瓶中加入500μl0.25％trypsin-edta室温消化细胞2min左右，至细胞皱缩变圆，间隙变大，并呈单个细胞，吸弃胰酶，每个t25细胞培养瓶中加入含10％fbs、2μg/mlpuromycin和200μg/mlhygromycinb的dme/f-125ml来终止消化反应，然后吹散细胞。将细胞悬液和台盼蓝染液按照1:1比例混合后计数。待细胞活力≥90％时，取200μl细胞悬液加入至96孔板中(按照每孔1个细胞的量配制细胞悬液)，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。记录单个细胞的孔。当细胞汇合率≥90％时，取单克隆细胞的上清进行elisa检测，将高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存，同时收获上清进行elisa检测。
实施例3阳性单克隆细胞株悬浮驯化
(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；dme/f-12(含10％血清)、hycell(含8mmglutamax)与pbs置于37℃水浴锅预热至37℃。将含10％血清的dme/f-12和含8mmglutamax的hycell分别按照3:1、1:1和1:3的比例配置驯化用培养基。
(2)从37℃培养箱中取出细胞(t75细胞培养瓶)，弃细胞上清，然后取预热的pbs润洗细胞。弃pbs后使用1ml0.25％trypsin-edta消化细胞2min左右，至细胞皱缩变圆，间隙变大，并呈单个细胞，吸弃胰酶，然后加入15ml含有10％fbs的dme/f-12培养终止消化反应，用移液管轻轻吹散细胞，将细胞悬液和台盼蓝染液按照1:1比例混合后计数。
(3)待细胞活力≥90％时，稀释细胞至5×105/ml，接种20ml至125ml摇瓶中培养，培养参数：37℃，5％co2，100rpm。每隔24h计数细胞密度及活力。按照hycell(含8mmglutamax)细胞悬浮驯化的说明书驯化细胞。
实施例4非洲猪瘟病毒p72蛋白纯化与鉴定
asfvp72融合蛋白纯化：收获细胞培养上清，4℃，10000rpm离心10min，去细胞碎片，然后使用ni 亲和层析柱纯化非洲猪瘟病毒p72蛋白，纯化蛋白用生理盐水进行透析。sds-page对纯化得到的蛋白进行鉴定，鉴定结果如图2所示。鉴定结果表明纯化产物经sds-page电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符。应用康复猪血清进行westernblot实验，结果见图3，康复猪血清中的特异性抗体能够识别实施例2表达的asfvp72蛋白，表明该蛋白可用于开发诊断试剂盒。
实施例5asfvp72融合蛋白用于制备检测非洲猪瘟抗体的elisa诊断试剂盒的应用
一、间接elisa检测方法建立
以asfvp72融合蛋白作为包被抗原，经过常规elisa方法优化最佳抗原浓度、包被条件及抗猪hrp标记igg抗体的稀释浓度及孵育条件；摸索出最佳待检血清的稀释比例及孵育条件，同时对间接elisa方法中所用到的抗原包被液、封闭液、洗涤液及抗体稀释液进行优化筛选。
二、结果评判标准
选取30份非洲猪瘟阴性血清，经优化后的间接elisa方法进行检测，计算其阴性血清od450nm的平均值
三、批间及批内重复性测定
取三块不同批次的包被板，分别加入10份非洲猪瘟阳性血清及非洲猪瘟阴性血清，每个样品分别做3个重复孔，经优化后的间接elisa方法进行检测，计算批间变异系数；在同一批次包被板中加入10份非洲猪瘟阳性及阴性血清，每个样品分别做3个重复孔，计算批内变异系数。结果表明批间及批内变异系数均小于10％，证明本实验所建立的间接elisa方法稳定。
四、灵敏性及特异性测定
将非洲猪瘟阳性血清以1:50为起始稀释度进行连续倍比稀释至1:6400，将测得可以检出非洲猪瘟阳性血清最大稀释倍数判定为本检测方法的灵敏度，测得本检测方法灵敏度为1：1600。使用本实施例建立的间接elisa方法对非洲猪瘟阳性及阴性血清、猪丹毒阳性血清、猪流感、猪瘟阳性血清、猪蓝耳病阳性血清及猪伪狂犬阳性血清各5份进行检测，每个检测样品做3个重复孔，结果表明，本实验建立的elisa方法与其他猪病血清无交叉反应，检测结果均为阴性；只有非洲猪瘟阳性血清为阳性结果，表明所建立的elisa检测方法特异性良好。
五、符合率测定
同时使用本实施例所建立的间接elisa方法及商品化非洲猪瘟抗体检测试剂盒对60份猪瘟血清(包括20份非洲猪瘟标准阳性血清)进行检测。结果显示经本方法检测出非洲猪瘟阳性结果22份，阴性结果38份；商品化试剂盒检测结果为阳性22份，阴性38份，两种方法符合率为100％。
实施例5非洲猪瘟病毒p72蛋白亚单位疫苗的制备
疫苗制备：将实施例4中纯化得到的蛋白使用pbs溶液稀释，将稀释后的蛋白溶液与seppic201佐剂按1：1比例混合在一起，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
sequencelisting
<110>天康生物(上海)有限公司
天康生物股份有限公司
<120>非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用
<160>8
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
metlysglnilegluasplysileglugluileleuserlysiletyr
151015
hisilegluasngluilealaargilelyslysleuileglygluarg
202530
<210>2
<211>646
<212>prt
<213>非洲猪瘟病毒（africanswinefevervirus）
<400>2
metalaserglyglyalaphecysleuilealaasnaspglylysala
151015
asplysileileleualaglnaspleuleuasnserargileserasn
202530
ilelysasnvalasnlyssertyrglylysproaspprogluprothr
354045
leuserglnileglugluthrhisleuvalhispheasnalahisphe
505560
lysprotyrvalprovalglypheglutyrasnlysvalargprohis
65707580
thrglythrprothrleuglyasnlysleuthrpheglyileprogln
859095
tyrglyaspphephehisaspmetvalglyhishisileleuglyala
100105110
cyshissersertrpglnaspalaproileglnglythrserglnmet
115120125
glyalahisglyglnleuglnthrpheproargasnglytyrasptrp
130135140
aspasnglnthrproleugluglyalavaltyrthrleuvalasppro
145150155160
pheglyargproilevalproglythrlysasnalatyrargasnleu
165170175
valtyrtyrcysglutyrproglygluargleutyrgluasnvalarg
180185190
pheaspvalasnglyasnserleuaspglutyrserseraspvalthr
195200205
thrleuvalarglysphecysileproglyasplysmetthrglytyr
210215220
lyshisleuvalglyglngluvalservalgluglythrserglypro
225230235240
leuleucysasnilehisaspleuhislysprohisglnserlyspro
245250255
ileleuthraspgluasnaspthrglnargthrcysserhisthrasn
260265270
prolyspheleuserglnhispheprogluasnserhisasnilegln
275280285
thralaglylysglnaspilethrproilethraspalathrtyrleu
290295300
aspileargargasnvalhistyrsercysasnglyproglnthrpro
305310315320
lystyrtyrglnproproleualaleutrpilelysleuargphetrp
325330335
pheasngluasnvalasnleualaileproservalserileprophe
340345350
glygluargpheilethrilelysleualaserglnlysaspleuval
355360365
asnglupheproglyleuphevalargglnserargpheilealagly
370375380
argproserargargasnileargphelysprotrppheileprogly
385390395400
valileasngluileserleuthrasnasngluleutyrileasnasn
405410415
leuphevalthrprogluilehisasnleuphevallysargvalarg
420425430
pheserleuileargvalhislysthrglnvalthrhisthrasnasn
435440445
asnhishisaspglulysleumetseralaleulystrpproileglu
450455460
tyrmetpheileglyleulysprothrtrpasnileseraspglnasn
465470475480
prohisglnhisargasptrphislyspheglyhisvalvalasnala
485490495
ilemetglnprothrhishisalagluileserpheglnaspargasp
500505510
thralaleuproaspalacysserserileseraspileserproval
515520525
thrtyrproilethrleuproileilelysasnileservalthrala
530535540
hisglyileasnleuileasplyspheproserlysphecysserser
545550555560
tyrileprophehistyrglyglyasnalailelysthrproaspasp
565570575
proglyalametmetilethrphealaleulysproarggluglutyr
580585590
glnproserglyhisileasnvalserargalaarggluphetyrile
595600605
sertrpaspthrasptyrvalglyserilethrthralaaspleuval
610615620
valseralaseralaileasnpheleuleuleuglnasnglyserala
625630635640
valleuargtyrserthr
645
<210>3
<211>4
<212>prt
<213>人工序列
<400>3
glyglysergly
1
<210>4
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<400>4
trpserhisproglnpheglulys
15
<210>5
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<400>5
hishishishishishis
15
<210>6
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<400>6
serserglyhismetalaser
15
<210>7
<211>716
<212>prt
<213>人工序列
<400>7
metleuphetrpileproalaserilesermetlysglnilegluasp
151015
lysileglugluileleuserlysiletyrhisilegluasngluile
202530
alaargilelyslysleuileglygluargglyglyserglymetala
354045
serglyglyalaphecysleuilealaasnaspglylysalaasplys
505560
ileileleualaglnaspleuleuasnserargileserasnilelys
65707580
asnvalasnlyssertyrglylysproaspprogluprothrleuser
859095
glnileglugluthrhisleuvalhispheasnalahisphelyspro
100105110
tyrvalprovalglypheglutyrasnlysvalargprohisthrgly
115120125
thrprothrleuglyasnlysleuthrpheglyileproglntyrgly
130135140
aspphephehisaspmetvalglyhishisileleuglyalacyshis
145150155160
sersertrpglnaspalaproileglnglythrserglnmetglyala
165170175
hisglyglnleuglnthrpheproargasnglytyrasptrpaspasn
180185190
glnthrproleugluglyalavaltyrthrleuvalaspprophegly
195200205
argproilevalproglythrlysasnalatyrargasnleuvaltyr
210215220
tyrcysglutyrproglygluargleutyrgluasnvalargpheasp
225230235240
valasnglyasnserleuaspglutyrserseraspvalthrthrleu
245250255
valarglysphecysileproglyasplysmetthrglytyrlyshis
260265270
leuvalglyglngluvalservalgluglythrserglyproleuleu
275280285
cysasnilehisaspleuhislysprohisglnserlysproileleu
290295300
thraspgluasnaspthrglnargthrcysserhisthrasnprolys
305310315320
pheleuserglnhispheprogluasnserhisasnileglnthrala
325330335
glylysglnaspilethrproilethraspalathrtyrleuaspile
340345350
argargasnvalhistyrsercysasnglyproglnthrprolystyr
355360365
tyrglnproproleualaleutrpilelysleuargphetrppheasn
370375380
gluasnvalasnleualaileproservalserilepropheglyglu
385390395400
argpheilethrilelysleualaserglnlysaspleuvalasnglu
405410415
pheproglyleuphevalargglnserargpheilealaglyargpro
420425430
serargargasnileargphelysprotrppheileproglyvalile
435440445
asngluileserleuthrasnasngluleutyrileasnasnleuphe
450455460
valthrprogluilehisasnleuphevallysargvalargpheser
465470475480
leuileargvalhislysthrglnvalthrhisthrasnasnasnhis
485490495
hisaspglulysleumetseralaleulystrpproileglutyrmet
500505510
pheileglyleulysprothrtrpasnileseraspglnasnprohis
515520525
glnhisargasptrphislyspheglyhisvalvalasnalailemet
530535540
glnprothrhishisalagluileserpheglnaspargaspthrala
545550555560
leuproaspalacysserserileseraspileserprovalthrtyr
565570575
proilethrleuproileilelysasnileservalthralahisgly
580585590
ileasnleuileasplyspheproserlysphecyssersertyrile
595600605
prophehistyrglyglyasnalailelysthrproaspaspprogly
610615620
alametmetilethrphealaleulysproarggluglutyrglnpro
625630635640
serglyhisileasnvalserargalaarggluphetyrilesertrp
645650655
aspthrasptyrvalglyserilethrthralaaspleuvalvalser
660665670
alaseralaileasnpheleuleuleuglnasnglyseralavalleu
675680685
argtyrserthrserserglytrpserhisproglnpheglulysser
690695700
serglyhismetalaserhishishishishishis
705710715
<210>8
<211>2151
<212>dna
<213>人工序列
<400>8
atgttgttctggatccccgcctcaatttctatgaaacagattgaggacaagatagaagag60
atcctttccaagatttaccatatagagaacgaaattgcaaggattaaaaagctcattgga120
gagaggggaggctccggaatggcaagtggaggggccttctgtcttatagccaacgacggt180
aaggctgataagatcatcttggcacaggacctgcttaactcccgtatatccaacataaag240
aatgtaaataaaagctacggaaagcctgaccctgagcccactcttagtcaaatcgaagag300
acacacttggtccactttaatgcacatttcaaaccctacgtgccagtcggattcgaatat360
aataaggttcgaccacatacagggacacccaccctgggcaataagctcaccttcggcata420
cctcaatatggagatttctttcacgatatggtcggacaccacatcctgggtgcctgtcac480
tcctcttggcaagatgctccaatccaaggaacctcacaaatgggcgcccatggacaactc540
caaacatttccacgtaatggttacgattgggataaccaaactcctctcgagggtgccgtt600
tacacactcgtcgaccccttcggacggccaattgttcccggcacaaaaaacgcttataga660
aatcttgtttattattgcgagtaccctggggaacgtctgtacgaaaacgtgaggtttgat720
gtgaacggtaattcacttgatgaatacagttctgatgtgactactttggtgcgaaaattc780
tgcatcccaggagataaaatgactggatacaaacatcttgtgggccaggaagttagtgta840
gaggggacttcagggcccttgctgtgcaacatccacgatctccacaaaccacaccagtcc900
aagcccatccttaccgacgagaacgatactcaaaggacctgttctcataccaatccaaaa960
tttttgagccaacatttccccgaaaattctcacaacattcagacagccggaaaacaagac1020
ataacacccattacagatgccacctaccttgatatacgcagaaacgtacactactcttgt1080
aacggaccccaaacccccaaatattaccagcccccccttgctctttggattaaactccgg1140
ttctggttcaatgagaatgtaaacctggcaattccatcagtgagcattcctttcggagag1200
cgttttatcaccattaagcttgcctcccagaaggatctggtaaatgagttccccggactt1260
ttcgttcgccagagcaggttcatagcaggacgtcccagccgtagaaacatacggttcaag1320
ccttggttcatccctggtgtaatcaatgagatttctcttacaaacaacgaattgtatatc1380
aacaacctgtttgtgactcccgagatacacaacctgtttgtcaagcgagtccgcttcagc1440
ctcatcagagttcataaaacacaagtaactcataccaacaacaaccaccacgacgaaaag1500
cttatgtccgctctgaagtggcctattgagtatatgttcattggtttgaaacctacctgg1560
aacatctccgatcaaaatccacatcagcatagggactggcataagtttggccatgttgtc1620
aacgcaattatgcaacccactcatcacgctgagatatcttttcaagatagggacacagcc1680
ttgccagacgcatgtagtagtatatcagacatatctcccgttacttatcctataaccctc1740
cccatcatcaaaaacatttccgtaacagctcacgggatcaaccttattgataaatttccc1800
agtaagttttgcagtagctatattcccttccactatggaggcaacgctataaaaacaccc1860
gacgatcccggagcaatgatgataactttcgcattgaagccacgagaggagtatcagcca1920
tcaggtcatatcaacgtttcccgtgccagggaattttacatctcatgggatacagattat1980
gttggtagtataacaactgctgatctcgtagtctctgctagtgccattaattttctgctc2040
cttcaaaacggatccgcagtgcttcgttattccacatcttccggctggtctcatcctcag2100
ttcgaaaaatcctcaggtcacatggcatcccatcatcaccaccatcattaa2151
1.一种非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，含有非洲猪瘟病毒的p72蛋白片段和gcn4片段，所述gcn4片段的氨基酸序列如seqidno.1所示。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，其特征在于，所述p72蛋白片段的氨基酸序列如seqidno.2所示；
优选地，gcn4片段融合于p72蛋白片段的n端；
优选地，p72蛋白片段和gcn4片段通过第一连接肽连接；
优选地，所述第一连接肽的序列如seqidno.3所示。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白还含有信号肽；
优选地，信号肽的序列如seqidno.3所示；
优选地，信号肽融合于非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的n端；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白还含有标签；
优选地，所述标签包括strepⅱ标签和his标签；
优选地，strepⅱ标签和his标签依次融合于所述p72片段的c端；
优选地，strepⅱ标签和his标签通过第二连接肽连接；
优选地，所述第二连接肽的氨基酸序列如seqidno.6所示；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由哺乳动物表达系统表达；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由cho细胞表达；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由cho-k1细胞表达。
4.根据权利要求1-3任一项所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，其特征在于，由n端至c端依次为信号肽、gcn4片段、第一连接肽、p72蛋白片段、strepⅱ标签、第二连接肽和his标签；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.7所示；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白由seqidno.8所示核苷酸序列表达。
5.编码权利要求1-4任一项所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因；
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因为如seqidno.8所示序列，或为和seqidno.8所示序列90％以上同源性的序列；
优选地，编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因为如seqidno.8所示序列。
6.生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达权利要求1-4任一项所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白和/或含有权利要求5所述的基因；
优选地，所述载体包括真核表达载体ucoe；
优选地，所述细胞系优选包括cho细胞，更优选包括cho-k1细胞。
7.权利要求1-4任一项所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括在宿主中表达编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的基因；
优选地，使用哺乳动物表达系统表达所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白；
优选地，将表达所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的载体导入宿主细胞，然后对宿主细胞进行处理，得到表达非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的宿主细胞；所述处理包括加压筛选、单克隆化和悬浮驯化中的至少一种；
优选地，使用cho细胞表达所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白；
优选地，所述载体包括真核表达载体ucoe；
优选地，使用cho-k1细胞表达非洲猪瘟病毒p72融合蛋白，提供包含编码所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白基因的表达载体，将所述表达载体导入cho-k1细胞中，对cho-k1细胞依次进行加压筛选、单克隆化和悬浮驯化，得到表达非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的cho-k1细胞。
8.权利要求1-4任一项所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、权利要求5所述的基因、权利要求6所述的生物材料或权利要求7所述的制备方法在如下(x1)～(x5)中至少一种的应用；
(x1)制备用于检测非洲猪瘟抗体的试剂盒；
(x2)制备非洲猪瘟抗体；
(x3)制备用于检测非洲猪瘟抗原的试剂盒；
(x4)制备用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(x5)制备非洲猪瘟疫苗。
9.试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、权利要求5所述的基因和权利要求6所述的生物材料中的至少一种；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.7所示。
10.疫苗，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的非洲猪瘟病毒p72融合蛋白、权利要求5所述的基因和权利要求6所述的生物材料中的至少一种；
优选地，所述非洲猪瘟病毒p72融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.7所示。
技术总结