发明领域
本发明涉及用于治疗疾病的组合物及方法。更具体地，本发明涉及合成蛋白及其用于癌症治疗的用途。
发明背景
根据世界卫生组织的统计，肿瘤形成(如癌症)是世界范围内主要死亡原因之一。2015年，肿瘤形成造成880万人死亡。在全球范围内，癌症的发生率很高：约六分之一的死亡是癌症造成的。2015年，最常见的高死亡率癌症包括：肺癌(约170万人死亡)、肝癌(约80万人死亡)、结直肠癌(约80万人死亡)、胃癌(约80万人死亡)和乳腺癌(约60万人死亡)。
通常采用多种方法中的任何一种方法进行癌症治疗，例如手术、化疗、放射治疗、肿瘤免疫治疗等。遗憾的是，许多方法都造成毒性/不良副作用。例如，标准癌症化学疗法往往会杀死快速分裂细胞，许多癌症化学疗法会造成毒性和不良副作用，例如免疫抑制、恶心、脱发等。过去20年，癌症研究主要旨在找出疗效更好、副作用更少的新疗法。
其中一种疗法被用于肿瘤免疫学，肿瘤免疫学研究的是免疫系统与肿瘤或恶性肿瘤等癌细胞之间的相互作用。癌症特异性抗原的识别等免疫应答的启动特别重要，其中，癌症特异性抗原由人类肿瘤表达，在正常组织中则不表达。为控制恶性细胞分裂和增殖，一般采取分离抗原，然后将其呈现出来的方法，以便免疫系统将其识别为非自体抗原，以诱导特异性免疫应答(例如癌症疫苗)。然而，这种癌症疫苗有一定的局限性，主要是因为生产方法和蛋白产物一致性、活性和同源性的潜在缺乏。例如，癌症疫苗一般包括由利用戊二醛化学偶联的重组载剂蛋白和人源多肽的混合物。遗憾的是，该反应性试剂能够在各种化学基团之间不合期望地形成共价交联键，并且一般会产生高度异质性产物。因此，由此得到的疫苗可能包含载剂蛋白分子，该载剂蛋白分子附着有不同数目(例如，0、1、2、3等)的靶人类多肽，而且该人类多肽均能经由不同的原子附着到载剂上，所以能在不同的位置以不同的方向附着到载剂上。此外，靶多肽和载剂蛋白分子可自行偶联，从而产生多种同源多聚体，该多种同源多聚体可能不具有临床效应，并且可能不对患者产生抗癌的免疫应答。相应地，在癌症免疫治疗方面，迫切需要新的癌症疫苗来克服现有的明显局限性。
技术实现要素：
本发明针对的是合成蛋白/分子及其各自的制造方法；合成蛋白/分子的表征，以及利用合成蛋白/分子治疗慢性疾病(如肺、乳腺、膀胱、前列腺、卵巢、外阴、结肠、结肠直肠、肠道、肺部、脑部、食管、其他癌症和疾病)的治疗方法。
本发明提出了可用于治疗疾病(例如癌症)的合成蛋白。在示例性实施例中，本发明提出了一种合成蛋白/分子，包括来自合成生长因子的一个或多个蛋白结构域、一个或多个连接区以及一个或多个免疫原区。
在一个方面，本发明提出了一种合成蛋白，包括一个合成生长因子序列、至少一个连接物和一个多肽序列。
在示例性实施例中，所述多肽序列包括一个免疫原性多肽序列。在一个示例性实施例中，所述多肽序列包括一种霍乱毒素b(ct-b)蛋白。
在示例性实施例中，所述至少一个连接物包括一个将所述合成生长因子与所述多肽序列分离的第一连接物。在示例性实施例中，所述第一连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。在示例性实施例中，所述第一连接物为ggsggtsgggggsg。
在示例性实施例中，所述合成生长因子序列包括一个合成表皮生长因子(segf)序列。在示例性实施例中，所述合成生长因子序列包括一个人表皮生长因子(hegf)tsp(htsp)结构域的至少一个合成靶信号传导通路(stsp)结构域，其中所述至少一个stsp与htsp相差6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。在示例性实施例中，所述合成生长因子序列包括一个第一tsp结构域和一个第二tsp结构域。
在示例性实施例中，所述至少一个连接物包括一个将所述第一tsp结构域与所述第二tsp结构域分离的第二连接物。在示例性实施例中，所述第二连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。在示例性实施例中，所述第二连接物为gssg。在示例性实施例中，所述合成蛋白具有序列编号2的氨基酸序列。在示例性实施例中，所述合成蛋白根据序列编号1的核酸序列进行编码。
在示例性实施例中，一部分合成生长因子包括存在于所述合成蛋白中的至少两种不同生长因子的一整段或中和域。
在一个方面，本发明提出了一种免疫原性组合物，包括一种合成蛋白，所述合成蛋白包括一个合成生长因子序列、至少一个连接物和一个多肽序列。
在示例性实施例中，所述多肽序列包括一个免疫原性多肽序列。在示例性实施例中，所述多肽序列包括一个霍乱毒素b(ct-b)蛋白。
在示例性实施例中，所述至少一个连接物包括一个将所述合成生长因子与所述多肽序列分离的第一连接物。在示例性实施例中，所述第一连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。在示例性实施例中，所述第一连接物为ggsggtsgggggsg。
在示例性实施例中，所述合成生长因子序列包括一个合成表皮生长因子(segf)序列。在示例性实施例中，所述合成生长因子序列包括一个人表皮生长因子(hegf)tsp(htsp)域的至少一个合成靶信号传导通路(stsp)域，其中所述至少一个stsp与htsp相差6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。在示例性实施例中，所述合成生长因子序列包括一个第一tsp结构域和一个第二tsp结构域。
在示例性实施例中，所述至少一个连接物包括一个将所述第一tsp结构域与第二tsp结构域分离的第二连接物。在示例性实施例中，所述第二连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。在示例性实施例中，所述第二连接物为gssg。在示例性实施例中，所述合成蛋白具有序列编号2的氨基酸。
在示例性实施例中，所述合成蛋白根据序列编号1的核酸序列进行编码。
在示例性实施例中，一部分合成生长因子包括存在于所述合成蛋白中的至少两种不同生长因子的一整段或中和域。在示例性实施例中，所述组合物还包括一种佐剂。
另外，本发明提供了一种患者治疗方法，包括以下步骤：在疫苗接种期间，在同一天或隔天或间隔一定时间，采用免疫原性组合物对患者给药，所述组合物包括一种合成蛋白，所述合成蛋白包括一个合成生长因子序列、至少一个连接物和一个多肽序列。
定义
“bvn22e核酸分子”是指对bvn22e多肽进行编码的多核苷酸。下面显示了一种示例性bvn22e核酸分子(序列编号1)：
“bvn22e多肽”是指与以下氨基酸序列(序列编号2)的氨基酸相同度(不包括以下氨基酸变化：t2s、e3d、n4s、d5e、e11d、a12g、v38i、f44y、r48k、d51e和a52l)为至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的多肽或其片段：
“表皮生长因子受体(egfr)核酸分子”是指一种对egfr多肽进行编码的多核苷酸。在ncbi登录号nm_005228.4处可获得示例性egfr核酸分子，显示如下(序列编号3)：
“表皮生长因子受体(egfr)多肽”是指与ncbi登录号np_005219.2的氨基酸相同度为至少大约85％并具有表皮生长因子(egf)结合活性的多肽或其片段，显示如下(序列编号4)：
“表皮生长因子(egf)核酸分子”是指一种对egf多肽进行编码的多核苷酸。在ncbi登录号nm_001963.5处可获得示例性egf核酸分子，显示如下(序列编号5)：
“表皮生长因子(egf)多肽”是指与ncbi登录号np_001954.2的氨基酸相同度为至少大约85％，并且对应于前蛋白原形式的egf(经过加工，产生53氨基酸egf分子)(以粗体显示)，并且具有egfr结合活性的多肽或其片段，显示如下(序列编号6)：
“神经调节蛋白1(nrg1)核酸分子”是指对nrg1多肽进行编码的多核苷酸。在ncbi登录号bc150609.1处可获得示例性nrg1核酸分子，显示如下(序列编号7)：
“神经调节蛋白1(nrg1)多肽”是指与ncbi登录号aai50610.1的氨基酸相同度为至少大约85％，并具有神经调节蛋白1(nrg1)结合活性的多肽或其片段，显示如下(序列编号8)：
“神经调节蛋白1β(nrg1β)核酸分子”是指对nrg1多肽进行编码的多核苷酸。在ncbi登录号nm_001322205.1处可获得示例性nrg1β核酸分子，显示如下(序列编号9)：
“神经调节蛋白1β(nrg1β)多肽”是指与ncbi登录号np_001309134.1的氨基酸相同度为至少大约85％，并具有神经调节蛋白1(nrg1)结合活性的多肽或其片段，显示如下(序列编号10)：
“nrg-bvn杂合多肽”是指与下面的氨基酸序列的氨基酸相同度为至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的多肽或其片段(序列编号11)：
“tgfα杂合多肽”是指与下面的氨基酸序列的氨基酸相同度为至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的多肽或其片段(序列编号12)：
这里的范围可以表示为从“大约”一个特定值和/或到“大约”另一个特定值。当表示此类范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。同样，当数值表示为近似值时，可使用前述的“大约”，可以理解为特定值构成了另一方面。另外，每个范围的端点相对于另一端点都很重要，并且独立于另一端点。本文公开了许多值，除了值本身以外，每个值“大约”等于该特定值。在整个应用中，数据以不同的格式呈现，并且该数据代表了任何数据点组合的端点、起点和范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和“15”，则可以理解为，大于、大于等于、小于、小于等于以及等于10和15视为已经公开，并且介于10和15之间。还可以理解为，同时公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则同时还公开了11、12、13和14。
本文提供的范围可以理解为范围内所有值的简写。例如，1到50这一范围可以理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50构成的小组中的任何数字、数字组合或子范围，以及上述整数之间的所有区间十进制值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，需要特别考虑从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1到50的嵌套子范围可以包括1到10、1到20、1到30和1到40，或者50到40、50到30、50到20和50到10。
即使本发明从不同方面对所述实施例进行了说明，在适用或未明确放弃权利的情况下，本文所述的任何一个实施例预期也能够与任何其他一个或多个实施例组合。
以下附图说明公开和/或包含了这些实施例和其他实施例。
附图说明
以下附图说明通过示例给出，但本发明不仅限于所描述的特定实施例，最好是结合附图来理解所述附图说明，其中：
图1a-1b描绘了本发明示例性实施例所述的合成蛋白的结构域和特征。图1a描绘了bvn22e的氨基酸序列，包括以单下划线显示的靶信号传导通路(tsp)结构域1和2，以双下划线显示的两个连接序列，以及以点下划线显示的免疫原性载剂域。图1b显示了与人egf(hegf)相应区域比对的bvn22e合成表皮生长因子(segf)区域的clustalomega比对结果；
图2显示了本发明示例性实施例所述的5只家兔的纯化igg分数滴定图，其中5只家兔采用bvn22e与1μg/ml浓度包被的固定化重组人表皮生长因子(rhegf)结合进行免疫；
图3显示了本发明的示例性实施例所述的5只家兔的混合igg分数比较图，其中5只家兔采用bvn22e或含有2个天然表皮生长因子(egf)结构域的等效蛋白进行免疫；
图4a-4b显示了免疫印迹法，说明了bvn22e具有刺激磷酸化的能力。图4a显示了免疫印迹法，说明了bvn22e能够在与类似分子(包含天然人egf结构域)相同的程度上，根据浓度刺激a431细胞的表皮生长因子受体(egfr)的磷酸化。图4b显示了与egf分子未进行比较情况下的另一种结果；
图5描绘了免疫印迹法，表明采用两种浓度的bvn22e免疫后5只家兔的纯化混合igg能够用30ng/mlrhegf中和a431细胞的egfr活化，其方式类似于市面上销售的中和单克隆抗体方法；
图6描绘了免疫印迹法，表明采用bvn22e免疫的5只家兔的血清能够用30ng/mlrhegf中和a431细胞的egfr活化，其方式类似于市面上销售的中和单克隆抗体方法；
图7描绘了免疫印迹法，表明仅一次升压注射(试验采血1；泳道6)后，经过bvn22e免疫的家兔的混合血清能够中和a431细胞上30ng/mlrhegf的egfr信号传导，其效果与中和单克隆抗体相同。免疫前的动物血清无中和活性(泳道5)；
图8描绘了免疫印迹法，表明bvn22e免疫后的家兔血清中纯化的igg的中和活性与采用仅含有天然egf结构域的类似分子进行免疫的动物活性类似；
图9描绘了免疫印迹法，表明来自bvn22e免疫小鼠或含有化学偶联天然人egf(hegf)免疫原的小鼠的混合血清(n＝10)抑制了egf信号传导通路。泳道4-6表明，与天然hegf的免疫原相比，bvn22e免疫产生的egf中和能力更强。
图10显示了合成nrg-ctb分子的考马斯亮蓝染色sds凝胶，其中un＝天然，d＝热变性，r＝还原，rd＝还原和变性。
图11显示了合成nrg-ctb分子的抗nrg免疫印迹法，其中un＝天然，d＝热变性，r＝还原，rd＝还原和变性。
图12显示了mcf-7细胞活化分析结果。顶图显示了rhnrg-1β(泳道2)对erb3受体的活化(如磷酸化)、合成nrg-ctb分子(泳道4)以及中和抗体对两者的抑制作用(泳道3和5)，而下图显示了erb3受体表达的控制情况。
图13a-13c显示了合成tgfα分子的sds凝胶。图13a显示了考马斯亮蓝染色sds凝胶。图13b显示了图13a中sds凝胶的免疫印迹法，sds凝胶已采用抗tgf抗体进行染色，表明合成tgfα分子由两种不同的中和抗tgfα抗体识别。图13c显示了图13a中sds凝胶的免疫印迹法，sds凝胶用抗egf抗体染色，表明两种不同的抗egf抗体并未识别合成tgfα分子。
图14描绘了经考马斯亮蓝染色的蓝色天然凝胶，表明合成tgf分子的纯化能够产生一条五聚体条带。
图15a-15b分别显示了经考马斯亮蓝染色的sds凝胶和抗tgfα免疫印迹法，表明合成tgf-a分子具有高稳定性，在升高温度(如室温和37℃)的条件下超过三周后，依然是离散的五聚体条带。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下发现：合成蛋白/分子，包括来自合成生长因子的一个或多个蛋白结构域、一个或多个连接区和一个或多个免疫原结构域，可用于治疗癌症等多种疾病。与现有技术相比，所述合成分子具有一些明显优势。例如，在现有技术中，人表皮生长因子(hegf)分子(例如，davila等人的美国专利5,984,018)存在于含有多达12种不同分子种类的非均匀混合物中，但是本文所述的合成蛋白/分子可作为单个分子(例如，分子的同质群体)产生。此外，本文所述的每个合成蛋白/分子包括10个活性组分(尽管活性组分可以以5的倍数增加或减少，例如作为五聚体的一部分)，然而，对于现有技术hegf分子(例如，davila等人的美国专利5,984,018)，每个分子中存在的活性组分数量变化极大(例如，davila每个分子的活性组分平均数量为1.5)。此外，本文所述的合成蛋白/分子更易于生产。例如，现有技术的hegf分子(例如，美国专利5,984,018)通过对rp64k和重组人egf(rhegf)进行化学偶联制成，从而产生由两个相互化学偶联的分子所组成的最终分子。这与本文所述的合成蛋白/分子形成鲜明对比，后者为单个合成分子。很明显，本文的技术提供了新颖的合成蛋白，可用于治疗癌症等疾病(例如，癌症疫苗)，其免疫原性活性水平高于现有技术方法(例如，美国专利5,984,018)。
概述
癌症免疫学研究的是免疫系统与癌细胞(例如肿瘤或恶性肿瘤)之间的相互作用。免疫应答激活特别值得关注，其可识别由人类肿瘤表达而非在正常组织中表达的癌特异性抗原。为了控制恶性细胞分裂和增殖，一般采取分离抗原，然后将其呈现出来的方法，以便免疫系统将其识别为非自体抗原，以诱导特异性免疫应答。
目前已经发现了大量生长因子，而且除了与其他病症有关以外，大多数(如非全部)生长因子已经被证明是各种癌症细胞增殖的重要中介体。生长因子一般为可溶性血清蛋白，可识别位于细胞表面的一组生长因子受体，并与其结合。特定的生长因子可能对单个受体有特异性，也可能与多个具有不同亲和力的密切相关受体结合。类似地，一些受体仅与单个生长因子配体结合，而另一些受体可与多个相关生长因子结合，这些相关生长因子通常也具有不同的亲和力。一旦与其天然受体结合，受体的胞浆结构域就会发生磷酸化作用，启动细胞内信号传导级联，导致一个或多个基因的转录调控，最终通过细胞周期和细胞增殖发展。
生长因子及其受体是正常生长、发育和修复过程的重要组成部分，其组织分布特征和表达水平对细胞生长有着有效的调节作用。大量研究表明，生长因子可以在体内外刺激多种细胞类型的增殖(cohens.，carpenterg，美国国家科学院院刊(pnas)72，1317，1975，witsche等人：生理学：25(2)：85-101，(2010))。此外，经证明，某些生长因子可刺激某些癌细胞株的增殖。例如表皮生长因子(egf)可以刺激一些非小细胞肺癌细胞(osbomec.k.等人《癌症研究》40，2.361(1980))。其他生长因子，如血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和血小板衍生生长因子(pdgf)可显著提升对非小细胞肺癌(nsclc)(ballasms，chachouaa.，肿瘤靶标和治疗：4，43-58(2011))，前列腺癌(coxme等人；前列腺69(1)：33-40(2009))和乳腺癌(lawj等人，癌症研究；68，24：10238-10346(2008))等几种肿瘤疾病的治疗效果。
据报道，恶性组织中存在高水平的多种生长因子受体。例如，在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺癌、脑癌和食道癌等上皮组织来源的恶性肿瘤中已检测到异常高水平的表皮生长因子受体(egfr)。生长因子及其受体在调节肿瘤生长方面的作用尚不得而知，但有迹象表明，肿瘤细胞中的生长因子受体表达为自分泌生长刺激提供了一种机制，从而导致不受控制的增殖(schlessingerj.，schreibera.b.，levia.，libermant.，yardeny.《生物化学与分子生物学评论》1983，14(2)93-111)。此外，liaoy等人；humpathol36(11)：1186-1196(2005)和coxme等人；《前列腺》：69(1)33-40(2009)描述了胰岛受体和生长因子可更好地治疗转移性前列腺癌。
对于癌症治疗，靶生长因子信号传导的一种治疗策略是，采用针对特定受体/关联受体的被动免疫疗法(如单克隆抗体)。这类研究已经证明，能够抑制配体结合的受体抗体的特异识别性能够对恶性细胞的有丝分裂原刺激起到抑制作用(satoj.d.等人《酶学方法》，第146卷，第63-81页，1987年)。然而，鼠源性抗体通常会产生人抗鼠抗体反应(hama)，因而限制了单一给药。
其它治疗方案利用疫苗的主动免疫性，其中疫苗包含生长因子，以诱导针对该分子的免疫应答，从而抑制该生长因子对肿瘤的增殖影响。例如，davila等人的美国专利5,984,018标题为“具有抗肿瘤活性的包括自体表皮生长因子或其片段或其衍生物的疫苗组合物及其在治疗恶性疾病中的应用”，公开了一种疫苗的用途，该疫苗包含利用戊二醛化学偶联在一起的生长因子和免疫原性(即非人类)载剂蛋白的混合物。然而，在不受任何特定理论限制的情况下，人们认为，化学偶联阻碍了针对疫苗的免疫应答。
因为要求宿主对‘自身抗原’产生免疫应答，而脊椎动物免疫系统已经进化，能够防止这种应答出现，所以这是一种具有技术挑战性的方法。例如，在对自身抗原产生强烈免疫应答时，通常会导致辅助性t细胞激活，即一种自身免疫疾病状态。多年来，已经假设了狼疮、多发性硬化(ms)、糖尿病等一些自体免疫疾病可能由于较早地暴露于环境因素引起，这些环境因素包括紧密模拟宿主自身表位的免疫原性表位(t-细胞表位)。这可能会导致刺激与宿主表位进行交叉反应的辅助性t细胞。随后暴露于环境因素可能会导致抗自身免疫应答(albert，l.j.和inman，r.d，《新英格兰医学期刊》，12月30日第2068-2074页，1999年)。经证实，病毒抗原确实能够产生针对神经细胞蛋白的抗自身免疫应答(levin，m.c.等人，《自然医学》第8卷(5)第509-513页，2002年)。
casimiro等人的美国专利2006/0251654标题为“恶性传染性慢性病的治疗方法”(′654公布文件)，公开了一种恶性或传染性慢性疾病患者主体的治疗方法，包括以下步骤：利用一种疫苗对主体进行免疫，所述疫苗包含与恶性或传染性慢性疾病相关的自身抗原，所述自身抗原与载剂蛋白偶联；利用一种免疫调节剂对主体进行治疗；利用步骤1的疫苗以及一种从氢氧化铝和montanideisa51(seppic，法国巴黎)中选择的适当佐剂，对主体再次进行免疫。遗憾的是，人们认为通过化学偶联制备疫苗阻碍了免疫应答。
上述大多数疫苗均存在一定的局限性，主要是因为蛋白产物的生产方法以及潜在缺乏一致性和同源性。上述疫苗通常包括利用戊二醛化学偶联的重组载剂蛋白和人源多肽的混合物。遗憾的是，该反应性试剂能够在各种化学基团之间形成共价交联键，并且通常会产生高度异质产物。因此，由此得到的疫苗可能不仅包括载剂蛋白分子，还包括附着的不同数目(例如，0、1、2、3等)的靶人类多肽，人类多肽均能通过不同的原子在不同的位置和不同的方位上附着到载剂上。此外，靶多肽和载剂蛋白分子可自身偶联，产生多种同源多聚体，而同源多聚体可能不具有临床疗效，对产生抗癌免疫应答不会起到积极作用。
合成蛋白/分子
本发明提出了一种均质合成蛋白/分子，用于促进将最大数量的生长因子表位、肿瘤抗原表位和/或受体结合部位呈现为免疫原性合成蛋白/分子的要素。在一个示例性实施例中，描述了一种合成蛋白/分子，能够表达一个免疫原性载剂结构域(例如霍乱毒素b(ct-b))、一个合成表皮生长因子(segf)、一个肿瘤抗原和/或一个受体的全部或部分内容。在替代的示例性实施例中，所述蛋白可以表达其他免疫原性合成或重组蛋白/分子，所述免疫原性合成或重组蛋白/分子根据已知免疫原性蛋白建立模型。在本发明的范围内，预计此类合成蛋白/分子可以表达对人体免疫系统具有高度免疫原性的多肽。优选地，合成蛋白/分子赋予嵌合蛋白额外的性质，例如，高表达率、易于生产、口服稳定性、跨过肠道进入血流的能力和/或先前在人类中的安全使用。
在示例性实施例中，本文公开的合成蛋白/分子可包括或表达作为总分子量函数的高比例蛋白序列，所述蛋白序列源自靶点自身抗原。例如，可以利用包含多个生长因子表位的大蛋白模型来实现这一目的。这些生长因子表位可以是单一生长因子的整体或部分的多个拷贝，或者多种不同生长因子的整体或部分的拷贝。这些生长因子表位可以自然发生，也可以合成(例如人工合成)。例如，本文所述的示例性合成蛋白bvn22e的分子量约为120kd。在示例性实施例中，本文所述的生长因子表位可对应于生长因子内的一个或多个结构域(例如，egf靶信号传导通路(tsp)结构域)。在示例性实施例中，egf结构域可包括呈现或约束β环的区域，例如，由合成蛋白序列的大约半胱氨酸6到大约半胱氨酸42定义的区域，由大约半胱氨酸6到大约半胱氨酸31定义的区域，或者由大约半胱氨酸22到大约半胱氨酸33定义的区域，或者由大约半胱氨酸22到大约半胱氨酸31定义的区域，或者由大约半胱氨酸62到大约半胱氨酸14定义的区域(例如图1a)。在不受任何特定理论限制的情况下，在本发明的范围内，预计半胱氨酸6和半胱氨酸42之间的不同区域或子区域在并入本发明的合成蛋白/分子时可以具有有益效果。例如，以下区域可具有有益效果：半胱氨酸6和半胱氨酸14之间的区域，半胱氨酸6和半胱氨酸20之间的区域，半胱氨酸6和半胱氨酸31之间的区域，半胱氨酸6和半胱氨酸33之间的区域，以及半胱氨酸6和半胱氨酸42之间的区域。在本发明的范围内，还预计反向渐进序列也可以具有有益效果。例如，以下区域可具有有益效果：半胱氨酸42和半胱氨酸33之间的区域，半胱氨酸42和半胱氨酸31之间的区域，半胱氨酸42和半胱氨酸20之间的区域，半胱氨酸42和半胱氨酸14之间的区域，以及半胱氨酸42和半胱氨酸6之间的区域。在本发明的范围内，进一步预计当并入本发明的合成蛋白/分子中时，半胱氨酸6和半胱氨酸42之间的区域内的特定间隔可具有有益效果(例如，半胱氨酸6和半胱氨酸14之间的区域、半胱氨酸14和半胱氨酸20之间的区域、半胱氨酸20和半胱氨酸31之间的区域以及半胱氨酸33和半胱氨酸42之间的区域)。
根据本发明，生长因子表位的表达应进行折叠，使其天然构象基本保留并呈现为宿主免疫系统的组分，从而激发对所述表位的强烈宿主免疫应答。为了建立模拟合成蛋白/分子的表位支撑结构域的模型，适当的天然蛋白质模型的示例包括但并不限于：霍乱毒素b亚单位、大肠杆菌热-不稳定lt和lt-ii肠毒素b亚单元、肠毒、百日咳毒素、空肠弯曲菌肠毒素、志贺毒素、李斯特菌毒素、破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白、噬菌体外壳蛋白、腺病毒及其他病毒外壳蛋白。或者，蛋白质的非己组分可能很小。非己序列在长度上至少应包括大约9、10、11或更多个氨基酸，并包括至少一个人类t-细胞表位的全部或部分。如本文所述，可使用非天然的合成多肽(例如bvn22e)来满足以下要求：使整个蛋白具有免疫原性，使宿主免疫系统适当地呈现生长因子、受体、肿瘤抗原或其表位。
根据本发明，所述合成蛋白/分子——无论是生长因子还是其部分、细胞受体还是其部分、肿瘤抗原还是其部分——均涉及参与慢性疾病或基于生长因子和受体癌症的广泛细胞通路，和/或在所述合成蛋白内用作肿瘤抗原的广泛实体瘤。所述蛋白形式为合成蛋白/分子，有助于治疗乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺动脉癌、脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、头颈癌和食管癌等慢性疾病。由于在所述疾病中可以表达不同的肿瘤抗原，并且可以过表达多种细胞受体和生长因子，因此下文所述的蛋白可包含与疾病相关的一个或多个不同的肿瘤抗原、一个或多个细胞通路的一个或多个不同的受体或生长因子。这些蛋白被称为“多价体”。
在示例性实施例中，公开了一种包括均质合成蛋白/分子的蛋白，所述均质合成蛋白/分子表达一个或多个表皮生长因子(egf)中和结构域(例如tsp结构域)。所述蛋白形式可以是合成蛋白/分子，有助于治疗乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、外阴癌、结肠癌、肺动脉癌、脑癌、结肠直肠癌、头颈癌和食道癌等慢性疾病。在示例性实施例中，所述蛋白为表达或含有合成egf序列和ct-b序列的合成蛋白/分子，如图1a所示。在示例性实施例中，合成蛋白质序列的生长因子组分可包括一个与egf相似度小于80％的序列。例如，生长因子组分可包括一个具有11个氨基酸置换的egf序列，所述序列可以增加合成蛋白序列的生长因子部分的免疫原性。在不受理论限制的情况下，人们相信egf中‘呈现’或约束β环的区域(例如，cys6到cys31定义的区域)可以是合成蛋白中包含的重要组成部分，并且适用于氨基酸修饰靶点。在示例性实施例中，cys6到cys31以外的区域也可以作为修饰的靶点(例如e11和a12)。
在示例性实施例中，如图1b所示，hegf的tsp1和tsp2结构域可以进行修饰，从而在在本文合成蛋白/分子中创建合成egf(segf)区域。
在示例性实施例中，本文公开的合成蛋白/分子可包括全部或部分生长因子，包括但不限于神经调节素1β(nrg1β)、转化生长因子α(tgfα)、血管内皮生长因子(vegf)等生长因子。
在其它示例性实施例中，本文所述的合成蛋白/分子可包括一个或多个连接物或间隔物。上述实施例中的一个或多个实施例包括与ct-b融合的segf，融合方式可以使合成分子的segf部分通过ggsggtsgggggsg连接物与ct-b部分分离。这些由此产生的重组或嵌合蛋白基本上包括与ct-b直接融合的segf。在其他示例性实施例中，嵌合蛋白的egf和ct-b组分通过3至14个氨基酸进行了有效分离，在两个域之间形成了一个柔性间隔物或连接物。在本发明的范围内，预计所述连接物的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。在某些情况下，生长因子尺寸较大(例如，人类生长因子)，使用较长的连接序列可能会有帮助。可使用以下典型连接物，包括但不限于：ssg、ssggg、sgg、gssg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg。本领域的技术人员应该理解，还有许多主要‘g’和‘s’的其他序列/组合也可作为有用的连接序列。
在不受任何特定理论限制的情况下，预计本文公开的合成蛋白/分子会产生显著的临床效益。例如，本文公开的合成蛋白/分子可在在商业规模和纯度的细菌系统中表达，同时产生正确折叠并具有一定功能性的稳定多肽。另外，本文公开的合成蛋白/分子能够形成五聚体。此外，由于所需的载剂量明显低于现有技术方法(例如，davila等人的美国专利5,984,018)，因此本文公开的合成蛋白/分子的优越特性在于，疫苗接种要求的蛋白质水平较低。在这方面，本文公开的合成蛋白/分子能够以显著较低的疫苗量向患者传递更多的生长因子。
佐剂
本文提供的某些示例性实施例包括疫苗组合物和免疫佐剂组合物(包括药用组合物)内的本发明的合成蛋白/分子，还包括至少一种佐剂，佐剂是指这类组合物中具有佐剂活性的组分。具有所述佐剂活性的佐剂包括一种组合物，当采用所述组合物对人(例如，人类患者)、非人类的灵长类动物、哺乳动物或具有公认免疫系统的另一高级真核生物等主体给药时，所述组合物能够改变(即以统计学显著的方式增加或减小，在某些优选实施例中则为增强或增加)免疫应答的效力和/或持续时间。在本文公开的某些示例性实施例中，一种蛋白载剂内包含的所需抗原和或多种抗原以及任选地一种或多种佐剂可以改变(例如激发或增强)针对所需抗原和或多种抗原的免疫应答，所述所需抗原和或多种抗原可在同一时间给药，或以一定时间和/或空间(例如，在不同的解剖位点)间隔独立给药。但某些示例性实施例并非如此限定，因而还要考虑到某一组合物中合成蛋白/分子的给药，所述组合物并不包括特定抗原，但可以包括但不限于一种或多种辅佐剂，即咪唑并喹恶啉免疫应答调节剂。
因此，如上所述，佐剂包括具有佐剂效果的组合物，如皂苷和皂苷类似物，包括qs21和qs21类似物(参见美国专利5,057,540、ep0362279b1、wo95/17210)、明矾、番茄素等植物生物碱、诸如(但不限于)皂苷、聚山梨醇酯80、span85和硬脂酰酪氨酸等去垢剂、一种或多种细胞因子(例如gm-csf、il-2、il-7、il-12、tnf-α、ifn-γ)、咪唑并喹啉免疫应答调节剂以及双茎环免疫调节剂(dslim，例如weeratna等人2005年《疫苗》23：5263)。
例如，美国专利6,544,518；lacaille-dubois，m和wagnerh.(1996年《植物医学期刊》(phytomedicine)2：363-386)，美国专利5,057,540，kensil，《治疗药物载剂系统的研究进展》(crit.revtherdrugcarriersyst)，1996，12(1-2)：1-55和ep0362279b1中提出了含有皂苷的去垢剂。称为免疫刺激复合物(iscoms)的颗粒结构包括quila(皂甙)组分，具有溶血活性，并且已经用于疫苗生产(morein，b.，ep0109942b1)。据报道，这些结构具有佐剂活性(ep0109942b1；wo96/11711)。具有溶血活性的皂苷qs21和qs17(经hplc纯化的quila组分)是有效的系统性佐剂，美国专利5,057,540和ep0362279b1中公开了其生产方法。这些参考文献中还描述了qs7(quil-a的非溶血性组分)的用途，qs7可作为系统性疫苗的有效佐剂。kensil等人(1991年《免疫学杂志》146：431-437)进一步说明了qs21的用途。qs21与聚山梨醇酯或环糊精的组合物是已知的组合物(wo99/10008)。wo96/33739和wo96/11711中说明了包括quila组分(如qs21和qs7)的颗粒佐剂体系。在系统性接种疫苗的研究中，已经使用的其他皂苷包括源自丝石竹(gypsophila)和肥皂草(saponaria)等其他植物物种的皂苷(bomford等人，《疫苗》，10(9)：572-577，1992)。[0203]七叶素是与皂苷相关的另一种去垢剂，用于本文公开的实施例的佐剂组合物中。在默克(merk)索引(12.sup.thed.，条目3737)中，七叶素被描述成存在于七叶树(horsechestnuttree)、欧洲七叶树(aesculushippocastanum)种子中的皂苷混合物。通过色谱分离和纯化(fiedler，arzneimittel-forsch.4，213(1953))以及离子交换树脂法(erbring等人，美国专利3,238,190)，对七叶素的分离进行了说明。七叶素组分(又称七叶皂甙钠)已经纯化，表现出生物活性(yoshikawam等人(《化学与药物通报》(chempharmbull)(东京)1996年8月；44(8)：1454-1464))。毛地黄皂苷是另一种去垢剂，在默克索引(12thed.，条目3204)中称为皂苷，源自紫花洋地黄(digitalispurpurea)的种子，并根据gisvold等人，《美国药物协会杂志》，1934,23,664以及rubenstroth-bauer，physiol.chem.，1955,301,621中描述的步骤进行纯化。
根据本文公开的某些实施例，所使用的其它佐剂或辅佐剂包括嵌段共聚物或可生物降解聚合物，所述嵌段共聚物或可生物降解聚合物指在相关领域中常见的一类聚合化合物。可包括在疫苗组合物或免疫佐剂中的嵌段共聚物或可生物降解聚合物的示例包括pluronic.rtm.l121(新泽西州芒特奥利夫市巴斯夫公司(basfcorp.)；例如参见yeh等人1996年《药学研究》13：1693)。
某些进一步的示例性实施例涉及免疫佐剂，所述免疫佐剂包括但不限于油状物，在一些实施例中，所述油状物有助于辅佐剂的活性，而在其他实施例中，所述油状物可以附加地或替代地提供药学上可接受的载剂或赋形剂。可以选择任何数量的适当油状物，加入到在本发明的疫苗组合物和免疫佐剂组合物中。所述油状物的示例(以实例说明，但并非限制)包括角鲨烯、角鲨烷、矿物油、橄榄油、胆固醇和二缩甘露醇单油酸酯。
在本领域中，咪唑并喹啉免疫应答调节剂等免疫应答调节剂是一种已知调节剂，也可作为佐剂或辅佐剂包含在某些目前公开的实施例中。
如上所述，根据本文所述的公开内容，用于疫苗组合物的一种类型的佐剂或辅佐剂可以是铝辅佐剂，所述铝辅佐剂通常称为“明矾”。明矾辅佐剂包括以下物质：铝氧-氢氧化物；铝-羟基磷酸；或各种专用盐。，因为明矾辅佐剂安全记录良好，提高了抗体应答，稳定了抗原，大规模生产相对简单，所以明矾辅佐剂具有有益效果。(edelman2002年《分子生物技术》21：129-148；edelman，r.1980年《感染性疾病热点回顾》2：370-383.)
药物组合物
在某些示例性实施例中，药物组合物是一种疫苗组合物，包括本发明所述的合成蛋白/分子，还可进一步包括本文提出的一种或多种组分，所述一种或多种组分为tlr激动剂、辅佐剂(例如包括细胞因子、咪唑并喹啉免疫应答调节剂和/或dslim)等和/或重组的表达构建体，与药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂结合。
示例性载剂所采用的剂量和浓度对主体无毒。对于包括合成蛋白/分子的疫苗，通常通过皮内、皮下、肌内或静脉内途径或通过其它途径进行给药，剂量为大约0.01μg/kg至大约100mg/kg体重。
对于本领域技术人员显而易见的是，根据宿主的应答来确定给药的次数和频率。用于治疗用途的“药学上可接受的载剂”在制药技术中众所周知，例如迈克出版公司(mackpublishingco.)的雷明登氏药学全书(remington′spharmaceuticalsciences)(a.r.gennaro1985版)中对此进行了说明。例如，可以使用生理ph的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。在药物组合物中，可以提供防腐剂、稳定剂、染料，甚至调味剂。例如，可以添加苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。此外，还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
药物组合物可以采用任何形式对患者进行组合物给药。例如，所述组合物可以是固体、液体或气体(气溶胶)。典型给药途径包括但不限于口服、局部、胃肠外(例如舌下或口颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内(例如喷雾)。本文中使用的术语“肠胃外”包括离子电渗疗法、超声促渗法、被动经皮、微针给药，也包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内、海绵体内、鞘内、道内、尿道内注射或输注技术。在具体实施例中，本文所述的组合物(包括疫苗和药物组合物)采用离子电渗疗法、微小气泡形成、超声促渗或微针技术经皮内给药。
对患者进行组合物给药时，药物组合物的配方允许其中包含的活性成分具有生物相容性。给药的组合物采取一种或多种剂量单位，例如，片剂可以是单一剂量单位，气溶胶形式的一种或多种化合物的容器可以采取多种剂量单位。
对于口服给药，可以存在赋形剂和/或粘合剂，例如蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。也可存在着色剂和/或调味剂。也可采用包衣壳。
组合物可以是酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液等液体。液体可以口服给药，也可以注射给药，这是两个示例。口服给药时，优选的组合物包含增甜剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。注射给药时，组合物可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
本文所使用的液体药物组合物，无论是溶液、悬浮液还是其它类似的形式，都可以包括以下载剂或赋形剂中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠，固定油，例如角鲨烯、角鲨烷、矿物油、二缩甘露醇单油酸酯、胆固醇和/或可作为溶剂或悬浮介质的合成单或双甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苄醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，用于调节渗透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可封装在安瓿瓶、一次性注射器或玻璃或塑料材质的多种剂量西林瓶中。对于可注射的药物组合物，优选无菌药物组合物。
在具体实施例中，本发明的药物或疫苗组合物包括小于0.2um的稳定水性悬浮液，并进一步包括磷脂、脂肪酸、表面活性剂、去垢剂、皂甙、加氟脂质等中的至少一种组分。
还有一种可取的做法是，在疫苗或药物组合物中包括其它组分，例如递送载剂，包括但不限于铝盐、油包水乳剂、可生物降解的油载剂、水包油乳剂、可生物降解的微胶囊和脂质体。在这类载剂中使用的其他免疫刺激物质(辅佐剂)的示例如上所述，可以包括n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸-d-异谷氨酰胺(mdp)、葡聚糖、il-12、gm-csf、γ干扰素和il-12。
虽然在本发明的药物组合物中可采用本领域普通技术人员已知的任何适当的载剂，但是，根据给药方式和是否期望持续释放，载剂的类型会发生变化。对于皮下注射等肠胃外给药，载剂优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给药，可采用任何上述载剂或固体载剂，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。对于本发明药物组合物所使用的载剂，也可采用可生物降解的微球体(例如，聚乳酸)。
药物组合物也可包含：稀释剂(如缓冲液)、抗氧化剂(如抗坏血酸)、低分子量(少于大约10个残基)的多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物(含有葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(如edta)、谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水都是示例性的适当稀释剂。优选地，利用适当的赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂，可将产品配制成冷冻干产物。
在示例性实施例中，无论源白天然还是合成的多肽序列，所述合成蛋白/分子的表位或受体支持结构域都应具有在适当的化学/环境条件下自组装成低聚多聚体的能力，或者在替代条件下还原为单体的能力。理想情况下，多聚化结构域将组装成具有精细量亚单元的稳定多聚体，例如二聚物、三聚物、四聚物、五聚物等，以便生成大小均一的产物。天然多肽的示例包括但不限于：亮氨酸拉链、乳糖阻抑蛋白、链霉亲和/亲和素、霍乱毒素b亚单元、假单胞菌三聚化结构域和病毒衣壳蛋白。
在示例性实施例中，公开了一种多价分子的制备方法。在此示例性实施例中，所述方法包括：从单体亚单元组装多聚体，形成包括一种或多种肿瘤抗原、受体和/或生长因子或其部分的合成蛋白。
在另一示例性实施例中，公开了一种疫苗制剂的制备方法。在此示例性实施例中，所述方法包括：将一种或多种单一的单价多聚体混合在一起，制备一种包括合成蛋白/分子的多价疫苗，所述合成蛋白/分子包括至少一种或多种肿瘤抗原、受体和/或生长因子或其部分。
在另一示例性实施例中，公开了一种患者的治疗方法。在此示例性实施例中，所述方法包括：在疫苗接种期间，在同一天或隔天或间隔一定时间，采用一种或多种单价体、一种肿瘤抗原、受体和/或生长因子、重组蛋白分别对患者给药。
当合成蛋白/分子被描述成包括或表达肿瘤抗原、生长因子和/或受体至少一种序列的全部或部分的一种或多种组合并且包括或表达ct-b序列时，所述合成蛋白/分子可以包括天然ct-b序列，或与天然ct-b序列基本相似的序列和/或合成序列。当合成蛋白/分子被描述成包括或表达ct-b序列时，所述合成蛋白/分子可以包括或表达ct-b序列的衍生物，或与ct-b序列基本相似的序列。
当结合某些实施例描述并说明均质合成蛋白/分子表达或并入一种或多种肿瘤抗原、合成生长因子和/或受体时，对本领域技术人员来说，许多变型和修改将变得显而易见，并且可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行。因此，本发明不局限于如上所述方法或构造的精确细节，此类变型和修改也应涵盖在本发明的范围之内。
示例
以下示例进一步举例说明了本发明，但不应解释为对本发明的限制。在整个申请中引用的所有参考文献、genbank登录号和基因编号以及已发表的专利和专利申请的内容均通过引用并入本申请中。本领域技术人员应认识到，本发明在实施过程中可以对所公开的结构、材料、组合物和方法进行变动，并且这种变动视为在本发明的范围内进行。
示例1：bvn22e免疫方案
采用500毫升(ml)bl21plys6细胞的胞浆作为包涵体，采用标准方案在其中对bvn22e进行表达。通过离心分离排除体，洗涤，并在10ml8m尿素2mmdtt中溶解。在1小时内，将1毫升蛋白液逐滴稀释，重新折叠成100ml50mmtris-hcl缓冲液2m尿素，1mmdttph7.4，含氧化还原缓冲剂(gsh/gssg)。在4℃下储存蛋白，使其能够继续折叠。
通过渗析，将大部分折叠的蛋白缓冲式交换到50mmtrsi-hclph8.0中，然后在‘hitrap’hpq柱上通过离子交换色谱法(iex)进行纯化。通过分步洗脱，分离出相当于洗脱bvn22e的组分，并在sephadex75尺寸排阻柱上进一步纯化，从其他低聚物状态中分离出五聚体蛋白，然后采用标准方法进一步纯化，除去内毒素。
使用以下时间表，将所述蛋白免疫接种到家兔(n＝5)，每次注射100μg弗氏完全佐剂(仅限初级注射)或弗氏不完全佐剂(升压注射)：
用标准辛酸沉淀法，对个别家兔的血清进行纯化，分离出igg组分，然后对纯化后的抗体进行混合，或者单独检测。
示例2：elisa结合测定
在室温下用1μg/ml的100μlrhegf涂覆孔板1小时，用pbs洗涤3次，然后每个孔中加入200μl2％bsa封闭2小时。如前所述洗涤孔板，并在第一孔中加入200μl纯化的igg。从第一孔中用移液器吸取100微升，注入相邻孔内的100μlpbs中，并在孔板上进行连续2倍稀释。孔板在室温下孵育1小时，然后按照上述方法洗涤。按规定加入hrp标记的抗兔二级抗体，室温孵育1小时后用pbs-tween洗涤。每个孔中加入100微升的tmb底物溶液，并孵育至显色。使用50μl1mh2so4停止反应，并在450nm下读数。
如图2所示，在rhegf结合测定中，在1000-1000000倍连续稀释范围内，五只免疫家兔中每一只免疫家兔的纯化igg组分滴定近似一致，由此表明，在每只免疫家兔中，对bvn22e具有强烈的免疫应答。
为了检测bvn22e免疫应答的特异性和敏感性，混合每只家兔的纯化igg组分，在rhegf结合测定中，与5只家兔混合池的纯化igg组分进行比较，其中5只家兔的混合池已经使用含有两个天然egf结构域的等效蛋白进行了免疫(图1b中的下序列)。
示例3：a431egfr磷酸化(egf信号传导)测定
在标准条件下，在加入10％fbs的dmem中，a431细胞在t75培养瓶中培养至50％融合。用移液器吸走培养基，然后添加10ml预热过的pbs，洗涤细胞。去除pbs，然后添加2ml胰蛋白酶。将培养瓶孵育20分钟(或如需要，更长时间)，使细胞与培养瓶分离。在培养瓶中添加10毫升新鲜dmem，然后将细胞转移到50ml‘falcon’管中。在250xg条件下，细胞沉淀10分钟，倒入上清液除去胰蛋白酶，然后将细胞重新悬浮在10ml新鲜dmem中。
用移液器吸取200微升细胞至96孔板的每个孔中，然后隔夜孵育，使细胞粘附在孔板上。第二天，用pbs洗涤所有孔，然后加入新鲜无血清培养基。然后将孔板再孵育一天/一夜，建立基础水平的egf-r磷酸化。
细胞测定时，移除培养基，并添加以下其中一项：
i)100μl新鲜无血清培养基(基本egf-r活化)；
ii)30ng/ml浓度的100μlsfm rhegf(egf-r活化控制)；
iii)所需浓度(5μg/m1)的100μlsfm 对照(中和)抗体；
iv)30ng/ml浓度的100μlsfm 所需浓度的样本抗体 /-rhegf。
对于需要rhegf和抗体(对照或样本)的孔，在eppendorf管中制备500μl反应物，并在37℃下预培养1小时。然后在上述a431细胞中应用100微升反应物。
在所有测定中，制备四倍孔。在37℃下，将细胞在5％co2中与反应介质孵育60分钟。
孵育时间结束后，用移液器移走培养基，每孔添加40ul裂解缓冲液(6m尿素、50mmtrihclph7.9、2％十二烷基硫酸钠(sds)、5％β-巯基乙醇)。将孔板在工作台上孵育10分钟，裂解细胞。对于每个样本，用移液器将4个重复孔的反应物轻轻地上下吸取，刮擦孔底以释放所有裂解物，并移入新鲜的eppendorf管中。每个管中加入20微升装载染液，管煮沸10分钟，然后以最高速度离心5分钟。
样本直接用于免疫印迹法，也可以在4℃下储存，直到需要使用为止。
免疫印迹法分两次进行，一次用兔抗egfr抗体(abcamab52894)检测细胞膜，使样本间受体表达水平正常化；另一次用磷酸化egfr特异性兔抗体(abcamab32578)评定受体活化水平。两者均用hrp标记的抗兔抗体(abcamab97051)进行显色。
如图4a-4b所示，bvn22e能刺激a431细胞中的egfr发生磷酸化。特别地，图4a显示了免疫印迹法，说明bvn22e能够刺激a431细胞的egfr发生磷酸化，并达到与包含天然人类egf结构域的类似分子相同的程度，这种刺激发生依赖于浓度。图4b显示了类似测定的结果，但未与egf分子进行比较。
抗bvn22e抗体能够中和egfr激活。如图5所示，用bvn22e免疫的5只家兔在两种浓度下纯化的混合igg能够通过30ng/mlrhegf中和a431细胞的egfr激活，其方式类似于市售的中和单克隆抗体(例如，研发系统的单克隆抗体10825)。图6显示，用bvn22e免疫的5只家兔中，每一只家兔的单独血清都能通过30ng/mlrhegf中和a431细胞的egfr激活，其方式类似于市售的中和单克隆抗体。
即使仅进行过一次升压注射，抗bvn22e抗体也能中和egfr激活。例如，图7显示，接受bvn22e免疫的家兔的混合血清仅在一次升压注射(试验采血1)后就能够中和a431细胞上来自30ng/mlrhegf的egfr信号传导，其效果与中和单克隆抗体(例如，研发系统单克隆抗体10825)相同。免疫前动物血清无中和活性(泳道5)。
此外，抗bvn22e抗体在中和egfr激活方面也十分有效。例如，图8显示，抗bvn22eigg的中和活性类似于可比分子免疫动物的纯化igg，所述可比分子仅包含天然egf结构域，并具有以下序列：
示例4：bvn22e与天然hegf免疫原的效价比较
如上述示例1所述，对bvn22e进行表达和纯化。将rhegf与一种与ctb五聚体大小类似的免疫原性细菌蛋白进行化学交联，制备天然egf免疫原。
使用以下时间表，用蛋白免疫小鼠(n＝10)，每次注射30μg弗氏完全佐剂(仅限初级注射)或弗氏不完全佐剂(升压注射)：
混合每组10只小鼠的血清，并在三种不同浓度下使用，以精确评估rhegf对a431细胞的磷酸化/磷酸化抑制作用，如上文示例3所述。
图9显示，由两种免疫原生成的血清均能引起免疫应答，包括能够阻断egf信号传导通路的抗体。在对泳道4和7以及泳道5和8进行比较时，还可以看出，抗bvn22e血清的中和活性大于含免疫原的天然egf的抗血清。
示例5：通过细菌表达系统，可以产生稳定的合成神经调节素1β
事实证明，神经调节素1β(nrg1β)分子很难产生和使用。例如，在大肠杆菌中很难产生功能性nrg1β，因为这种通过细菌产生的nrg1β的产率非常低，它会发生糖基化，而且不能折叠成功能性活化形式。另外，细菌产生的nrg1β蛋白稳定性较差。例如，天然野生型神经调节素具有天然不稳定性，市面上购买的材料在-80℃下的保质期仅为一个月。
nrg1β包括以下序列：
bvn22e的等效部分包括以下序列：
为了检测bvn22e序列的某些部分是否对nrg1β多肽的产量、稳定性和功能发挥积极作用，将半胱氨酸残基(小写字母)之间的nrg1β区域系统地替换成bvn22e多肽的等效区域。令人惊讶的是，bvn22e位于第一和第二半胱氨酸(如plsheay)之间的部分在与nrg1β结合到类似位置时产生了有益的影响，而其余半胱氨酸残基之间的区域并未产生有益影响。这种杂交‘合成’多肽序列称为nrg-bvn杂交多肽，并且具有以下序列：
nrg-bvn杂交多肽(序列编号11)
nrg-bvn杂交多肽在大肠杆菌中能够表达为折叠蛋白，并作为五聚体在bvn22e纯化方法的改良(但仍然非常相似)版中进行纯化。尽管产率较低，但是在合适的大肠杆菌菌株中，nrg-bvn序列也可以以折叠可溶性形式表达。
如图10和11所示，免疫印迹法中的条带反映了抗nrg抗体对蛋白质各种状态的识别能力。
图12显示了mcf-7细胞活化测定，在该测定中，顶图显示rhnrg-1β(泳道2)、合成nrg-ctb分子(泳道4)对erb3受体的活化(例如磷酸化)，以及通过中和抗体(泳道3和泳道5)对两者的抑制。下图为erb3受体表达的对照。这些数据表明，合成nrg-bvn杂交多肽稳定性较强(例如，＞1个月后，无可见降解)。此外，nrg-bvn杂交多肽也未与egf的天然受体即egfr(erb1)结合。
示例6：细菌表达系统可产生稳定的合成tgfβ
tgfα分子在细菌表达系统中的产生也存在问题。例如，tgfα分子的主要问题是，虽然它们可以在细菌系统中表达，产生折叠蛋白，但由此产生的蛋白同样很不稳定，并且会受到去折叠的限制。
为了检测bvn22e序列的某些部分是否能对tgfα多肽的不稳定性和功能发挥积极作用，将半胱氨酸残基之间的tgfα区域系统地替换成bvn22e多肽的等效区域。利用计算机模拟和已知的结构信息来设计和生产合成分子，以预测/确定重要的受体结合区。与nrg-bvn杂交多肽相比，合成的tgfα分子仅包含从半胱氨酸3到5的tgfα序列(例如rflvqedkpacv)。该区域包含“b环”。所述杂交‘合成’多肽序列称为tgfα杂交多肽，并且具有以下序列：
tgfα杂交多肽(序列编号12)
如图13a-13c所示，tgfα杂交多肽的表达、折叠和纯化方式可与bvn22e非常相似。图中显示了合成tgfα分子(图13a)的sds凝胶，所述sds凝胶由两种不同的中和抗tgfα抗体(图13b)识别，而非由两种不同的抗egf抗体其中的任何一种抗egf抗体识别(图13c)。
此外，tgfα杂交多肽形成了五聚体和纯化过程中去除的一些其他低聚物。如图14所示，纯化后，在非变性凝胶上可以看到单个五聚体条带。
如图15a和15b所示，tgfα杂交多肽的稳定性也有所提高，在加速稳定性研究中，在持续超过3周的高温下，tgfα杂交多肽依然是棱角分明的五聚体。
援引并入
本文引用或参考的全部文献，和本文所引文献引用或参考的全部文献，以及本文或通过援引并入本文的任意文献中提及的任意产品的任意制造商的指南、说明、产品说明书和产品说明页，在此处通过援引并入本文，并且可以用于本发明的实施。
等价物
应当理解，本文所述的详细示例和实施例以示例的方式给出，仅出于示例性目的，不应视为本发明的限制。据此做出的各种修改或变更应作为建议提供给本领域技术人员，纳入本申请的精神和范围内，并视为所附权利要求的保护范围。根据所附权利要求，与本发明的系统、方法和过程相关联的其他有利特征和功能显而易见。此外，本领域技术人员应认识到或仅利用常规实验就能确定本文所述的具体实施例的多个等价物。此类等价物拟包含在以下权利要求中。
1.一种合成蛋白，包括：
一个合成生长因子序列；
至少一个连接物，
一个多肽序列。
2.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，所述多肽序列包括一个免疫原性多肽序列。
3.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中多肽序列包括一个霍乱毒素b(ct-b)蛋白。
4.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，所述至少一个连接物包括一个将合成生长因子与所述多肽序列分离的第一连接物。
5.根据权利要求4所述的合成蛋白，其中，所述第一连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。
6.根据权利要求4所述的合成蛋白，其中第一连接物为ggsggtsgggggsg。
7.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，所述合成生长因子序列包括一个合成表皮生长因子(segf)序列。
8.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，所述合成生长因子序列包括一个人表皮生长因子(hegf)tsp(htsp)结构域的至少一个合成靶信号传导通路(stsp)结构域，其中，所述至少一个stsp与所述htsp相差6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。
9.根据权利要求8所述的合成蛋白，其中，所述合成生长因子序列包括一个第一tsp结构域和一个第二tsp结构域。
10.根据权利要求9所述的合成蛋白，其中，所述至少一个连接物包括一个将所述第一tsp结构域与所述第二tsp结构域分离的第二连接物。
11.根据权利要求10所述的合成蛋白，其中，所述第二连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。
12.根据权利要求10所述的合成蛋白，其中，所述第二连接物为gssg。
13.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，所述合成蛋白具有序列编号2的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，所述合成蛋白根据序列编号1的核酸序列进行编码。
15.根据权利要求1所述的合成蛋白，其中，一部分合成生长因子包括存在于所述合成蛋白中的至少两种不同生长因子的一整段或中和域。
16.一种免疫原性组合物，包括一种合成蛋白，所述合成蛋白包括一个合成生长因子序列、至少一个连接物和一个多肽序列。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述多肽序列包括一个免疫原性多肽序列。
18.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述多肽序列包括一个霍乱毒素b(ct-b)蛋白。
19.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述至少一个连接物包括一个将所述合成生长因子与所述多肽序列分离的第一连接物。
20.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述第一连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。
21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中，第一连接物为ggsggtsgggggsg。
22.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述合成生长因子序列包括一个合成表皮生长因子(segf)序列。
23.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述合成生长因子序列包括一个人表皮生长因子(hegf)tsp(htsp)结构域的至少一个合成靶信号传导通路(stsp)结构域，其中，所述至少一个stsp与所述htsp相差6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。
24.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述合成生长因子序列包括一个第一tsp结构域和一个第二tsp结构域。
25.根据权利要求24所述的免疫原性组合物，其中，所述至少一个连接物包括一个将所述第一tsp结构域与所述第二tsp结构域分离的第二连接物。
26.根据权利要求25所述的免疫原性组合物，其中，第二连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。
27.根据权利要求26所述的免疫原性组合物，其中，第二连接物为gssg。
28.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述合成蛋白具有序列编号2的氨基酸序列。
29.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，所述合成蛋白根据序列编号1的核酸序列编码。
30.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其中，一部分合成生长因子包括存在于所述合成蛋白中的至少两种不同生长因子的一整段或中和域。
31.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，进一步包括一种佐剂。
32.一种有需要患者的治疗方法，包括：
在疫苗接种期间，在同一天或隔天或间隔一定时间，采用根据权利要求16所述的免疫原性组合物对患者给药。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述患者患有癌症。
34.一种合成蛋白，包括：
一个合成神经调节素1β(nrg1β)序列或合成转化生长因子α(tgfα)序列；
至少一个连接物，
一个多肽序列。
35.根据权利要求34所述的合成蛋白，其中，所述多肽序列包括一个免疫原性多肽序列。
36.根据权利要求34所述的合成蛋白，其中，所述多肽序列包括一个霍乱毒素b(ct-b)蛋白。
37.根据权利要求34所述的合成蛋白，其中，所述至少一个连接物包括一个将合成生长因子与多肽序列分离的第一连接物。
38.根据权利要求37所述的合成蛋白，其中，所述第一连接物为ssg、gssg、ssggg、sgg、ggsgg、ggggs、ssgggsgg、ssggggsggg、tsgggsg、tsggggsgg、ssgggsggssg、ggsggtsgggsg、sggtsggggsgg、ggsggtsggggsgg、ssggggsgggssg、ssgggsggssggg和ssggggsgggssggg的任意组合。
39.根据权利要求37所述的合成蛋白，其中，所述第一连接物为ggsggtsgggggsg。
40.根据权利要求34所述的合成蛋白，其中，所述合成神经调节素1β(nrg1β)序列为gtshlvkcplsheaycvnggecfmvkdlsnpsrylckcpneftgdrcqnyvmasf(序列编号11)。
41.根据权利要求34所述的合成蛋白，其中，所述合成转化生长因子α(tgfα)序列为ntendcplsheayclhdgvcrflvqedkpacvcvvgyvgercqfrdlrwwdar(序列编号12)。
技术总结