【技术领域】
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖及其制备方法和应用。
背景技术：
免疫低下或免疫系统失调与一系列疾病(肥胖及2型糖尿病等在内的代谢综合症、肿瘤等)的发生发展息息相关。免疫调节剂能有效增强宿主防御应答，提高机体抵抗力，防止疾病侵袭，增强并改善体质，为许多疾病的预防及治疗带来新的希望，对防控系列重大健康问题起积极作用，研发药效显著且毒副作用小的免疫调节剂仍是新药开发的关注点。已有部分天然免疫调节剂广泛使用，如人参多糖、甘露聚糖肽、雷公藤多苷等。
真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体或发酵液中提取分离得到的一类活性物质。已证实真菌多糖具有降血脂、免疫调节、抗病毒及抗肿瘤等功效且毒副作用小，安全可靠，尤其免疫调节活性备受关注，被誉为天然的“免疫增强剂”。目前已有香菇多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖、猪苓多糖等部分真菌多糖应用于临床，能有效改善机体免疫功能，提高免疫力，并作为抗肿瘤的辅助治疗剂，减轻放化疗副作用。
金耳(tremellaaurantialbabandonietzang)属担子菌亚门层菌纲银耳属真菌，俗称脑耳、金木耳，是一种珍贵的食药两用真菌。现代研究表明金耳富含蛋白质、氨基酸、多糖等营养物质及活性成分，尤其多糖含量引人注目，占子实体干重的60-70％，远高于其他食用菌多糖所占比重。其中葡糖醛酸-木甘聚糖(glucuronoxylomannan)是一种由葡萄糖醛酸、木糖、甘露糖构成的酸性多糖，存在于金耳子实体中(foodhydrocolloid,2015,43:459-64；carbohydrres,2009,344(5):672-8)，也见于银耳、木耳等真菌中(intjmedmushrooms,2,169-93；chemcommun,2018,54(51),6995–8)，但不同物种来源的葡糖醛酸-木甘聚糖结构差异较大。天然的金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)具有增强免疫、降血脂、抗肿瘤、护肝、抗氧化等生物活性，尤其具有强效的免疫增强活性。
然而，天然tag仍存在一些药学上难以接受的物理特性如黏度大、溶解性较差等。适当解聚的低聚tag可保留天然tag的免疫增强活性，而且黏度显著降低，溶解性显著增强，具有良好的成药性。本领域相关研究显示，酸水解降解多糖不具有选择性，不能保持原型多糖的基本结构，对多糖的结构破坏较大，而且酸水解条件及解聚产物质量难以控制。由于tag化学结构的特殊性，酶法解聚、酸或碱解聚等常用的多糖解聚方法均难以应用于tag解聚。
技术实现要素：
鉴于上述内容，有必要提供一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖及其制备方法和应用，该低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)具有强效机体免疫增强活性，能够作用于tlr4受体激活巨噬细胞，促进各种免疫因子的产生，因此，可用于预防和/或治疗免疫低下相关疾病。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖为同系葡糖醛酸-木甘聚糖衍生物的混合物，其结构式如下：
所述结构式中，
a为α–d–甘露糖–1–基；
b为β–d–甘露糖–1–基；
c为β–d–葡萄糖醛酸–1–基；
d为β–d–木糖–1–基；
r1为–oh或–2–o–α–d–甘露糖；
r2为–h或(1□→□2,3)–α–d–甘露糖；
r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9相互独立地为–h或–coch3；
r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9均为–h时，化合物为低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的脱乙酰化衍生物。
本发明之低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的多分散指数(pdi,重均/数均分子量之比，mw/mn)一般介于1.0至2.0之间；优选的低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的pdi介于1.1至1.6之间。
本发明中，进一步地，以摩尔比计，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖所含甘露糖(d-man)、葡萄糖醛酸(d-glca)、木糖(d-xyl)三种单糖残基与所含–coch3的摩尔比为3:(1±0.3):(1±0.3):(0.5±0.05)；
所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖脱乙酰化衍生物所含–coch3的摩尔数为0；
所述n是均值为4-12的整数。
本发明中，进一步地，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖为担子菌亚门层菌纲银耳属金耳子实体、发酵菌丝体或其发酵液中分离提取的金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的解聚产物。
本发明中，进一步地，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的重均分子量范围为8,000-24,000da。
本发明中，进一步地，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖分子量范围为10,000-20,000da。
本发明中，进一步地，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖分子量为19300da。
本发明中，进一步地，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖分子量为14700da。
本发明中，进一步地，所述同系物的n的均值为5-10。
本发明中，进一步地，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的黏度介于0.05-0.50dl/g，在该粘度下，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖易溶于水，成药性强。
本发明还提供一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)从担子菌亚门层菌纲银耳属金耳子实体、发酵菌丝体或其发酵液中提取金耳总多糖，即金耳葡糖醛酸-木甘聚糖；
从金耳中提取金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)可参考本领域已知的方法进行，一般包括但不限于以下步骤：热水提取或加酶酶解处理获得提取液，乙醇和/或丙酮沉淀得到粗多糖提取物，再进行透析、超滤或凝胶过滤除小分子杂质，离子交换色谱法纯化(deaesepharosefastflow)等，最后通过冷冻干燥法获得金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)。
(2)利用过氧化物解聚步骤(1)所得的金耳葡糖醛酸-木甘聚糖，以获得其低分子量的解聚产物，即低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖。
本发明中，进一步地，所述步骤(2)中采用过氧化物解聚金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的具体方式为：将步骤(1)所得金耳葡糖醛酸-木甘聚糖用去离子水溶解得到质量分数为0.05-10％的水溶液，接着向所得水溶液中加入质量分数为0.05-0.5％的金属离子催化剂，接着加入质量分数为1-6％过氧化物，于25-55℃温度下反应；期间进行hpgpc检测，待检测到解聚产物分子量达到所述重均分子量范围时，加入金属离子螯合剂终止反应，再加入乙醇或丙酮将解聚产物沉淀，离心收集沉淀，采用超滤、透析或凝胶色谱法进行脱盐处理，即可得到所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖。
以本发明上述方法制备的低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)中，根据产物1hnmr谱图计算，以摩尔百分比计，r1为–oh的化合物可占ltag总量的90％以上。
本发明中，进一步地，所述金属离子催化剂为乙酸铜；所述过氧化物为过氧化氢。
本发明还提供一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的脱乙酰化衍生物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)从担子菌亚门层菌纲银耳属金耳子实体、发酵菌丝体或其发酵液中提取金耳总多糖，即金耳葡糖醛酸-木甘聚糖；
从金耳中提取金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)可参考本领域已知的方法进行，一般包括但不限于以下步骤：热水提取或加酶酶解处理获得提取液，乙醇和/或丙酮沉淀得到粗多糖提取物，再进行透析、超滤或凝胶过滤除小分子杂质，离子交换色谱法纯化(deaesepharosefastflow)等，最后通过冷冻干燥法获得金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)。
2)将步骤1)所得金耳葡糖醛酸-木甘聚糖配成质量分数为0.05-10％的水溶液，接着向所得水溶液中加入终浓度为0.05-0.5m的naoh溶液，在反应温度为10-40℃下反应0.5-6h，反应结束后用盐酸调节ph为6.5-7.5，透析、超滤或过凝胶柱层析除去小分子杂质，即可得到所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的脱乙酰化衍生物。
本发明还提供一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的应用，是利用以上所述的低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖、低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的脱乙酰化衍生物或以上两者在药学上可接受的盐制备免疫增强剂。
本发明中，进一步地，所述药学上可接受的盐是通过采用阳离子交换柱将所得产品转化为药学上可接受的盐。
本发明还进一步提供一种免疫增强剂的药物组合物，所述药物组合物中含有有效剂量的本发明ltag及其脱乙酰化衍生物或其药学上可接受的盐，及药用赋形剂。含低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的药物组合物可选择系统给药制剂，适合静脉注射给药、肌肉内和/或皮下注射给药制剂。这些制剂中，优选的药物组合物剂型为注射用冻干粉针剂、注射用水溶液等。
由于本发明之ltag为多糖类化合物具有良好的稳定性，因此可以与现有临床用药联合使用，包括与现有药物如抗肿瘤、药物同时给药，或组成药物组合物制剂。
本发明中，进一步地，以上所述药学上可接受的盐均可以是低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的有机铵盐、碱金属盐或碱土金属盐。
本发明中，进一步地，以上所述药学上可接受的盐均可以为钙盐、钠盐或者钾盐。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明首先发现，所述强效免疫增强活性的低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)，其在实验剂量范围内(12.5-200μg/ml)均能显著促进巨噬细胞的增殖，剂量依赖性地刺激巨噬细胞释放no及分泌免疫因子如il-1β、tnf-α等，此外，本发明还发现，作为免疫增强剂，所述ltag的特点是结合细胞的toll-样受体4(tlr4)；由于针对巨噬细胞激活的免疫增强剂已成为增强免疫药物研制的重点方向，因此，本发明之低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)对于研制免疫增强剂具有重要的应用价值。
2、本发明在制备低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)的过程中，解决了天然金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)存在一些药学上难以接受的物理特性如黏度大、溶解性较差等问题，此外，还能保留解聚产物(ltag)的免疫活性，在免疫活性基本不降低的同时，降低了解聚物的分子量，其化合物结构更清楚，黏度降低，溶解性提高，成药性更强。
3、申请人经过多次试验发现，酶法解聚、酸或碱解聚等常用的多糖解聚方法均难以应用于金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)解聚，经研究可能是由于tag化学结构的特殊性导致，为避免解聚过程对tag特征结构的影响，本发明通过金属离子催化的过氧化物解聚法实现tag解聚，试验结果显示，该方法除了降低结构单元的聚合度外(结构中的n的数值降低)，基本不影响解聚产物的基本结构如单糖组成、重复结构单元特性，不影响乙酰基等特征化学官能团，即不影响低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖结构式的结构通式。
4、以本发明上述方法制备的低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)中，根据产物1hnmr谱图计算，以摩尔百分比计，r1为–oh的化合物可占ltag总量的90％以上。
【附图说明】
图1为金耳来源的tag及其低分子量产物ltag的hpgpc图谱；
图2为ltag1h检测图谱；
图3为ltag13cnmr检测图谱；
图4为ltagdept135°检测图谱；
图5为ltag1h-1hcosy、tocsy和roesy异头氢信号区域叠加图谱；
图6为ltag1h-1hhsqc检测图谱；
图7为ltag1h-13chmbc检测图谱；
图8为ltag脱乙酰衍生物1hnmr检测图谱；
图9为ltag对巨噬细胞增殖影响，显示ltag能够使巨噬细胞增殖；
图10-图12为ltag对no、il-1β、tnf-α产生的影响，显示ltag能够刺激no、il-1β、tnf-α的产生；
图13-图15为ltag在有或无抗tlr4抗体存在下对细胞因子水平的影响数据图，显示ltag作用的膜受体为tlr4。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)的制备
1.材料和方法
(1)材料
金耳(tremellaaurantialbabandonietzang)，市售品；
h2o2，cu(ch3coo)2·h2o，nacl，naoh，乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。
(2)方法
1)金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(tag)制备：取金耳干燥子实体，粉碎，提取、分离、纯化，获得tag，得率50.6％，纯度98％(hpgpc,面积归一化法)，重均分子量(mw)为6.24×105da。
2)低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)制备：取步骤1)所得tag2.0g与一水乙酸铜混合后加入反应瓶中，加蒸馏水20ml溶解，35℃水浴，在15min内滴加10％的h2o210ml，反应过程中用1m的naoh溶液控制ph值范围为5.0-6.0。连续搅拌反应约0.5h后，向反应液中加入40mgedta-2na终止反应，加入无水乙醇120ml，4000rpm离心15min得沉淀。将所得沉淀加水20ml溶解，经dowex50wx8型阳离子交换树脂交换成钠盐，然后以截留分子量1000da的透析膜透析24小时，冷冻干燥，得到解聚样品ltag-11.66g，得率为83.0％。
3)将所得tag及其解聚产物ltag-1理化性质及结构检测：硫酸咔唑法检测葡萄糖醛酸(d-glca)含量(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999,11-21)；采用乌式粘度计按照中国药典(2015版)四部通则0633黏度测定法测定特性黏数；高效凝胶色谱法(hpgpc)检测分子量及分布；单糖组成采用柱前衍生化hplc检测。
4)采用甲基化分析tag多糖连接方式；avanceav600核磁共振谱仪(600mhz)检测nmr谱图解析糖结构(瑞士bruker公司，溶剂为d2o含trimethylsilyl-propionicacid(tsp-d4)内标，温度25℃)；1hnmr甲基峰积分面积计算乙酰基摩尔百分比。
2.结果：
tag及其解聚产物ltag-1的hpgpc检测谱图见附图1，单糖组成、理化参数测定结果见表1；1d和2dnmr检测谱图见附图2-7，1h/13cnmr谱图数据的信号归属见表2。
表1金耳子实体来源的tag及ltag-1的理化参数、单糖组成检测结果
表1检测结果显示，与tag相比，ltag-1分子量和特性粘度显著降低，而单糖组成及乙酰基含量保持稳定(摩尔比约3:1:1:0.5)。
以ltag-1为例简述其信号归属与结构解析。ltag-1的1h/13cnmr谱图见附图2-3和附图4，其信号归属数据见表2。
如附图5所示，该图为1h-1hcosy、tocsy、roesy谱图，图中显示制备的解聚产物ltag-1含有七组自旋耦合系统。位于低场区5.14、5.19、5.19ppm处信号分别为主链α-1,2-man、α-1,3-man和α-1,2,3-man糖残基的游离末端的α-端基氢信号。β-端基氢信号出现在约4.3-4.7ppm处。其中，4.38、4.52、4.61、4.67ppm信号分别对应β-1,3-xyl、β-1,4-glca、β-t-man和β-t-xyl。乙酰基质子出现在约2.1-2.2ppm。1h-1hnoesy谱则分别显示了α-1,2,3-man的端基氢与自身的h3耦合，以及与α-1,2-man的h3之间耦合；α-1,3-man端基氢与α-1,2,3-man的h3耦合；α-1,2-man端基氢与α-1,3-man的h3耦合；β-1,3-xyl、β-1,4-glca的端基氢分别与α-1,2,3-man的h2耦合；β-t-xyl的端基氢与β-1,3-xyl的h3耦合；β-t-man的端基氢与β-1,4-glca的h3耦合。该结果表明了单糖之间的连接关系：man以α(1→2)和α(1→3)糖苷键相互连接形成主链，man则以β(1→4)糖苷键连接于glca形成支链连接于主链man的2位，另外两个xyl以β(1→3)糖苷键相连形成支链连接于主链man的2位。
如附图6所示，该图为1h-13chsqc谱图，依据该图可判断，13c-nmr谱中的α-1,2-man、α-1,3-man、α-1,2,3-man、β-1,3-xyl、β-1,4-glca、β-t-man和β-t-xyl的c1峰分别出现在104.57、105.10、103.51、106.28、104.74、104.74和106.29ppm。glca羧基中的羰基碳(c6)与乙酰基中的羰基碳(c7)出现在几乎相同的位置分别为178.2和177.2ppm。
如附图7所示，该图为1h-13chmbc谱图，图中可见α-1,2,3-man的h1与自身的c3耦合，以及与α-1,2-man的c3之间耦合；α-1,3-manh1与α-1,2,3-man的c3耦合；α-1,2-manh1与α-1,3-man的c3耦合；β-1,3-xyl、β-1,4-glca的h1分别与α-1,2,3-man的c2耦合；β-t-xyl的h1与β-1,3-xyl的c3耦合；β-t-man的h1与β-1,4-glca的c3耦合。由此进一步确认ltag-1组成单糖之间的连接关系。通过脱乙酰化前后的信号变化，ltag-1乙酰基取代位于man6位的oh基上。
表2金耳子实体tag制备的ltag-1的1h/13cnmr检测数据(δ[ppm])
*加粗体表示糖残基的取代位点。
综合ltag-1氢谱、碳谱及其相关谱可见，本品三种组成单糖中，α-man通过α-(1→2)和α-(1→3)糖苷键相互连接组成聚糖主链，侧链是由β-xyl、β-glca和β-man形成的二糖连接于主链的man的2位。乙酰基取代位点位于man的6位oh上，而仅有少数man残基的6位oh基被乙酰基取代，氢谱中可计算出乙酰基摩尔百分比约为10％。
实施例2
系列分子量ltag的制备
1.材料和方法
(1)材料
金耳子实体来源的tag，同实施例1所述方法制备。
h2o2，cu(ch3coo)2·h2o，nacl，naoh，乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。
(2)方法
1)系列分子量ltag样品制备：金耳子实体来源的tag三份各2g，采用实施例1步骤2)所述方法解聚，但反应终止的时间点分别为60，120，180min。经超滤脱盐，阳离子交换柱交换，制备获得的ltag解聚产物分别编号为：ltag-2、ltag-3、和ltag-4。所述解聚产物的得率均大于75％；
2)ltag产物检测：硫酸咔唑法检测葡萄糖醛酸(d-glca)含量(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999,11-21)；采用乌式粘度计按照中国药典(2015版)四部通则0633黏度测定法测定特性黏数；高效凝胶色谱法(hpgpc)检测分子量及分布；单糖组成采用柱前衍生化hplc检测。
2.结果
所得系列解聚产物ltag-2、ltag-3、ltag-4的测定结果，如表3所示。
表3金耳子实体来源的ltag的理化参数、单糖组成检测结果
根据表3检测结果显示，金耳子实体来源的tag经过氧化氢解聚法制备的解聚产物分子量分布较窄，糖醛酸含量和单糖组成没有明显变化，特征黏度随分子量降低而降低。
实施例3
ltag脱乙酰化衍生物的制备
1.材料和方法
(1)材料
金耳子实体来源的tag及ltag-1，同实施例1所述方法制备。
nacl、naoh、乙醇、hcl等所用试剂均为市售分析纯试剂。
(2)方法
1)ltag脱乙酰化样品制备：取ltag-11g，加入去离子水10ml，向所得ltag-1水溶液中滴加1m的naoh水溶液1ml，反应温度为30℃，反应4h。反应结束用1mhcl调ph为7.4，过bio-gelp2凝胶柱层析除去小分子杂质，采用阳离子交换柱将所得产品转化为药学上可接受的盐；所述脱乙酰化产物命名为ltag-1a，得率大于85％；
2)ltag的脱乙酰化产物ltag-1a检测：硫酸咔唑法检测葡萄糖醛酸(d-glca)含量(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江：浙江大学出版社，1999,11-21)；采用乌式粘度计按照中国药典(2015版)四部通则0633黏度测定法测定特性黏数；高效凝胶色谱法(hpgpc)检测分子量及分布；单糖组成采用柱前衍生化hplc检测。1hnmr甲基峰积分面积计算乙酰基摩尔百分比。
2.结果
步骤2)所得脱乙酰化产物ltag-1a的测定结果如表4。
表4ltag-1的脱乙酰化产物ltag-1a的理化参数、单糖组成检测结果
根据表4检测结果显示，ltag-1经弱碱处理制备的脱乙酰化产物ltag-1a分子量分布较窄，糖醛酸含量和单糖组成与ltag-1没有变化，特征黏度随着乙酰基的脱除而明显降低。
1hnmr谱图见附图8，根据附图检测结果显示，ltag-1经弱碱处理制备的脱乙酰化产物ltag-1a，其氢谱中2.0-2.2ppm处的乙酰基信号峰完全消失，表明ltag-1a的脱乙酰化程度为100％。糖残基其他所有信号峰未见改变，表明弱碱处理不影响ltag-1的基本结构。
实施例4
低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖(ltag)免疫活性
1.材料与试剂
(1)检测样品：实施例1和实施例2制备的ltag-1和ltag-3(mw19.3和11.1kda)溶于注射用水中，4℃下保存。
(2)试剂：mtt(3-(4,5)-dimethylthiahiazo-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide、脂多糖(lipopolysaccharide,lps)购自sigma公司；高糖培养基(high-glucosedulbecco’smodifiedeagle’smedium,dmem)、胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)、青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)购自hyclone公司；il-1βelisakit购自bdbiosciences公司；tnf-αelisakit购自欣博盛公司；no测定试剂盒购自progema公司；antitlr2(6c2)单克隆抗体、anti-tlr4(mts510)单克隆抗体购自ebioscience公司。
(3)细胞：raw264.7细胞购于中国典型培养物保藏中心。细胞均按常规方法冻存和复苏。
2.实验方法
(1)金耳多糖对raw264.7的细胞活力检测：对数生长期的raw264.7细胞悬液(1×106/ml)接种于96孔板，37℃下5％co2培养过夜，弃上清，加入不同浓度金耳多糖，37℃下5％co2培养24h后，mtt法检测细胞毒性。tecan酶标仪测定od值，计算细胞活力。
(2)金耳多糖对raw264.7释放no及细胞因子的影响：将对数生长期的raw264.7细胞悬液(5×105/ml)接种于6孔板，37℃下5％co2培养过夜后，弃去上清，加入不同浓度金耳多糖，37℃下5％co2培养24h后，通过试剂盒检测no及细胞因子含量。
(3)膜受体的检测：将对数生长期的raw264.7细胞悬液(4×105/ml)接种于6孔板，37℃下5％co2培养过夜后，弃上清，加入10μg/ml抗体预处理2h后再加入100μg/ml金耳多糖孵育24h，试剂盒检测no及细胞因子含量。
3.实验结果
(1)ltag对巨噬细胞活力影响：如附图9结果显示，ltag-1和ltag-3在实验剂量范围能够极显著促进巨噬细胞的增殖；根据配制最高浓度药物(200μg/ml)未见显著的细胞毒性。
(2)ltag对免疫因子的影响：如附图10-12结果显示，ltag-1和ltag-3在实验剂量范围均能够极显著促进巨噬细胞分泌no、il-1β和tnf-α，高浓度时效果更明显，可与阳性对照组相媲美。ltag-1在浓度为100-200μg/ml时促进巨噬细胞分泌no、il-1β和tnf-α的水平与原型tag相比无显著性差异，表明解聚产物ltag-1能够很好地保留原型tag的免疫增强活性。
(3)ltag免疫增强活性的膜受体：如附图13-15结果显示，在抗体anti-tlr4存在下ltag-1促进巨噬细胞分泌no、il-1β和tnf-α的水平明显降低，而在抗体anti-tlr2存在下未见影响，表明tlr4为ltag影响巨噬细胞的膜受体。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。
1.一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖，其特征在于，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖为同系葡糖醛酸-木甘聚糖衍生物的混合物，其结构式如下：
所述结构式中，
a为α–d–甘露糖–1–基；
b为β–d–甘露糖–1–基；
c为β–d–葡萄糖醛酸–1–基；
d为β–d–木糖–1–基；
r1为–oh或–2–o–α–d–甘露糖；
r2为–h或(1□→□2,3)–α–d–甘露糖；
r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9相互独立地为–h或–coch3；
r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9均为–h时，化合物为低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的脱乙酰化衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖，其特征在于，以摩尔比计，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖所含甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖三种单糖残基与所含–coch3的摩尔比为3:(1±0.3):(1±0.3):(0.5±0.05)；
所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖脱乙酰化衍生物所含–coch3的摩尔数为0；
所述n是均值为4-12的整数。
3.根据权利要求1所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖，其特征在于，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖为担子菌亚门层菌纲银耳属金耳子实体、发酵菌丝体或其发酵液中分离提取的金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的解聚产物。
4.根据权利要求1所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖，其特征在于，所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的重均分子量范围为8,000-24,000da。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)从担子菌亚门层菌纲银耳属金耳子实体、发酵菌丝体或其发酵液中提取金耳总多糖，即金耳葡糖醛酸-木甘聚糖；
(2)利用过氧化物解聚步骤(1)所得的金耳葡糖醛酸-木甘聚糖，以获得其低分子量的解聚产物，即低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖。
6.根据权利要求5所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用过氧化物解聚金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的具体方式为：将步骤(1)所得金耳葡糖醛酸-木甘聚糖用去离子水溶解得到质量分数为0.05-10％的水溶液，接着向所得水溶液中加入质量分数为0.05-0.5％的金属离子催化剂，接着加入质量分数为1-6％过氧化物，于25-55℃温度下反应；期间进行hpgpc检测，待检测到解聚产物分子量达到所述重均分子量范围时，加入金属离子螯合剂终止反应，再加入乙醇或丙酮将解聚产物沉淀，离心收集沉淀，采用超滤、透析或凝胶色谱法进行脱盐处理，即可得到所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖。
7.根据权利要求6所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的制备方法，其特征在于，所述金属离子催化剂为乙酸铜；所述过氧化物为过氧化氢。
8.一种制备如权利要求1所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖脱乙酰化衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)从担子菌亚门层菌纲银耳属金耳子实体、发酵菌丝体或其发酵液中提取金耳总多糖，即金耳葡糖醛酸-木甘聚糖；
2)将步骤1)所得金耳葡糖醛酸-木甘聚糖配成质量分数为0.05-10％的水溶液，接着向所得水溶液中加入终浓度为0.05-0.5m的naoh溶液，在反应温度为10-40℃下反应0.5-6h，反应结束后用盐酸调节ph为6.5-7.5，透析、超滤或过凝胶柱层析除去小分子杂质，即可得到所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的脱乙酰化衍生物。
9.如权利要求1-7任一项所述的低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖和/或权利要求8所述低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖脱乙酰化衍生物在制备免疫增强剂上的应用，所述免疫增强剂为两者在药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的一种低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐是低分子量金耳葡糖醛酸-木甘聚糖的有机铵盐、碱金属盐或碱土金属盐。
技术总结