本发明属于刺激响应性聚合物材料技术领域，具体涉及一种光、氧化及还原三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束，以及该聚合物胶束的制备方法和应用。
背景技术：
生命系统的复杂功能取决于它们对多种外部刺激的固有协同作用，这些刺激诱导其物理化学性质的动态变化。随着仿生学方法应用于刺激响应聚合物的设计、合成和工程系统，越来越智能的设计灵感开始产生。刺激响应性药物传输系统就是利用刺激响应性聚合物材料形成纳米载体，在不同的刺激(温度、ph、光、电场、氧化还原等)下产生可逆或不可逆的化学或物理变化，将包埋的载体(抗癌药、胰岛素、基因、荧光分子等)在特定条件下进行释放。通过对刺激响应性聚合物分子的合理设计和合成条件的准确控制，能够构建出集信号传感、药物传递、效果反馈于一体的智能药物传输系统。智能药物传输系统的“智能”性取决于构成体系的聚合物本身的特性，即人体病变细胞发出的生物信号被机体变现为氧化、还原、ph、温度等方式，利用这些刺激来模拟体内的病变信号并找到合适的刺激响应性聚合物材料，从而达到对药物的有效控制。
随着纳米科学技术的快速发展，越来越多“智能”药物输送系统的出现已经代替传统的给药途径。刺激响应性聚合物胶束作为药物递送载体时，不仅能极大地增加疏水药物的溶解性，还能够保护基因、酶、糖等大分子物质的活性，增加药物的目标性、延长药物的作用时间，并且能够根据体内环境的差异性进行可控释放。基于以上背景，具有多重刺激响应性聚合物胶束得以探索和发展，然而由于缺乏体内的可降解性以及生物安全性而不能满足临床应用的要求。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有优良的生物相容性、可降解性，并且具有光、氧化及还原三重刺激响应性的纳米聚合物胶束，以及该聚合物胶束的制备方法，并为该聚合物胶束提供新的应用。
针对上述目的，本发明的光、氧化及还原三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束所采用的聚合物的结构式如下所示：
式中x为30～100的整数，y为25～60的整数，z为20～80的整数。
上述三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的具体合成路线和合成步骤如下：
1、将双(2-羟基乙基)二硫醚与2-溴异丁酰溴反应合成2-羟乙基-2’-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物；将2-羟乙基-2’-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物、三乙胺溶于二氯甲烷，然后缓慢滴加丁炔基氧基草酰氯，滴加完后在剧烈搅拌下进行酰化反应，得到式i所示的2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物。
2、以溴化亚铜为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，在惰性气体保护下，将甲基丙烯酸邻硝基苄酯在2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物的引发下进行原子转移自由基聚合反应，得到式ii所示聚合物。
3、以甲氧基聚乙二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂、2-氯-ε-已内酯为单体，通过开环聚合反应合成式iii所示双亲性聚合物。
4、将式iii所示双亲性聚合物、叠氮化钠溶于n,n-二甲基甲酰胺中，在剧烈搅拌下进行叠氮化反应，得到式iv所示聚合物。
5、以溴化亚铜为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，在惰性气体保护下，将式iii所示双亲性聚合物和式iv所示聚合物进行点击化学反应，得到式v所示双亲嵌段聚合物。
6、将式v所示双亲嵌段聚合物溶于四氢呋喃中，利用透析法制备成胶束，得到三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束。
上述步骤1中，优选双(2-羟基乙基)二硫醚与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(1～3)，2-羟乙基-2’-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物与三乙胺、丁炔基氧基草酰氯的摩尔比为(4～6):(10～12):(8～11)；优选酰化反应的温度为20～35℃，时间为8～14小时。
上述步骤2中，优选甲基丙烯酸邻硝基苄酯、2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物、溴化亚铜、五甲基二乙烯三胺的摩尔比(20～60):1:(1～2):(1～2)；优选原子转移自由基聚合反应的温度为60～80℃，时间为18～24小时。
上述步骤3中，优选甲氧基聚乙二醇与辛酸亚锡、2-氯-ε-已内酯的摩尔比为(1～2):1:(60～80)；优选开环聚合反应的温度为100～120℃，时间为10～12小时。
上述步骤4中，优选式iii所示双亲性聚合物与叠氮化钠的摩尔比为(3～4):1；优选叠氮化反应的温度为20～35℃，时间为24～36小时。
上述步骤5中，优选式iii所示双亲性聚合物与式iv所示聚合物、溴化亚铜、五甲基二乙烯三胺的摩尔比(1～3):(1～2):(1～2):(1～2)；优选点击化学反应的温度为50～70℃，时间为24～48小时。
上述甲基丙烯酸邻硝基苄酯根据文献“rscadvances,2015,5,65847-65855.”中报道的方法合成，2-氯-ε-已内酯根据文献“journalofpolymersciencepartapolymerchemistry,2010,47(14):3583-3594.”中报道的方法合成。
本发明三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束可作为药物载体用于制备癌药物紫杉醇(ptx)载药胶束。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、采用炔基基团修饰的小分子作为聚合物链的起始引发剂，避免了形成无端基修饰的聚合物链，同时可降解主链上支化修饰的叠氮基团又增加了发生点击化学反应的高效性。
2、合成了具有光、氧化及还原三重刺激响应可降解的双亲嵌段聚合物，其在水溶液中能够形成核-壳结构的胶束，利用物理包埋的方法将紫杉醇负载于疏水的内核中，光、氧化和还原刺激能够不同程度的触发紫杉醇的释放。
3、细胞毒性实验中，该胶束表现出优良的生物相容性。聚合物胶束的药物负载量高，对癌细胞的微环境具有多重响应性且具备良好的生物相容性及可降解性，是一个理想的载体材料。
附图说明
图1是实施例1制备的双亲嵌段聚合物的核磁氢谱图，溶剂为氘代氯仿(cdcl3)。
图2是实施例1中mpeg43-oh(a)、mpeg43-b-pclcl25(b)、mpeg43-b-pacl25(c)、alkyne-po-ss-pnbm50-br(d)、mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl25(e)的红外谱图。
图3是芘在不同浓度实施例1制备的聚合物胶束中的荧光谱图(激发波长为340nm)。
图4是图3中芘的i3/i1和实施例1聚合物胶束浓度对数(logc)的分析谱图。
图5是芘在不同浓度实施例2制备的聚合物胶束中的荧光谱图(激发波长为340nm)。
图6是图5中芘的i3/i1和实施例2聚合物胶束浓度对数(logc)的分析谱图。
图7是实施例1制备的聚合物胶束在365nmuv光照不同时间下聚合物胶束的紫外可见光谱图。
图8是实施例1制备的聚合物胶束在无刺激下的粒径分布直方图。
图9是实施例1制备的聚合物胶束在365nmuv光照后的粒径分布直方图。
图10是实施例1制备的聚合物胶束在10mmolh2o2下的粒径分布直方图。
图11是实施例1制备的聚合物胶束在10mmoldtt下的粒径分布直方图。
图12是在紫外分光光度计下测得的紫杉醇标准曲线。
图13是负载ptx的实施例1的聚合物胶束在不同刺激多重触发下(无刺激、10mmolh2o2、10mmoldtt、uv光照)的药物释放曲线图。
图14是负载ptx的实施例2的聚合物胶束在不同刺激多重触发下(无刺激、10mmolh2o2、10mmoldtt、uv光照)的药物释放曲线图。
图15是不同浓度的两种空白聚合物胶束培养a549细胞48h时的细胞存活率。
图16是ptx及两种负载ptx的聚合物胶束培养a549细胞48h时的细胞存活率。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、将双(2-羟基乙基)二硫醚(0.9243g，6mmol)、三乙胺(0.606g，6mmol)和四氢呋喃(24ml)加入到100ml圆底烧瓶中，冰浴中搅拌0.5h；将2-溴异丁酰溴(0.946g，4mmol)溶于6ml四氢呋喃中并缓慢滴入圆底烧瓶，反应温度为25℃，密闭并持续搅拌12h。反应结束后，抽滤除去不溶性的盐，利用旋转蒸发仪将滤液浓缩，再用二氯甲烷将其溶解，滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、去离子水洗涤三次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥12h，过滤，浓缩，粗产品通过硅胶柱层析法(乙酸乙酯:正己烷＝1/6，v/v)纯化得到产物2-羟乙基-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物。
将2-羟乙基-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物与(1.4g，0.5mmol)、三乙胺(1.2g，1.2mmol)及二氯甲烷(24ml)加入100ml圆底烧瓶中，0℃下搅拌0.5h；将丁炔基氧基草酰氯(1.5g,1mmol)溶于6ml四氢呋喃，在0℃下缓慢滴入反应体系，滴加完后室温反应12h。反应结束，将不溶盐抽滤，滤液依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、去离子水洗涤三次，合并有机相并干燥，浓缩得到的粗产品通过硅胶柱层析法(乙酸乙酯：正己烷＝1/8)进行纯化，得到式i-1所示的2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物(alkyne-po-ss-br)。
2、将alkyne-po-ss-br(0.2g，0.47mmol)、甲基丙烯酸邻硝基苄酯(nbm)(2.59g，11.75mmol)、五甲基二乙烯三胺(pmdeta)(0.081g，0.47mmol)和n,n-二甲基甲酰胺(5ml)加入50ml的史莱克管中，磁力搅拌至所有反应物完全溶解后，将反应体系密封，反应体系经过两次通氮气-冷冻-抽真空-解冻的循环过程后，加入cubr(0.067g，0.47mmol)搅拌10min使反应物混合均匀，该反应体系再经过一次通氮气-冷冻-抽真空-解冻的过程，置于75℃的油浴锅中，磁力搅拌反应24h。反应用四氢呋喃淬灭，利用中性氧化铝柱除去铜离子等催化剂副产物，将产物浓缩后，在-4℃的无水乙醚中沉淀3次以除去未反应的单体甲基丙烯酸邻硝基苄酯，在25℃下真空干燥得到白色固体即为式ii-1所示的聚合物(alkyne-po-ss-pnbm50-br)。
3、将聚合度为43的甲氧基聚乙二醇(mpeg43-oh)(0.2g，0.1mmol)、辛酸亚锡(24.3mg,0.06mmol)、2-氯-ε-已内酯(clcl)(0.7g，4.2mmol)和无水甲苯(5ml)加入到50ml史莱克聚合管中，搅拌至反应物全部溶解，通过三次通氮气-冷冻-抽真空-解冻的循环操作过程对混合物进行脱氧，然后将密闭的反应系统置于118℃下搅拌10h。反应结束后，将聚合物装入透析袋(透析袋规格：2kd)，用去离子水进行透析72h后冷冻干燥，得到式iii-1所示双亲性聚合物(mpeg43-b-pclcl25)。
4、将mpeg43-b-pclcl25(0.665g，3.5mmol)溶于20mldmf中，搅拌至完全溶解，然后加入叠氮化钠(0.0627g，0.965mmol)，室温反应24h，过滤除去不溶性盐，将聚合物装入透析袋进纯化(透析袋规格：2kd)，冷冻干燥即得到式iv-1所示聚合物(mpeg43-b-pacl25)。
5、称取mpeg43-b-pacl25(0.04g，0.1mmol)、alkyne-po-ss-pnbm50-br(0.31g，0.125mmol)、pmdeta(0.017g,0.1mmol)加入史莱克聚合管中，溶解于无水dmf(5ml)，通过两个通氮气-冷冻-抽真空-解冻的循环操作过程对所得混合物进行脱氧处理，然后快速加入cubr(0.014g，0.1mmol)，再进行一次通氮气-冷冻-抽真空-解冻操作，再在50℃下连续搅拌反应24h。反应完后旋蒸除去溶剂，将聚合物装入透析袋(透析袋规格：2kd)，用去离子水进行透析，每4h换一次水，72h后冷冻干燥产物，得到式v-1所示的双亲嵌段聚合物(mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl25)。
采用核磁共振谱仪、傅里叶红外光谱对上述步骤5所得样品进行表征，结果见图1～2。图1中，7.57-7.76ppm峰归属nbm单元的-ar-h基团上的氢，3.65ppm峰归属于mpeg单元中-och2基团的氢，1.35-2.29ppm峰归属于pcl单元的-ch2ch2ch2基团上的氢，3.92ppm及2.85ppm峰归属于alkyne-po-ss-br引发剂的-ssch2ch2基团上氢，8.04ppm峰归属为1,2,3-三氮唑环的特征吸收峰(-n-ch＝c-基团)。对比图2中曲线a与b，1165cm-1处出现吸收峰为c-o-c的伸缩振动峰，归属为mpeg-b-pclcl的酯基；710cm-1处的吸收峰为c-cl的伸缩振动，进一步证实mpeg-b-pclcl的成功合成；在2100cm-1处出现的叠氮基团的特征吸收证明嵌段聚合物mpeg-b-pclcl支链被叠氮化修饰；随着点击化学反应的进行，2100cm-1处的特征吸收峰显著减弱，1630cm-1处出现的新信号峰为1,2,3-三氮唑环特征吸收峰，这些均证实双亲嵌段聚合物mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl25被成功制备。
6、将mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl25(1.095g，0.05mmol)溶于10ml四氢呋喃中，缓慢的滴加到20ml超纯水中，在磁力搅拌下形成均一的胶束溶液。将得到的胶束溶液搅拌24h挥发除去四氢呋喃，最终得到具有三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束。以芘分子作为探针测试所得聚合物胶束的cmc为0.037mg/ml(见图3和图4)。
实施例2
1、该步骤与实施例1的步骤1相同，得到式i-1所示的2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物(alkyne-po-ss-br)。
2、该步骤与实施例1的步骤2相同，得到式ii-1所示的聚合物(alkyne-po-ss-pnbm50-br)。
3、该步骤中clcl的用量增加至0.8g(4.8mmol)，其他步骤与实施例1的步骤3相同，得到式iii-2所示双亲性聚合物(mpeg43-b-pclcl35)。
4、该步骤中，用等摩尔mpeg43-b-pclcl35替换实施例1步骤4中的mpeg43-b-pclcl25，其他步骤与实施例的步骤4相同，得到式iv-2所示聚合物(mpeg43-b-pacl35)。
5、该步骤中，用等摩尔mpeg43-b-pacl35替换实施例1步骤4中的mpeg43-b-pacl25，其他步骤与实施例的步骤5相同，得到式v-2所示双亲嵌段聚合物(mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl35)。
6、将mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl35(1.53g，0.05mmol)溶于10ml四氢呋喃中，缓慢的滴加到20ml超纯水中，在磁力搅拌下形成均一的胶束溶液。将得到的胶束溶液搅拌24h挥发除去四氢呋喃，最终得到具有三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束。以芘分子作为探针测试所得聚合物胶束的cmc为0.022mg/ml(见图5和图6)。
通过gpc的方法得到了实施例1和实施例2中聚合物的分子量及分子量分布，数据见表1。
表1聚合物的分子量数据
采用uv-vis光谱法研究了实施例1制备的双亲嵌段聚合物mpeg43-b-p(po-ss-nbm50)cl25的光响应特性。如图7所示，聚合物胶束溶液在经过365nmuv光照后，265nm处的邻硝基苄酯峰有所减弱，该现象可以解释为随光照时间的增加聚合物结构中的pnbm链段的破坏越严重。与之相反，我们可以显著的观察到随着光照时间的增加，314nm处的信号峰在不断地增强，这归因于副产物硝基苯甲醛的生成。由此可见，该聚合物胶束具有光刺激响应性。如图8所示，dls结果显示聚合物胶束的水动力学半径为153.9nm，具有单峰分布，pdi仅为0.094，表明该聚合物在水溶液中形成的胶束尺寸大小均一，形貌规整。图9是聚合物胶束在365nmuv光照30min后，聚合物胶束的粒径增大到199.3nm，pdi为0.225，胶束的分布呈双峰，这是由于光照的作用使得内核中pnbm链段发生断裂，发生亲疏水性的改变，从而导致胶束紧密的内核发生部分破坏，粒径由此变大。图10是聚合物胶束在氧化环境中的粒径分布情况，当向胶束体系中加入10mmol/lh2o2时，由于被修饰的pcl链段中含有氧化敏感的过氧草酸酯键，因此被修饰链段会发生断裂，然而由于pnbm为疏水性，因此可能部分停留于胶束的内核中，由于断裂导致的结构疏松，因此粒径会发生较大幅度的增加，而pdi也变为0.862。当向体系中加入10mmol/ldtt时，胶束处于还原环境，内核修饰链上的二硫键会发生断裂从而导致内核紧密结构的破坏，粒径变至672nm(见图11)。由此可见聚合物胶束具有光、氧化及还原刺激响应性。
实施例3
以紫杉醇(ptx)作为疏水药物模型，以实施例1和2的聚合物胶束为载体，制备ptx载药胶束，研究聚合物胶束对药物的负载情况及在模拟的生理环境中控制释放性能，具体试验如下：
1、标准工作曲线的确定
称取5mgptx溶于dmf溶液中，磁力搅拌下至其充分溶解，然后将其转移到50ml的容量瓶，加溶剂dmf至刻度处，即得到浓度为0.1g/l的ptx溶液，用微量进样器分别取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml、7.0ml及8.0ml的上述ptx溶液至10个干燥的50ml容量瓶，加dmf至刻度处，定容后得到浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml和40mg/ml的ptx溶液。实验通过紫外分光光度法测定不同浓度的ptx溶液在波长为228nm处的吸光度(abs)，然后以溶液的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标进行作图，即可得到ptx的标准工作曲线。
将不同ptx的浓度值作为横坐标，相应的吸收光度a为纵坐标，计算可得到一个回归方程y＝0.03511x 0.0303，r2＝0.9995，即ptx的标准曲线(见图12)。
2、制备封装ptx的聚合物胶束
将ptx通过物理包覆的方法负载至聚合物胶束中，具体方法为：将30mg双亲嵌段共聚物与1.5mgptx溶解在10mldmf中，至其完全溶解后将其逐滴加入到去离子水中同时搅拌以诱导胶束的形成，搅拌30min后将胶束溶液转移到透析袋中透析24h以除去有机溶剂dmf(透析袋规格：2kd)，再通过离心的方法得到负载ptx的聚合物胶束，冲洗两次以除去未负载上的ptx，冷冻干燥。聚合物胶束的载药率(lc)和包封率(ee)通过下列公式3-1和3-2进行计算：
3、封装ptx的聚合物胶束的药物释放实验
称取负载ptx的聚合物胶束(5mg)溶于pbs缓冲溶液中，并将其平均分为3份(空白对照、光照、加氧化剂h2o2或还原剂dtt)。将3种经过不同刺激的混合物注入1kd的透析袋中，并将透析袋放于加有模拟生理环境的缓冲溶液(150ml)的烧杯中。每间隔5h从释药体系中取3ml透析液，利用紫外分光光度计测量其在228nm处的吸光度。每次取出测试液时，应往释药体系中加入同等体积的透析液以保证总体积恒定。通过以下公式计算药物的累积释放率：
其中mt为t时刻聚合物胶束释放出的ptx质量，m0为聚合物负载的药物总质量，未包覆的ptx可以通过测定228nm处的紫外吸光度进行计算而得到。
通过uv-vis法测得两种嵌段比不同的聚合物胶束的dlc和dle如表2所示。对比可以发现两者在投料比相同的条件下，实施例2聚合物胶束的药物包覆率更高(11.2％)，药物包封效率也更高(72.3％)。这主要是由于聚合物疏水链分子量的增加使得胶束内核体积增加，负载药物的能力随之增强，而ptx为疏水性药物，因此载药的同时又协同地增加了聚合物胶束的稳定性，保证药物封装的高效性以及储存稳定性，避免在载药过程中出现大量的药物泄露情况。
表2两种嵌段比不同的聚合物胶束的lc和ee
图13～14表明不同嵌段比的聚合物胶束载药释放效率具有一定的差异性，其中疏水链段比值较大的实施例2聚合物胶束表现出更为敏感的药物释性能。从图中可以看到两种不同聚合物胶束在模拟体液环境中，无刺激时药物的累积释放量仅为10％，说明两种胶束均具有良好的存储稳定性。当释药体系受到365nmuv光照的刺激时，实施例1聚合物胶束与实施例2聚合物胶束在前20h内均表现出良好的控制释放过程，其累计释放量分别为43.6％和51.5％，实施例2聚合物胶束之所以表现出更高的累计药物释放量是由于其疏水内核中含有的刺激响应性官能团较多。
当载药体系处于还原或者氧化环境中，即透析液中含有10mmol/lh2o2或10mmol/ldtt时，由于聚合物中的过氧草酸酯键、二硫键可以分别与h2o2、dtt发生反应，从而导致胶束中部分链段断裂，结构被破坏导致更多药物的释放，如图图13所示，实施例1聚合物胶束的累计释放量分别增加至63.2％、65.4％，且在30h后仍然呈现缓慢递增的趋势。由图14可知，实施例2聚合物胶束对ptx的释放速率在氧化或还原刺激下同样呈现更高的释放量，分别可达71.2％、76.3％，同样归因化学键的断裂，促使更多的ptx从聚合物胶束中释放出来。实验结果表明聚合物胶束具有不同的刺激响应性，且疏水嵌段比值大的聚合物胶束具有更好的刺激敏感性及缓释效果。
4、体外细胞毒性测试
通过mtt法检测ptx、空白聚合物胶束以及负载ptx的聚合物胶束对细胞存活率的影响。首先向a549细胞中加入胰蛋白酶消化液，得到细胞悬液。在96孔板中接种时，浓度为1×104/孔，每孔100μla549细胞悬液，置于37℃、5％co2培养箱中。24h后，向每个孔板中加入不同浓度的空白胶束继续培养24h。待培养结束后，向每个孔板中避光加入20μlmtt储备液，继续培养4h。结束后，小心吸走上清液，并向孔板中中加入200μl细胞级dmso溶液，震荡培养10min以便结晶物质充分溶解，在490nm处测定细胞的吸光度值(od)。细胞的存活率计算公式如下：
其中od空白样品是空白培养基吸光度值，od待测样品分别是ptx、空白聚合物胶束以及负载ptx的聚合物胶束的吸光度值。
如图15所示，两种空白聚合物胶束在浓度为0.1～500μg/ml内对a549细胞表现出大于85％的存活率，实验结果证实所制备的两种聚合物胶束具有良好的生物相容性，可以用于生物载体材料。将a549细胞与游离ptx、装载ptx的两种聚合物胶束培养48h，游离的ptx作为阴性对照，ptx浓度范围为0.1～20μg/ml时细胞的存活率如图16所示，根据图可以看出随着ptx浓度的增加，a549细胞的存活率在下降，当浓度达到20μg/ml时，细胞的存活率为18％。与此同时，负载ptx的实施例1聚合物胶束与实施例2聚合物胶束随浓度增加的同时对于细胞的毒性也在增加，当浓度达到20μg/ml时，细胞的存活率分别下降到22％及24％。该现象说明，随着聚合物中疏水链段的增加，载药胶束的稳定性提高，对于细胞的毒性减小，另一方面说明载药纳米粒子在癌细胞中的抑制作用低于游离ptx。
1.一种三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束，其特征在于所述聚合物的结构式如下所示：
式中x为30～100的整数，y为25～60的整数，z为20～80的整数。
2.一种权利要求1所述的三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)将双(2-羟基乙基)二硫醚与2-溴异丁酰溴反应合成2-羟乙基-2’-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物；将2-羟乙基-2’-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物、三乙胺溶于二氯甲烷，然后在0℃下滴加丁炔基氧基草酰氯，滴加完后在剧烈搅拌下进行酰化反应，得到式i所示的2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物；
(2)以溴化亚铜为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，在惰性气体保护下，将甲基丙烯酸邻硝基苄酯在2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物的引发下进行原子转移自由基聚合反应，得到式ii所示聚合物；
(3)以甲氧基聚乙二醇为引发剂、辛酸亚锡为催化剂、2-氯-ε-已内酯为单体，通过开环聚合反应合成式iii所示双亲性聚合物；
(4)将式iii所示双亲性聚合物、叠氮化钠溶于n,n-二甲基甲酰胺中，在剧烈搅拌下进行叠氮化反应，得到式iv所示聚合物；
(5)以溴化亚铜为催化剂、五甲基二乙烯三胺为配体、n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，在惰性气体保护下，将式iii所示双亲性聚合物和式iv所示聚合物进行点击化学反应，得到式v所示双亲嵌段聚合物；
(6)将式v所示双亲嵌段聚合物溶于四氢呋喃中，利用透析法制备成胶束，得到三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束。
3.根据权利要求2所述的三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述双(2-羟基乙基)二硫醚与2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:(1～3)；所述2-羟乙基-2’-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物与三乙胺、丁炔基氧基草酰氯的摩尔比为(4～6):(10～12):(8～11)，酰化反应的温度为20～35℃，时间为8～14小时。
4.根据权利要求2所述的三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述甲基丙烯酸邻硝基苄酯、2-丁炔基氧基草酸酯-2′-(溴异丁酰基)-乙基二硫化物、溴化亚铜、五甲基二乙烯三胺的摩尔比(20～60):1:(1～2):(1～2)，所述原子转移自由基聚合反应的温度为60～80℃，时间为18～24小时。
5.根据权利要求2所述的三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述甲氧基聚乙二醇与辛酸亚锡、2-氯-ε-已内酯的摩尔比为(1～2):1:(60～80)；所述开环聚合反应的温度为100～120℃，时间为10～12小时。
6.根据权利要求2所述的三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，式iii所示双亲性聚合物与叠氮化钠的摩尔比为(3～4):1；所述叠氮化反应的温度为20～35℃，时间为24～36小时。
7.根据权利要求2所述的三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，式iii所示双亲性聚合物与式iv所示聚合物、溴化亚铜、五甲基二乙烯三胺的摩尔比(1～3):(1～2):(1～2):(1～2)，所述点击化学反应的温度为50～70℃，时间为24～48小时。
8.权利要求1所述三重刺激响应性可降解纳米聚合物胶束作为药物载体在制备紫杉醇载药胶束中的应用。
技术总结