本发明涉及样品中磷酸根的检测方法，具体涉及一种基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针对磷酸根的测定，属于生物与环境检测技术领域。
背景技术：
磷酸根是广泛存在于环境中的一种阴离子，它经常被用来做阻燃剂、农作物肥料、洗涤剂等。对于水生生态系统来说，它是水生生物必要的营养元素，但是过量的磷酸根会导致微生物大量繁殖，造成水体富营养化，严重消耗水中的溶解氧，从而使其他动植物因缺氧而死亡，因此磷酸根是重要的水质指标之一。同时磷酸根也在人体生命系统中发挥着重要作用，它是人体遗传物质的组成成分，在能量代谢、膜完整性、骨骼发育中起着重要作用。人体体液如血清、尿液中磷酸根含量的高低反映着人体的健康状况。磷酸根的缺乏会导致肌无力、骨骼发育不良，而磷酸根水平过高又意味着肾功能异常。很多食品添加剂中含有磷酸根，而磷酸根容易与钙离子结合，过多摄入磷酸根会导致人体吸收钙离子的能力降低，从而造成骨质疏松、骨折等疾病。
目前检测磷酸根的方法主要有紫外-可见分光光度法、离子色谱法、电分析法和酶生物传感器等，但这些分析方法存在一些缺陷，比如需要昂贵的仪器、操作过程繁琐、存在一定干扰、灵敏度不够高等。而荧光法具有方便、快捷、灵敏等优点，在检测磷酸根方面具有一定优势。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，并提供一种基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针及检测方法。
本发明所采用的具体技术方案如下：
一种基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，该荧光探针是由稀土离子骨架材料在ph＝6.5～7.5的缓冲溶液体系中形成的复合物；所述稀土离子骨架材料的制备方法为：将在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，分别加入环丙沙星与eucl3溶液，混合均匀并静置后，在搅拌条件下，滴加均苯四甲酸溶液，其中加入的环丙沙星、eu3 和均苯四甲酸的摩尔比为(0.5～2)：1：(4-20)；滴加完毕后，继续搅拌反应至沉淀完全，收集沉淀物并进行洗涤和干燥，得到稀土离子骨架材料。
作为优选，所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的ph＝7.0，浓度为22.5mm。
作为优选，加入的环丙沙星、eu3 和均苯四甲酸的摩尔比优选为1:1:5，其中eu3 浓度为100～250μm。
作为优选，滴加完毕后，继续搅拌反应时间为15h。
作为优选，沉淀完全后，沉淀物用0.22μm的滤膜过滤。
作为优选，所述洗涤采用蒸馏水多次清洗，所述干燥采用室温晾干。
作为优选，所述缓冲溶液体系为ph＝6.5～7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
作为优选，所述缓冲溶液体系中，稀土离子骨架材料的浓度优选为25mg/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的ph优选为7.0。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述任一方案所述双发射比率荧光探针的水样中磷酸根检测方法，其步骤如下：
取待测样品定量加入所述的双发射比率荧光探针中定容，然后将定容后的混合溶液充分摇匀后，静置反应10～90min，以347nm为激发波长，分别测定其在发射波长为415nm、614nm处的荧光强度f415、f614，以log(f415/f614)与磷酸根浓度的线性关系计算待测水样中磷酸根的浓度。
作为优选，所述定容后的混合溶液中稀土离子骨架材料的浓度为25mg/l；所述静置反应的时间为30min。
本发明相对于现有技术而言，基于稀土离子骨架材料构建了一种新型的双发射比率荧光探针，该荧光探针对磷酸根具有灵敏的响应，能够准确测定水样中的磷酸根浓度，其检测限为4.4nm。而且，该荧光探针具有较好的选择性，常见的无机阴离子和无机阳离子对该荧光体系基本不存在干扰。
附图说明
图1为mofs材料及各组分的荧光性能；
图2为双发射比率荧光探针对磷酸根的响应；
图3为mofs合成组分的浓度比优化(f＝f415/f614,f0、f分别为磷酸根加入前、后的两个荧光峰强度的比值)；
图4为eu3 浓度的优化(f＝f415/f614,f0、f分别为磷酸根加入前、后的两个荧光峰强度的比值)；
图5为ph对双发射比率荧光探针测定体系的影响(f＝f415/f614,f0、f分别为磷酸根加入前、后的两个荧光峰强度的比值)；
图6为反应时间对双发射比率荧光探针测定体系的影响(f＝f415/f614)；
图7为磷酸根检测的线性关系，该图中的小图为大图中线性段的拟合示意图；
图8为其它阴阳离子对荧光体系的干扰情况(po43-和各干扰离子浓度均为10μm)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
实施例1
本实施例中，设计了一种基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，该双发射比率荧光探针用于对水中的磷酸根浓度进行检测。该双发射比率荧光探针的制备方法如下：
(1)稀土离子骨架材料(ln-mofs)的制备：在22.5mm142.0ml的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(hepes，ph＝7.0)中，分别加入一定量的环丙沙星(cip)与eucl3溶液，混合均匀后室温静置30min；在搅拌条件下，再滴加一定量的均苯四甲酸(btec)溶液，上述加入的反应物中，cip：eu3 ：btec的浓度比(摩尔浓度)为(0.5～2)：1：(4-20)。滴加过程中会迅速形成沉淀，滴加完后继续搅拌反应15h。上述反应物用0.22μm的滤膜过滤，保留沉淀物，用蒸馏水洗涤沉淀数次后室温晾干，得到ln-mofs。
本步骤中，cip：eu3 ：btec的浓度比可以根据实际调整，其中最佳浓度比为1:1:5(此时eu3 浓度为250μm)。
(2)双发射比率荧光探针构建：取制得的ln-mofs配制成200.0mg/l的储备液。在5.0ml比色管中，分别移入一定体积200.0mg/l的ln-mofs储备液，0.5ml100.0mmhepes缓冲液(ph＝6.5～7.5)，得到双发射比率荧光探针体系。可以向上述双发射比率荧光探针体系中加入一定浓度(0.01～10.0μm)的po43-标准溶液或待测样品，最后用蒸馏水定容至5.0ml，静置反应一定时间后，用于通过后续的比率探针法测定最终磷酸根浓度。在实际测定是，可在激发波长下，测定其双发射波长处的荧光强度，通过比率探针计算待测样品中磷酸根的浓度。
为了确定该检测体系中的最佳参数，通过设置多个试验组对其进行优化。
1.双发射比率荧光探针的构建与荧光性能
稀土离子骨架材料(ln-mofs)是由cip、eu3 、btec制备而成的，mofs材料与各组分的荧光光谱如图1所示。实施例1中制得的mofs材料有415nm与614nm两个荧光发射峰，分别对应cip与eu3 的特征荧光峰，磷酸根加入后发红光的eu3 离子特征荧光峰减弱，而发蓝光的cip荧光增强(如图2)，构成了双发射比率荧光探针，可以用于磷酸根的灵敏测定。
2.双发射比率荧光探针测定条件的优化
1)cip/eu3 /btec摩尔比优化：
在eu3 浓度为250μm时，试验了cip/eu3 浓度比为0.5:1、1:1、2:1条件下，btec/eu3 浓度比变化时制备的双发射比率荧光探针对磷酸根淬灭效率的影响，结果如图3所示。结果表明，cip/eu3 /btec组成比为1:1:5时制得的mofs材料对磷酸根的淬灭效率最佳。
2)体系中eu3 浓度优化：
固定cip/eu3 /btec组成比为1:1:5，试验了eu3 浓度变化时对磷酸根淬灭效率的影响，如图4所示，结果表明eu3 在100-250μm范围内最佳，实验中选取eu3 浓度为250μm。
3)hepes缓冲液ph与静置反应时间优化：
同时试验了将ln-mofs溶解于hepes缓冲液构建荧光探针时，hepes缓冲液的ph与静置反应时间对双发射比率荧光探针测定体系的影响，结果如图5和图6所示。结果表明，ph＝7，平衡反应时间为30min是测定体系最优化条件。
3.双发射比率荧光探针对磷酸根的定量检测
通过加入不同po43-浓度的标准溶液，确定上述各最优条件下构建的双发射比率荧光探针能否对磷酸根实现定量检测。如图7所示，随着po43-浓度的增大，614nm处来自eu3 的荧光强度下降，而415nm处cip的荧光强度增强，365nm紫外灯照射下也可以观察到溶液颜色由红色逐渐变为蓝色。对测定结果分析后发现，两处荧光强度比值的对数log(f415/f614)与po43-在0.01～10μm浓度范围内呈现良好的线性关系，其线性方程为log(f415/f614)＝0.0762c 0.005(r2＝0.9920)，检测限lod(s/n＝3)为4.4nm。
4.双发射比率荧光探针对磷酸根的选择性检测
为了评价上述各最优条件下构建的双发射比率荧光探针对po43-检测的选择性，试验了常见的无机阴离子如no3-、co32-、so42-、so32-、s2-、scn-、ch3coo-、f-、cl-、br-、i-和无机阳离子如na 、mg2 、al3 、k 、ca2 、cu2 、co2 、ni2 、zn2 、mn2 、ag 、ba2 、cd2 、fe2 、fe3 、hg2 、cr3 等对该荧光体系的影响，见图8。除了cr3 对po43-的检测有轻微影响，其余离子的影响可以忽略。
实施例2
本实施例主要为了评估双发射比率荧光探针对实际样品中po43-的检测可行性。
基于实施例1确定的最优条件，本实施例中基于双发射比率荧光探针的水样中磷酸根检测方法，其步骤如下：
(1)稀土离子骨架材料(ln-mofs)的制备：在22.5mm142.0ml的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(hepes，ph＝7.0)中，分别加入一定量的环丙沙星(cip)与eucl3溶液，混合均匀后室温静置30min；在搅拌条件下，滴加一定量的均苯四甲酸(btec)溶液，所加入的反应物中cip/eu3 /btec浓度比为1：1：5，其中eu3 浓度为250μm。滴加过程中会迅速形成沉淀，滴加完后继续搅拌反应15h。上述反应物用0.22μm的滤膜过滤，保留沉淀物，用蒸馏水洗涤沉淀数次后室温晾干。
(2)磷酸根(po43-)的检测：取制得的ln-mofs配制成200.0mg/l的储备液。在5.0ml比色管中，分别移入一定体积200.0mg/l的ln-mofs储备液(定容后的最终溶液中ln-mofs浓度为25mg/l)，0.5ml100.0mmhepes缓冲液(ph＝7.0)，再加入待测样品，最后用蒸馏水定容至5.0ml，充分摇匀后，静置反应30min。以347nm为激发波长，分别测定其在发射波长为415nm、614nm处的荧光强度f415、f614，以log(f415/f614)与磷酸根浓度的线性关系计算待测水样中磷酸根的浓度。
此处线性关系方程参见实施例1，即：log(f415/f614)＝0.0762c 0.005(r2＝0.9920)，c为磷酸根浓度。
本实施例中，加入的待测样品为人体尿液，人体尿液中磷酸根的含量高低与肾脏、肝脏功能的异常以及维生素d的缺乏等有着密切关系，因此临床检验中将磷酸根的含量作为常规检测项目之一。分别收集某志愿者早晨、中午和下午的尿样，稀释1000倍后，用本法直接平行测定5次，测定的结果与磷钼蓝分光光度法测得的结果比较如表1，由表可以看出两种测定方法结果基本一致。
表1尿样中磷酸根的检测
同样的，除了人体尿液之外，该方法也可以用于测定其他水样中的磷酸根浓度。若水样中磷酸根浓度过高，应当预先进行稀释，检测浓度尽量保持在0.01～10.0μm范围内。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
1.一种基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，该荧光探针是由稀土离子骨架材料在ph＝6.5～7.5的缓冲溶液体系中形成的复合物；所述稀土离子骨架材料的制备方法为：将在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中，分别加入环丙沙星与eucl3溶液，混合均匀并静置后，在搅拌条件下，滴加均苯四甲酸溶液，其中加入的环丙沙星、eu3 和均苯四甲酸的摩尔比为(0.5～2)：1：(4-20)；滴加完毕后，继续搅拌反应至沉淀完全，收集沉淀物并进行洗涤和干燥，得到稀土离子骨架材料。
2.如权利要求1所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的ph＝7.0，浓度为22.5mm。
3.如权利要求1所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，加入的环丙沙星、eu3 和均苯四甲酸的摩尔比优选为1:1:5，其中eu3 浓度为100～250μm。
4.如权利要求1所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，滴加完毕后，继续搅拌反应时间为15h。
5.如权利要求1所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，沉淀完全后，沉淀物用0.22μm的滤膜过滤。
6.如权利要求1所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，所述洗涤采用蒸馏水多次清洗，所述干燥采用室温晾干。
7.如权利要求1所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，所述缓冲溶液体系为ph＝6.5～7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
8.如权利要求7所述的基于稀土离子骨架材料的双发射比率荧光探针，其特征在于，所述缓冲溶液体系中，稀土离子骨架材料的浓度优选为25mg/l，4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的ph优选为7.0。
9.一种利用如权利要求1～8任一所述双发射比率荧光探针的水样中磷酸根检测方法，其特征在于，步骤如下：
取待测样品定量加入所述的双发射比率荧光探针中定容，然后将定容后的混合溶液充分摇匀后，静置反应10～90min，以347nm为激发波长，分别测定其在发射波长为415nm、614nm处的荧光强度f415、f614，以log(f415/f614)与磷酸根浓度的线性关系计算待测水样中磷酸根的浓度。
10.如权利要求9所述水样中磷酸根检测方法，其特征在于，所述定容后的混合溶液中稀土离子骨架材料的浓度为25mg/l；所述静置反应的时间为30min。
技术总结