相关申请案之交叉引用
本申请根据2017年10月12日提交的美国临时专利申请第62/571608号和2018年2月10日提交的美国临时专利申请第62/628973号，皆以全文引用之方式并入本文中。
背景技术：
t细胞，淋巴细胞的一种，在细胞介导之免疫性中起重要作用。其与其他淋巴细胞(诸如b细胞及自然杀手细胞(nk细胞))之区别在于细胞表面上存在t细胞受体(tcr)。t辅助细胞，亦称为cd4 t或cd4t细胞，在其表面上表达cd4糖蛋白。辅助t细胞在暴露于由mhc(主要组织相容复合体)ii类分子呈递之肽抗原时活化。一旦活化，此等细胞快速增殖且分泌可调节免疫反应之细胞因子。细胞毒性t细胞，亦称为cd8 t细胞或cd8t细胞，在细胞表面上表达cd8糖蛋白。cd8 t细胞在暴露于由mhci类分子呈递之肽抗原时活化。记忆t细胞，一种t细胞亚群，长期留存并回应于其等同源抗原，因此向免疫系统提供针对过去感染及/或肿瘤细胞之“记忆”。
经基因改造后，t细胞可于其表面产生特殊受体，称为嵌合抗原受体(car)。car为允许t细胞识别肿瘤细胞上之特定蛋白(抗原)之蛋白。此等经工程改造之cart细胞接着在实验室中生长直至其数目达到数十亿。接着将扩增之cart细胞群输注给患者。
迄今为止，临床试验已证实嵌合抗原受体(car)t细胞在对标准化学疗法具有抗性之血液科恶性疾病中具有巨大前景。最值得注意的是，特定之cd19car(cd19car)t细胞疗法具有显著效果，包括b细胞恶性肿瘤之长期缓解(kochenderfer,wilson等人2010，kalos,levine等人2011，porter,levine等人2011，davila,riviere等人2013，grupp,frey等人2013，grupp,kalos等人2013，kalos,nazimuddin等人2013，kochenderfer,dudley等人2013，kochenderfer,dudley等人2013，lee,shah等人2013，park,riviere等人2013，maude,frey等人2014)。
尽管car疗法在b细胞白血病及淋巴瘤中取得成功，但尚未有明确之car疗法应用于软组织肿瘤。鉴于恶性软组织肿瘤之疗法比b细胞恶性肿瘤之疗法具有明显更差之效果(abramson,feldman等人2014)，因此car疗法具有进一步解决巨大临床需求之潜力。
现时存在一些阻碍car治疗性方法之更广泛应用之障碍。其中最常见挑战为：(1)抗原标靶及嵌合抗原受体之选择；(2)car设计；(3)肿瘤异质性，尤其肿瘤抗原之表面表达之差异。靶向单一抗原具有免疫逃逸之风险，此可由靶向多个所需抗原来解决。
大部分car嵌合抗原受体为来源于单株抗体之scfv且部分此等单株抗体已用于临床试验或疾病治疗。然而，单株抗体具有有限功效，表明需要替代的及更强效的靶向方法，诸如car。
靶点发现和选择是第一步，因为没有通用规则来确保或指导car设计的有效性。
scfvs为car之最常用的嵌合抗原受体。然而，抗原上所识别之抗原决定基之car亲和结合及位置可影响功能。此外，t细胞或nk细胞之表面car表达量受适合的前导序列及启动子影响。然而，过表达之car蛋白可对细胞具有毒性。
因此，现时仍然需要经改良之基于嵌合抗原受体之疗法，其可慮及t细胞相关恶性肿瘤之更有效、安全及有效靶向。
此外，car靶向神经母细胞瘤由于存在异质性肿瘤群体以及肿瘤微环境抑制而具有相当的挑战性。长期以来针对神经母细胞瘤的抗原特异性免疫治疗一直致力于改善患者的治疗效果，但迄今为止成功率有限，因为许多此类治疗要么在临床上无效，要么对患者的治疗效果产生不确定的影响。神经母细胞瘤或其他软组织肿瘤(如肉瘤)，抗原多样性很强的疾病的理想靶点目前尚未确定。确定合适的靶点是car设计的重要步骤，car设计需要解决肿瘤异质性、car持续性和肿瘤微环境抑制等问题。car设计的有效性和安全性没有一般规律可循。
因此，仍然需要改进以嵌合抗原受体为基础的治疗方法，使软组织肿瘤的靶向性更加有效、安全和高效。
技术实现要素：
在一个实施例中，本发明提供了一种工程细胞，其含有的第一抗原受体多肽包含第一抗原识别结构域，包括第一信号肽，第一铰链区，第一跨膜结构域，第一共刺激结构域和第一信令域；和第二嵌合抗原受体多肽包含第二抗原识别结构域，第二信号肽，第二铰链区，第二跨膜结构域，第二共刺激结构域和第二信号传导结构域；其中第一抗原识别结构域不同于第二抗原识别结构域，并且第一抗原识别结构域和第二抗原排斥结构域选自白介素6受体，ny-eso-1，甲胎蛋白(afp)，甘氨吡啶-3(gpc3)，baff-r，baff，april，bcma，taci，ley，cd5，cd4，cd3，cd2，cd52，gd2，cd13，cd14，cd15cd19，cd20，cd22，cd33，cd30，cd41，cd45cd61，cd64，cd68，cd117，cd123，cd138，cd267，cd269，cd38，flt3受体，cd4，cll-1和cs1(slamf7)。
在另一实施例中，本发明提供一种工程多肽，包括嵌合抗原受体和增强子。
在另一实施例中，本发明提供一种减少靶细胞数量的方法，其步骤包括(i.)将所述靶细胞与有效量的具有至少一种嵌合抗原受体多肽的工程细胞接触，对于具有多个嵌合抗原受体多肽的工程细胞，每个嵌合抗原受体多肽是独立的；并且(ⅱ.)可选地，检测所述细胞数量的减少。靶细胞包括至少一种细胞表面抗原，选自gd2、gd3、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3、糖脂、glypican3、f77、gd-2、wt1、cea、her-2/neu、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6、甲胎蛋白、ca19-9、ca72-4、ny-eso、fap、erbb、c-met、mart-1、muc1、muc2、muc3、muc4，muc5、cd30、egfrviii、cd33、cd123、cll-1、免疫球蛋白kappa和lambda、cd38、cd52、cd19、cd20、cd22、cd38、bcma、cs1、nkg2d受体、april受体、baff受体、taci、cd3、cd4、cd8、cd5、cd7、cd2和cd138。靶抗原还可以包括病毒或真菌抗原，例如来自人乳头瘤病毒(hpv)或ebv(ebstein-barr病毒)抗原的e6和e7。
在另一实施例中，本发明提供了治疗b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、慢性骨髓增生性肿瘤、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、原发性浆细胞样树突状细胞肿瘤、肺癌的方法，肝癌、脑癌、骨肉瘤、乳腺癌、前列腺癌和细胞增殖性疾病，即向有需要的患者施用上述任何工程细胞。
在另一个实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括根据权利要求1向有此需要的患者施用上述工程细胞；其中所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮(sle)，多发性硬化症(ms)，炎性肠病(ibd)，类风湿性关节炎，干燥综合征，皮肌病，自身免疫性溶血性贫血，视神经脊髓炎(nmo)，nmo频谱失调(nmosd)，特发性血小板减少性紫癜(itp)，与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多管炎(mpa)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ancas)，肉芽肿伴多管炎(gpa，wegener肉芽肿病)，或嗜酸性肉芽肿伴多管炎(egpa，churg-strauss综合征)和ttp(血小板减少性紫癜)。
本发明提供了针对非血液系统恶性肿瘤的嵌合抗原受体(cars)，其组成和使用方法。
在一个实施例中，本发明提供了具有第一嵌合抗原受体多肽的工程改造细胞，所述第一嵌合抗原受体多肽包括第一抗原识别结构域，第一信号肽，第一铰链区，第一跨膜结构域，第一共刺激结构域和第一信号域；第二嵌合抗原受体多肽，包括第二抗原识别结构域，第二信号肽，第二铰链区，第二跨膜结构域，第二共刺激结构域和第二信号结构域；其中第一抗原识别结构域不同于第二抗原识别结构域。
在另一个实施例中，本发明提供了包含嵌合抗原受体和增强子的工程改造多肽。
在另一实施例中，本发明提供一种工程多肽，包括嵌合抗原受体和增强子。在另一个实施例中，增强子可从包括但不限于il-2、il-7、il-12、il-15、il-15/il-15sush、il-15/il-15sushi锚、il-15/il-15ra、il-18、il-21、il-21锚、pd-1、pd-l1、csf1r、ctal-4、tim-3、il-15受体α、4-1bbl、il-21、il-21锚和tgfrβ,受体组中选择至少一个。
在一些实施例中，具有抗原识别域的car是表达盒的一部分。在优选实施例中，所述表达基因或盒可包括辅助基因或标签或其部分。副基因可以是诱导自杀基因或其一部分，包括但不限于caspase9基因。“自杀基因”消融方法提高了基因治疗的安全性，只有在特定化合物或分子激活时才能杀死细胞。在一些实施例中，表位标记是c-myc标记、cd52、链霉亲和素结合肽(sbp)、截短的egfr基因(egfrt)或其部分或组合。
在一些实施例中，可通过向受试者施用抗cd52单克隆抗体(campath)来消融car细胞。
在另一实施例中，本发明提供通过向需要的患者施用上述任何工程细胞来治疗软组织肿瘤、癌、肉瘤、白血病和细胞增殖性疾病的方法。
附图说明
图1：car构造和表达
(a)两个离散的car单元：一个由cd8衍生的铰链(h)和跨膜(tm)区域以及与cd3ζ信号结构域相连的4-1bb共激活结构域组成的抗bcma-car通过一个自裂解的p2a肽与一个完整的抗cs1-car融合。用强脾灶形成病毒启动子(sffv)和cd8引导序列在t细胞表面高效表达bc1ccar(bcma-cs1ccar)分子。(b)用流式细胞仪检测对照t细胞bc1ccar的表达。bcma也叫cd269。
图2：bc1ccart细胞对骨髓瘤细胞株的体外抗肿瘤作用
(a)bc1ccar和对照t细胞与mm1s和rpmi-8226细胞共培养24小时，e:t比分别为2:1和5:1。靶细胞用细胞追踪器染料(cmtmr)染色，以区别于效应t细胞，并显示为红色。对bcma、cs1和cmtmr种群进行设门。(b)将bc1ccar和对照t细胞与u266(bcma cs1dim)细胞在相似条件下孵育。(c)bc1ccart细胞对不同骨髓瘤细胞株体外细胞毒性的图解总结。
图3：原发性患者细胞表型
用流式细胞仪检测bcma和cs1的表达。密度图代表主要抗原群体。
图4：bc1ccart细胞对原发性骨髓瘤细胞抗肿瘤活性的研究
(a)对bcma cs1 原发性骨髓瘤细胞(mm7-g)共培养24小时，并用cmtmr预染色靶细胞。用bcma和cs1以及cmtmr对该群进行门控，流式细胞仪显示目标肿瘤群呈红色(左)。总结体外细胞毒性的条形图(右)。(b)在相同条件下与mm10-g原代细胞共培养。流式细胞术检测bcma cs1 双阳性(紫色)和cs1 单阳性(深蓝色)。特异性细胞毒性总结(见下文)。(c)bcmadimcs1dim原代细胞(mm11-g)在e:t剂量范围内显示bc1ccar抗肿瘤活性。(d)bc1ccar体外筛选结果汇总面板图。
图5：bc1ccar抗原特异性的功能验证
(a)将cml细胞株(k562)转入，使其稳定表达bcma或cs1。在各自抗原表达范围内的直方图总体变化显示了表达。(b)短期(4小时-8小时)培养的bc1ccart细胞对bcma-k562或cs1-k562具有抗原特异性细胞毒性，与e:t剂量增加相关。以野生型k562细胞为阴性对照。制备cs1单个car(红条)，比较bc1ccar对cs1-k562细胞的作用。(c)用bcma-k562细胞和cs1-k562细胞的1:1混合物进行长期培养(48小时)。将bc1ccar、cs1-car、bcma-car和对照t细胞按5:1e:t的比例添加到每个处理孔。按治疗条件，直方图显示bcma或cs1细胞残留群体的(％门)，红线界定t细胞或目标肿瘤群体。
图6:长期序列杀伤试验与肿瘤再激发
(a)在没有外源性细胞因子的情况下，在168小时内进行检测，并使用混合bcma cs1 mm1s细胞的car细胞或对照细胞的1:1e:t比率进行初始培养。48小时后，对小样本进行流式细胞仪分析，并将mm1s细胞重新导入每个处理孔。在168小时内重复。(b)48小时后t细胞增殖和反应。流式细胞仪采集当天采集图像，用抗bcma、抗cs1、抗cd3抗体、mm1s细胞(蓝色圆圈)染色。(c)在108小时时，进行类似的图像采集和facs分析。
图7:bc1ccart细胞在体内表现出抗白血病作用
(a)mm1s模型肿瘤通过给小鼠注射1.0x106荧光素酶 细胞制备。用bc1ccart细胞(右)或队中t细胞(左)处理小鼠，并通过ivis采集图像。(b)测量bc1ccart细胞处理小鼠(红色)与对照t细胞处理小鼠(黑色)的平均光强度。(c)bc1car(红色)和对照组(黑色)的生存结果。
图8:bc1ccart细胞在混合抗原异种小鼠模型中表现出更好的细胞毒性作用
(a)以4:1bcma:cs1k562细胞的比例将bcma和cs1表达的k562细胞注射入小鼠模型(每组n＝5)。用bc1ccart细胞、对照t细胞或bcma特异性car治疗小鼠。ivis显示肿瘤负荷，并绘制出各组的荧光强度函数(右)。(b)对照组处理(黑色)、bcma-car处理(蓝色)和bc1ccar处理(红色)小鼠的生存结果。
图9：在单抗原模型中，bc1ccart细胞持续性的改善和肿瘤抑制的维持
(a)注射bcma-k562或cs1-k562肿瘤细胞的小鼠处死时，取它的全血(每组5只)。bcma或cs1阳性峰的直方图总体代表肿瘤的存在。(b)总结小鼠全血和肝脏标本的组织分析。小鼠肿瘤细胞计数通过每250000个样本中抗原阳性细胞的facs建立，并在每个处理组的所有小鼠中取平均。(c)全血和肝组织也通过cd3表达分析了t细胞在耗竭的持续性，总结了所有处死小鼠(右)。
图10a：分别注射bcma-k562或cs1-k562的小鼠全血分析
在不同的处死时间，收集小鼠全血并用抗cd3、cd45、bcma和cs1的抗体标记。构建直方图以显示肿瘤的存在，并在25000个事件中平均计数以生成图形总结。一些老鼠在处死前死亡，无法采集样本。
图10b：分别注射bcma-k562或cs1-k562的小鼠肝脏分析
在不同的献祭时间，收集小鼠肝脏样本并用抗cd3、cd45、bcma和cs1的抗体标记。构建直方图以显示肿瘤的存在，并在25000个事件中平均计数以生成图形总结。一些老鼠在献祭前死亡，无法采集样本。
图11a：带有il-15/il-5sushi增强子结构的ccar-t示意图
该结构包括驱动cars多模块单元表达的sffv启动子和分别由p2a和t2a肽连接的il-15/il-15sushi。在连接体裂解后，ccars分裂，靶向表达bcma和/或cs1和il-15/il-15sushi融合的分泌促进剂。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于bcmacar段上的4-1bb或cd28以及cs1car段上的cd28或4-1bb。所述结构物的肽自裂解肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌增强剂还可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7、il-21和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。可溶性il-15/il-15sushi融合稳定，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的免疫调节作用。可溶性il-15/il-15sushi融合还可增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖和抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图11b.cart细胞的表达。用抗人cd3抗体激活富集的白细胞细胞3天。用对照载体(左)和cd269-a7d-hu63-il15/il-15sushi(右)转导细胞。培养3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。cart细胞被表示为绿点(带圆圈)。
图11c.cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞在共培养分析中特异性裂解k562肿瘤细胞系，该肿瘤细胞系合成表达bcma(左)或cs1(右)表面抗原。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养48小时，并用流式细胞仪直接分析抗人cs1(cd319)和cd3。
图11d.cd269-a7d-cs1-il15/il15sushicart细胞在体内对mm.1s肿瘤细胞系(骨髓瘤细胞系)具有较强的抗肿瘤作用。亚致死剂量照射nsg小鼠，静脉注射4.0x106荧光素酶表达的mm.1s细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后8天开始，小鼠静脉注射15×106的cd269-a7d-cs1-il15/il15sushicart或载体对照t细胞。第8天(t细胞注射前)和第12天(t细胞注射后72小时)，小鼠皮下注射d-荧光素，并进行ivis显像。
图11e.cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushink细胞表达功能性il15。用cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-car慢病毒载体转染nk-92细胞。(a)在bd-facs-aria上对细胞进行分类，选择f(ab')2表型阳性的nk细胞。(b)cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-car-nk细胞和野生型nk-92细胞在24孔培养板中以0.5x10e6细胞/ml的总体积培养。将细胞添加到重复的孔中；每对孔中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一个孔没有。48小时后(第2天)，计数细胞(b)，体积增大，产生约0.5x10e6细胞/ml的浓度。该过程在第4、6和8天重复。
图11f.将分类的cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushink细胞和野生型对照nk-92细胞分别培养在不同的孔中72小时。收集上清液，在涂有il-15抗体的96孔板上进行elisa检测。按照制造商(boster)的指示，将读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线(a)进行比较，以确定上清液(b)中il-15的浓度。
图12:cd123b-cd33b-ccar的遗传结构和功能
(a)代表cd123-cd33ccar。(b)cd123b-cd33b-ccart细胞是由cd123b-cd33b-ccar基因构建的病毒转染的供者t细胞而产生的。转导后的cd123和cd33-car蛋白在cart细胞表面表达，并能识别和结合白血病细胞表面的cd123和cd33靶蛋白。cd123b-cd33b-ccar-t细胞的药理作用和机制是通过cd123b-cd33b-ccar对抗原的识别来介导的，通过在构建物中加入cd28或4-1bb共激活区，cd3zeta/zap70的典型细胞毒性t细胞活性进一步增强，从而产生“第二代”car。
图13:cd123b-cd33bccar转导效率
流式细胞术检测t细胞表面cd123b-cd33b-ccar表达水平。
图14:cd123b-cd33bccart细胞显示molm13和u937肿瘤细胞系的靶向溶解
(a)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞对molm13(aml细胞系)肿瘤靶细胞的作用。目标细胞群被圈出。(b)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞对u937肿瘤靶细胞的作用。目标细胞群被圈出。(c)molm13肿瘤细胞(cd123 cd33 )和u937细胞(cd123-cd33 )单独染色作为标记物，并在两种e:t比率下汇总其溶解百分比。(d)用hl60(cd123dimcd33 )和kg1a(cd123dimcd33 )细胞进行的剂量依赖性培养在e:t比为0.25:1到10:1时显示出较高的ccar杀伤效率。
图15:cd123b-cd33bccart细胞显示对原发性肿瘤细胞的靶向溶解
(a)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞在2:1和5:1e:t比率下对pt1肿瘤靶细胞的杀伤作用。目标细胞群被圈出。(b)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞在2:1和5:1e:t比率下对pt2肿瘤靶细胞的杀伤作用。目标细胞群被圈出。(c)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞在2:1和5:1e:t比率下对pt3肿瘤靶细胞的杀伤作用。靶细胞群(cd123 cd34 )被cd38表达圈出并进一步分解，显示lsc(cd123 cd34 cd38-)消除。(d)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞在2:1和5:1e:t比率下对pt4肿瘤靶细胞的杀伤作用。靶细胞群(cd33 主体病)被圈出。(e)cd123b-cd33bccart细胞在2:1和5:1e:t比率下对所有四个患者样本的裂解百分比分析总结。
图16:cd123b-cd33bccart细胞高效地消除表达cd33或cd123抗原的细胞
(a)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞对野生型jurkat肿瘤细胞和表达cd123(jurkatxp123)的jurkat细胞的作用。目标细胞群被圈出。(b)流式细胞术分析对照t细胞和cd123b-cd33b-ccart细胞对野生型jurkat肿瘤细胞和表达cd33(jurkatxp33)的jurkat细胞的作用。目标细胞群被圈出。(c)cd123b-cd33b-ccart细胞对wt-jurkat细胞、jurkatxp33细胞和jurkatxp123细胞在2:1e:t比率下的消除百分比分析总结。
图17:cd123b-cd33b-ccart细胞在两个异种移植小鼠体内模型中对molm13和u937细胞系显示出强的抗白血病作用
(a)在第3天、第6天、第9天和第13天对表达荧光素酶的molm13细胞进行ivis成像，以显示肿瘤负荷(每组8个)。cd123b-cd33bccart细胞和对照t细胞治疗小鼠肿瘤负荷随时间变化的图示比较。从第6天开始，肿瘤减少具有统计学意义。kaplan-meier生存分析曲线代表生存结果(mantel-cox对数秩检验p＝0.0082)。(b)在第3、6、9和13天对表达荧光素酶的u937细胞进行ivis成像，以显示肿瘤负荷(每组8个)。cd123b-cd33bccart细胞和对照t细胞治疗小鼠肿瘤负荷随时间变化的图示比较。从第6天开始，肿瘤减少具有统计学意义。kaplan-meier生存分析曲线代表生存结果(mantel-cox对数秩检验p＝0.0082)。(c)molm13和u937小鼠肿瘤模型的外周血。流式细胞术可以显示cd45 cd3 t细胞和cd45 cd33 肿瘤细胞。
图18：campath治疗使注入的cd123b-cd33bccart细胞耗竭
(a)评价cd19b-cd123-ccart细胞输注ngs小鼠后给予campath的效果的实验方案。将10x106cd19b-cd123-ccart细胞静脉注射入亚致死剂量照射的小鼠(n＝6)中，24小时后腹腔注射campath(0.1mg/kg)或pbs(n＝3/h，对照组n＝2)。6小时和24小时后，采集外周血，测定cart细胞的持久性。(b)使用和不使用campath治疗，6小时后外周血cd19b-cd123-ccart细胞持续性表现。流式细胞术检测cd19b-cd123细胞的存在。(c)使用和不使用campath治疗，24小时后外周血cd19b-cd123-ccart细胞持续性表现。流式细胞术检测cd19b-cd123-ccar细胞的存在。
图19:cd19b-cd123ccar的结构组织
ccar-t结构示意图(cd19b-cd123ccar)。该结构包括一个sffv启动子，该启动子驱动由p2a肽连接的cars的多个模块单元的表达。在连接体裂解后，ccars分离，分别以cd19和cd123抗原为靶点，与表达cd19bcar和cd123-car的靶点接合。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于cd19bcar段上的4-1bb和cd123car上的cd28区域。一个铰链结构域(h)、一个跨膜结构域(tm)、一个共刺激结构域(cd28或4-1bb)和细胞内信号结构域cd3zeta(cd3)。
图20:cd19b-cd123-ccar的转导效率
活化的t细胞用表达cd19b-cd123-ccar的解冻的慢病毒在重组人纤维蛋白涂层板上进行转导。转导后，洗细胞并扩增；进行流式分析(f(ab')2标记)以确认car效率。
图21:cd19b-cd123ccart细胞显示了对cd19 和cd123 白血病/淋巴瘤细胞系的特异性和有效溶解
(a)流式细胞术分析对照t细胞和cd19b-cd123-ccart细胞对人工诱导的cd19 k562细胞和对照k562细胞16和48小时在5:1的e:t比值的影响。目标细胞群用红色表示。未转导的cd19-细胞被描绘成深黄色。(b)流式细胞术分析对照t细胞和cd19b-cd123-ccart细胞对人工诱导的cd19 k562细胞和对照k562细胞在5：1e:t比的作用。目标细胞群用红色表示。未转导的cd123-jurkat细胞被描绘成紫色。(c)流式细胞术分析e:t比5:1，16和48h的kg1a肿瘤细胞(cd123 cd19-)和sp53细胞(cd123-cd19 )。(d)肿瘤细胞溶解率汇总图。
图22:cd19b-cd123ccart细胞显示对原发性患者细胞定向溶解
(a)pt1和pt2肿瘤细胞表型的流式细胞术分析。(b)流式细胞术分析在e:t比为5:1，24小时时对照t细胞和cd19b-cd123-ccart细胞对pt1肿瘤靶细胞的作用。目标细胞群用红色表示。(c)流式细胞术分析24和48小时，在5:1e:t比时对照t细胞和cd19b-cd123-ccart细胞对pt2肿瘤靶细胞的影响。目标细胞群用红色表示。(d)cd19b-cd123ccart细胞在24小时和48小时以5:1的e:t比率对患者样本消除的百分比分析总结。
图23:cd19b-cd123ccart细胞在两个体内异种移植小鼠模型中对molm13和reh细胞系显示出深刻的抗白血病作用
(a)在第3天、第6天、第8天和第11天对表达荧光素酶的molm13细胞进行ivis成像，以显示肿瘤负荷(代表每组小鼠)。(b)肿瘤负荷的图示cd19b-cd123ccart细胞和对照t细胞治疗小鼠的肿瘤负荷随时间变化的比较，测量肿瘤负荷背侧和腹侧。从第6天开始，肿瘤减少具有统计学意义。(c)kaplan-meier生存分析曲线代表生存结果(mantel-cox对数秩检验p＝0.0031)。(d)在第16天对表达荧光素酶的reh细胞进行ivis成像，以显示肿瘤负荷(每组n＝5)。(e)cd19b-cd123-ccart细胞和对照t细胞治疗小鼠肿瘤负荷随时间变化的图示比较。肿瘤缩小有统计学意义。测量背侧和腹侧肿瘤负荷。(f)kaplan-meier生存分析曲线代表生存结果(mantel-cox对数秩检验p＝0.0016)。
图24.由p2a连接的示意图，显示单个结构中的car，4-1bb和il-21(car共表达il-21)及其在t或nk细胞中的表达
该结构由一个sffv启动子驱动共刺激域为4-1bb的car的表达。在连接体裂解时，car和il-21分裂并与表达抗原的靶点结合。car-t细胞不仅通过4-1bb或cd28接受共刺激，还通过4-1bb配体(4-1bbl或cd137l)或il-21接受共刺激，cd3-zeta信号结构域完成了car-t的组装，il-21信号肽被il-2信号肽替代，以更好地分泌il-21。h、cd8a铰链区，tm，cd8a跨膜区。带有il-21的car可以是cd19-il-21car、bcma-il-21car、cd4-il-21car和cd45-il-21car。
图25.该结构(car共表达il-21锚)及其在t细胞或nk细胞中的表达的示意图阐明
一个带有il-21锚的car与p2a自裂序列相连。il-21锚融合由与il-21融合的il-2信号肽组成，与cd8铰链区和cd8跨膜区相连。car和il-21融合的结合被组装在一个表达载体上，它们的表达由sffv启动子驱动。用il-2信号肽代替il-21信号肽，可以更好地分泌il-21并锚定在细胞表面。带有il-21锚的car可以是cd19-il-21锚car、bcma-il-21锚car、cd4-il-21锚car和cd45-il-21锚car。
图26.由p2a连接的示意图，显示单个结构中的car、4-1bb和il-18(car共表达il-18)及其在t或nk细胞中的表达。
该结构由一个sffv启动子驱动共刺激域为4-1bb的car的表达。在连接体裂解时，car和il-18分裂并与表达抗原的目标结合。car-t细胞不仅通过4-1bb或cd28接受共刺激，而且还通过4-1bb配体(4-1bbl或cd137l)或il-21接受共刺激，cd3-zeta信号结构域完成了car-t的组装，il-21信号肽被il-2信号肽取代，以更好地分泌il-18。h、cd8a铰链区，tm，cd8a跨膜区。cd3-zeta信号域完成了该car-t的组装，例如il-18的car可以是cd19-il-18car、bcma-il-18car、cd4-il-18car和cd45-il-18car。
图27.该结构(car共表达il-18锚)及其在t细胞或nk细胞中的表达的示意图阐明
带有il-18锚的car与p2a自裂序列相连。il-18锚融合由il-2信号肽与il-18融合并与cd8铰链区和cd8跨膜区连接而成。car与il-18锚融合的结合被组装在无cd3zeta链的表达载体上，其表达由sffv启动子驱动。用il-2信号肽代替il-18信号肽，可以更好地分泌il-18，然后锚定在细胞表面。带il-18锚的car可为cd19-il-18锚car、bcma-il-18锚car、cd4-il-18锚car和cd45-il-18锚car。
图28a.不同版本抗bcma-car或ccar-t细胞的表达。用抗cd3抗体激活白细胞3天。
用对照载体(左上角)或各种cd269car慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图28b.不同版本的bcma-cs1ccart细胞的表达。
用抗cd3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左上角)或各种cd269ccar慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图29a:cd269-a7d-cd19bcart细胞在共培养分析中特异性地裂解合成表达cd19表面抗原(k-19)的k562肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cd19和cd3。每项检测包括k-19靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cd269-a7d-cd19bcart细胞(右板)。k-19细胞被圈出。
图29b.在共培养分析中，cd269-a7d-cd19bcart细胞特异性地裂解合成表达bcma表面抗原(k-bcma)的k562肿瘤细胞系。
以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cd269和cd3。每项检测包括k-bcma靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cd269-a7d-cd19bcart细胞(右板)。k-bcma细胞被圈出。
图30a.不同版本的bcma-cs1ccart细胞的表达。
用抗cd3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左上角)或各种cd269(bcma)ccar慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图30b.不同版本的bcma-cs1ccart细胞或增强型bcmacart细胞的表达。
用抗cd3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左上角)或各种cd269(bcma)car慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图30c.在共培养分析中，cd269-a7d-cd19bcart细胞特异性地裂解合成表达bcma表面抗原(k-bcma)的k562肿瘤细胞系。
以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cd269和cd3。每项检测包括k-bcma靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cd269-a7d-cd19bcart细胞(右板)。k-bcma细胞被圈出。
图30d.在共培养分析中，cd269-a7d-cd19bcart细胞特异性地裂解合成表达cd19表面抗原(k-19)的k562肿瘤细胞系。
以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cd19和cd3。每项检测包括k-19靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cd269-a7d-cd19bcart细胞(右板)。k-19细胞被圈出。结果汇总在左下角的图表中。(n＝2)。
图30e.cd269-a-7d-cd19bccart细胞对k562-bcma(k-bcma)和k562-cd19(k-19)细胞的裂解的分析总结。
图30f.cd269-a7dccart细胞在共培养分析中特异性裂解mm1s肿瘤细胞系。
以5:1的效应靶比进行共培养实验18小时后，用流式细胞仪直接检测cd269(bcma)和cmtmr(celltracker)。每个分析都包括mm1靶细胞(左)、对照t细胞(上中板)、cd269-a7d-41bbl(下中)、cd269-a7d-c11d(右上)和cd269-a7d-cs1-hu63ccart细胞(右下)。mm1s单元格用蓝点表示。(n＝2)。
图30g.不同版本的cd269-cs1ccar或增强型cd269cart细胞在共培养分析中特异性地裂解k562-bcma肿瘤细胞系。
共培养18小时，效应靶比为5:1，流式细胞仪直接检测cd269和cd3。每个检测包括mm1s靶细胞(左)、对照t细胞(上中板)、cd269-a7d-41bbl(下中)、cd269-a7d-c11d(靶向bcma抗原两个不同表位的ccar)(右上)和cd269-a7d-cs1-hu63cart细胞(右下)。k-bcma细胞用绿点表示。(n＝2)。
图30h.cd269-a7d-cs1-hu63cart细胞在共培养分析中特异性地裂解k562-cs1肿瘤细胞系，而cd269-a7d-c11dccar(一种针对bcma抗原不同表位的ccar，不含cs1car)则没有。共培养18小时，效应靶比为5:1，流式细胞仪直接检测cd269和cd3。每个分析都包括mm1s靶细胞(左)、对照t细胞(中面板)、cd269-a7d-c11d(右上角)和cd269-a7d-cs1-hu63cart细胞(右下角)。k-cs1细胞由深绿色点表示。(n＝2)。
图30i.cd269-a7d-41bbl、cd269-a7d-c11d和cd269-cs1-hu63cart细胞对mm1s骨髓瘤细胞的裂解分析总结。
图30j.cd269-a7d-41bbl、cd269-a7d-c11d和cd269-cs1-hu63cart细胞对k-bcma(表达bcma的k562)细胞的裂解分析总结。
图30k.cd269-a7d-c11d和cd269-cs1-hu63细胞对k-cs1(表达cs1的k562)细胞的裂解分析总结。
图31.cll1-cd33bcart细胞的表达。用抗cd3抗体激白细胞3天。
用对照载体(左)或cll1-cd33bcar(右)慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图32a.在共培养分析中，cll1-cd33bcart细胞不能裂解reh肿瘤细胞系。
用cfse染料预标记靶细胞，以区别于t细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验,18小时后用流式细胞仪直接检测cfse和cd3。每项检测包括reh靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cll1-cd33bcart细胞(右板)。reh细胞被表示为紫色点。注：reh细胞不表达cll1(cll-1)或cd33。
图32b.共培养分析中，cll1-cd33bcart细胞不裂解ccrf-cem肿瘤细胞系。
用cfse染料预标记靶细胞，以区别于t细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cfse和cd3。每个分析都由ccrf-cem靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cll1-cd33bcart细胞(右板)组成。ccrf-cem细胞用橙色圆点表示。注：ccrf-cem细胞不表达cll1或cd33抗原。
图32c.cll1-cd33bcart细胞特异性地裂解jurkat肿瘤细胞系，该细胞系在共培养分析中合成表达cll-1表面抗原。
用cfse染料预标记靶细胞，以区别于t细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cfse和cd3。每个分析包括jurkat-cll1(j-cll)靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cll1-cd33bcart细胞(右板)。jurkatcll细胞表示为蓝点。
图32d.cll1-cd33bcart细胞在共培养分析中特异性地裂解合成表达cd33表面抗原的jurkat肿瘤细胞系。
用cfse染料预标记靶细胞，以区别于t细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cfse和cd3。每个分析包括jurkat-cd33(j-33xp)靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cll1-cd33bcart细胞(右板)。jurkat-cd33(j-33xp)细胞被表示为浅蓝色点。
图32e.cll1-cd33bccart细胞在共培养试验中有效裂解hl60肿瘤细胞系。
用cfse染料预标记靶细胞，以区别于t细胞。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养18小时，并用流式细胞仪直接分析cfse和cd3。每个分析包括hl60靶细胞(左)、对照t细胞(中板)和cll1-cd33bcart细胞(右板)。hl60细胞用绿点表示。
图32f.cll1-cd33ccar(cll-1-cd33ccar)裂解表达cll-1或cd33的不同aml细胞系和jurkat细胞的共培养分析结果的总结。
图32g.cll1-cd33b复合cart细胞消融hl60靶肿瘤细胞
以2:1和5:1的e:t比进行共培养过夜。用cfse染料预标记cll-1和cd33双阳性的hl60细胞。第二天用cd3、cll-1和cd33抗体进行流式细胞分析采集(facs)。
图32h.cll1-cd33b复合cart细胞消融u937靶肿瘤细胞
以2:1和5:1的e:t比进行共培养过夜。靶细胞u937对cll-1和cd33均呈高度阳性，并用cfse染料预标记。第二天用cd3、cll-1和cd33抗体进行流式细胞仪采集(facs)。
图32i.cll1-cd33b复合cart细胞最低程度地靶向阴性对照ccrf-cem细胞
以2:1和5:1的e:t比进行共培养过夜。ccrf-cem细胞对cll-1和cd33主要呈阴性，并用cfse染料预标记。第二天用cd3、cll-1和cd33抗体进行流式细胞仪采集(facs)。
图32j:cll1-cd33b复合cart细胞对靶细胞系的体外总结
所有共培养均培养过夜，并用cfse染料对靶细胞进行预标记。第二天使用cd3、cll-1和cd33抗体对所有样本进行流式细胞仪采集(facs)。用hl60靶细胞进行剂量依赖性共培养，采用递增的e:t比方案，在相同的共培养条件下培养。
图32k.混合细胞共培养中cll1-cd33b复合car相对于单个cart细胞的抗原消耗。
将表达cd33或cll-1的cdna稳定转染野生型jurkat细胞，获得表达cd33和cll-1的jurkat细胞。然后对jurkat细胞进行分类表达，建立表达cd33或cll-1的均一稳定细胞系。对于混合细胞共培养，表达cd33(jurkat-cd33)的jurkat细胞和表达cll-1(jurkat-cll1)的jurkat细胞以大约1:1的比例混合在一起，共有200000个细胞。然后以1:2的比例(效应器：靶)添加效应细胞，在隔夜培养中总共添加100000个t细胞。第二天使用cd3、cll-1和cd33抗体对所有样本进行流式细胞仪采集(facs)。图示各种car治疗下抗原耗竭的直方图，条形图(左)描绘t细胞群和抗原表达的jurkat细胞(右)
图32l.混合细胞共培养中cll1-cd33b复合car相对于单个cart细胞的抗原消耗总结。
总结上一个图的直方图数据的图。总的来说，cll1-cd33b复合car-t细胞对表达cd33和cll-1的jurkat细胞都表现出有效和靶向的细胞毒性，对两种细胞的消融率均大于85％。此外，cll1-cd33b复合car-t细胞相对于单个抗cd33bcar-t细胞或单个抗cll-1car-t细胞对其自身抗原群具有更好的细胞毒性。复合型car比cd33-car-t和cll-1-car-t细胞靶向性分别提高60％和40％。
图33a.由p2a连接的示意图，显示单个结构中的cd19car和il-21(cd19car共表达il-21)及其在t或nk细胞中的表达。
图33b.cd19b-il-21cart细胞和cd19-il-21锚的表达。用抗cd3抗体激活白细胞3天。
用对照载体(左)、cd19b-il-21或cd19b-il21-anchor-car(右)慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图34.阐明该结构(cd19-car共表达il-21锚)及其在t细胞或nk细胞中的表达的示意图。
带有il-21锚的cd19-car与p2a自裂序列相连。il-21锚融合由与il-21融合的il-2信号肽组成，与cd8铰链区和cd8跨膜区相连。cd19car与il-21融合后的蛋白在表达载体上组装，由sffv启动子驱动表达。用il-2信号肽代替il-21信号肽，可以更好地分泌il-21并锚定在细胞表面。
图35.一个p2a连接示意图显示bcma-car和il-18在单个结构中(bcma-car共表达il-18)及其在t或nk细胞中表达。
该结构由一个sffv启动子驱动共刺激域为4-1bb的car的表达。在连接体裂解时，bcma-car和il-18分裂并与表达抗原的靶点结合。car-t细胞不仅通过4-1bb或cd28接受共刺激，还通过4-1bb配体(4-1bbl或cd137l)或il-18接受共刺激，cd3-zeta信号域完成了car-t的组装，il-21信号肽被il-2信号肽替代，以更好地分泌il-21。h、cd8a铰链区，tm，cd8a跨膜区。
图36.bcma(car共表达il-18锚)的结构及其在t细胞或nk细胞中的表达阐明。
带有il-18锚的car与p2a自裂序列相连。il-18锚融合由与il-18融合的il-2信号肽组成，与cd8铰链区和cd8跨膜区相连。bcma-car与il-18锚融合的结合被组装在一个表达载体上，其表达由sffv启动子驱动。用il-2信号肽代替il-18信号肽，可以更好地分泌il-18并锚定在细胞表面。
图37.ccar结构的示意图(bcma-cd38ccar)。
该结构包括一个sffv启动子，它驱动由p2a裂解肽连接的cars的多个模块单元的表达。p2a连接子裂解后，ccars分裂并与表达bcma和/或cd38的目标结合。car的每个单元都有一个针对抗原的scfv、一个铰链结构域(h)、一个跨膜结构域(tm)，一个共刺激结构域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号结构域cd3zeta链。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于bcmacar段上的4-1bb和cd38car上的cd28区域。
图38.ccar结构的示意图(bcma1-bcma2ccar)。
该结构包括一个sffv启动子，其驱动由p2a裂解肽连接的cars的多个模块单元的表达。p2a连接子裂解后，ccars裂解并接合到表达bcma1(bcma1表位之一)和/或bmca2(另一bcma抗原表位)的靶点上。每个car单元带有一个针对该抗原的scfv，一个铰链结构域(h)、一个跨膜结构域(tm)、一个共刺激结构域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号结构域cd3zeta链。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于bcma1car上的4-1bb和bcma2car的cd28区域。每个bcma-car都以其抗原表位为靶点。复合carbcma1-bcma2能够识别两个不同的bcma表位。
图39a.带有il-15/il15sushi增强子结构的ccar-t示意图。该结构包括驱动cars多模块单元表达的sffv启动子和分别由p2a和t2a肽连接的il-15/il-15sushi。在连接体裂解后，ccars分裂靶向表达cll-1和/或cd33的靶点和il-15/il-15的分泌增强子。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于cll-1car上的4-1bb或cd28和cd33bcar上的cd28或4-1bb区域。所述结构自裂解的肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构的分泌促进剂还可包括但不限于il-15/il-15sushi、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图39b.cll1-cd33b-il15/il-15sushicart细胞的表达。用抗人cd3抗体激活人外周血白细胞3天。用两种对照载体(左)、cll1-cd33b-il15/il15sushi-car(右)慢病毒上清液转导细胞。培养4天后，取细胞，用山羊抗人f(ab')2和小鼠抗人cd3抗体标记流式细胞。cart细胞被表示为绿点(带圆圈)。
图39c.在共培养分析体系中,cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞特异性裂解表达cll-1或cd33表面抗原的reh肿瘤细胞系。每项试验包括reh-cllxp(左图)或reh-cd33xp靶细胞(右图)与对照t细胞或cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞以2:1和5:1效应靶细胞比率共同培养。共培养24小时，用流式细胞仪直接分析抗人cd3和cll-1或cd33。
图40a.cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞在体内对molm13肿瘤细胞株表现出强烈的抗肿瘤作用。亚致死剂量照射nsg小鼠，静脉注射1.0x106荧光素酶表达molm13细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后5天开始，小鼠静脉注射15×106cll1-cd33b-il15/il15sushicart或载体对照t细胞。第4天(t细胞注射前)、第8天和第12天，小鼠皮下注射d-荧光素，并进行ivis显像。背视图。
图40b.cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞在体内对molm13肿瘤细胞株表现出强烈的抗肿瘤作用。亚致死剂量照射nsg小鼠，静脉注射1.0x106荧光素酶表达molm13细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后5天开始，小鼠静脉注射15×106cll1-cd33b-il15/il15sushicart或载体对照t细胞。第4天(t细胞注射前)、第8天和第12天，小鼠皮下注射d-荧光素，并进行ivis显像。腹侧视图。
图40c.(a)处死时从图40a中取出小鼠外周血，用小鼠抗人cd45、cd3和cd33标记，并进行流式细胞术。移植的人细胞被cd45门控，分析t细胞(绿点)和molm13细胞(蓝点)的数量。两个对照组小鼠的结果在左侧，两个用cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞处理的小鼠在右侧。(b)用elisa法测定小鼠外周血中人il-15融合的分泌量。小鼠对照，#1-2。孔可重复的。
图40d.cll1-cd33b-il15/il15sushink细胞表达功能性il-15/il-15融合。用含cll1-cd33b-il15/il15sushi-car的慢病毒载体转导nk-92细胞。(a)在bd-facs-aria上对细胞进行分类，选择f(ab')2表型阳性的nk细胞。(b)将cll1-cd33b-il15/il15sushi-car-nk细胞和野生型nk-92细胞以0.5x10e6细胞/ml的总体积在24孔培养板中培养。将细胞添加到重复的孔中；每对孔中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一个孔没有。48小时后(第2天)，计数细胞(b)，体积增大，产生约0.5x10e6细胞/ml的浓度。该过程在第4、6和8天重复。
图40e.将分类的cll1-cd33b-il15/il15sushink细胞和野生型对照nk-92细胞分别培养在不同的孔中72小时。收集上清液，在96个涂有il-15抗体的孔板上进行elisa检测。按照制造商(boster)的指示，将读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线(a)进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(b)。
图41a.cd20ccd19bcart细胞的表达。用抗cd3抗体激活白细胞3天。用对照载体(左)、cd20ccd19b或cd20hcd19bcar(右)慢病毒上清液转导细胞。培养3天后，收集细胞并用流式细胞仪标记。
图41b.在共培养分析中，cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞不能裂解k562肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验6小时，并用流式细胞仪直接分析cd3和cd45。每项检测包括k652靶细胞(右)、对照t细胞(左)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中间板)。靶细胞表示为蓝点。(n＝2)
图41c.在共培养试验中，ccart细胞裂解合成的表达cd19的k562肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验24小时，并用流式细胞仪直接分析cd19和cd3。每个分析包括单独的k562-cd19xp靶细胞(k562表达cd19，k-19)(右侧)、对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中间面板)。靶细胞用绿点表示。
图41d.在共培养分析中，ccart细胞裂解合成的表达cd20k562肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验24小时，并用流式细胞仪直接分析cd20和cd3。每项检测包括单独的k562-cd20xp靶细胞(右侧)、对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中间面板)。靶细胞表示为紫色点。
图41e.在共培养分析中，ccart细胞在共培养中完全裂解表达cd19的reh肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验，24小时后用流式细胞仪直接检测cd19和cd3。每项检测包括reh靶细胞(右侧)、对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中间面板)。靶细胞表示为橙色点。
图41f.ccart细胞在共培养试验中完全溶解表达cd19和cd20抗原的sp53肿瘤细胞系。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养实验24小时，并用流式细胞仪直接分析cd19和cd3。每项检测包括sp53靶细胞(右侧)、对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中间面板)。靶细胞表现为绿松石点。(n＝2)
图41g.共培养结果总结。
图42a.cd20hcd19bcart细胞在体内对表达cd19抗原的reh肿瘤细胞株具有抗肿瘤作用。nsg小鼠接受亚致死剂量照射，静脉注射1.0x106荧光素酶表达的reh细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后6天开始，小鼠静脉注射10×106cd20hcd19bcart细胞或载体对照t细胞。第5、9、12天，小鼠皮下注射d-荧光素，进行ivis显像。腹侧视图。
图42b.cd20hcd19bcart细胞在体内对表达cd19抗原的reh肿瘤细胞株具有抗肿瘤作用。nsg小鼠接受亚致死剂量照射，静脉注射1.0x106荧光素酶表达的reh细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后6天开始，小鼠静脉注射10×106cd20hcd19bcart细胞或载体对照t细胞。第5、9、12天，小鼠皮下注射d-荧光素，进行ivis显像。腹侧视图。
图43a.ccar-t与il-15/il15sushi增强子结构的示意图。该结构包括驱动cars多模块单元表达的sffv启动子和分别由p2a和t2a肽连接的il-15/il-15sushi。在连接体裂解时，ccars，cd20h-cd19b分裂靶向表达cd20和/或cd19和il-15/il-15sushi融合的分泌增强子。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于cd20hcar上的4-1bb或cd28和cd19bcar上的cd28或4-1bb区域。所述的自裂解肽的肽结构物可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂也可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi可增强car-t或nk-t或nk细胞的增殖和持久性。融合的可溶性il-15/il-15sushi，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的免疫调节作用。稳定可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图43b.cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞的表达。用抗人cd3抗体激活人外周血白细胞3天。用对照载体(左)或cd20h-cd19b-il15/il15sushi-car(右)慢病毒上清液转导细胞。培养4天后，取细胞，用山羊抗人f(ab')2和小鼠抗人cd3抗体标记流式细胞。cart细胞被表示为绿点(带圆圈)。
图43c.cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞在共培养分析中特异性地裂解合成的表达cd20表面抗原(a)的u937肿瘤细胞系和表达表面抗原cd19的reh肿瘤细胞(b)。以2:1或5:1的效应靶比进行共培养48小时，并分别用流式细胞仪直接分析抗人cd20和cd19。
图44a.cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞在体内对reh肿瘤细胞株具有较强的抗肿瘤作用。nsg小鼠接受亚致死剂量照射，静脉注射1.0x106荧光素酶表达的reh细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后5天开始，小鼠静脉注射15×106的cd20h-cd19b-il15/il15sushicar-t或载体对照t细胞。第4天(t细胞注射前)8天(t细胞注射后72小时)、第12天和第16天，小鼠皮下注射d-荧光素，并进行ivis显像。背视图。
图44b.cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞在体内对reh肿瘤细胞株具有较强的抗肿瘤作用。nsg小鼠接受亚致死剂量照射，静脉注射1.0x106荧光素酶表达的reh细胞(第0天)，诱导可测量的肿瘤形成。从注射肿瘤细胞后5天开始，小鼠静脉注射15×106的cd20h-cd19b-il15/il15sushicar-t或载体对照t细胞。第4天(t细胞注射前)8天(t细胞注射后72小时)、第12天和第16天，小鼠皮下注射d-荧光素，并进行ivis显像。腹侧视图。
图44c.(a)在处死时从图3中取出小鼠外周血，用小鼠抗人cd45、cd3和cd19标记，并进行流式细胞术。移植的人细胞通过cd45门控，分析t细胞(绿点)和reh细胞(蓝点)的数量。两个对照组小鼠的结果在左侧，两个用cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞处理的小鼠在右侧。(b)用elisa法测定小鼠外周血il-15的分泌量。对照小鼠，#1-2。
图44d.cd20h-cd19b-il15/il15sushink细胞表达功能性il15。用cd20h-cd19b-il15/il15sushi-il15/il15sushi-car慢病毒载体转导nk-92细胞。(a)在bd-facs-aria上对细胞进行分类，选择f(ab')2表型阳性的nk细胞。(b)cd20h-cd19b-il15/il15sushi-il15/il15sushi-car-nk细胞和野生型nk-92细胞在24孔培养板中以0.5x10e6细胞/ml的总体积培养。将细胞添加到重复的孔中；每对孔中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一个孔没有。48小时后(第2天)，计数细胞(b)，体积增大，产生约0.5x10e6细胞/ml的浓度。该过程在第4、6和8天重复。
图44e.将分类的cd20h-cd19b-il15/il15sushink细胞和野生型对照nk-92细胞分别培养在不同的培养孔中72小时。收集上清液，在包被il-15抗体的96孔板上进行elisa检测。按照制造商(boster)的指示，将读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线(a)进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(b)。
图45a.用流式细胞仪测定对照t细胞的表达。上面是cd19b-il-15/il-15sushicar的组织。cd19b-il-15/il-15sushi-cart细胞是患者或供体t细胞经表达cd19b-il-15/il-15sushi-car慢病毒的病毒转导而产生的，经转导的t细胞能够分泌il-15/il-15sushi融合。facs分析显示cd19b-il-15/il-15sushi-car能在35％的t细胞上表达，而且分泌的il-15/il-15sushi融合对car-t细胞或nk细胞有额外的刺激、增殖和增强作用。
图45b.cd19b-il15/il15sushicart细胞能有效裂解cd19 sp53细胞。
图45c.cd19b-il15/il-15sushicart细胞能有效地裂解cd19 sp53细胞(与cd19b单个cart细胞相比)。
图46a.基于cd19的cars在体内耗尽reh细胞，il-15/il-15sushi结合物增强抗肿瘤反应。小鼠于第1天注射表达荧光素酶的reh肿瘤细胞(0.5x106细胞/小鼠)。第3天进行ivis检测reh细胞的情况。第4天注射对照t细胞、cd19b-car和cd19b-il15/il-15sushi-cart细胞(～7.5x106总细胞/小鼠)，第6至22天进行ivis显像，以半定量评估肿瘤负荷和随后的肿瘤耗竭，和t细胞对细胞生长的控制。在这里，两种cart治疗显示出相似的疗效，与标准cart19细胞相比，分泌il-15的car显示出对reh肿瘤生长的可比或更好的控制。
图46b.长期对比cd19b-car-t与cd19b-il-15/il15sushicar-t抗reh细胞。(上图)与上述ivis方法学相似的实验方案，但是在观察到肿瘤复发迹象之前，对小鼠进行跟踪。在这里，在第30天之后，我们观察到在标准cart19治疗的小鼠中开始出现侵袭性reh肿瘤复发。多数cart19小鼠可见肿瘤簇(由ivis成像小鼠上的红色区域指示)，单个cd19b-il-15/il-15sushicart治疗小鼠到第22天也显示肿瘤生长。然而，30天后，所有cart19小鼠均出现严重肿瘤复发的迹象，而cd19b-il-15/il-15sushi-cart治疗的小鼠则没有肿瘤的迹象。即使在第22天复发的小鼠在第32天也被解除肿瘤，这意味着cd19b-il-15/il-15sushi-cart细胞仍处于有效循环中。
图46c.总结每个治疗队列中估计肿瘤随时间增长的ivis趋势值的线图。在过去的第30天，标准cd19b-car(cart19)治疗小鼠的肿瘤负担急剧上升，导致肿瘤负担与cd19b-il-15/il-15sushi-cart治疗组相比显著增加，而cd19b-il-15/il-15sushi-cart治疗组基本上没有肿瘤。显示小鼠两个视图(背侧图像采集视图)的值。
图46d.小鼠血液数据的总结,总结了小鼠体内t细胞的持续性。图3a-1中模型小鼠血液中t细胞的总持久性在存活终点进行分析，并使用cd3抗体对大量的t细胞群进行流式细胞术筛选。为了进一步剖析cd19b-il-15/il-15sushicar的持久性结果，必须采集小鼠血液，以揭示植入的人类细胞的耐久性。总的来说，我们通过流式细胞术分析发现，与标准cart19组相比，分泌il-15/il-15sushi的car队列中的t细胞平均计数更高。由于体内循环肿瘤的最小刺激，对照组t细胞保持在预期的基线水平。
图46e.小鼠血液数据(个体)。图3a-1中的代表性小鼠在处死时，通过流式细胞术进行检测，以筛选剩余的肿瘤和t细胞群，分别通过cd19 和cd3 表达显示。这些流式细胞术图进一步分析了每只小鼠在其处死时的情况，揭示了对照组和大多数cart19小鼠的特征是显著的肿瘤数量和减少的t细胞数。cd19b-il-15/il-15sushicar队列小鼠具有显著的t细胞计数和少量或无肿瘤细胞的特征。
图47a.cd269-a7d-cd38汽车t细胞的表达。用抗cd3抗体激活浅黄色毛细胞3天。用控制载体(左)、cd269-a7d-cd38a、cd269-a7d-cd38b或cd269-a7d-cd38ccar(右)慢病毒上清液导入细胞。培养3天后，收集细胞并标记流式细胞仪。
图47b.在共培养分析中，cd269-a7d-cd38cart细胞特异性地裂解表达cd38表面抗原的reh肿瘤细胞系。以2:1(顶排)或5:1(底排)的效应靶比进行24小时共培养实验，并用流式细胞仪直接分析cd38和cd3。每个分析都包括与对照t细胞(左面板)、cd269-a7d-cd38a(左中面板)或cd269-a7d-cd38acart细胞(右中面板)一起孵育的reh靶细胞，或单独孵育的细胞(最右侧)。reh单元格表示为蓝点。
图47c.cd269-a7d-cd38cart细胞在共培养实验中特异性裂解合成的表达cd269(bcma)表面抗原的k562肿瘤细胞系。以2:1(顶排)或5:1(底排)的效应靶比进行共培养实验24小时，并用流式细胞仪直接分析cd269和cd3。每项分析都包括与对照t细胞(左面板)、cd269-a7d-cd38b(左中面板)或cd269-a7d-cd38acart细胞(右中面板)或单独细胞(最右侧)孵育的k562-bcma靶细胞。k-bcma细胞表现为绿点。
图48a.带有il-15/il15sushi增强子结构的ccar-t示意图。该结构包括驱动cars多模块单元表达的sffv启动子和分别由p2a和t2a肽连接的il-15/il-15sushi。在连接体裂解后，ccars分裂并靶向表达bcma和/或cd38和il-15/il-15sushi的分泌促进子融合。作为一种新的ccar结构，该结构的激活域可以包括但不限于bcmacar段上的4-1bb或cd28以及cd38car段上的cd28或4-1bb区域。所述自裂解肽结构物的肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂也可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi可增强car-t或nk-t或nk细胞的增殖和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞或nk-t细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图48b.cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞的表达。用抗人cd3抗体激活人外周血白细胞3天。用任一对照载体(左)、cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi-car(右)慢病毒上清液转导细胞。培养4天后，取细胞，用山羊抗人f(ab')2和小鼠抗人cd3抗体标记流式细胞。cart细胞被表示为绿点(带圆圈)。
图48c.cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞裂解cd38 t细胞。用抗人cd3抗体激活人外周血白细胞3天。用任一对照载体(左)、cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi-car(右)慢病毒上清液转导细胞。培养6天后(两张左图)和12天后(两张右图)，收集细胞并用小鼠抗人cd3和cd38抗体标记流式细胞。cd38 t细胞用蓝点(圆圈)表示。
图48d.cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞在共培养分析中特异性地裂解合成的表达bcma(cd269)表面抗原的k562肿瘤细胞系和自然表达cd38抗原的野生型reh细胞。每项检测包括k562bcmaxp(左图)或reh靶细胞(右图)与对照t细胞或cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞以2:1和5:1的效应靶细胞比率共同培养。共培养24和48小时，用流式细胞仪直接分析抗人cd3和cd269或cd38。
图48e.cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushink细胞表达功能性il15。用含有cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi-car的慢病毒载体转导nk-92细胞。(a)在bd-facs-aria上对细胞进行分类，选择f(ab')2表型阳性的nk细胞。nk-car细胞用蓝点(圆圈)表示。(b)cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi-car-nk细胞和野生型nk-92细胞在24孔培养板中以0.5x10e6细胞/ml的总体积培养。将细胞添加到重复的孔中；每对孔中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一个孔没有。48小时后(第2天)，计数细胞(b)，体积增大，产生约0.5x10e6细胞/ml的浓度。该过程在第4、6和8天重复。
图48f.将分类后的cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushink细胞和野生型对照nk-92细胞分别在不同的培养井中培养72小时。收集上清液，在包被有il-15抗体的96孔板上进行elisa检测。按照制造商(boster)的指示，将读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线(a)进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(b)。
图49a.cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sushicart细胞的表达。用抗人cd3抗体激活人外周血白细胞3天。用对照载体(左)、cd123b-cd33b-il15/il15sushi(中)或cd123b-cll1-il15/il15sushicar(右)慢病毒上清液转导细胞。培养4天后，取细胞，用山羊抗人f(ab')2和小鼠抗人cd3抗体标记流式细胞。cart细胞被表示为绿点(带圆圈)。
图49b.cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sushink细胞表达功能性il15。用cd123b-cd33b-il15/il15sushi或cd123b-cll1-il15/il15sushi载体转导nk-92细胞。(a)在bd-facs-aria上对细胞进行分类，选择f(ab')2表型阳性的nk细胞。nk-car细胞用蓝点(圆圈)表示。(b)cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sushicar-nk细胞和野生型nk-92细胞在24孔培养板中以每毫升0.5×10e6细胞的体积培养。将细胞添加到重复的孔中；每对孔中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一个孔没有。48小时后(第2天)，细胞计数(b)，体积增大，产生约0.5x10e6细胞/ml的浓度。该过程在第4、6和8天重复。
图49c.将分类后的cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sushink细胞和野生型对照nk-92细胞分别在不同的培养孔中培养72小时。收集上清液，在包被有il-15抗体的96孔板上进行elisa检测。按照制造商(boster)的指示，将读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线(a)进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(b)。
图50a.带有il-15/il15sushi增强子结构的抗bcmacar示意图(bcma-il-15/il15sushi，也称为cd269-a7d-il-15/il-15sushi)。所述结构包括驱动抗bcma-car表达的sffv启动子和分别由p2a或t2a肽连接的il-15/il-15sushi。在连接体断裂后，car分裂并靶向表达bcma和il-15/il-15sushi分泌增强剂融合。作为一种新的car结构，该结构的激活域可以包括但不限于反bcmacar段上的cd28或4-1bb。所述结构物的肽自裂解肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂还可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk或nk-t细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统(尤其是nk细胞)来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图50b.辐射转基因k562细胞作为原代nk细胞扩增的饲养细胞的产生和制备步骤。
图50c.通过与经辐照的转基因k562细胞(饲养细胞)共培养从脐血中产生和扩增car转基因自然杀伤细胞(nk)的步骤。
图51a.bcma-il15/il15sushicarnk细胞在体内小鼠模型中表现出抗白血病作用。nsg小鼠接受亚致死剂量照射，第二天静脉注射表达荧光素酶的mm1s多发性骨髓瘤细胞，诱导可测量的肿瘤形成。第4天，小鼠静脉注射10x106对照nk细胞或bcma-il15/il15sushicar表达的nk细胞。第3、6、8、10天，小鼠皮下注射d-荧光素，进行ivis显像。
图51b.对照组和bcma-il15/il15sushicar表达nk细胞的小鼠总通量值(光子/秒)随时间变化的比较。数据以平均值 s.d.*表示，与指定日期的对照nk细胞相比，p<0.05。
图51c.对照组和bcma-il15/il15sushicarnk细胞治疗组间，注射mm1s多发性骨髓瘤细胞的小鼠随时间的存活率比较。通过对数秩(mantel-cox)检验p＝0.0069，生成一个生存曲线来显示小鼠在80天之前的生存时间。
图52a.异种移植物小鼠模型第25(d)天和第60(e)天注射bcma-a7d-il15/il15sushicar转导的nk细胞的持久性评估。在第25天(对照nk或carnk细胞注入小鼠后21天)和第60天(对照nk或carnk细胞注入小鼠后58天)，从单个小鼠采集外周血，用人cd56和人cd45抗体标记细胞，以检测注入的对照和/或carnk细胞的存在。采用流式细胞术检测外周血中nk细胞的存活率。左侧面板显示阴性对照，其中一个nk细胞未融合。中间的面板显示给这组老鼠注射了对照nk细胞。右图显示，这组小鼠输注了bcma-il15/il15sushicar转导的nk细胞。
图52b.第60天异种移植小鼠模型中注射bcma-a7d-il15/il15sushicar转导的nk细胞的持久性评估。
图53.分泌il-15/il-15sushi融合的car的构建及其在t细胞或nk细胞中的表达的阐明。a)将car(第三代或第二代)和il15α受体的il15/sushi结构域组合在表达载体上，由sffv启动子驱动其表达。带有il-15/sushi的car与p2a自裂序列有关。il-15/sushi部分由融合到il-15的il-2信号肽组成，并通过26个氨基酸的多脯氨酸连接物连接到sushi结构域。b)t或nk细胞上有car和il-15/sushi。所述结构物的自裂解肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂还可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图54.显示了一个含有il-15/il-15sushi锚的car的一个示意图。a)该结构包括驱动car表达的sffv启动子和由p2a肽连接的il-15/il-15sushi锚(也称锚)。当p2a肽断裂时，il-15/il-15锚car分裂成一个car和一个il-15/il-15suchi锚。il-15/il-15sushi部分锚由融合到il-15的il-2信号肽组成，并通过26个氨基酸的多脯氨酸连接物与il-15α受体的sushi结构域连接。car和锚包括一个铰链(h)区，一个跨膜区(tm)。car还具有单链抗体、共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号、cd3zeta链，而锚不承担这些成分。b)il-15/il-15sushi锚在t细胞或nk细胞表面。
图55.显示car增强子结构的示意图。该结构包括一个驱动car表达的sffv启动子和一个由p2a肽连接的增强子4-1bbl(cd137l)。当这个p2a肽被切割时，一个含有4-1bbl的car结构体分裂成一个car和全长的4-1bbl蛋白。car包括先导序列和单链抗体、铰链(h)区、跨膜区(tm)。car还具有共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号、cd3zeta链，而4-1bbl不含这些成分。4-1bbl与cd28或4-1bb具有协同激活t细胞或抗肿瘤作用(但不限于)
图56.显示car增强子结构的示意图。该结构包括一个驱动car表达的sffv启动子和一个由p2a肽连接的增强子il-15。当这个p2a肽被切割时，一个含有il-15的car结构分裂成一个car和il-15蛋白的全长。car包括先导序列和单链抗体、铰链(h)区、跨膜区(tm)。car还具有共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号传导cd3zeta链，而il-15不具有这些成分。il-15与cd28或4-1bb具有协同t细胞活化、扩增或抗肿瘤作用。il-15中的il-15信号肽被il-2信号肽(先导序列)取代，这是一种提供高效il-15分泌的强信号肽。
图57.带有多个增强子(carsuper)的car结构的示意图。该结构包括驱动car和增强子表达的sffv启动子，分别由p2a和t2a肽连接的4-1bbl(cd137l)和il-15/il-15sushi。当这个p2a和t2a肽被裂解时，一个含有4-1bbl和il-15/il-15sushi的car结构体分裂成一个car和全长4-1bbl蛋白，并分泌il-15/il-15sushi。car包括先导序列和单链抗体、铰链(h)区、跨膜区(tm)。car还具有共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号传导cd3zeta链。4-1bbl配体与cd28或4-1bb(但不限于)具有协同t或nk细胞活化或抗肿瘤活性。所述结构物自裂解肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂也可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk或nk-t细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk或nk-t细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
图58.表达cd123b-super-1-car的人脐血nk细胞。流式细胞术检测cd123b-super-1car病毒转导脐血细胞后cd56阳性细胞(粉红色圆圈)cd123b-super-1car的表达水平。
图59.bcma-cd38a-il15/il15sushiccar(又称cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi)的产生。bcma-cd38a-il15/il15sushi-ccar在人脐血nk细胞中表达。流式细胞术检测bcma-cd38a-il-15/il-15sushi-ccar病毒转导脐血细胞后，脐血cd56阳性细胞(粉红色圆圈)bcma-cd38a-il-15/il-15sushi-ccar表达水平。
图60a.super1car结构的示意图。通过p2a和t2a链接，生成一个super1car，显示一个car，gd2car配备4-1bbl和il-15/il-15sushi在一个单一的结构。该结构由一个sffv启动子驱动car、4-1bbl和il-15/il-15sushi三个片段的表达。链接器(p2a和t2a)断裂后，car(gd2car)、4-1bbl和il-15/il-15sushi分裂并与靶向靶点。car具有单链抗体、铰链区、跨膜区、共刺激区(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号转导、cd3-zeta链，4-1bbl或il-15/il-sushi或两者均能与cd28或4-1bb协同发挥t或nk细胞活化和持续或抗肿瘤活性。
图60b.gd2-super1-car-t细胞几乎消除了小鼠肝脏中的y79细胞
(a)流式细胞术分析显示y79肿瘤(蓝点)在不同形式的抗gd2-cart细胞治疗的小鼠肝脏中持续存在。经尾静脉注射y79细胞(1x106细胞)3天后，静脉注射cart细胞(10x106细胞)。y79肿瘤注射后第30天处死小鼠，取肝脏匀浆，观察cart疗效。用小鼠抗人cd3和cd56抗体标记匀浆肝细胞，分别检测人t细胞和y79肿瘤细胞。左侧显示了给了的对照t细胞的一个鼠；小鼠使用gd2car(左中)、gd2-4-1bblcar(右中)和gd2-super1car(右)t细胞处理。肿瘤细胞的清除与高标记的t细胞有关。gd2-4-bbl-car是一种共表达4-1bbl配体的gd2-car。
(b)显示每只car处理小鼠对y79细胞的杀伤活性百分比的图表，与对照小鼠相比(n＝2)。特别是从这些数据来看，只有gd2super1cart能够真正清除肝脏中的y79细胞。
图60c.gd2-super1-cart细胞在小鼠脾脏中表现出更强的持久性
(a)流式细胞术分析显示，不同形式的抗gd2-car-t细胞处理的小鼠肝脏中存在car-t细胞(环状)。经尾静脉注射y79细胞(1x106细胞)3天后，静脉注射cart细胞(10x106细胞)。y79肿瘤注射后第30天处死小鼠，取脾脏匀浆，观察cart的疗效。用小鼠抗人cd3和cd45抗体标记匀浆脾细胞，检测人t细胞。左侧显示了一个给了对照t细胞的小鼠表示；小鼠使用gd2car(左中)、gd2-4-1bblcar(右中)和gd2-super1car(右)t细胞处理。
(b)显示处理组小鼠cart细胞比对照组小鼠加倍的图表(n＝2)。从这些数据来看，尤其是gd2超级cart细胞在小鼠脾细胞中的扩增效果明显好于对照t细胞。
图60d.小鼠血液中cart细胞的持久性
(a)流式细胞术分析显示，不同形式的抗gd2-car-t细胞处理后，小鼠全血中的car-t细胞(环状)持续存在。经尾静脉注射y79细胞(1x106细胞)3天后，静脉注射cart细胞(10x106细胞)。y79肿瘤注射后30天处死小鼠，采集全血，观察cart的持续性。用小鼠抗人cd3和cd45抗体标记全血细胞，检测人t细胞。左侧显示了给了对照t细胞小鼠；小鼠用gd2car(左中)、gd2-4-1bblcar(右中)和gd2-super1car(右)t细胞处理。
图60e.表示全血样本中人类t细胞持续性百分比的条形图，通过流式细胞术分析的总细胞数(n＝2个)
【实施方式】
本发明提供嵌合抗原受体(car)成分、方法及其制备，以及使用car成分的方法。
成分
嵌合抗原受体多肽
在一个实施例中，本发明提供一种嵌合抗原受体(car)多肽，其具有一个信号肽、一个抗原识别域、一个铰链区、一个跨膜域、至少一个共刺激域和信号域。
如本文中所使用，术语「肽」、「多肽」及「蛋白质」可互换使用，且是指具有由肽键共价连接之胺基酸残基之化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个胺基酸，且对可包括蛋白质或肽序列之胺基酸最大数目无限制。多肽包括任何具有两个或更多个藉由肽键彼此接合之胺基酸之肽或蛋白质。如本文所使用之术语是指短链(其在此项技术中亦通常称为例如肽、寡肽及寡聚物)及长链(其在此项技术中通常称为蛋白质，其存在多种类型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、实质上同源多肽、寡肽、均二聚体、杂二聚体、多肽变异体、经修饰之多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重组型肽、合成肽或其组合。
「信号肽」包括肽序列，其引导细胞内肽及任何连接之多肽之传递及定位，例如传递及定位至某一细胞器(诸如内质网)及/或细胞表面。
信号肽为任何分泌或跨膜蛋白之肽，其引导所揭示之多肽传递至细胞膜及细胞表面，且提供本发明之多肽之正确定位。特定言之，本发明之信号肽将本发明之多肽引导至细胞膜，其中多肽之细胞外部分在细胞表面上显示，跨膜部分横跨质膜，且活性域位于细胞质部分或细胞之内部中。
在一个实施例中，信号肽在通过内质网(er)之后裂解，亦即为可裂解之信号肽。在一个实施例中，信号肽为i、ii、iii或iv型人类蛋白质。在一个实施例中，信号肽包括免疫球蛋白重链信号肽。
“抗原识别域”包括对靶的抗原、受体、肽配体或蛋白质配体具有选择性的多肽；或靶的多肽。
标靶特异性抗原识别域较佳包括来源于针对标靶之抗原之抗体的抗原结合域，或结合标靶之抗原之肽，或结合抗体(其结合标靶之抗原)之肽或蛋白质，或结合标靶上之受体之肽或蛋白质配位体(包括(但不限于)生长因子、细胞激素或荷尔蒙)，或来源于结合标靶上之肽或蛋白质配位体之受体(包括(但不限于)生长因子受体、细胞激素受体或荷尔蒙受体)之域。靶标包括gd2和gd3。在另一实施例中，靶标包括gd2和gd3的任何部分。在另一实施例中，靶标为神经节苷脂gd2，其结构为gd2＝bdgalpnac(1-4)[aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)]bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer。在另一实施例中，靶标是神经节苷脂gd3，其结构为gd3＝aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer。
在一个实施例中，抗原识别域包括针对标靶(对标靶具有选择性)之单株或多株抗体之结合部分或可变区。
在一个实施例中，抗原识别域包括抗原结合片段(fab)。在另一实施例中，抗原识别域包括单链可变片段(scfv)。单链抗体是免疫球蛋白重链(vh)和轻链(vl)可变区的融合蛋白，与短连接肽相连。
在另一实施例中，抗原识别域包括骆驼科(camelid)单域抗体，或其部分。在一个实施例中，骆驼科单域抗体包括在骆驼中发现之重链抗体，或vhh抗体。骆驼科(例如骆驼、单峰驼、大羊驼及羊驼)之vhh抗体系指骆驼单链抗体之可变片段(参见nguyen等人,2001；muyldermans,2001)，且亦包括经分离之骆驼vhh抗体、重组型骆驼vhh抗体或合成骆驼vhh抗体。
在另一实施例中，抗原识别域包括接合其同源受体之配位体。在另一实施例中，抗原识别域经人类化。
抗原识别域可在其序列内包括一些可变性且仍对本文中所揭示之标靶具有选择性。因此，预期抗原识别域之多肽可与本文中所揭示之抗原识别域多肽具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％一致性，且仍对本文中所描述之标靶具有选择性且属于本发明之范畴内。
在另一个实施例中，抗原识别域对神经节苷脂gd2和神经节苷脂gd3是选择性的。
铰链区为安置于例如包括(但不限于)嵌合抗原受体与至少一个共刺激域及信号传导域之间的序列。可获得铰链序列，包括例如来自任何属之任何适合的序列，包括人类或其部分。此项技术中已知此类铰链区。在一个实施例中，铰链区包括人类蛋白质之铰链区，包括cd-8α、cd28、4-1bb、ox40、cd3-ζ、t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能衍生物及其组合。
在一个实施例中，铰链区包括cd8a铰链区。
在一些实施例中，铰链区包括选自(但不限于)免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3、igg4及igd)之一者。
跨膜域包括横跨细胞膜之疏水性多肽。特定言之，跨膜域自细胞膜之一侧(细胞外)横跨细胞膜之另一侧(细胞内或细胞质)。
跨膜域可呈α螺旋或β筒或其组合形式。跨膜域可包括异地同型蛋白质，其具有多个跨膜区段，各呈α-螺旋、β片或其组合形式。
在一个实施例中，使用与car中之一个域天然相关之跨膜域。在另一实施例中，选择跨膜域或藉由胺基酸取代修饰以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白质之跨膜域之结合，从而最小化与受体复合物之其他成员之相互作用。
举例而言，跨膜域包括以下各者之跨膜域：t细胞受体α或β链、cd3ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、其功能衍生物及其组合。
人工设计的跨膜结构域是一种主要由亮氨酸和缬氨酸等疏水残基组成的多肽。在一个实施例中，在合成跨膜域之各端发现苯丙胺酸、色胺酸及缬胺酸之三联体。
在一个实施例中，跨膜域为cd8跨膜域。在另一实施例中，跨膜域为cd28跨膜域。此类跨膜域为此项技术中已知的。
信号传导域及共刺激域包括可活化免疫细胞以刺激或活化至少某些方面的免疫细胞信号传导路径的多肽。
在一个实施例中，信号传导域包括以下各者之功能性信号传导域之多肽：cd3ζ、共同fcrγ(fcer1g)、fcγrlla、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dnax活化蛋白质10(dap10)、dnax活化蛋白质12(dap12)、其活性片段、其功能衍生物及其组合。此类信号传导域为此项技术中已知的。
在一个实施例中，car多肽还包含一个或多个共刺激域。在一个实施例中，共刺激结构域是来自至少一个蛋白的功能性信号传导结构域，包括但不限于il-15受体α。il-15受体α细胞质结构域；b7-1/cd80；cd28；4-1bb,4-1bbl,b7-2/cd86；ctla-4；b7-h1/pd-l1；icos；b7-h2；pd-1；b7-h3；pd-l2；b7-h4；pdcd6；btla；4-1bb/tnfrsf9/cd137；cd40配体/tnfsf5；4-1bb配体/tnfsf9；gitr/tnfrsf18；baff/blys/tnfsf13b；gitr配体/tnfsf18；baffr/tnfrsf13c；hvem/tnfrsf14；cd27/tnfrsf7；light/tnfsf14；cd27配体/tnfsf7；ox40/tnfrsf4；cd30/tnfrsf8；ox40配体/tnfsf4；cd30配体/tnfsf8；taci/tnfrsf13b；cd40/tnfrsf5；2b4/cd244/slamf4；cd84/slamf5；blame/slamf8；cd229/slamf3；cd2，cd27，cracc/slamf7；cd2f-10/slamf9；ntb-a/slamf6；cd48/slamf2；slam/cd150；cd58/lfa-3；ikaros；cd53；整合素alpha4/cd49d；cd82/kai-1；整合素alpha4beta1；cd90/thy1；整合素α4beta7/lpam-1；cd96；lag-3；cd160；lmir1/cd300a；crtam；tcl1a；dap12；tim-1/kim-1/havcr；dectin-1/clec7a；tim-4；dppiv/cd26；tslp；ephb6；tslpr；和hla-dr。
本发明还提供一种编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸。编码car的多核苷酸很容易通过任何常规方法从指定car的氨基酸序列制备。编码氨基酸序列的碱基序列可以从每个结构域的氨基酸序列的前述ncbirefseqid或genbenk的登录号获得，并且本发明的核酸可以使用标准分子生物学和/或化学程序制备。例如，基于碱基序列，可以合成多核苷酸，并且可以通过结合使用聚合酶链反应(pcr)从cdna文库获得的dna片段来制备本发明的多核苷酸。
在一个实施例中，本发明公开的多核苷酸是基因、表达或克隆盒的一部分。
如本文所使用之术语「聚核苷酸」定义为核苷酸链。聚核苷酸包括dna及rna。此外，核酸为核苷酸之聚合物。因此，如本文所使用之核酸及聚核苷酸为可互换的。熟习此项技术者具有核酸为聚核苷酸之常识，聚核苷酸其可水解成单体「核苷酸」。单体核苷酸可水解成核苷。如本文所使用，聚核苷酸包括(但不限于)藉由此项技术中可使用的任何手段获得的所有核酸序列，包括(但不限于)重组手段，亦即使用一般选殖技术自重组型文库或细胞基因体选殖核酸序列，及聚合酶链反应(pcr)，及其类似手段，及藉由合成成段。
多核苷酸载体
上述聚核苷酸可选殖至载体中。「载体」为物质之组合物，其包括经分离之聚核苷酸，且其可用于将经分离之聚核苷酸传递至细胞内部。此项技术中已知的大量载体包括(但不限于)线性聚核苷酸、与离子性或两性化合物相关之聚核苷酸、质体、噬菌粒、黏质体及病毒。病毒包括噬菌体、噬菌体衍生物。因此，术语「载体」包括自主复制质体或病毒。该术语亦应视为包括非质体及非病毒化合物，其促进核酸转移至细胞中，诸如聚离胺酸化合物、脂质体及其类似物。病毒载体之实例包括(但不限于)腺病毒载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体及其类似物。
在一个实施例中，载体包括选殖载体、表现载体、复制载体、探针产生载体、整合载体及测序载体。
在一实施例中，载体为病毒载体。在一个实施例中，病毒载体为反转录病毒载体或慢病毒载体。在一个实施例中，经工程改造之细胞以病毒方式转导以表现聚核苷酸序列。
已针对基因转移至哺乳动物细胞中开发出许多基于病毒之系统。举例而言，反转录病毒提供基因传递系统之适宜平台。所选基因可插入载体中且使用此项技术中已知之技术封装于反转录病毒粒子中。接着可分离重组型病毒且活体内或离体传递至患者之细胞中。此项技术中已知许多反转录病毒系统。在一些实施例中，使用腺病毒载体。此项技术中已知许多腺病毒载体。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
病毒载体技术为此项技术中熟知的且描述于例如sambrook等人(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)及其他病毒学及分子生物学手册中。适用作载体之病毒包括(但不限于)反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒及慢病毒。通常，适合的载体含有在至少一种生物体、启动子序列、限制内切酶位点及一或多种可选标记物中具有功能性的复制起点(例如wo01/96584；wo01/29058；及美国专利第6,326,193号)。
嵌合抗原受体多核苷酸的表达可使用例如表达载体来实现，所述表达载体包括但不限于sffv(脾脏病灶形成病毒)或人类延伸因子11α(ef)启动子、cag(带cmv增强剂的鸡β肌动蛋白启动子)启动子人类延伸因子1α(ef)启动子中的至少一个。使用的弱/低表达启动子的实例可包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子、泛素c(ubc)启动子和磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子或其部分。嵌合抗原受体的诱导表达可以使用，例如，四环素应答启动子，包括但不限于tre3gv(tet应答元件，包括所有代并且优选地，第三代)、诱导启动子(clontechlaboratories，mountainview，ca)或其部分或组合来实现。
适合的启动子之一个实例为前早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列为能够驱使任何与其以操作方式连接之聚核苷酸序列之高表达量的强组成性启动子序列。适合的启动子之另一实例为延长生长因子-1a(ef-1a)。然而，亦可使用其他组成性启动子序列，包括(但不限于)猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(mmtv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽类白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒前早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子(roussarcomaviruspromoter)，以及人类基因启动子，诸如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子及肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成性启动子，亦涵盖诱导性启动子作为本发明之一部分。诱导性启动子之使用提供分子开关，该分子开关能够在需要此类表达时打开其以操作方式连接之聚核苷酸序列表现，或在不需要时关闭表现。诱导性启动子之实例包括(但不限于)金属硫离子启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子及四环素启动子。
「表现载体」是指包括重组性聚核苷酸之载体，该重组性聚核苷酸包含与待表现之核苷酸序列以操作方式连接之表现控制序列。表现载体包括足够的顺式作用元素用于表现；用于表现之其他元素可由宿主细胞供应或在活体外表现系统中。表现载体包括此项技术中已知之所有表现载体，诸如并入重组性聚核苷酸之黏质体、质体(例如裸露或含于脂质体中)及病毒(例如慢病毒、反转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始点上游30-100bp的区域，尽管最近已经显示出一些增强子也包含起始点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相互反转或移动时，启动子功能得以保留，在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。根据启动子的不同，似乎单个元素可以协同或独立地激活转录。
为了评估car多肽或其部分的表达，将要导入细胞的表达载体也可以包含可选择的标记基因或报告基因，或者两者都包含，以便于从通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞；在其他方面，可选择的标记可携带在单独的dna片段上，并用于共转染过程。可选择的标记和报告基因可与适当的调控序列结合以在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如neo等抗生素抗性基因。
报告基因用于识别潜在的转染细胞和评估调控序列的功能。一般来说，报告基因是指受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，它编码一种多肽，其表达表现为一些易于检测的特性，例如酶活性。报告基因的表达在dna导入受体细胞后的适当时间进行检测。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，uitei等人，2000febs信件479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知的技术制备或商业化获得。一般来说，报告基因表达水平最高的最小的5'区域结构体被确定为启动子。这些启动子区域可以与报告基因相连接，并用于评估调节启动子驱动转录的能力。
本领域已知将基因导入和表达到细胞中的方法。在表达载体的内容中，通过本领域的任何方法，该载体可以容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质感染、粒子轰击、微量注射、电穿孔等。生产包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是众所周知的。例如，参见sambrook等人。(2001年，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)。将多核苷酸导入宿主细胞的首选方法是磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(如人类细胞)中最广泛使用的方法。其他病毒载体可衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等。例如，见美国专利第5350674号和第5585362号。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子络合物、纳米胶囊、微球、珠子和脂基系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。脂质体(例如，人工膜囊泡)是一种在体内外用作运载工具的典型胶体系统。在使用非病毒递送系统的情况下，典型的递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、体外或体内)。在另一方面，核酸可能与脂质有关。与脂质相关联的核酸可以被包裹在脂质体的水内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸相关联的连接分子连接到脂质体上，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂类的溶液中，与脂类混合，与脂类结合，作为悬浮液包含在脂类中，包含或与胶束复合，或以其他方式与脂类相关。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关成分不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可能以胶束的形式存在于双层结构中，或具有“折叠”结构。它们也可能简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂类是指天然或合成脂类的脂肪物质。例如，脂类包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
可从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二苯乙烯磷脂酰胆碱(“dmpc”)可从sigma，st.louis，mo获得；磷酸二苯乙烯(“dcp”)可从k&k实验室(plainview，ny)获得；胆固醇(“choi”)可从calbiochembehring获得；二苯乙烯磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可从avantipolarlipses，inc.获得。(阿拉巴马州伯明翰)。氯仿或氯仿/甲醇中脂质的储备溶液可储存在-20℃左右。氯仿是唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。
“脂质体”是一个总称，包含由封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单室和多室层脂质载体。脂质体具有囊泡结构，具有磷脂双层膜和内部水介质。多室层脂质体在水介质中具有多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并在脂质双层之间夹带水和溶解溶质(ghosh等人，191glycobiology5；505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的成分也被包围。例如，脂质可能呈现胶束结构，或者仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质体-核酸复合物。
无论用于将外源多核苷酸引入宿主细胞或以其他方式使细胞暴露于本发明的多核苷酸中的方法如何，为了确认宿主细胞中存在重组dna序列，可以执行多种分析。此类分析包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”分析，例如southern和northernblotting、rt-pcr和pcr；“生化”分析，例如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫方法(ellsa和westernblots)或本文所述的分析来识别属于本发明范围内的试剂。
工程细胞
在另一实施例中，本发明提供一种表达上述嵌合抗原受体多肽或编码上述嵌合抗原受体多肽的多核苷酸的工程细胞。
「经工程改造之细胞」意谓任何生物体之经修饰、经转型或借由基因、dna或rna序列或蛋白质或多肽之添加或修饰而操作之任何细胞。本发明之经分离之细胞、宿主细胞及经基因工程改造之细胞包括经分离之免疫细胞，诸如含有编码嵌合抗原受体或嵌合抗原受体复合物之dna或rna序列且在细胞表面上表达嵌合受体之nk细胞及t细胞。经分离之宿主细胞及经工程改造之细胞可用于例如增强nk细胞活性或t淋巴细胞活性、治疗癌症及治疗感染性疾病。
可以使用能够表达和/或能够将本文所揭示的嵌合抗原受体多肽整合到其膜中的任何细胞。
在一个实施例中，经工程改造之细胞包括免疫调节细胞。免疫调节细胞包括t细胞，诸如cd4t细胞(辅助t细胞)、cd8t细胞(细胞毒性t细胞、ctl)及记忆体t细胞或记忆体干细胞t细胞。在另一实施例中，t细胞包括自然杀手t细胞(nkt细胞)。
t细胞由cd4和cd8细胞组成。cd4是一种存在于t辅助细胞等免疫细胞表面的糖蛋白，在t细胞活化和hiv受体中起重要作用。一些单核细胞或巨噬细胞也表达cd4。cd4叫做okt4。细胞毒性t细胞也被称为cd8 t细胞或在其表面表达cd8糖蛋白的cd8t细胞。这些cd8 t细胞一旦暴露在mhcⅰ类抗原肽中就会被激活。
在一个实施例中，所述工程细胞包括nkt细胞。nkt细胞在本领域中是众所周知的。
在一个实施例中，经工程改造之细胞包括自然杀手细胞。自然杀手细胞为此项技术中所熟知的。在一个实施例中，自然杀手细胞包括细胞系，诸如nk-92细胞。nk细胞系之其他实例包括nkg、yt、nk-ys、hank-1、yts细胞及nkl细胞。
nk细胞在无gvhd风险情况下介导抗肿瘤作用且相对于t细胞为短生命期。因此，nk细胞将在毁坏癌细胞之后不久耗竭，减少对car构筑体上将消融经修饰之细胞之诱导性自杀基因之需要。
如本文所述，cdxcar是指具有cdx抗原识别域的嵌合抗原受体。如本文所用，cdx可以是gd2和gd3中的任何一个。
用于运载car的缺乏tcr的t细胞
在一个实施例中，经工程改造之细胞,特别是从供体获得的同种异体t细胞，可被修饰以灭活参与mhc识别的tcr(t细胞受体)组分。结果，缺少tcr的t细胞不会引起植物抗宿主病(gvhd)。
细胞来源
工程细胞可从外周血、脐血、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴结组织或胸腺组织中获得。宿主细胞可包括胎盘细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或造血干细胞。这些细胞可以从人类、猴子、黑猩猩、狗、猫、老鼠、老鼠及其转基因物种中获得。这些细胞可以从已建立的细胞系中获得。
上述细胞可通过任何已知方法获得。这些细胞可以是自体的、同基因的、异基因的或异种的。
“自体”一词是指从同一个人身上获得的任何材料，这些材料随后将被重新引入该个人体内。
“异基因”一词是指从同一物种的不同动物身上获得的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或多个个体被称为彼此异基因。在某些方面，来自同一物种的个体的异基因材料可能与基因完全不同，从而在抗原上相互作用。
“异种”一词是指来自不同物种的动物的移植物。
“同基因”一词是指一种非常接近的遗传相似性或同一性，特别是在抗原或免疫反应方面。同基因系统包括器官和细胞(例如癌细胞及其非癌对应物)来自同一个体的模型，和/或器官和细胞来自同一近交系不同个体动物的模型。
在某些实施方案中，t和nk细胞来源于人类外周血单个核细胞(pbmc)、白细胞分离产物(pbsc)、人类胚胎干细胞(hesc)、诱导多能干细胞(ipsc)、骨髓或脐带血。
在car治疗中使用nk细胞的潜在缺点包括缺乏持久性，这可能会降低长期疗效。
寻找匹配的供体t细胞来产生car-t细胞可能是一个挑战，因为不匹配的t细胞可能附着在受体的组织上，导致移植物抗宿主病(gvhd)。
最近的研究表明，通过crispr-cas9进行基因编辑以产生通用cart细胞，可能会通过产生无意突变和破坏p53修复蛋白的功能而增加癌症风险。考虑到这种风险，在为患者创建car疗法时，寻找避免基因组编辑的方法是很重要的。自然杀伤细胞(nk)是一个理想的平台，可以创建一个通用car，避免与基因组编辑相关的风险。然而，nk-car细胞在体内的预期寿命很短，大约为一周。
在一个实施例中，本发明包括一种产生嵌合抗原受体(car)修饰的nk细胞的方法，该嵌合抗原受体在体内具有长寿命或持久性潜力以治疗疾病。令人惊讶的是，共表达il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚的car-nk细胞可以长期存活。
在进一步的实施例中，可以通过共同表达il-15/il-15锚来实现car-nk细胞存活的延长。
在一些实施例中，共同表达il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚的car-nk细胞可扩增并用作现成产品。
在一个实施例中，共表达il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚的car-nk细胞能够持续产生细胞因子信号，这对其在患者输注后的存活至关重要。
在一些实施例中，共表达il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚的car-nkt细胞可扩增并用作现成产品。
在一个实施例中，共表达il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚的car-nkt细胞能够持续产生细胞因子信号，这对其在患者输注后的存活至关重要。
在进一步的实施方案中，可通过共同表达从il-7、il-15、il-15/il-15锚、il-15/il-15ra、il-12、il-18和il-21中选择的细胞因子来实现car-nk细胞存活的延长。
在一个实施例中，共表达il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚的car-nkt细胞能够继续产生细胞因子信号，这对其在患者输注后的存活至关重要。
在进一步的实施方案中，可通过共同表达从il-7、il-15、il-15/il-15锚、il-15/il-15ra、il-12、il-18和il-21中选择的细胞因子来实现car-nkt细胞存活的延长。
自然杀伤性t细胞(nk-t)是一组具有t细胞和自然杀伤性t细胞共同特性的t细胞。
在一个实施例中，对il-15产物进行修饰以形成二硫键，将il-15/sushi结构域络合物与fc区域(例如来自igg1)连接。在本实施例中，il-15/sushi复合物可与fc区域连接，fc区域将形成二聚体，其具有连接两个分子的二硫桥。在一个实施例中，il-15的位置52处的亮氨酸替换为半胱氨酸，sushi结构域的位置40处的丝氨酸替换为半胱氨酸。
在一个实施例中，可诱导的启动子在细胞途径(如t细胞受体途径)激活时引起表达。在该实施例中，感兴趣基因的表达将在t细胞受体或类似途径激活时诱导，包括由cars激活的启动子。本领域技术人员将理解这包括启动子，例如在活化t细胞(nfat)启动子的核因子控制下的启动子，包括il-2启动子的部分或由nfat结合基序组成的合成启动子，其序列已被很好地描述。这些只是激活诱导启动子的例子，并不是限制性的。
ucar-nk细胞
目前大多数临床试验或治疗方法都是注入自体cart细胞，因为同种异体cart细胞能够诱导受者发生移植物抗宿主病(gvhd)。尽管这种自体移植方法在临床上取得了显著的成功，但制造特定于患者的t细胞产品的过程既耗时又昂贵。此外，从一个经过严重预处理的病人身上收集足够的t细胞来成功地产生足够剂量的cart细胞并不总是可能的。非自体异基因car产品的开发有着巨大的需求。nk细胞与t细胞相似之处在于它们具有高度的细胞毒性免疫效应。与t细胞相比，nk细胞具有通过特定方式杀死靶细胞的特性。nk细胞可以作为一种非自体异基因产品，因为它们通常缺乏引起gvhd的可能性。使用nk细胞的主要缺点是它们在体内缺乏持久性，半衰期只有一周左右。
在一些实施例中，本发明公开了一种表达来自健康供体的nk细胞或nkt细胞的通用car的形式，该通用car可以被存储，然后根据需要注入到个体中。
在进一步的实施例中，本发明包括一种从异基因健康供体产生非自体通用car-nks的方法，该方法可以在不引起gvhd的情况下输注到任何患者。
在一些实施例中，从脐带血库和外周血库获得nk细胞或nkt。在另一实施例中，nk是诱导的多能干细胞或胚胎干细胞或nk-92细胞。
在一些实施例中，本发明包括用于在nk细胞中具有共同表达il-15/il-15的car或复合car(ccar)的方法。这些工程化的nk细胞被称为ucar-nk细胞。
在一些实施例中，ucarnk细胞具有共同表达il-15/il-15sushi的car或ccar。在进一步的实施方案中，ucarnk细胞能够在体内持续超过一周。
在一些实施例中，本发明包括用于具有用il-15/il-15sushi表达car或ccar的载体的ucarnk细胞的方法。
在一些实施例中，il-15/il-15sushi与car或ccar的共同表达为受试者中的nk细胞提供长期持久性。
在一些实施方案中，il-15/il-15sushi与car或ccar的共表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或通过将固有免疫细胞招募到癌细胞中来在患者中提供长期持久缓解。
在一些实施例中，本发明包括一种用一个car或ccars共同表达il-15/il-15sushi生成nk细胞的方法。在进一步的实施方案中，car中抗原识别域靶向的特定肿瘤抗原可从以下组中选择，但不限于：gd2、gd3、白细胞介素6受体、fshr、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3、糖脂、glypican3、f77、wt1、cea、her-2/neu、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6，cd2和cd138。
在一些实施例中，本发明包括通过输注治疗有效量的nk细胞来治疗紊乱或疾病的方法，该nk细胞经基因工程以表达il-15/il-15sushi和/或具有特定肿瘤抗原的抗原识别域的car。在进一步的实施方案中，抗原识别域靶向的特定肿瘤抗原可从以下组中选择，但不限于：gd2、gd3、白细胞介素6受体、fshr、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3、糖脂、glypican3、f77、wt1、cea、her-2/neu、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6、甲胎蛋白、ca19-9,ca72-4,ny-eso,fap,erbb,c-met,mart-1,muc1,muc2,muc3,muc4,muc5,mmg49epitope,cd30,egfrviii,cd33,cd123,cll-1,nkg2d,nkg2d受体、免疫球蛋白kappa和lambda、cd38、cd52、cd47、cd200、cd70、cd56、cd19、cd20、cd22、cd38、bcma、cs1、baff受体、taci、cd3、cd4、cd8、cd5、cd7、cd2和cd138。
在一些实施例中，施用高剂量ucarnk细胞可导致细胞因子释放综合征(crs)。在本发明中，包括通过向受试者提供低剂量或分剂量的ucarnk细胞来减少或避免crs的方法。
自杀和安全开关系统
本发明的工程细胞也可能包括自杀系统。自杀系统提供了一种机制，使得如上所述的工程细胞可以被停用或破坏。这种特性允许对使用工程细胞的任何治疗进行精确的治疗控制。如本文所使用的，自杀系统提供了一种机制，通过该机制，具有自杀系统的细胞可以被停用或破坏。自杀系统是众所周知的技术。
在一个实施例中，自杀系统包括一个基因，该基因可根据需要在药理学上被激活以消除所含细胞。在特定方面，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不具有免疫原性。在一个例子中，自杀系统包括一个基因，该基因导致cd20在工程细胞的细胞表面表达。因此，给药利妥昔单抗可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在一些实施例中，自杀系统包括表位标记。表位标记的例子包括c-myc标记、cd52链霉亲和素结合肽(sbp)和截短的egfr基因(egfrt)。在本实施例中，表位标签在工程细胞中表达。因此，针对表位标签施用抗体可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在另一个实施例中，自杀系统包括一个基因，该基因导致截短的表皮生长因子受体在工程细胞表面表达。因此，西妥昔单抗可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在另一实施例中，自杀系统包括cd52以在工程细胞的表面上表达。因此，给药抗-52单克隆抗体(campath，alemtuzumab)可用于破坏含有该基因的工程细胞。
在另一个实施例中，自杀系统包括campath(alemtuzumab)。因此，使用抗-52单克隆抗体(campath)可以在不表达标记或基因的情况下破坏工程细胞，因为cart细胞或t细胞高度表达cd52。
在另一实施例中，自杀基因可包括caspase8基因、caspase9基因、胸苷激酶、cytosinedeaminase(cd)或细胞色素p450。
进一步自杀系统的例子包括琼斯等人描述的自杀系统。(jonesbs、lambls、goldmanf和distasia(2014)通过自杀基因转移提高细胞治疗产品的安全性。front.pharmacol.5：254.doi:10.3389/fphar.2014.00254)，通过引用将其全部并入本文。
复合car(ccar)
如本文中所使用，复合car(ccar)或多个car是指具有至少两种不同且完整的嵌合抗原受体多肽之经工程改造之细胞。如本文中所使用，「不同的嵌合抗原受体多肽」具有独特抗原识别域、信号肽、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及信号传导域。因此，两个独特的嵌合抗原受体多肽将具有不同的抗原识别域。在两个不同的嵌合抗原受体多肽之间，信号肽、铰链区、跨膜域、至少一个共刺激域及信号传导域可相同或不同。如本文中所使用，嵌合抗原受体(car)单元是指不同的嵌合抗原受体多肽，或编码不同的嵌合抗原受体多肽之聚核苷酸。
如本文中所使用，独特抗原识别域为对单个标靶或标靶之单个抗原决定基具有特异性或靶向其之抗原识别域。
如本文所述，在复合car的内容中。单个嵌合抗原受体多肽只有一个独特的抗原识别域。作为进一步的解释，这个单一抗原识别域只识别并结合单一抗原或单一抗原表位。
在一些实施例中，复合car靶向相同的抗原。例如，ccar靶向单一抗原的不同表位或部分。在一些实施例中，复合car中存在的每个car单元靶向针对相同或不同疾病状况或由疾病状况引起的副作用的特异性的不同抗原。
在一些实施例中，一个复合car靶向两种不同抗原。
产生携带不同car单元之复合car可极具挑战性：(1)car与car之间的相互作用可具有不利影响且适合的car设计为抵消此作用之关键；(2)单一构筑体中之复合car可增加表达盒之长度，其可引起病毒效价及蛋白质表达量降低；(3)需要适合的设计以包括多种car主体元素，尤其选择策略以在单一载体中表达多个car；(4)强启动子对于携带其他car单元之复合car尤其重要；(5)car中之铰链区需要经设计使得较佳避免各car单元之间铰链区之相互相用；(6)表达于细胞中之两个或更多个car单元可引起毒性作用(car-car相互相用)。本文中之申请人提供可解决此等障碍之新颖及出人意料的car组合物及方法。
ccars的转导效率(cart细胞百分比)通常低于单个单位car。在转染和转导过程中，有几种方法可以提高效率。为了提高制备ccars的病毒滴度，最好使用lentixtm293t(clontech/takara)包装细胞系，用于制备高滴度慢病毒，而不是常用的hek-293ft，转染包装细胞时，最好将质粒dna(含ccar结构)增加1.5-2.0倍，以提高转染效率。在复合物形成过程中，病毒包装质粒和转染试剂的量保持不变。通过在转导过程中降低t细胞与病毒载体的比率，使之达到每毫升0.3x106个细胞，并增加慢病毒上清液或慢病毒的体积，可以进一步提高转导效率。
在一个实施例中，本发明提供具有多个car单元之经工程改造之细胞。此使得单个经工程改造之细胞靶向多个抗原。一个多个car单元同时靶向多个表面标记物或抗原可防止抗性纯系之选择及减少肿瘤复发。尚未研发用于任何恶性肿瘤之多个cart细胞免疫疗法，其中每个个别组分car包含多个域及活化位点。
在本发明之一个态样中，ccar包括多个car单元。在一些实施例中，ccar包括至少两个car单元。在另一实施例中，ccar包括至少三个car单元。在另一实施例中，ccar包括至少四个单元。
在一个实施例中，本发明提供经工程改造之细胞，其具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽，各自具有不同的抗原识别域。
在一个实施例中，具有至少两个不同嵌合抗原受体多肽之经工程改造细胞为t细胞或nk-t细胞。t细胞可以被改造使其不表达细胞表面抗原。例如，可以改造t细胞使其不表达cd45细胞表面抗原。
在优选实施方案中，具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽的工程细胞是从外周血或脐血和nk-92细胞中分离出来的原代nk细胞或nkt细胞，使得其「现成地」投与任何患有疾病或癌症之哺乳动物。
在一个实施例中，经工程改造之细胞包括(i.)第一嵌合抗原受体多肽，其包含第一抗原识别域、第一信号肽、第一铰链区、第一跨膜域、第一共刺激域及第一信号传导域；及(ii.)第二嵌合抗原受体多肽，其包含第二抗原识别域、第二信号肽、第二铰链区、第二跨膜域、第二共刺激域及第二信号传导域。第一抗原识别域与第二抗原识别域不同。
在一个较佳实施例中，每个经工程改造之car单元聚核苷酸具有不同核苷酸序列以避免同源重组。
在一个实施例中，第一抗原识别域的靶点选自但不限于gd2、gd3、白细胞介素6受体、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3、糖脂、glypican3、f77、gd-2、wt1、cea、her-2/neu、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6、甲胎蛋白、ca19-9、ca72-4、ny-eso，fap、erbb、c-met、mart-1、muc1、muc2、muc3、muc4、muc5、cd30、egfrviii、cd33、cd123、cll-1、nkg2d、nkg2d受体、免疫球蛋白kappa和lambda、cd38、cd52、cd19、cd20、cd22、cd38、bcma、cs1、baff受体、taci、cd3、cd4、cd8、cd5、cd7、cd2和cd138；第二个识别域的靶点选自gd2、gd3、白细胞介素6受体、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3、糖脂、glypican3、f77、gd-2、wt1、cea、her-2/neu、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6、甲胎蛋白、ca19-9、ca72-4、ny-eso、fap、erbb、c-met、mart-1、muc1，muc2、muc3、muc4、muc5、cd30、egfrviii、cd33、cd123、cll-1、nkg2d、nkg2d受体、免疫球蛋白kappa和lambda、cd38、cd52、cd19、cd20、cd22、cd38、bcma、cs1、baff、baff受体、april受体、taci、cd3、cd4、cd8、cd5、cd7、cd2和cd138。
在一个实施例中，第一抗原识别域的靶点选自但不限于：gd2、gd3、cd19、cd20、cd22、cd38、cd138、bcma、cs1、baff、baff受体、taci、april、april受体、cd3、cd4、cd5、cd7、cd2、cll-1、cd33、cd123、nkg2d受体和cd30；第二个识别域的靶点选自gd2、gd3、cd19、cd20、cd22、cd38、cd138、bcma、cs1、baff、april、april受体、baff受体、taci、cd3、cd4、cd5、cd7、cd2、cll-1、cd33、cd123、nkg2d受体和cd30。
在一个实施例中，各car单元包括相同或不同铰链区。在另一实施例中，各car单元包括相同或不同跨膜区。在另一实施例中，各car单元包括相同或不同胞内域。
在一个实施例中，各car单元包括cd3ζ链信号传导域。
在一个实施例中，每个不同的car单元包括不同的共刺激域。举例而言，第一嵌合抗原受体多肽包括4-1bb共刺激域；且第二嵌合抗原受体多肽包括cd28共刺激域。
在一个实施例中，每个不同的car单元包括相同的共刺激域。例如，第一嵌合抗原受体多肽包括4-1bb共刺激结构域；第二嵌合抗原受体多肽包括4-1bb共刺激结构域。
在另一实施例中，铰链区经设计以排除可能引起不合需要的分子内或分子间相互作用之胺基酸。举例而言，铰链区可经设计以排除或最小化半胱胺酸残基以防止形成二硫键。在另一实施例中，铰链区可经设计以排除或最小化疏水性残基以防止不合需要之疏水相互作用。
复合car可独立地或组合杀死细胞。多重或复合car包含相同或不同铰链区、相同或不同跨膜、相同或不同共刺激及相同或不同细胞内域。较佳选择铰链区以避免相互相用位点。
本发明之复合car可靶向t或nk细胞中之相同或不同肿瘤群。第一个car例如可靶向大型肿瘤群且随后或第二个car例如可根除癌症或白血病干细胞，以避免癌症复发。
根据本发明，意外发现t或nk细胞中靶向不同或相同肿瘤群之复合car对抗可引起对car杀死活性之抗性之癌细胞的肿瘤因子，借此产生自癌细胞表面之标靶抗原之下调。亦意外发现此能够引起癌细胞「躲避」car疗法，称为「抗原逃逸」，及肿瘤非均质性，由此不同肿瘤细胞可呈现不同表面抗原表达概况。如下所述，令人惊讶地发现，由于其多靶向性，复合car比单car疗法具有显著的优势。虽然在抗原特异性选择压力下单一抗原的丢失是可能的，但同时丢失两种主要抗原的可能性要小得多。
在一个实施例中，抗原识别域包括针对(选择性)靶点的人源化单克隆或人源化多克隆抗体的结合部分或可变区域。
在本发明的一个方面中，抗原识别域可以是包括两个靶向域的双特异性串联嵌合抗原受体。在另一实施例中，存在包含三个或更多靶向结构域的多特异性串联嵌合抗原受体。
在本发明的某些方面中，抗原识别域可以是包括两个靶向域的双特异性嵌合抗原受体(源自双特异性抗体)。
在一个实施例中，双特异性串联嵌合抗原受体或双特异性嵌合抗原受体有效地抵消肿瘤逃逸或抗原丢失，并增加抗原识别的敏感性。
在另一实施例中，抗原识别域包括骆驼单域抗体或其部分。在一个实施例中，骆驼单域抗体包括在骆驼中发现的重链抗体或vhh抗体。骆驼的vhh抗体(例如骆驼、骆驼、骆驼和羊驼)是指骆驼单链抗体的可变片段(见nguyen等人，2001；muyldermans，2001)，还包括骆驼的分离vhh抗体、骆驼的重组vhh抗体或骆驼的合成vhh抗体。
car功能和t及固有细胞增殖的增强子
il-15/il15sushi增强子
在一个实施例中，带有il-15/il-15sushi增强子的car结构如图53所示，car配备有分泌il-15/il-15sushi复合物。含有il-15/il-15sushi的car与p2a自裂序列相关。il-15/il-15sushi部分由融合到il-15的il-2信号肽组成，并通过26-氨基酸多脯氨酸连接物连接到il-15α受体的sushi结构域。car具有单链抗体、共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号转导cd3zeta链。il-15中的il-15信号肽被il-2信号肽(先导序列)所取代，这是一种提供高效il-15/il-15sushi分泌的强信号肽。所述结构物的肽自裂解肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂还可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
il-15可以是一种变体，il-15n72d在别处描述，us8507222b2。
il-15/il15sushi锚增强子
在一个实施例中，具有il-15/il-15sushi锚的car结构如图54所示。car-il-15/il-15sushi锚构建物包括驱动car表达的sffv启动子和由p2a肽连接的il-15/il-15sushi锚(也称锚)。当p2a肽断裂时，il-15/il-15锚car分裂成一个car和一个il-15/il-15suchi锚。il-15/il-15sushi锚部分由融合到il-15的il-2信号肽组成，并通过26个氨基酸的多脯氨酸连接物与il-15α受体的sushi结构域连接。car和锚包括一个铰链(h)区，一个跨膜区(tm)。car还具有单链抗体、共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号、cd3zeta链，而锚不承担这些成分。il-15/il-15sushi锚与cd28或4-1bb具有协同激活t细胞或抗肿瘤的作用。配备il-15/il-15sushi锚后，car的功能更强(图54)
il-15可以是一种变体，il-15n72d于其他地方所述，us8507222b2
4-1bbl增强子
在另一个实施例中，带有4-1bbl增强子的car结构如图55所示。car4-1bbl结构包括一个驱动car表达的sffv启动子和一个由p2a肽连接的增强子4-1bbl(cd137l)。当这个p2a肽被切割时，一个含有4-1bbl的car结构体分裂成一个car和全长的4-1bbl蛋白。car包括先导序列和单链抗体、铰链(h)区、跨膜区(tm)。car还具有共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号、cd3zeta链，而4-1bbl不含这些成分。4-1bbl与cd28或4-1bb具有协同激活t细胞或抗肿瘤的作用。当配备4-1bbl时，car的功能更大。
il-15增强子
car功能可以通过加入一种分泌促进剂il-15来增强，如图56所示。car4-il-15由一个驱动car表达的sffv启动子和一个由p2a肽连接的增强子il-15组成。当这个p2a肽被切割时，一个含有il-15的car结构分裂成一个car和全长il-15蛋白。car包括先导序列和单链抗体、铰链(h)区、跨膜区(tm)。car还具有共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号传导cd3zeta链，而il-15不含这些成分。分泌il-15与cd28或4-1bb具有协同激活t细胞或抗肿瘤的作用。当分泌il-15时，car的功能更大。il-15中的il-15信号肽被il-2信号肽(先导序列)取代，这是一种提供高效il-15分泌的强信号肽。
有多种增强子的car
一个例子，一个car与多个增强子(超级car)。图57是一个car增强子结构示意图。该结构包括驱动car和增强子表达的sffv启动子，分别由p2a和t2a肽连接的4-1bbl(cd137l)和il-15/il-15sushi。当这个p2a和t2a肽被裂解时，一个含有4-1bbl和il-15/il-15sushi的car结构体分裂成一个car和全长4-1bbl蛋白，并分泌il-15/il-15sushi。car包括先导序列和单链抗体、铰链(h)区、跨膜区(tm)。car还具有共刺激域(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号传导cd3zeta链。4-1bbl配体与cd28或4-1bb(但不限于)具有协同t或nk细胞活化或抗肿瘤活性。所述结构物的肽自裂解肽可包括但不限于p2a、t2a、f2a和e2a。所述结构物的分泌促进剂还可包括但不限于il-15/il-15sush、il-15、il-21、il-18、il-7和il-12。分泌促进剂，如il-15/il-15sushi，可增强cart或nk细胞的扩张和持久性。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的效果。
bcma-cs1复合car(bcma-cs1ccar)
多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是一种由浆细胞异常快速增殖引起的血癌，占美国所有血癌的18％。mm的治疗方案包括化疗、皮质类固醇治疗、靶向治疗、干细胞移植大剂量化疗、生物治疗、放射治疗、单克隆抗体、蛋白酶体抑制剂和手术。即使采用这些有效的治疗方法，mm的5年生存率仍为49.6％。然而，对于mm仍然没有治愈的方法，几乎所有的患者在治疗后都会复发。
目前，car技术在多发性骨髓瘤中的应用包括使用靶向bcma(cd269)的cart细胞对抗由jameskochenderfer(nih)导致的大量疾病。那些在bcma-car治疗后病情缓解的患者最终会复发，这可能是由于一些骨髓瘤细胞对bcma呈弱(弱)或阴性表达。因此，以car为基础的单一靶点治疗可能不足以预防骨髓瘤复发。cs1(slamf7)是另一个很好的骨髓瘤靶点，因为它在骨髓瘤细胞中的表达通常很高且均匀，并且与骨髓瘤细胞的粘附性和致瘤性有关。
本发明由单个cart细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达2个不同的car单位，可作为一种新的靶向多抗原和潜在地避免肿瘤复发的方法。一种复合car(ccar)，包括bcma-car，该bcma-car通过自裂p2a肽连接到cs1-car，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。
在本发明中，令人惊讶地发现这种bcma-cs1ccar(bc1ccar)t细胞在体外表现出强大和特异的抗肿瘤活性，并在体内控制显著的肿瘤生长。我们首次证明，一个2单位的不同car能够在体外有效地靶向两种抗原，对更全面的临床结果具有潜在的意义。出乎意料的是，以bcma和cs1为靶点的复合car联合治疗多发性骨髓瘤是一种非常有力的策略。这一新的方法，由于复合设计的复合压力，避免了单一car治疗因选择压力导致的抗原逃逸(单一抗原的损失)。
bcma(b细胞成熟抗原)和cs1(slamf7)被选为复合car的靶点，因为绝大多数骨髓瘤患者表达两种或两种表面抗原，而这些抗原不包括造血干细胞。在浆细胞上广泛表达bcma和cs1两种不同的靶点，可以增加覆盖率，有效地消除癌细胞，防止抗原逃逸。
在本发明中，令人惊讶地发现，将cs1作为靶点添加到bcma-car中通过消除存活的bcma-cs1 骨髓瘤细胞来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。bcma和cs1(cd319)均在mm细胞上广泛表达，这种高表达使bcma-cs1ccar能够全面覆盖所有潜在的癌细胞。这允许癌细胞更彻底的消除，以减少抗原逃逸，在其抵抗发展前通过对多个目标同时猛烈打击。
在一个实施例中，bcma-cs1指导的bcma-cs1car(bc1ccar)疗法是骨髓移植(bmt)的“桥梁”或与重型化疗加bmt的组合。bcma-cs1ccar可为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的bmt选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负担(mrd)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，bcma-cs1ccar疗法能够将疾病负担降低到移植前的最低水平或彻底消除mrd，可以预期复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，bcma-cs1ccar疗法可进一步应用于bcma 和/或cs1 多发性骨髓瘤患者，其范围超过骨髓移植桥。bcma-cs1car治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在一些实施例中，bcma-cs1ccart细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或多发性骨髓瘤患者的独立治疗。
在一些实施例中，本发明提供了一种复合car多肽工程细胞，其靶向表达bcma或cs1抗原或两者的细胞。靶细胞可能是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(mgus)和冒烟型骨髓瘤。
令人惊讶的是，il-15/il-15sushi与ccar联合表达可通过提高靶癌细胞的car识别敏感性或向癌细胞招募天然免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在不被理论束缚的情况下，人们相信，il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与bcma-cs1ccar的共表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，il-21或il-21锚与bcma-cs1ccar的共同表达，通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，工程细胞包括bcma-cs1ccar多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.42)以及相应的核苷酸(seqidno.43)。
bcma1-bcma2复合car(bcma1-bcma2ccar)(图38)
大多数b-all在cd19-car-t治疗中可初步缓解，但10％-20％的出现表位丢失而复发。
目前，car技术在多发性骨髓瘤中的应用包括以jameskochenderfer(nih)为首的bcma(cd269)靶向的cart细胞治疗多发性骨髓瘤。那些在bcma-car治疗后处于初始缓解期的患者最终会复发，这可能是由于一些骨髓瘤细胞对bcma的表达暗淡(弱)或阴性。此外，单个car的效力也是消除患者多发性骨髓瘤细胞的一个问题。因此，以car为基础的单一靶点治疗可能不足以预防骨髓瘤复发。
在一个实施例中，抗体识别域包括单克隆抗体的结合变量区域、单链抗体(scfv)。单链抗体包括一种轻链抗体和一种重链抗体。在特定实施例中，抗原识别域由两个不同的重链域(vhh)组成。每个重链结构域与同一抗原或不同抗原的不同表位结合。vhh抗体比整体抗体更稳定和强壮。
在一些实施例中，复合car靶向相同抗原。例如，ccar针对不同的表位或单一抗原的部分。在一些实施例中，复合car中存在的每个car单元针对特定于相同抗原但不同位置的不同表位。
在一些实施例中，复合car靶向一种抗原上的不同表位。
本发明是由一个在具有独立信号结构域的载体中表达两个不相连car单元的单个cart细胞组成，可作为一种新的靶向一种抗原上不同表位的方法，并且有可能避免肿瘤表位跳跃或表位丢失或表位逃逸。一种复合ccar(bcma1-bcma2-ccar)由一个bcma-car(bcma1-car)通过自裂p2a肽连接到另一个bcma-car(bcma2-car)并在t细胞表面表达两个功能性car分子组成。ccar中的两个cars单位都针对同一抗原bcma。
在一个实施例中，工程细胞包括具有bcma抗原识别表位的第一嵌合抗原受体多肽和具有不同bcma识别表位的第二嵌合抗原受体多肽。在一个实施例中，该工程细胞包括seqidno.3的多肽和相应的seqidno.4的多核苷酸。
在本发明中，令人惊讶的是，该bcma1-bcma2ccart细胞在体外表现出强大且特异的抗肿瘤活性，并在体内控制显著的肿瘤生长。我们首次证明，一个2单位的不同car能够在体外有效地靶向一种抗原bcma的两个不同表位，这对更全面的临床结果具有潜在的意义。出乎意料的是，联合使用针对不同表位的复合car靶向多发性骨髓瘤是一种非常有力的策略。这种新的方法由于复合设计的组合压力而避免了由于单个car治疗的选择压力导致的表位逃逸(单个表位丢失或表位跳跃)。
在本发明中，令人惊讶地发现，将表位作为靶点添加到bcma-car中可增强抗肿瘤反应，并降低由于bcma表位丢失而导致多发性骨髓瘤复发的风险。
在一个实施例中，bcma1-bcma2定向治疗作为骨髓移植(bmt)的“桥梁”，或与重型化疗加bmt相结合。bcma1-bcma2ccar可提高bcma抗原识别的敏感性，为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的bmt选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负担(mrd)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，bcma1-bcma2ccar疗法能够将疾病负担降低到移植前的最低水平或彻底消除mrd，可以将复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一些实施例中，本发明提供了一种针对bcma抗原上两个不同表位的复合car多肽工程细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(mgus)和冒烟型多发性骨髓瘤。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为，il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与bcma1-bcma2ccar的共表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不被理论束缚的情况下，人们相信il-21或il-21锚与bcma1-bcma2ccar的共同表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
cd123-cd33复合car(cd123-cd33ccar)
将car成功转化针对aml需要仔细了解该疾病特有的特征。急性髓系白血病的特征是有大量的原始细胞，这些细胞具有高度的侵袭性和快速分裂，形成了疾病的主体。与b细胞恶性肿瘤不同，aml由于其在白血病干细胞(lscs)中的作用而具有独特的治疗挑战性。lscs是一组表达造血干细胞标志物(cd34 cd38-)的细胞，它们能够引发和维持造血恶性肿瘤，产生超过健康骨髓的克隆细胞群。由于lscs大多处于细胞周期的静止期，针对快速分裂的肿瘤群体的化疗使lscs未受影响。最常见的是这种难以捉摸的数量，包括微小残留病(mrd)，并和aml治疗后不可避免的复发有关。成功地将car治疗转化针对aml以彻底消除疾病并确保不再复发需要仔细的抗原选择，这将不仅能够根除大量白血病疾病，而且能够根除白血病干细胞。
cd123-cd33ccar将在不引起car和car相互作用的情况下同时消融cd33 和cd123 细胞。在本例中，一个有用的类比是将aml视为具有叶和根的癌树。虽然叶子构成了疾病的大部分(这些是cd33 aml细胞)，但是修剪这些叶子并不能阻止树的进一步生长，除非你把树从根上拔下来(这些是cd123 cd34 cd38-lsc)。对319例aml患者的研究发现，87.8％的患者表达cd33，因此靶向cd33可能是大多数白血病细胞。然而，用吉妥珠单抗治疗的患者，一种与卡利霉素相关的抗cd33抗体疗法，可能由于获得性卡利霉素耐药而复发cd33 aml。因此，在靶向cd33消除大多数疾病的同时，耐药lscs也必须靶向，否则会复发。这可以通过靶向cd123来实现，与健康造血干细胞相比，cd34 cd38-lsc上的cd123过度表达。考虑到97.2％的aml患者至少表达这两个靶点中的一个，因此靶向cd123和cd33可以消除大多数患者的所有癌细胞，提高治疗效果并根除癌树。
aml是一种进展迅速的血癌，约占儿童急性白血病的15-20％，占成人急性白血病的80％。目前，患者仍采用大剂量多药化疗和造血干细胞移植治疗。尽管这些强化治疗往往伴随着相当大的毒性甚至死亡，但约60-70％的aml患者仍因获得性治疗抵抗或lsc复发而复发。此外，aml的5年生存率仍保持在令人沮丧的27％。然而，有有限的临床试验试图使用car治疗am。
本发明由单个cart细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达两个不相连的car单元，可作为一种新的靶向多抗原和潜在地避免肿瘤复发的方法。一种复合car(ccar)，包括cd123car，其通过自裂p2a肽连接到cd33car，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。
在本发明中，令人惊讶地发现，该cd123-cd33ccart细胞在体外表现出强大和特异的抗肿瘤活性，并在体内控制显著的肿瘤生长。我们首次证明，一个2单位的不同的car能够在体外有效地靶向两种抗原，对更全面的临床结果具有潜在的意义。出乎意料的是，通过靶向aml的复合car,靶向cd123和cd33联合是一个非常有力的战略。这种新的方法避免了与lscs相关的疾病复发，由于复合设计的组合压力，避免了由于单个car治疗的选择压力而导致的抗原逃逸(单个抗原的丢失)。
在本发明中，令人惊讶的是，在cd33car中添加cd123作为靶点，通过消除白血病细胞及其根源lscs来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。这样可以更彻底地清除癌细胞，通过消除生长缓慢的lsc和增殖性白血病细胞来减少疾病复发。
在本发明中，令人惊讶地发现，cd123-cd33ccart细胞能够清除常规白血病细胞和白血病前体细胞，从而降低复发风险，增强抗肿瘤活性。
在本发明中，还令人惊讶地发现cd123-cd33ccart细胞在产生抗性之前，通过同时打击多个靶点来减少抗原逃逸，更彻底地消除癌细胞。
在一个实施例中，cd123-cd33ccart细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或检查点封锁(包括但不限于pd-l1、ctla-4抑制剂)或作为包括但不限于急性髓性白血病、骨髓增生异常综合征，慢性粒细胞白血病和慢性骨髓增生性疾病的疾病患者的独立治疗。
在另一实施例中，cd123-cd33ccart细胞疗法可用于将疾病负担降至移植前的最低水平或彻底消除mrd，预期可以将复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，cd123-cd33ccart细胞治疗可进一步应用于cd123 和/或cd33 白血病患者的骨髓移植桥之外的患者。cd123-cd33ccart细胞治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在不被理论束缚的情况下，人们相信il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与cd123-cd33共表达ccar通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，il-21或il-21锚与cd123-cd33ccar的共同表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或向癌细胞招募先天性免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，工程细胞包括cd123-cd33ccar多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.34)以及相应的核苷酸(seqidno.35)。
cll-1-cd33复合car(cll-1-cd33ccar)
ccar包含两个cars单位，cll-1car和cd33car靶向肿瘤细胞，分别表达cll-1和cd33。cd33bcar和cll-1car用于构建图92所示的ccar版本。该结构包括一个sffv启动子，该启动子驱动由p2a肽连接的cars的多个模块单元的表达。连接蛋白裂解后，ccars分裂并与表达cd33和cll-1的靶结合。该结构的激活域包括cd33b(cd33)car单元上的4-1bb和cll-1car单元上的cd28。cd33b-cll-1ccar的目的是清除包括白血病干细胞在内的髓系白血病细胞。
目前，mds、mpn(慢性骨髓增生性肿瘤)和aml的治疗主要集中在白血病细胞上，因为它们量非常大，并且清楚地代表了患者最直接的问题。重要的是，白血病干细胞(lscs)与大多数其他白血病细胞(“blast”细胞)截然不同，它们构成了一个罕见的亚群。虽然杀死肿瘤细胞以提供短期缓解，但lsc如果没有被破坏，总是会重新生长，导致患者复发。为了实现mds疾病的持久治疗，必须销毁lsc。不幸的是，标准药物方案对mds、mpn或aml-lscs无效。因此，开发新的治疗方法，特别是针对白血病干细胞群体和庞大的白血病群体是至关重要的。本发明中公开的复合car针对两种群，并在此实施。
在本发明的一个方面中，cll-1抗原是ccar治疗的靶点之一。c型凝集素样-1(cll-1)又称为micl、clec12a、clec-1和dcal2。cll-1是一种糖蛋白受体，在造血细胞中表达。cll-1不存在于未定型的cd34 /cd38-或cd34 /cd33-干细胞上，但存在于cd34 /cd38 或cd34 /cd33 祖细胞的亚群上(bakker等，2004)。此外，cll-1在其他组织中不表达。
cll-1在急性髓系白血病(aml)细胞和白血病干细胞中表达。cll-1在多种白血病中均有表达，包括骨髓单核细胞白血病(m4)、急性单核细胞白血病(m5)、急性早幼粒细胞白血病(m3)、慢性髓系白血病(cml)、慢性髓系增生性肿瘤和骨髓增生异常综合征(mds)。
cll-1在白血病干细胞(lscs)相关的白血病细胞亚群中表达，其的消除对预防疾病的难治性和复发至关重要。
cd33(siglec-3)是一种髓系特异性抗原，在早期髓系祖细胞、多数单核细胞和约90％的aml细胞上表达，但在正常hscs上不表达。
在本发明的一个方面中，cd33抗原是ccar治疗的靶点之一。cd33是一种跨膜受体，在急性髓系白血病90％的恶性细胞中均有表达。因此，根据本发明，从安全的角度来看，cll-1和cd33靶抗原特别具有吸引力。
根据本发明，复合cll-1-cd33ccars可能是治疗慢性粒细胞白血病(cml)人群的高效药物。在慢性粒细胞白血病(cml)中，有一种罕见的细胞亚群是cd34 cd38-。这个群体被认为是由lscs组成的。lscs数量的增加与疾病的进展有关。小分子bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂(tki)能显著提高cp-cml患者的总生存率。然而，lscs被认为对tki治疗有抵抗力。治疗cml急需一种针对cml耐药lscs的新疗法，该新疗法体现在本发明公开的复合cd33cll-1car中。cll-1在cd34 cd38群中高表达。根据本发明，复合cd33cll-1cars对于该群的治疗是高效的。
在本发明的一个实施例中，在ccar中同时表达cd33和cll-1的白血病细胞被用作治疗。cd33在髓系细胞、髓系白血病细胞和成熟单核细胞中表达，但在正常多能干细胞中不表达。cd33在cml、骨髓增生性肿瘤和mds的白血病细胞中广泛表达。
由于大量急性髓系白血病(aml)患者对标准化疗方案难以耐受或治疗后出现疾病复发(burnett2012)，因此开发针对aml的cart细胞免疫疗法有可能满足巨大的临床需求。在大多数患者中，白血病细胞同时表达cll-1和cd33，这使得本文所揭示的复合cll-1-cd33ccar具有广泛的临床适用性。因此，本发明公开了一种新的多ccart/nk细胞结构，其包含多个靶向多个白血病相关抗原的car，从而通过共刺激结构域激活的协同效应来抵消抗原逃逸机制，靶向白血病细胞，包括白血病干细胞，从而提供更有效的，安全有效的治疗。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种根除或杀死表达cll-1或cd33或两者的白血病干细胞(lscs)或大量白血病细胞的方法。在本实施例中，向有需要的患者施用具有cd33单元和cll-1单元的t或nk工程细胞。
在进一步的实施方案中，t或nk细胞中的复合car可用于根除或杀死cd34 cd38-白血病干细胞或表达cll-1或cd33或两者的大量白血病细胞。
本发明还公开了一种复合car结构物，其具有增强的抗肿瘤活性，抗共表达靶抗原的细胞的效力，但对仅表达一种抗原的肿瘤细胞保持敏感性。此外，该复合car的每个car包括一个或两个共刺激域，并且在特定目标的存在下表现出强大的杀伤能力。
在本发明中，令人惊讶地发现，cll-1-cd33ccart细胞能够清除常规白血病细胞和白血病前体细胞，以降低复发风险，并增强抗肿瘤活性。
在本发明中，还令人惊讶地发现，cll-1-cd33ccart细胞更彻底地消除癌细胞，在产生抵抗力之前，通过同时靶向多个靶点来减少抗原逃逸。
在一个实施例中，cll-1-cd33ccart细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或检查点阻断(包括但不限于pd-l1、ctla-4抑制剂)或作为包括但不限于急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征，慢性粒细胞白血病和慢性骨髓增生性疾病的疾病患者的独立治疗。
在另一实施例中，cll-1-cd33ccart细胞治疗可用于将移植前肿瘤负荷降至最低水平或彻底消除mrd，可以使复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，cll-1-cd33ccart细胞治疗可进一步应用于cll-1 和/或cd33 白血病患者的骨髓移植桥之外的患者。cll-1-cd33ccart细胞治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在不被理论束缚的情况下，人们相信il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与cll-1-cd33ccar的共表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，il-21或il-21锚白与cll-1-cd33ccar的共同表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，工程细胞包括cll1-cd33ccar多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.60)以及相应的核苷酸(seqidno.61)。
在一个实施例中，工程细胞包括cll-1car多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.44)和相应的核苷酸(seqidno.45)。
在一个实施例中，所述工程细胞包括cd33car多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.20)及相应核苷酸(seqidno.21)。
cd123-nkg2dccar或cll-1-nkg2dccar或cd33-nkg2dccar或bcma-nkg2dccar
nkg2d(nkg2d受体)是一种跨膜蛋白，属于c型凝集素样受体cd94/nkg2家族。nkg2d可以与至少8种不同的配体结合，这些配体在aml、多发性骨髓瘤或其他白血病中自然表达。nkg2d配体是诱导的自身蛋白，在正常细胞表面几乎不存在或仅以极低水平存在，但在癌细胞(包括aml和多发性骨髓瘤)中过度表达。因此，他们是很好的car目标候选。
ccar包含两个cars单元：cd123-car和nkg2d-car，它们分别靶向表达cd123和nkg2d配体的肿瘤细胞。
ccar包含两个cars单元，cll-1car和nkg2dcar，它们分别靶向表达cll-1和nkg2d配体的肿瘤细胞。
cd123-nkg2d-ccar或cll-1-nkg2d-ccar或cd33-nkg2d-ccar均能消除白血病，包括aml、mds、cml和mpn。
在本发明中，bcma-nkg2dccar能够消除多发性骨髓瘤。
在本发明中，将nkg2d作为靶点添加到cd123-car或cll-1-car或cd33-car中可增强抗肿瘤反应并降低与疾病复发相关的抗原逃逸风险，因为nkg2d在aml、mds、cml和mpn中广泛表达。
bcma和nkg2d配体均广泛表达于多发性骨髓瘤细胞，这种高表达使bcma-nkg2d-ccar能够全面覆盖所有潜在的癌细胞。在抗性产生前，通过对多个靶点同时猛烈打击，以减少抗原逃逸使癌细胞更彻底的消除。
bcma-cd38复合car(bcma-cd38ccar)
目前，car技术在多发性骨髓瘤中的应用包括使用靶向bcma(cd269)的cart细胞对抗由jameskochenderfer(nih)领导的大量疾病。那些在bcma-car治疗后病情缓解的患者最终会复发，这可能是由于一些骨髓瘤细胞对bcma呈弱(弱)或阴性表达。因此，以car为基础的单一靶点治疗可能不足以预防骨髓瘤复发。
cd38又称环状adp核糖水解酶，是一种糖蛋白，存在于许多免疫细胞表面，包括cd4 、cd8 、b淋巴细胞、浆细胞和自然杀伤细胞。
cd38是骨髓瘤的另一个良好靶点，因为它在骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞中的表达通常很高且均匀。
本发明是由单个cart细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达2个不同的car单位，可作为靶向多抗原和潜在避免肿瘤复发的新方法。一种复合car(ccar)，包括bcma-car，该bcma-car通过自裂p2a肽连接到cd38-car，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。这种复合ccar的表达由一个强启动子sffv控制，以确保car的充分表达。
在本发明中，bcma-cd38ccart细胞可在阻止骨髓瘤恶化中提供有效且特异的抗肿瘤活性(图37)。以bcma和cd38为靶点的复合car联合治疗多发性骨髓瘤是一种非常有效的治疗策略。这一新的方法,由于复合设计的组合压力，避免了因单一car治疗的选择压力，使抗原逃逸(单一抗原的损失)。
在本发明中，将cd38作为靶点添加到bcma-car中，通过消除存活的bcma-cd38 骨髓瘤细胞来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。
bcma和cd38都广泛表达于多发性骨髓瘤细胞，这种高表达使得bcma-cd38ccar能够全面覆盖所有潜在的癌细胞。在抗性产生前，通过对多个靶点同时猛烈打击，以减少抗原逃逸，这使癌细胞更彻底的消除。
在一个实施例中，bcma-cd38引导的bcma-cd38ccar疗法是骨髓移植(bmt)的“桥梁”，或是与重型化疗加bmt相结合。bcma-cd38ccar可以为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的bmt选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负荷(mrd)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，bcma-cd38ccar疗法能够将疾病负荷降低到移植前的最低水平或彻底消除mrd，可以预期复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，bcma-cd38ccar疗法可在bcma 和/或cd38 多发性骨髓瘤患者的骨髓桥移植之外有进一步的应用。bcma-cd38ccar治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在一些实施例中，本发明提供了一种复合car多肽工程细胞，其靶向表达bcma或cd38抗原或两者的细胞。靶细胞可能是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(mgus)和冒烟型多发性骨髓瘤。
令人惊讶的是，il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与bcma-cd38ccar的共表达通过提高靶癌细胞的car识别敏感性或向癌细胞招募先天免疫细胞，提供长期持久的疾病缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为，il-21或il-21锚与bcma-cd38ccar的共同表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在一个实施例中，工程细胞包括bcma-cd38ccar多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.40)和相应的核苷酸(seqidno.41)。
在不受到理论约束的情况下，人们相信，bcma-cd38复合car工程细胞通过消耗与自身免疫性疾病相关的b细胞和浆细胞，为患有自身免疫性疾病或器官排斥的患者提供更好的治疗结果。
在一些实施例中，负荷car(bcma-cd38ccar)靶向表达bcma或cd38抗原或两者的细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如，但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(mgus)和冒烟型多发性骨髓瘤。
bcma-cd38ccar靶向细胞是自身免疫性疾病患者的b细胞、未成熟b细胞、记忆b细胞、浆细胞、长寿浆细胞或浆细胞。自身免疫性疾病包括系统性硬皮病、多发性硬化、银屑病、皮炎、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿关节炎、干燥综合征、多发性肌炎、肺泡蛋白沉积症、肉芽肿和血管炎，艾迪生病、抗原抗体复合物介导的疾病和抗肾小球基底膜疾病。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。自身免疫性疾病选自一组疾病，包括系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化(ms)、炎症性肠病(ibd)、类风湿性关节炎、
复合cd123-cll-1
与b细胞和浆细胞恶性肿瘤不同，由于白血病干细胞(lscs)的作用，aml的治疗具有独特的挑战性。lscs是一组造血干细胞标志物(cd34 cd38-)表达的细胞，它们能够引发和维持造血恶性肿瘤，产生超过健康骨髓的克隆细胞群。由于lscs大多处于细胞周期的静止期，针对快速分裂的肿瘤群体的化疗使lscs未受影响。通常，这种难以捉摸的群只有极少的残留疾病(mrd)，并导致aml治疗后不可避免的复发。药成功地将car治疗转为aml，以彻底消除疾病并确保不会复发，将需要仔细的抗原选择，以便不仅能够根除大量白血病疾病，而且能够根除白血病干细胞。
最近，在治疗先前难治性和复发性b细胞恶性肿瘤方面，单car疗法在获得高缓解率方面取得了突破性进展。相反，aml缺乏新的治疗方法，而car疗法提供了希望的灯塔。尤其是，将复合car疗法应用于aml，有可能彻底改变aml的治疗方法。
cd123和c型凝集素样分子-1(cll-1)存在于aml患者的cd34 cd38-细胞中。在不被理论束缚的情况下，人们认为，复合car提出了这样一种想法，即编码两个不相连car单元的单个t细胞可以同时更广泛地瞄准和消灭lscs，防止疾病复发。
本发明由单个cart细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达两个不相连的car单元，可作为靶向多种抗原和潜在避免肿瘤复发的新方法。一种复合car(ccar)由一个cd123-car通过一个自裂解的p2a肽连接到一个cll-1-car并在t细胞表面表达两个功能性car分子组成。
在一个实施例中，cd123-cll-1ccart细胞治疗可发展为“移植桥”、化疗的补充或检查点阻断(包括但不限于pd-l1、ctla-4抑制剂)或作为包括但不限于急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征的疾病患者的独立治疗，慢性粒细胞白血病和慢性骨髓增生性疾病。
在另一实施例中，cd123-cll-1ccart细胞治疗可用于彻底消除mrd。可以预期，复发率将降低，长期无病生存率将提高，患者预后将显著改善。
在一个实施例中，cd123-cll1ccart细胞治疗可进一步应用于cd123 和/或cll-1 白血病患者的骨髓移植桥之外的患者。cd123-cll-1ccart细胞治疗可作为独立治疗或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为，il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与cd123-cdll-1ccar的共表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不受到理论约束的情况下，人们认为il-21或il-21锚与cd123-cll-1ccar的共同表达通过增加靶癌细胞对car识别的敏感性或通过将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
用于t细胞恶性肿瘤的复合cd38cars
本发明内容由在具有独立信号传导域的载体中表达两个不相连的car单元的单个t细胞组成，其可以用作靶向多种抗原并潜在地避免肿瘤复发的新颖方法。基于cd38的复合car(ccar)由cd4car或cd5car或cd3car或cd7car组成，该cd4car或cd7car通过自身裂解的p2a肽与cd38car连接，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。
本发明内容由在具有独立信号传导域的载体中表达两个不相连的car单元的单个nk细胞组成，其可以用作靶向多种抗原并潜在地避免肿瘤复发的新颖方法。基于cd38的复合car(ccar)由cd4car或cd5car或cd3car或cd7car组成，该cd4car或cd7car通过自身裂解的p2a肽与cd38car连接，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。
不受到理论的束缚，据信基于cd38的复合ccart或nk细胞能够消除t细胞淋巴瘤/白血病细胞，从而降低由于抗原逃逸而复发的风险并增强抗肿瘤活性。
包含cd4car的cd4-cd38化合物car(ccar)通过自切割的p2a肽与cd38car连接，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。
包含cd5car的cd5-cd38化合物car(ccar)通过自切割p2a肽与cd38car连接，并在t细胞表面表达两个功能性car分子。
在一个实施方案中，工程细胞包括cd5-cd38嵌合抗原受体多肽(seqidno.18)和相应的核苷酸(seqidno.19)。
包含cd4car的cd7-cd38复合car(ccar)通过自裂解的p2a肽与cd38car连接，并在t细胞表面表达两个功能性car分子。
cd56-cd38cars用于淋巴瘤/白血病
cd56是一种糖蛋白，起神经细胞粘附分子的作用。抗原在nk细胞上表达。cd56或cd38通常存在于以下情况中：1)侵袭性nk细胞白血病/淋巴瘤，2)结外nk/t淋巴瘤(鼻型)，肝上腺t细胞淋巴瘤和4)慢性nk细胞淋巴瘤。
像cd38一样，cd56也可以在非血液细胞(如脑细胞)中表达。对于仅接受cd56或cd38cart细胞治疗的患者，脱靶效应将很严重。
不希望被理论所束缚，含有两个car和靶向不同抗原的复合ccart细胞与含有ccar靶向的两种抗原的细胞的结合亲和力比单一ccar靶向抗原的细胞高。因此，人们认为复合的car-t细胞比单一的car-t细胞具有更高的抗肿瘤能力。因此，申请人惊奇地发现，当使用基于复合car细胞的疗法时，脱靶效应大大降低。
cd56是一种糖蛋白，起神经细胞粘附分子的作用。抗原在nk细胞上表达。像cd38一样，cd56也可以在非血液细胞(如脑细胞)中表达。对于接受cd56car或cd38cart细胞治疗的患者，脱靶效应将很严重。因此，本发明公开提供了一种产生cd56-cd38ccar以减少与单独使用cd56car或cd38car相关的脱靶效应的缺陷的方法。
本发明由在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散car单元的单个t细胞组成，该t细胞可以用作同时靶向cd56和cd38并潜在地避免肿瘤复发的新方法。cd56-cd38复合car(ccar)带有通过自裂解p2a肽与cd38car连接的cd56car，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。
本发明由在具有独立信号传导域的载体中表达两个离散car单元的单个t细胞组成，该t细胞可以用作同时靶向cd56和cd38并潜在地避免肿瘤复发的新方法。cd56-cd38复合car(ccar)带有通过自裂解p2a肽与cd38car连接的cd56car，并在nk细胞表面表达两种功能性car分子。
cd19-cd38复合car(cd19-cd38ccar)
虽然使用cd19car的b-all患者的初始缓解率约为90％，但大多数患者在一年内复发。复发至少一部分是由于抗原逃逸。因此，迫切需要更有效的car-t细胞治疗来预防复发
cd38是淋巴瘤的另一个良好靶点，因为它在淋巴瘤细胞中的表达通常很高且均匀。cd38在多种淋巴瘤中表达，包括慢性淋巴细胞性淋巴瘤/小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤。
本发明是由单个cart细胞组成，在具有独立信号结构域的载体中表达两个离散car单元，可作为一种新的靶向多抗原和潜在地避免肿瘤复发的方法。一种复合car(ccar)，包括cd19-car通过自裂p2a肽连接到cd38-car，并在t细胞表面表达两种功能性car分子。这种复合ccar的表达由一个强启动子sffv控制，以确保car的充分表达。
在本发明中，cd19-cd38ccart细胞可在阻止淋巴瘤恶化中提供有效且特异的抗肿瘤活性。以bcma和cd19为靶点的复合car联合治疗多发性骨髓瘤是一种非常有效的治疗策略。由于来自复合设计的组合压力，这种新颖的方法避免了单一car处理选择压力下的抗原逃逸(单个抗原的丢失)。
在本发明中，将cd38作为靶点添加到bcma-car中，通过消除存活的bcma-cd38 淋巴瘤来增强抗肿瘤反应，以降低复发的风险。
cd19和cd38均广泛表达于多发性骨髓瘤细胞，这种高表达使cd19-cd38-ccar能够全面覆盖所有潜在的淋巴瘤细胞。通过在抗药性产生之前对多个靶标同时攻击，可以更彻底地消除癌细胞，减少抗原逃逸。
在一个实施例中，cd19-cd38导向的bcma-cd38ccar疗法是骨髓移植(bmt)的“桥梁”，或与重型化疗加bmt相结合。cd19-cd38ccar可为许多先前可能有残留疾病的患者提供一条可能治愈的bmt选择途径。目前的文献支持这样的观点：将最小残留疾病负荷(mrd)降低到一个无法检测的水平可能与改善患者的预后相关。这对于预防难治和高度侵袭性恶性肿瘤的复发极为有益。
在另一个实施例中，cd19-cd38ccar治疗能够在移植前将疾病负荷降低到最低水平或彻底消除mrd，可以预期复发率将降低，淋巴瘤的长期无病生存率将提高，患者的预后将显著改善。
在一个实施例中，cd19-cd38-ccar疗法可在骨髓移植桥以外的cd19 和/或cd38 多发性骨髓瘤患者中有进一步的应用。cd19-cd38ccar治疗作为独立治疗，或作为患者个体化免疫化疗方案的一部分。对于老年患者或不能耐受高强度化疗或骨髓移植的合并症患者，这可能是延长患者生存时间和保留更好生活质量的一个有希望的策略。
在一些实施例中，本发明提供了一种复合的car多肽工程细胞，其靶向表达cd19或cd38抗原的细胞或两者。靶细胞可能是癌细胞，例如但不限于淋巴瘤。在进一步实施例中，淋巴瘤选自无限制性、b-all、高级别b细胞淋巴瘤、低级别b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、burkett淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、cll、边缘区b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤。
在不希望被理论束缚的情况下，人们认为il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与cd19-cd38ccar的共表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到癌细胞中来为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，人们相信il-21或il-21锚与cd19-cd38ccar的共同表达通过增加靶癌细胞的car识别敏感性或向癌细胞招募先天性免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，人们相信，cd19-cd38复合car工程细胞通过消耗与自身免疫性疾病相关的b细胞和浆细胞，为患有自身免疫性疾病或器官排斥反应的患者提供更好的治疗结果。
在一些实施例中，复合car(bcma-cd38ccar)靶向表达bcma或cd38抗原或两者的细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如，但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨浆细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(mgus)和冒烟型多发性骨髓瘤。
bcma-cd38ccar靶向细胞是自身免疫性疾病患者的b细胞、未成熟b细胞、记忆b细胞、浆细胞、长寿浆细胞或浆细胞。自身免疫性疾病包括系统性硬皮病、多发性硬化、银屑病、皮炎、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿关节炎、干燥综合征、多发性肌炎、肺泡蛋白沉积症、肉芽肿和血管炎，艾迪生病、抗原抗体复合物介导的疾病和抗肾小球基底膜疾病。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。自身免疫性疾病选自一组疾病，包括系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化(ms)、炎症性肠病(ibd)、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、视神经脊髓炎(nmo)、nmo谱系障碍(nmosd)，特发性血小板减少性紫癜(itp)、与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多脉管炎(mpa)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ancas)、肉芽肿伴多脉管炎(gpa)、韦格纳肉芽肿、寻常天疱疮(pv)和叶状天疱疮(pf)相关。寻常型天疱疮(pv)和叶状天疱疮(pf)是由自身抗体引起的慢性、危及生命的水疱性疾病。
bcma-cd19复合car(bcma-cd19ccar)
虽然杀死多发性骨髓瘤细胞可以提供短期缓解，但lscs(骨髓瘤白血病干细胞)如果不被破坏，总是会重新生长，导致患者复发。必须破坏lscs，以实现多发性骨髓瘤疾病的持久治疗。在不希望受到理论约束的情况下，人们认为，一小部分多发性骨髓瘤细胞是cd19阳性的干细胞，与疾病的进展和复发有关，而大量的骨髓瘤细胞群是bcma阳性。因此，开发新的治疗方法，特别是针对骨髓瘤干细胞群体和庞大的骨髓瘤群体是至关重要的。本发明中的复合car以多发性骨髓瘤细胞的bcma 和/或cd19 阳性群为靶点，并在这里实现。
在一些实施例中，本发明提供了一种根除或杀死表达cd19和/或bcma的骨髓瘤干细胞(lscs)或大量骨髓瘤细胞的方法。在本实施例中，向需要的患者施用具有bcma单元和cd19单元的t或nk工程细胞。
在一些实施例中，公开的公开内容包括使用bcma-cd19ccar消除多发性骨髓瘤中bcma和cd19群体以防止复发的方法和组成。当bcma和cd19(bcma-cd19)的两个单位在一个载体或一个细胞中结合在一起时，car在清除骨髓瘤细胞方面更为强大。
在进一步的实施方案中，t或nk细胞中的复合carbcma-cd19ccar可用于根除或杀死bcma cd19 或bcma cd19-或bcma-cd19 种群。
在一些实施例中，本发明的公开内容包括使用bcma-cd19ccar消除多发性骨髓瘤中bcma和cd19群体以防止复发的方法和成分。当两个bcma和cd19(bcma-cd19)单位在载体或细胞中结合在一起时，car清除骨髓瘤细胞的能力更强。
在一些实施方案中，cd19 群体可以是多发性骨髓瘤细胞的早期前体，而cd19-bcma 细胞可以是分化程度更高的恶性多发性骨髓瘤细胞。在一些实施例中，本发明包括使用bcma-cd19bccar(bcma-cd19ccar的一个版本)t或nk细胞消除多发性骨髓瘤细胞的早期前体和更具差异性的恶性多发性骨髓瘤细胞的方法和成分。在另一实施例中，所公开的公开内容包括使用bcma-cd19bccart或nk细胞靶向早期前体和更具分化的恶性细胞以完全消除多发性骨髓瘤恶性克隆的方法和成分。
本发明还公开了一种复合car结构物，其具有增强的抗骨髓瘤细胞活性对抗共表达靶抗原的细胞的效力，但对仅表达一种抗原的肿瘤细胞保持敏感性。此外，该复合car的每个car包括一个或两个共刺激域，并且在特定目标的存在下表现出强大的杀伤能力。
在不希望被理论束缚的情况下，人们相信il-15/il-15sushi或il-15/il-15sushi锚或4-1bbl与bcma-cd19ccar的共表达通过增加靶骨髓瘤细胞的car识别敏感性或向骨髓瘤细胞招募先天免疫细胞，为患者提供长期持久的缓解。
在一些实施例中，复合car(bcma-cd19ccar)靶向表达bcma或cd19抗原或两者的细胞。靶细胞可以是癌细胞，例如，但不限于淋巴瘤、白血病或浆细胞肿瘤。在进一步的实施方案中，浆细胞肿瘤选自浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、重链疾病、淀粉样变性、waldestrom巨球蛋白瘤、重链疾病、孤立性骨浆细胞瘤、未定性的单克隆免疫球蛋白病(mgus)和冒烟型多发性骨髓瘤。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为il-21或il-il-21锚与bcma-cd19-ccar的共同表达通过增加靶向骨髓瘤细胞的car识别敏感性或将先天免疫细胞招募到骨髓瘤细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为il-18或il-il-18锚与bcma-cd19ccar的共同表达通过增加靶向骨髓瘤细胞的car识别敏感性或将固有免疫细胞招募到骨髓瘤细胞中，为患者提供长期持久的缓解。
在一些实施例中，本发明提供了通过向患者施用car或复合car(bcma-cd19ccar)t细胞或nk细胞来消耗清除自身免疫性疾病患者中的b细胞、未成熟b细胞、记忆b细胞、浆母细胞、长寿血浆细胞或血浆细胞的方法。
bcma-cd19ccar靶向清除细胞是自身免疫性疾病患者的b细胞、未成熟b细胞、记忆b细胞、浆细胞、长寿浆细胞或浆细胞。自身免疫性疾病包括系统性硬皮病、多发性硬化、银屑病、皮炎、炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿关节炎、干燥综合征、多发性肌炎、肺泡蛋白沉积症、肉芽肿和血管炎，艾迪生病、抗原抗体复合物介导的疾病和抗肾小球基底膜疾病。
在一些实施例中，自身免疫性疾病患者中的免疫细胞包括b细胞、未成熟b细胞、记忆b细胞、浆母细胞、长寿浆细胞或浆细胞可被bcma和cd19双特异性cart细胞或双特异性抗体消除。
在另一实施例中，本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的方法。自身免疫性疾病选自一组疾病，包括系统性红斑狼疮(sle)、多发性硬化(ms)、炎症性肠病(ibd)、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、视神经脊髓炎(nmo)、nmo谱系障碍(nmosd)，特发性血小板减少性紫癜(itp)、与系统性自身免疫性小血管血管炎综合征或显微镜下多脉管炎(mpa)相关的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ancas)、肉芽肿伴多脉管炎(gpa)、韦格纳肉芽肿、寻常天疱疮(pv)和叶状天疱疮(pf)相关。
器官移植代表一个人的新生命，可以移植的器官包括肾脏、心脏、肺、胰腺和肠。然而，许多患者由于预先存在或后天得到了针对供者抗原(如人类白细胞抗原(hla))的供者特异性抗体而无法获得潜在的救生的器官。因此，患者可能会失去捐赠的器官。目前，抗体介导的排斥反应的治疗方法很少，而有效治疗抗体介导的排斥反应在这一领域的巨大需求尚未得到满足。使用cart/nk细胞去除b细胞或浆细胞或两者，可为抗体介导的排斥反应提供治疗。
bcma-cd19-ccar或cd19-cd38-ccar或bcma-cd38-ccar靶向细胞为b细胞、未成熟b细胞、记忆b细胞、浆母细胞、长寿血浆细胞或血浆细胞，患者的抗体介导的排斥反应与器官排斥反应相关。
含有car多肽和增强子的工程细胞
在另一实施例中，本发明提供了一种具有至少一种嵌合抗原受体多肽和增强子的工程细胞。
在另一实施例中，本发明提供了一种具有至少一种嵌合抗原受体多肽和至少一种增强子的工程细胞。
在一个实施例中，本发明提供具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽和增强子的工程细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种工程细胞，其具有至少两种不同的嵌合抗原受体多肽和至少一种增强子。
如本文所用，增强子包括促进或增强具有嵌合抗原受体多肽的工程细胞活性的生物分子。促进剂包括细胞因子。在另一实施例中，增强剂包括il-2、il-7、il-12、il-15、il-18、il-21、il-21锚、pd-1、pd-l1、csf1r、ctal-4、tim-3和tgfrβ、其受体及其功能片段。
增强子可以由本文所述的工程细胞表达并显示在工程细胞的表面上，或者增强子可以由工程细胞分泌到周围的细胞外空间。表面显示和分泌的方法在本领域中是众所周知的。例如，增强子可以是一种融合蛋白，其具有提供表面展示或向细胞外空间分泌的肽。
增强子的作用可由诸如增强子受体及其功能片段等附加因子来补充。附加因子可以作为融合蛋白与增强子共同表达，或者作为单独的多肽表达并分泌到细胞外空间。
促进剂可以是由工程化的car细胞分泌的细胞因子，设计用于与car多肽共同表达。当同源抗原与car结合时发生大量释放。肿瘤细胞周围的炎性细胞与肿瘤细胞的进展和转移密切相关。炎性细胞包括t细胞和nk细胞、巨噬细胞、树突状细胞等天然免疫应答细胞，它们的增殖和抗肿瘤活性受细胞因子的调控。像cart或nk细胞这样的car细胞与靶向癌细胞结合，并通过cart/nk细胞的扩张触发大量的增强子分泌。分泌的促进剂能有效地促进癌细胞免疫应答细胞的存活、分化和活化。增强子与car的共表达可以补充cart或nk细胞不能消除非靶向癌细胞的缺陷
car细胞可以作为细胞因子的载体，通过car细胞将细胞因子传递到靶向肿瘤部位，用大剂量外源性细胞因子降低全身毒性。
为了提高car细胞的持续存活率或长期存活率，可以将膜结合增强因子与car共表达以提高car的持续性
在一个实施例中，增强子为il-15。在这种情况下，上述附加因子是il-15受体及其功能片段。功能片段包括il-15受体、il-15ra和il-15ra(il-15sushi)的sushi结构域。可溶性il-15ra或il-15sushi通过防止il-15降解而显著增强il-15的功能活性。可溶性il-15/il-15ra或il-15/il-15sushi复合物在体内比单独的il-15更稳定和刺激。
在一个实施例中，il-15作为融合蛋白与il-15受体il-15ra和il-15ra的sushi结构域(il-15sushi)中的至少一个共同表达。在一个实施例中，il-15受体il-15ra或il-15ra的sushi结构域(il-15sushi)位于il-15的n-末端。在另一实施例中，il-15受体il-15ra或il-15ra的sushi结构域(il-15sushi)位于il-15的c-末端。如本文所用，il-15/il-15sushi表示il-15sushi在融合蛋白中位于il-15的c-末端；il-15sushi/il-15表示il-15sushi在融合蛋白中位于il-15的n-末端。
在一些实施例中，il-15和il-15受体或其多肽的功能片段位于单个多肽分子上并由肽连接物分离，肽连接物可为1-25个氨基酸残基、25-100个氨基酸残基或50-200个氨基酸残基。该连接器可包括本文所述的高效解理位点。
白细胞介素(il-15)及其特异性受体链il-15rα(il-15-ra)在nk、cd8t细胞等多种效应细胞中发挥着重要的作用。cd8 t细胞可被修饰以表达自分泌生长因子，包括但不限于il-2、il-7、il-21或il-15，以维持体内移植的存活。在不希望被理论束缚的情况下，人们认为il-15可以克服cd4缺陷，诱导原代和回忆记忆性cd8t细胞。il-15-ra或il-15-il-ra融合物在cd8t细胞上的过表达显著提高了其在体内外的存活和增殖。在一些实施例中，cd4-car或cd3-car或cd5-car或cd20-car、cd33-car、cll-1或cd123-car、cd19-car或cd45-car或gd2-car、bcma-car或任何car与il-15、il15ra和il-15/il-15ra或il15-ra/il-15或il-15/il-15sush中的至少一个或其部分或组合共同表达，以增强cart或nk的存活或增殖，并改善记忆carcd8 t细胞或nk细胞的扩增。
cd4-car或cd7-car、cd3-car或cd5-car或cd20-car、cd33-car、cll-1或cd123-car、cd19-car或gd2-car或cd45-car或bcma-car或与il-15/il-15sushi或其一部分或组合中的至少一种共同表达的任何car，以增强carnk的存活或增殖，并改善记忆car车cd8 t细胞的扩张。
令人惊讶的是，il-15/il-15sushi的car共表达对t细胞和nk细胞靶向肿瘤细胞的持久性和活性增强具有重要意义。
令人惊讶的是，car共表达il-15/il-15sushi对t细胞或nk-t细胞、nk细胞靶向肿瘤细胞和预防肿瘤复发具有重要意义。
令人惊讶的是，当与il-15/il-15共表达时，car-nk细胞或nk细胞可以延长生存期。
本发明提供了一种工程细胞，其具有如本文所述的car多肽以及il-15、il-15ra、il-15sushi、il-15/il-15ra、il-15-ra/il-15、il-15/il-15sushi、il-15sushi/il-15中的至少一种及其组合，提高肿瘤患者的生存率、持续性或增殖性。
在一个实施例中，工程细胞包括cd5嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.48)以及相应的核苷酸(seqidno.49)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd4嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.22)以及相应的核苷酸(seqidno.23)。
在一个实施例中，所述工程细胞包括cd4嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.20)及相应核苷酸(seqidno.21)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd3嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.18)和相应核苷酸(seqidno.19)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd19嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.24)以及相应的核苷酸(seqidno.25)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd19嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.26)和相应核苷酸(seqidno.27)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd33嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.30)和相应核苷酸(seqidno.31)。
在一个实施例中，所述工程细胞包括cd123嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.32)和相应核苷酸(seqidno.33)。
在一个实施例中，所述工程细胞包括bcma嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.38)和相应核苷酸(seqidno.39)。
在一个实施例中，工程细胞包括gd2嵌合抗原受体多肽、4-1bbl和il-15/il-15sushi(seqidno.46)和相应核苷酸(seqidno.47)。
在一个实施例中，工程细胞包括gd2嵌合抗原受体多肽(seqidno.56)和相应核苷酸(seqidno.57)。
在一个实施例中，所述工程细胞包括gd2嵌合抗原受体多肽和4-1bbl(seqidno.56)及相应核苷酸(seqidno.57)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd45嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.54)以及相应的核苷酸(seqidno.55)。
在另一个实施例中，本发明提供了一种工程细胞，其具有重组il-15、il-15ra、il-15sushi、il-15/il-15ra、il-15-ra/il-15、il-15/il-15sushi、il-15sushi/il-15中的至少一个、其功能片段及其组合；以及至少一种不同的car多肽，其中抗原识别域包括gd2、gd3、白细胞介素6受体、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3、糖脂、glypican3、f77、gd-2、wt1、cea、her-2/neu、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6、甲胎蛋白、ca19-9、ca72-4、ny-eso、fap、erbb、c-met、mart-1、muc1，muc2、muc3、muc4、muc5、cd30、egfrviii、cd33、cd123、cll-1、免疫球蛋白kappa和lambda、cd38、cd52、cd19、cd20、cd22、cd38、bcma、cs1、baff受体、taci、cd3、cd4、cd8、cd5、cd7、cd2和cd138。
在不希望受到理论约束的情况下，人们认为il-15/il-15sushi和其他类型的il-15或il-15ra蛋白或其蛋白片段与检查点抑制剂或调节剂(如抗pd-1)结合时，提供car多肽的协同效应。
在一个实施例中，本发明提供了一种通过向需要il-21或il-12锚的患者施用共表达il-21或il-12锚的car工程细胞来为癌症患者提供长期持久缓解的方法(图24和25)。在不希望受到理论约束的情况下，人们认为il-21或il-21锚与car共同表达可通过增加car工程细胞的持久性，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，我们还认为分泌il-21与car多肽的共同表达通过影响肿瘤微环境，减少免疫抑制，促进先天性细胞增殖或功能，为患者提供长期持久的缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，我们认为分泌il-21或il-21锚的car共表达对于t细胞、nk细胞和nk细胞靶向肿瘤细胞的持久性和活性增强具有重要意义。car-nk细胞或nk细胞或nk-t细胞与il-21或il-21锚联合表达可延长生存期。
在一个实施例中，本发明提供了一种与靶向肿瘤细胞的cart或nk细胞可以是将增强子il-21递送到肿瘤微环境的载体有关的方法。cart或nk细胞被设计成共同表达分泌型il-21。工程化的car-t或nk-t细胞或nk细胞在肿瘤微环境中，靶向肿瘤细胞，与car靶向抗原结合，引起肿瘤细胞裂解，并从car-t或nk-t细胞或nk细胞的扩张中大量分泌可溶性il-21。
在特定实施例中，可通过结合以下至少一个或多个步骤来实现肿瘤的消除：
(1)通过靶向car抗原将本文公开的car工程t细胞或nk细胞或nkt细胞结合到肿瘤细胞的一部分；
(2)从共表达该分子的cart/nk细胞的扩增中触发大量分泌il-21；
(3)招募和刺激多种天然和适应性免疫细胞对抗肿瘤；
(4)通过使用检查点阻断剂，如pd-l1和ctla-4抑制剂，减少肿瘤中存在的肿瘤抑制。
在不希望受到理论约束的情况下，人们相信，上述步骤的组合通过协调一致的先天性和适应性免疫反应提供了有效的抗肿瘤效果。
在另一个实施例中，本发明提供一种具有il-21或il-21锚、其功能片段及其组合的工程细胞；以及至少一种不同的car多肽，其中抗原识别域包括gd2、gd3、白细胞介素6受体、ror1、psma、psca(前列腺干细胞抗原)、magea3，糖脂，glypican3，f77，gd-2，wt1，cea，her-2/neu，mage-3，mage-4，mage-5，mage-6，甲胎蛋白，ca19-9，ca72-4，ny-eso，fap，erbb，c-met，mart-1，muc1，muc2，muc3，muc4，muc5，cd30，egfrviii，cd33，cd123，cll-1，免疫球蛋白kappa和lambda，cd38，cd52，cd19，cd20，cd22，cd38，bcma，cs1，baff受体，taci，cd3，cd4，cd8，cd5，cd7，cd2和cd138。
在一个实施方案中，本发明提供了一种通过向需要其的患者施用共表达il-18或il-18锚的car工程细胞来给患有癌症的患者中提供长期持久缓解的方法(图26和图27)。不希望受理论的束缚，据信il-18或il-18锚与car的共表达通过增加car工程细胞的持久性在患者中提供了长期的持久缓解。
在不希望被理论束缚的情况下，还认为分泌il-18与car多肽的共同表达通过影响肿瘤微环境，减少免疫抑制和促进先天性细胞增殖或功能，为患者提供长期持久的缓解。
不希望受理论的束缚，据信分泌il-18或il-18锚的car共表达对于靶向肿瘤细胞的t细胞和nk细胞的更长的持久性和增强的活性是重要的。与il-18或il-18锚共表达时，carnk细胞或nk细胞可以延长生存期。
在一个实施方案中，本发明提供了一种与靶向肿瘤细胞的cart或nk细胞可以是将增强子il-18递送至肿瘤微环境的载体有关的方法。cart或nk细胞经过工程改造，可以共表达分泌性il-18。肿瘤微环境中的工程cart或nk细胞靶向肿瘤细胞，与car靶向抗原结合，并触发肿瘤细胞的裂解以及cart或nk细胞的扩增大量分泌可溶性il-18。
在特定的实施方案中，可以通过组合以下步骤中的至少一个或多个步骤来消除肿瘤：
(1)通过靶向car抗原将本文公开的car工程改造的t细胞或nk细胞与一部分肿瘤细胞结合；
(2)共同表达该分子的cart/nk细胞扩增引发il-18大量分泌；
(3)招募和刺激各种针对肿瘤的先天性和适应性免疫细胞；
(4)通过给予检查点阻断剂例如pd-l1和ctla-4抑制剂来减少存在于肿瘤中的肿瘤抑制。
在不希望受到理论约束的情况下，人们相信，上述步骤的组合通过协调一致的先天性和适应性免疫反应提供了有效的抗肿瘤效果。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种工程细胞，其具有il-18或il-18锚定物，其功能片段及其组合。至少一种不同的car多肽，其中的抗原识别域包括gd2，gd3，白介素6受体，ror1，psma，psca(前列腺干细胞抗原)，magea3，糖脂，glypican3，f77，gd-2，wt1，cea，her-2/neu，mage-3，mage-4，mage-5，mage-6，甲胎蛋白，ca19-9，ca72-4，ny-eso，fap，erbb，c-met，mart-1，muc1，muc2，muc3，muc4，muc5，cd30，egfrviii，cd33，cd123，cll-1，免疫球蛋白kappa和lambda，cd38，cd52，cd19，cd20，cd22，cd38，bcma，cs1，baff受体，taci，cd3，cd4，cd8，cd5，cd7，cd2和cd138。
在一些实施例中，靶向一种以上不同抗原可通过汇集由至少两个单独的cart或nk细胞产生的car工程细胞来实现。
如本文所使用的，汇集的car工程细胞包括具有多个不同car多肽单元的工程细胞群。举例来说，集合工程细胞包括具有不同car多肽的工程细胞群和具有不同car多肽的工程细胞群。此外，汇集的car工程细胞包括具有ccar多肽的工程细胞。
工程细胞的产生方法
可以通过本领域已知的任何方法将本文公开的任何多核苷酸引入工程改造细胞中。
在一个实施例中，通过本文公开的任何病毒载体将car多核苷酸递送至工程改造细胞。
在一个实施例中，为了实现增强的安全性特征或治疗指数，本文公开的任何工程改造细胞可构建为瞬时rna修饰的“可生物降解的”形式或衍生物，或其组合。可以将本发明中rna修饰的car电穿孔到t细胞或nk细胞中。复合car的表达可在几天内逐渐减少。
在本发明的一些实施例中，本文公开的任何工程改造细胞可以在转录系统(也称为“睡美人”)中构建，没有用病毒载体将cardna整合到宿主基因组中。
在本发明的一些实施例中，本文公开的任何工程细胞可以通过两个载体引入，并且每个载体带有car或增强子单元。
产生具有多个car单元的工程改造细胞的方法
在另一个实施例中，本发明提供了制备具有至少两个car单元的工程改造细胞之方法。
在一些实施例中，使用双顺反子或多顺反子表达载体在t或nk细胞中表达多个car单位。有几种策略可用于构建双顺反子或多顺反子载体，包括但不限于(1)与car的开放阅读框融合的多个启动子；(2)在car单元之间插入剪接信号；car的融合，其表达由单个启动子驱动；(3)在car单元之间插入蛋白水解切割位点(自切割肽)；(4)插入内部核糖体进入位点(ires)；(5)分离两个来表达不同的car单元。
在优选的实施例中，多个car单元在单个开放阅读框(orf)中表达，从而产生具有多个car单元的单个多肽。在该实施例中，在每个car单元之间设置含有高效切割位点的氨基酸序列或接头。
如本文所用，高切割效率定义为超过50％，超过70％，超过80％或超过90％的转化蛋白质被切割。如kim2011所述，可通过蛋白印迹分析测量切割效率。
此外，在优选的实施例中，存在等量的裂解产物，如蛋白质印迹分析所示。
高效切割位点的实例包括猪teschovirus-21a(p2a)，fmdv2a(本文缩写为f2a)；马鼻炎a病毒(erav)2a(e2a)；和那些甲病毒2a(t2a)，细胞质多角体病毒2a(bmcpv2a)和flacherie病毒2a(bmifv2a)，或其组合。在优选的实施例中，高效切割位点是p2a，kimjh，lees-r，lil-h，parkh-j，parkj-h，leeky等人(2011)描述了高效切割位点。在人细胞系，斑马鱼和小鼠中源自猪teschovirus-1的2a肽的高切割效率。plosone6(4)：e18556之内容通过引用并入本文。
在其中多个car单元在单个开放阅读框(orf)中表达的实施例中，表达受强启动子的控制。强启动子的实例包括sffv启动子及其衍生物。
当设计更长的基因结构时，蛋白质表达水平随着附加长度的增加而显著下降。因此，对多个抗原识别序列进行初步筛选，以找到既能产生最高转导效率又能产生最高靶细胞裂解率的组合。另外，它最好避免很高的car表达，这会导致细胞表面的单链聚集导致强直效应和不好的溶解。
在实施例中，其中多个car单元表示在一个单元中，避免每个单独car厢的铰链区域之间的轿厢相互作用。最好排除铰链的相互作用部位，或者每个car使用不同的铰链区域以避免其相互作用。
在一些实施例中，其中多个car单元在一个细胞中表达，对于每个共同结构域的不同核苷酸序列，例如先导序列、铰链和跨膜区域以及cd3zeta区域，优选以避免同源重组，同时保持相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，其中创建了多个car单元，基于将基于医学知识和背景给出最佳治疗效果的目标抗原的选择是优选的。
在一些实施例中，靶向一种以上不同抗原可通过汇集由至少两个单独的cart或nk细胞产生的car工程细胞来实现。
最好在靶细胞系和非靶细胞系上使用cart或nk细胞进行共培养裂解实验，以测试特异性。此外，优选仅表达一种靶向抗原的细胞系，每种细胞系用于证明每种组分car的裂解能力。要做到这一点，最好是制造一个非靶细胞系来合成表达所需抗原。
在一些实施例中，靶向一种以上不同抗原可通过汇集由至少两个单独的cart或nk细胞产生的car工程细胞来实现。
如本文所使用的，汇集的car工程细胞包括具有多个不同car多肽单元的工程细胞群。举例来说，集合工程细胞包括具有不同car多肽的工程细胞群和具有不同car多肽的工程细胞群。此外，汇集的car工程细胞包括具有ccar多肽的工程细胞。
具有car多肽和增强子的工程改造细胞
在另一个实施例中，本发明提供了制备表达至少一种car单元和增强子的工程改造细胞的方法。
在一些实施例中，使用双顺反子或多顺反子表达载体在t或nk细胞中表达至少一种car单元和增强子。有几种策略可用于构建双顺反子或多顺反子载体，包括但不限于(1)与car的开放阅读框融合的多个启动子；(2)在car单元之间插入剪接信号；car的融合，其表达由单个启动子驱动；(3)在car单元之间插入蛋白水解切割位点(自切割肽)；(4)插入内部核糖体进入位点(ires)。
在一些实施例中，至少一个在t细胞或nk细胞中表达的car和增强子可以通过两个分离的载体或病毒来实现。
在优选的实施例中，至少一个car单元和增强子在单个开放阅读框(orf)中表达，从而产生具有至少一个car单元和增强子的单一多肽。在该实施例中，含有高效切割位点的氨基酸序列或接头位于每个car单元之间和car单元及增强子之间。在该实施例中，orf处于强启动子的控制下。强启动子的实例包括sffv启动子及其衍生物。
此外，在优选的实施例中，存在等量的裂解产物，如蛋白质印迹分析所示。
综合疗法
本发明的成分和方法可用于产生一个cart淋巴细胞或nk细胞群，其传递初级和共刺激信号以用于癌症治疗中的免疫治疗。在进一步的实施例中，本发明的临床方面与其他有效治疗高增殖性疾病的药物(例如抗癌药物)相结合。抗癌药物能够减轻受试者的肿瘤负担。抗癌药物包括化疗、放疗和免疫治疗。
超过50％的癌症患者将接受某种类型的手术。根治性手术包括切除全部或部分癌组织，切除和/或破坏。
本发明所述的成分和方法可与其他癌症治疗类型(例如化疗、手术、放疗、基因治疗等)结合使用。
根据本发明，自然杀伤(nk)细胞可用于car杀伤的替代细胞毒性效应器。与t细胞不同，nk细胞不需要预先激活，并具有细胞溶解功能。ccars在nk细胞中的进一步表达使nk细胞能够有效地杀死癌症，特别是对nk细胞治疗有抵抗力的癌细胞。
此外，nk细胞可以介导抗癌作用，而不会诱发移植物抗宿主病(gvhd)。
参考下面列出的实施例可以更好地理解本发明。提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的化合物，组合物，制品，装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示例性的并且不旨在限制本发明。
可以通过共同施用car增强自来补充本文所述的任何工程改造细胞的施用。car增强自的实例包括增强car活性的免疫调节药物，例如但不限于靶向免疫检查点途径的药剂，集落刺激因子-1受体(csf1r)的抑制剂以获得更好的治疗结果。靶向免疫检查点途径的药剂包括结合抑制性免疫受体ctla-4，pd-1和pd-l1的小分子，蛋白质或抗体，并导致ctla-4和pd-1/pd-l1阻断。如本文所用，增强子包括如上所述的增强子。
这里使用的“病人”包括哺乳动物。此处所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本法所称哺乳动物，是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠、仓鼠等，以及兔等啮齿目哺乳动物。哺乳动物可能来自食肉目，包括猫科和犬科。哺乳动物可能属于偶蹄目，包括牛(牛)和猪(猪)，也可能属于蹄目，包括马(马)。哺乳动物可能属于灵长目、头鲸目或类人猿目(猴子)，也可能属于类人猿目(人类和类人猿)。最好，哺乳动物是人类。病人包括受试者。
在特定的化身,病人是一种人类0到6个月大的时候,6到12个月大的时候,1-5岁,5到10岁,5到12岁,10到15岁,15到20岁,13至19岁,20到25岁,25-30岁,20到65岁,30到35岁,35至40岁,40到45岁,45至50岁,50到55岁,55到60岁,60到65岁,65年到70岁,70-75岁,75年到80岁,80年到85年的历史,85到90岁，90到95岁或者95到100岁。
本文所用的术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以提供所需治疗或生理或效果或结果的工程改造细胞。这样的效果或结果包括减少或改善细胞疾病的症状。不良影响，例如副作用，有时表现出所需的治疗效果；因此，从业者在确定适当的“有效金额”时，将潜在利益与潜在风险进行平衡。所需的确切量将因患者而异，取决于患者的种类，年龄和一般状况，给药方式等。因此，可能无法指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员仅使用常规实验可确定任何个别情况下的适当“有效量”。通常，工程改造细胞以足以减少靶细胞增殖的量和条件给予。
在施用用于治疗，抑制或预防癌症的递送系统后，可以以本领域技术人员熟知的各种方式评估治疗性工程改造细胞的功效。例如，本领域普通技术人员将理解，通过观察治疗性工程改造细胞减少癌细胞负荷或预防，与化学佐剂联合递送的治疗性工程改造细胞在治疗或抑制患者的癌症方面是有效的。癌细胞负荷进一步增加。癌细胞负荷可以通过本领域已知的方法测量，例如，使用聚合酶链反应测定来检测某些癌细胞核酸的存在或使用例如抗体鉴定血液中的某些癌细胞标记物。用于检测来自受试者或患者的样品(例如但不限于血液)中标志物的存在的测定法，或通过测量患者体内循环癌细胞抗体水平的水平。
在整个说明书中，数量范围以及范围的下边界和上边界定义。每个下边界可以与每个上边界组合以定义范围。下边界和上边界应分别作为单独的元素。
在整个说明书中对“一个实施例”，“实施例”，“一个示例”或“示例”的引用意味着结合该实施例或示例描述的特定特征，结构或特性包括在至少一个实施例中。本实施例。因此，贯穿本说明书在各个地方出现的短语“在一个实施例中”，“在实施例中”，“一个示例”或“示例”不一定都指代相同的实施例或示例。此外，特定特征，结构或特性可以在一个或多个实施例或示例中以任何合适的组合和/或子组合进行组合。另外，应理解，此处提供的附图仅用于解释本领域普通技术人员的目的，并且附图不一定按比例绘制。
如本文所使用的，术语“包括”，“包含”，“包括”，“包括”，“具有”，“具有”或其任何其他变型旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括元素列表的过程，物品或装置不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的或该过程，物品或装置固有的其他元素。
此外，除非有相反的明确说明，否则“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，条件a或b由以下任何一个满足：a为真(或存在)且b为假(或不存在)，a为假(或不存在)且b为真(或存在)，a和b都是真的(或存在)。
另外，本文给出的任何示例或说明不以任何方式被视为对使用它们的任何术语的限制，限制或表达定义。相反，这些示例或说明应被视为关于一个特定实施例进行描述并且仅是说明性的。本领域普通技术人员将理解，利用这些示例或说明的任何术语或术语将包括可以或可以不在其中或在说明书中的其他地方给出的其他实施例，并且所有这些实施例旨在包括在该术语或术语的范围。指定这种非限制性示例和说明的语言包括但不限于：“例如”，“例如”，“例如”和“在一个实施例中”。
在本说明书中，描述了包含多个成员的各种参数的组。在一组参数内，每个成员可以与任何一个或多个其他成员组合以产生另外的子组。例如，如果组的成员是a，b，c，d和e，则特别考虑的其他子组包括任何一个，两个，三个或四个成员，例如a和c；a，d和e；b，c，d和e；等等
如本文所用，xxxx抗原识别结构域是对xxxx具有选择性的多肽。“xxxx”表示如本文和上文所讨论的目标。例如，cd38抗原识别结构域是对cd38特异的多肽。
如本文所用，cdxcar是指具有cdx抗原识别结构域的嵌合抗原受体。
实例
bcma-cs1ccar靶向多发性骨髓瘤等浆细胞疾病
bcma-cs1ccar(bc1ccar)t细胞的产生
bc1ccar结构是一个2单位的car，由一个完整的bcma-car与一个完整的cs1-car通过一个自裂解的p2a肽融合而成，使两个car受体分别在t细胞表面独立表达(图1a)。流式细胞仪检测的显示出不同的转导细胞的表达(图1b)。每个car单元中包括一个先导、一个单链抗体、一个铰链结构域(h)、一个跨膜结构域(tm)、一个共刺激结构域(cd28或4-1bb)和细胞内信号结构域cd3zeta(cd3)。用强脾灶形成病毒启动子(sffv)和cd8引导序列在t细胞表面高效表达bcma-cs1-ccar分子。
bc1ccart细胞特异性裂解bcma 和cs1 骨髓瘤细胞系
为了评估bc1ccart细胞的细胞毒性，我们对骨髓瘤细胞株mm1s(bmca cs1 )、rpmi-8226(bcma cs1dim)和u266(bcma cs1dim)进行了共培养实验。24小时共培养bc1car细胞毒性的facs分析显示，在所有e:t比率下，mm1s细胞几乎完全溶解(>90％)(图2a)。对培养的rpmi-8226和u266细胞观察到类似的趋势(图2a、2b)，显示出对不同抗原表达水平的靶细胞群的有效的细胞毒性(图2c)。
bc1ccart细胞特异性靶向原发性骨髓瘤bcma 和cs1 细胞群
为了进一步评估bc1ccar杀伤不同原发性骨髓瘤细胞类型的能力，选择原发性样本展示靶抗原表达谱(图3)。流式细胞术分析mm10-g标本发现一个混合性肿瘤，bcma cs1 双阳性，cs1 仅为群体亚群。mm7-g样本显示完全的bcma cs1 表型，而骨髓抽吸物mm11-g显示杂乱的bcmadimcs1dim表型。
bc1ccart细胞显示了对mm7-g原发性患者样本的强大(>80％)剂量依赖性(图4a)的能力。
在mm10-g共培养中，bc1ccar通过显著消融bcma cs1 和bcma-cs1 群体亚群，也显示了靶向性和特异性裂解能力。当e:t比为2:1时，bc1cart细胞消融超过60％的bcma cs1 细胞群，70％的cs1 细胞群有轻微的剂量依赖性增加(图4b)。bc1ccart细胞对mm11-g细胞也具有剂量依赖性的细胞毒活性(图4c)。通过细胞毒性筛选，bc1ccart细胞对表达bcma和cs1不同组合的骨髓瘤细胞系和原发性肿瘤细胞均表现出强大的抗肿瘤活性(图4d)
bc1ccar抗原特异性活性的功能评估
我们建立了一个模型，使我们能够独立测试bc1ccarscfv功能。骨髓瘤标志物阴性的cml细胞系k562，过表达cs1(cs1-k562)或bcma(bcma-k562)。在确认每种细胞系中独立的抗原表达后(图5a)，我们通过共培养实验确定了bc1ccart细胞靶向功能。
在短期培养中(过夜)，bc1ccart细胞表现出对bcma-k562细胞的细胞毒活性。对两种抗原均为阴性的野生型k562细胞没有脱靶作用(图5b)。针对cs1-k562细胞的短期培养也显示出对表达cs1的靶细胞的类似反应。此外，bc1ccart细胞似乎比针对cs1-k562细胞的cs1特异性car具有更强的细胞毒性作用(图5b)。
拥有非靶标抗原的残留肿瘤种群可能导致接受单抗原car治疗的患者复发。因此，因此，为了模拟更多临床相关的混合表达抗原的细胞群体，我们进行了联合培养实验。在持续(48h)培养中，以1：1的比例混合bcma-k562和cs1-k562细胞，以检测残留的抗原阳性群体。接下来，构建直方图，代表t细胞群以及带有的残留门控靶肿瘤群体标记的肿瘤目标细胞的群(图5c)。我们发现，与对照t细胞相比，bcma特异性car和cs1特异性car对它们各自的目标人群具有强大的细胞毒性作用。但是，cs1-car留下了大量残余的bcma 群体，而bcma-car获得了高的细胞毒性，但留下了少量的cs1 群体。相反，bc1ccart细胞有效地耗尽了两个靶标群体(图5c)。
肿瘤再挑战证明了bc1ccart细胞的连续杀伤能力
接下来，我们研究了在不利的微环境下，由细胞裂解，碎片和肿瘤再挑战引起的bc1ccart细胞连续杀死肿瘤细胞的能力。使用图6a中的方案，我们使用mm1s细胞作为模型骨髓瘤肿瘤进行了长期共培养，并定期将bc1ccart细胞以及单个bcma-car和cs1-cart细胞与新鲜的mm1s细胞一起刺激肿瘤扩大或复发。即使没有外源性细胞因子，我们也发现所有car治疗都在48小时后消除了靶抗原，具有明显的聚集和t细胞增殖(图6b)。相反，对照t细胞没有反应或增殖，产生的肿瘤细胞数量是其初始大小的两倍。用新鲜的mm1s细胞重新挑战所有处理孔后，我们发现所有car仍保留高度的细胞毒性。到108小时时，bcma-car和bc1ccar几乎耗尽了新的mm1s细胞，而cs1-car显示出对新mm1s细胞的不完全杀伤作用(图6c)。168小时后，所有car介导的肿瘤溶解和细胞毒性都停止了，但是bcma-car和bc1ccar仍然显示出可检测到的少数t细胞群，而对照t细胞和cs1-cart细胞实际上是不可检测的(数据未显示)。
bc1ccart细胞在体内对肿瘤有明显的控制和抑制作用
为了评价bc1ccart细胞的体内活性，我们建立了表达荧光素酶的mm1s细胞诱导荧光可见肿瘤形成的骨髓瘤小鼠模型。与对照组相比，注射bc1ccart细胞的mm1s的小鼠显著降低了肿瘤负担，延长了存活时间。给予小鼠单剂量bc1ccar或对照t细胞，用ivis显像测定肿瘤负荷(图7a)。从第6天开始，对照组和bc1ccar治疗组在肿瘤负荷的ivis测量方面有非常显著的差异(p<0.0003)(图7b)。car注射小鼠也有更有利的生存结果(图7c)。
混合抗原组小鼠模型显示ccar表达细胞比单一car表达细胞更能控制肿瘤负荷
为了建立异质细胞群和潜在的抗原逃逸模型，我们给小鼠注射了4:1的表达bcma:cs1的k562细胞混合物，并在第3天用7.5x106的对照、bcma-car或bc1ccart细胞治疗。cs1-cart细胞因体外疗效差而被排除。第3天，两只对照小鼠因注射程序死亡，排除在分析范围之外。荧光法观察肿瘤负荷(图8a)。在第10天，与gfp对照组相比，两种cars均表现出50％以上的肿瘤减少，到第12天增加到60％以上(图8a-右)。到第10天，bc1car在肿瘤抑制方面超过bcma-car6％，到第12天，这种扩散增加到17％，这可能是bcma-car无法溶解残留的cs1-k562细胞(注射肿瘤的20％)。与对照组相比，所有经cart细胞治疗的小鼠的存活率均显著提高。与bcma-car组相比，bc1ccar组的生存率也有显著改善(p<0.05)(图8b)。虽然这两种car在控制肿瘤生长方面都是有效的，但bc1car与单一靶点方案相比，显示出更强大的控制能力。
复合car-t细胞增强独立抗原小鼠模型t细胞的持续性及维持肿瘤消退
为了检测特异性bcma和cs1抗原表达细胞的耗竭并验证复合单链抗体的有效性，建立了4组小鼠模型，每组5只，分别注射bcma-k562和cs1-k562细胞，对照组和bc1ccart细胞给药给每一个肿瘤组(n＝19，因一只小鼠早期自发死亡)。在处死的时候(不同的：30-80天以上)，对小鼠全血和肝组织进行t细胞和肿瘤群的筛选。与ccar组相比，对照组的两种血液组织类型显示出一致的肿瘤存在(图9a、9b、10a、10b)。两种组织中平均肿瘤细胞群的聚集组织分析显示ccar治疗组肿瘤负荷减少的趋势一致(图9b)。在血液和肝脏中，对照t细胞不能持续存在超过标记30天，并且在两种组织类型中都显示出显著的肿瘤负荷(图9b、9c)。相比之下，即使在30 天，ccar处理的小鼠也显示出显著的t细胞扩张和持续性(图9c)，这与观察到的抗肿瘤活性增加和支持总体生存改善相关。
bcma-cs1-il-15/il-15sushi(cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi)的组织结构
bcma-cs1-il-15/il-15sushi(图11a)包含两个独立的car单元cd269-a7d(也称为bcmacar或反cd269car)和cs1car(也称为cs1-hu63car或反cs1car)。bcma-cs1-il-15/il-15sushicar可以分泌il-15/il-15sushi。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的免疫调节作用。可溶性il-15/il-15sushi融合可增强car-t/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，从而提供抗肿瘤疫苗样效果
car表达
用cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi慢病毒载体转导活化的人外周血t细胞。car。图11b显示了通过山羊抗鼠f(ab’)2抗体标记的用对照载体或cd269-a7d-hu63-il15/il15sushicar载体转导的活化t细胞之间的转导效率。用car载体转导的活化t细胞的cd269-a7d-hu63-il15/il15sushi的f(ab’)2阳性细胞数为23.7％(图11b)。这些cart细胞用于以下体外杀伤试验。
cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞在体外实验中能够裂解表达cd269或cs1抗原的肿瘤细胞系
对图11b中的cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞进行分析，以确定它们对合成表达cd269(bcma)或cs1(cd319)抗原的k562细胞的特异性裂解能力。用慢病毒载体转导野生型k562细胞表达cd269抗原或cs1抗原，经facs(facsaria，bd)筛选阳性。与表达k562-bcmaxp或k562-cs1xp的合成细胞以2:1和5:1的效应细胞与靶细胞比例共培养48小时。孵育后，用小鼠抗人cd3抗体(在所有情况下)和小鼠抗人cd269或cs1对细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析。在2:1e:t比率下，58％的k562bcmaxp肿瘤细胞被裂解，而在5:1比率下，91％的肿瘤细胞被裂解(图11c)。与k562-cs1-xp肿瘤细胞共培养，裂解率分别为33％和72％(图11c)。这些结果表明cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞的每个car组分都能裂解其预定的靶细胞。
cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞在异种小鼠模型中具有显著的抗肿瘤活性
为了评价cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞对人肿瘤细胞株的体内特异性抗肿瘤活性，我们用亚致死剂量照射nsg小鼠并静脉注射4×106表达荧光素酶的mm.1s野生型多发性骨髓瘤细胞，建立异种小鼠模型，诱导可测量的肿瘤形成。肿瘤细胞注射后8天，所有小鼠静脉注射15×106个对照t细胞或cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞。在第8天(t细胞治疗前一天)和第12天(治疗后72小时)，对小鼠进行ivis成像以测量肿瘤负荷。将注射cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞的mm.1s小鼠的平均光照强度与注射对照t细胞的小鼠进行比较，以确定靶细胞的裂解率。结果显示，在t细胞治疗后仅3天(第12天)，用cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞治疗的小鼠的肿瘤负担比用对照t细胞治疗的小鼠低90％(图11d)。这些结果表明cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-car-t细胞对多发性骨髓瘤细胞株的作用。此外，处死时抽取的血液显示，注射cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicart细胞的mm.1s小鼠的人il-15/il-15sushi水平显著高于未检测到的对照小鼠。
il15在cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicarnk细胞中的作用
为了进一步确定il-15/il15sushi是否分泌，用含有cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-car的慢病毒载体转导nk-92细胞株。在bd-facs-aria上对细胞进行分类，以选择f(ab’)2表型阳性的nk细胞(图11e)。分离后的细胞进行扩增，72小时后收集上清液，在96个涂有il-15抗体的孔板上进行elisa检测。按照制造商(boster)的指示，将读盘器上获得的比色结果与人il-15生成的标准曲线进行比较，以确定上清液中il-15的浓度。在285.9pg/ml的上清液中检测到il-15(图11f)。相比之下，含有相同数量野生型对照nk-92细胞的上清液的浓度仅为0.33pg/ml。
cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-car-nk细胞分泌的il15/il15sushi可替代il-2在体外对t细胞的扩增作用
nk-92细胞培养需要il-2的存在。il-15可以替代il-2的缺失，促进nk-92细胞的体外生长或扩增。本系统用于检测cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushicar转导的nk细胞分泌il-15/il-15sushi融合的功能。将分选后的cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-car-nk细胞和野生型nk-92细胞以0.5x10e6/ml的总体积在24孔培养板中培养。将细胞添加到重复的孔中；每对孔中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一个孔没有。48小时(第2天)后，计数细胞，容量增大，产生约0.5x10e6细胞/ml的浓度。该过程在第4、6和8天重复。如图11e所示，培养8天不含il-2的cd269-a7d-cs1-hu63-il15/il15sushi-nk-car细胞与添加il-2的野生型nk-92细胞的扩增速率相同，而未添加il-2的野生型nk-92细胞到第6天全部死亡。这表明nk-car细胞分泌的il-15可以替代il-2的扩增活性。
在一个实施例中，工程细胞包括bcma-cs1ccar多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.42)以及相应的核苷酸(seqidno.43)。
cd123b-cd33b-ccar(cd123-cd33-ccar)t细胞靶向cd123 和/或cd33 白血病/淋巴瘤的例子。
cd123b-cd33bccart细胞的产生
慢病毒转导的细胞毒性效应t细胞被设计成表达两个完整的car单元，由一个自裂解的p2a肽连接(图12a)。由此产生的复合car(cd123b-cd33b-ccar)能够靶向cd123 和/或cd33 白血病细胞(图12b)。每个car单元中包括一个先导、一个单链抗体、一个铰链结构域(h)、一个跨膜结构域(tm)、一个共刺激结构域(cd28或4-1bb)和细胞内信号结构域cd3zeta(cd3)。用强脾灶形成病毒启动子(sffv)和cd8引导序列在t细胞表面高效表达cd123b-cd33b-ccar分子。
cd123b-cd33b-ccart细胞转导效率
为了评估转导后t细胞表面cd123b-cd33bccar的表达水平，采用流式细胞术分析(图13)。转导效率为25％。
cd123b-cd33b-ccart细胞有效裂解急性髓系白血病细胞株
为了评价cd123b-cd33b-ccar(cd123b-cd33b-ccar)t细胞的抗肿瘤活性，我们用aml细胞株molm13(cd33 cd123 )和u937细胞株(cd33 cd123-)进行共培养。在流式细胞术中，为了区分靶向白血病细胞(molm13和u927；两者都是cd3-)和效应t细胞(cd3 )。以2:1和5:1的效应靶比(e:t)进行24小时的共培养分析，并使用流式细胞仪分析cd123b-cd33bccart细胞或对照t细胞的细胞裂解率(图14a、14b)。在2:1e:t比下，cd123b-cd33b-ccar细胞能裂解约98％的cd123 cd33 molm13细胞和99.9％的cd33 u937细胞。此外，在5:1的比率下，观察到两种细胞系100％裂解(图14c)。我们还验证了molm13和u937细胞株上表达的表面标记(图14c)。总的来说，这些结果表明cd123b-cd33b-ccart细胞能够特异而有力地清除表达两种抗原或其中一种的肿瘤细胞。此外，cd123b-cd33b-ccart细胞有效地消除了只表达cd33而不表达cd123的u937细胞，这一发现支持了复合car的每个离散单元可以独立地靶向其抗原并消除只表达一种抗原或同时表达两种抗原的靶点的事实。
我们进一步评估了剂量依赖的cd123b-cd33b-ccart细胞肿瘤溶解能力的，通过对其他两种细胞系：kg1a(cd123dimcd33 )和hl60(cd123dimcd33 )变化和降低e:t比值。以0.25:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1和10:1e:t的比例对kg1a和hl60细胞培养的cd123b-cd33b-ccart细胞，即使在0.25:1的比例下，也显示出75％以上的肿瘤溶解能力。总的来说，在5:1的比例下，剂量和肿瘤溶解到饱和之间有很强的相关性(图14d)。
cd123b-cd33b-ccar细胞有效裂解原发性髓系白血病肿瘤细胞
接下来我们建立了cd123b-cd33b-ccart细胞对原发性肿瘤细胞的抗肿瘤特性。用cd3染色细胞，以区分cart细胞和cd3白血病细胞。不同的原发性白血病患者样本，包括两个cd123 cd33 aml和两个cd123 b-all样本(pt1:aml、pt2:b-all、pt3:aml和pt4:b-all)，在这个小组中进行分析，并进行流式细胞术分析，以验证肿瘤溶解与被消除的圈出的靶细胞群(图15)。与以往aml细胞株的抗肿瘤细胞毒性结果(图14)相比，cd123b-cd33b-ccart细胞对所有患者样本显示出类似的阳性结果，2:1的比例下肿瘤溶解率超过80％，5:1的比例下肿瘤溶解率超过98％(图15)。而且，与我们的细胞株相似，cd123b-cd33b-ccart细胞有效地消融了只表达cd123而不表达cd33的pt2细胞，这一发现支持了这样一个事实：复合car的每个离散单元可以独立地靶向其抗原，并消除只表达其一个靶抗原(如针对cd33 u937和cd123 pt2细胞所见)或同时表达两个靶抗原的细胞(如对cd123 cd33 molm13和pt1细胞所见)。总的来说，这些结果表明cd123b-cd33b-ccart细胞对表达一种或两种抗原的病人肿瘤细胞具有很高的杀伤作用。
我们还特别检查了我们的cd123b-cd33bccar清除特定细胞群的能力，包括pt3样本中的白血病干细胞(cd123 cd34 cd38-)和pt4样本中的大量髓系白血病(cd34可变的cd33 )(图15c、15d)。我们发现cd123b-cd33b-ccart细胞成功地消融了lscs和大量疾病细胞。
cd123b-cd33bccart细胞的离散受体单元以抗原特异性的方式独立地裂解靶细胞
为了进一步证实我们的ccar的独立抗原靶向能力，我们产生了表达cd123或cd33的jurkat人工细胞系，并对这些细胞和不表达抗原的野生型jurkat细胞进行了cd123b-cd33bccart细胞的检测(图16)。我们发现cd123b-cd33b-ccart细胞表达cd123或cd33抗原，与不表达两种抗原的野生型jurkat细胞相比(图16a、16b和16c)，具有特异性和强杀伤性。总之，我们认为我们的cd123b-cd33bccart细胞可以通过刺激任一种car受体发挥作用，并且能够靶向表达一种或两种靶抗原的细胞，并且能够高效地消除靶点。
cd123b-cd33b-ccart细胞在两只使用molm13和u937细胞的aml小鼠模型中均表现出较强的抗肿瘤活性
为了评估cd123b-cd33b-ccart细胞的体内抗肿瘤活性，以预测其对患者的治疗效果，我们建立了两个异种移植小鼠模型(图17)。亚致死剂量(2.0gy)照射nsg小鼠，静脉注射1.0x106荧光素酶表达的molm13细胞或1.0x106荧光素酶表达的u937细胞。在molm13或u937移植后的第4天，小鼠静脉注射cd123b-cd33b-ccar或对照t细胞的10×106细胞。为了评估小鼠的肿瘤负荷，在第6、9和13天再次注射d-荧光素酶(perkinelmer)，并对小鼠进行ivis成像，以量化荧光素酶活性(caliperlifesciences)(图17a、17b)。通过ivis成像观察到，肿瘤负荷急剧增长的对照组小鼠的总流量水平持续增加。相比之下，cd123b-cd33bccar治疗的小鼠早在第3天就显著抑制了肿瘤负荷。到第6天，两种模型中用ccar治疗的小鼠的肿瘤负担都减少了80％以上(图17a、17b)。随着cd123b-cd33bccar治疗小鼠的总流量保持在接近背景零值，且与对照t细胞治疗小鼠相比具有统计学显著差异，这种肿瘤抑制作用在第13天得以维持并增强。
我们还评估了肿瘤细胞和cart细胞在死亡时的持续性。在处死时，从每个实验鼠和对照鼠采集外周血，并通过流式细胞仪分析是否存在移植瘤(molm13或u937细胞)和t细胞(ccar或对照)。molm13和u937细胞是cd3-细胞，可以与cd3 car或对照t细胞区分开来。小鼠外周血细胞通过侧散射和人cd45抗体进行门控，然后用cd3和cd33标记。对照组小鼠在外周血中显示出明显的残留肿瘤群(约75-87％)，而cd123b-cd33b-ccar治疗组小鼠显示出与对照组小鼠相当的所有肿瘤的几乎都被消除了(图17c)。此外，cd123b-cd33bccar处理的小鼠外周血中几乎所有人类细胞都是car-t细胞，显示出显著的t细胞扩张。这证实了我们的ccart细胞在维持长期反应方面的效力和持久性。此外，与对照组相比，cd123b-cd33bccar治疗组小鼠的存活率显著增加(图17a、17b)。
campath治疗后体内注射的ccart细胞的耗竭
对于用car-t细胞治疗急性髓性白血病的临床治疗，在肿瘤消失后或在因car治疗引起意外副作用的紧急情况下，可能需要建立安全的方法从患者体内清除car-t细胞。t细胞和b细胞在细胞表面表达cd52，一种cd52特异性抗体campath(alemtuzumab)可以清除循环中的cd52 细胞。为了评估campath治疗消除car的效果，我们进行了以下的描述的体内程序(图18a)。我们静脉注射10×106ccart细胞到受照射的小鼠体内。第二天，我们给每组3只小鼠注射0.1mg/kg的campath或pbs。在campath治疗后6小时和24小时，我们采集外周血，通过facs分析确定ccart细胞的存在。用侧散射(ssc)和cd3表达及cd3、cd45表达对ccart细胞进行门控，以区别于小鼠t细胞。在6小时和24小时，campath注射耗尽了血液中的ccart细胞(图18b，18c)。这些发现支持使用campath作为安全开关，快速消耗循环中的car-t细胞。
在一个实施例中，工程细胞包括cd123-cd33ccar多肽、il-15/il-15sushi(seqidno.34)和相应的核苷酸(seqidno.35)。
在一个实施例中，工程细胞包括cd123-cll1ccar多肽、il-15/il-15sushi(seqidno.36)和相应的核苷酸(seqidno.37)。
cd19b-cd123-ccar靶向b-all和其他白血病的例子(cd19-cd123-ccar的一个版本)
cd19b-cd123细胞的产生
慢病毒转导的细胞毒性效应细胞，即t细胞，被设计成通过自裂p2a肽与抗cd123片段(scfv2，cd123)融合的表达抗cd19单链可变片段(scfv1，cd19b)区域。这些抗体结构域通过cd8衍生的铰链(h)和跨膜(tm)区域与4-1bb和cd28共激活结构域和cd3ζ信号结构域相连(图19)。用强脾灶形成病毒启动子(sffv)和cd8引导序列在t细胞表面高效表达cd19b-cd123-ccar分子。
cd19b-cd123-ccart细胞转导效率
从脐带血(ucb)白膜层中分离的t细胞活化2天后，用cd19b-cd123-ccar慢病毒转导。流式细胞术测定cd19b-cd123-ccar转导效率为26％(图20)。
cd19b-cd123-ccar-2gt细胞能有效裂解cd19阳性和cd123阳性白血病细胞系
为了评估cd19b-cd123-ccart细胞的细胞毒性，我们以5:1的效应靶比(e:t)对人工表达cd19和cd123的白血病/淋巴瘤细胞系进行了共培养试验。使用k562细胞(髓样白血病细胞系)通过慢病毒感染表达cd19抗原(命名为k19)，并使用野生型k562细胞系作为对照。用jurkat细胞表达cd123抗原(j123)，以野生型jurkat细胞为对照。流式细胞术检测cd19b-cd123-ccart细胞对靶细胞的裂解作用。在16小时共培养中，cd19b-cd123ccart细胞在16小时内裂解了超过66％的k19细胞，在48小时内裂解了超过99％(图21a)。超过88％的j123细胞在16小时内溶解，达到饱和(图21b和21d)。对照组k562和对照组jurkat细胞未发生明显裂解，裂解率小于20％。
cd19b-cd123-ccart细胞对人工诱导的单阳性cd19和cd123细胞有效消融的发现，支持了复合car的每个离散单元可以独立地靶向其抗原并消除仅表达一种抗原或同时表达两种抗原的靶点的观点。此外，对照k562和jurkat细胞缺乏细胞裂解，表明cd19b-cd123-ccart细胞具有抗原特异性细胞毒性。
接下来，我们评估了cd19b-cd123-ccart细胞对自然发生的cd19/cd123抗原表达的白血病/淋巴瘤细胞系的靶向能力：人类套细胞淋巴瘤sp53(cd19 cd123-)和人类急性髓系白血病kg1a(cd19-cd123 )。在16小时共培养中，cd19b-cd123-ccar显示sp53细胞几乎完全溶解，靶细胞消耗86％，达到饱和(图21c)。在kg1a中，cd19b-cd123-ccar在16小时内裂解了超过69％的cd123 靶细胞，在48小时内裂解了超过94％(图21c和21d)，总的来说，cd19b-cd123-ccart细胞特异而有效地裂解了表达任一抗原靶细胞的靶细胞群，显示出有效的体细胞毒性。
cd19b-cd123-ccar-2g细胞能有效溶解原发性b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)和急性髓系白血病(aml)肿瘤细胞
我们使用cd19b-cd123-ccart细胞对原发性肿瘤细胞进行共培养，以评估它们杀死不同类型原发性白血病细胞的能力。用cmtmr细胞追踪器染色区分原发性肿瘤细胞和cart细胞。用pt1:b-all和pt2:aml共培养，流式细胞仪检测肿瘤溶解情况。流式细胞术分析pt1样本显示接近全部为cd19 表型，明显的cd19 cd123 群体。pt2样本显示混合肿瘤表型和部分cd123 cd19-表型(图22a)。cd19b-cd123ccart细胞对pt1原发性b-all样本有较强的消融作用，24小时e:t比为5:1时几乎完全溶解(图22b和22d。cd19b-cd123ccart细胞也消融了pt2原发性aml样本，24小时31％溶解，48小时67％溶解(图22c和22d)。综上所述，cd19b-cd123ccart细胞对白血病细胞系和表达cd19和cd123不同组合的原发性肿瘤细胞均表现出较强的抗肿瘤活性(图22d)。
在aml和使用molm-13和reh细胞的b-all的两个异种移植小鼠模型中，cd19b-cd123-ccar-3gt细胞表现出了很强的抗肿瘤活性。
为了评价cd19b-cd123-ccar-t细胞的体内抗肿瘤活性，我们建立了两种模型，一种是表达荧光素酶的molm13细胞(cd123 cd19-)模型，另一种是表达荧光素酶的reh细胞(cd19 cd123-)模型。给予小鼠单剂量cd19b-cd123-ccar-t细胞或对照gfp细胞，在第3、6、8和11天测量肿瘤负荷(图23a)，在molm13模型中，ccar治疗组和对照组在第6天有显著性差异(p<0.01)，与对照组相比，cd19b-cd123-ccart细胞注射组的光照强度更低，因此肿瘤负担更少(图23b)。到第11天，注射cd19b-cd123-cart细胞的小鼠比对照组小鼠的肿瘤负担少99％。接下来，我们比较了两组小鼠的存活率。根据先前描述的ivis成像实验，每天观察小鼠是否有严重疾病症状，一旦运动受到严重损害就处死小鼠。所有对照组小鼠在第18天死亡，而cd19b-cd123cart治疗组小鼠存活时间比对照组小鼠延长15天(p＝0.0031)(图23c)
0a1也发现了类似reh小鼠模型中的结果(图23d)。在第16天，注射cd19b-cd123ccart细胞的reh白血病小鼠的肿瘤负担比对照小鼠少99％(图23e)。比较ccar组和对照组小鼠的存活率时，cd19b-cd123ccart注射小鼠比对照小鼠存活时间长得多(图23f)(p＝0.0031)。总之，这些体内数据表明，与对照t细胞相比，cd19b-cd123ccart细胞注射和再注射nsg小鼠显著降低肿瘤负担，延长存活时间。
用共培养杀伤试验筛选和评价几种靶向bcma 和/或cs1 白血病细胞，特别是多发性骨髓瘤细胞的ccars。
1.不同版本bcma(cd269)-cs1ccars的产生。
如上所述，创建承载不同car单元的复合car可能是一个相当大的挑战。我们选择了不同的car元素，用一个强启动子和p2a自裂位点在单个载体中表达多个car单元。选择了car的铰链区，避免了各单元之间铰链区的相互作用。慢病毒转导的细胞毒性效应细胞，即t细胞，被设计成表达抗bcma(cd269)单链可变片段(scfv1)区域，通过自裂解p2a肽与抗cs1片段(scfv2)融合。这些单链抗体结构域通过cd8衍生的铰链(h)和跨膜(tm)区域连接到4-1bb和cd28共激活结构域和cd3ζ(cd3)信号结构域(图30)。采用强脾灶形成病毒启动子(sffv)和cd8引导序列在t细胞表面高效表达复合car分子。最后，筛选并评估构建物的表达和功能。单链抗体1代表对抗bcma抗原的不同单链抗体版本(a7d或c11d)。单链抗体2代表针对cs1抗原的不同单链抗体版本(hu63、mu34或mu90)。
2.不同版本bcma-cs1ccar慢病毒转转t细胞后，car表达水平不同。
外周血单个核白细胞细胞激活3天，用慢病毒载体转导6种不同序列的ccars，包括cd269(a7d或c11d)和cs1(hu63、mu34或mu90)car或对照载体。用山羊抗鼠fab抗体和小鼠抗人cd3染色转导的t细胞，观察转导后3d，car在t细胞表面的表达。图30a显示了每个cd269-cs1car的表面表达：a7d-mu34为11.2％；a7d-mu90为23.1％；a7d-hu63为28.5％；c11d-mu34为28.0％；c11dmu90为13.6％；c11dhu63为42％。这表明需要找到一对可以产生最高级别的car表达式的car单元。高效慢病毒包装细胞系对于产生这些结构物的高滴度至关重要(图30b)。我们使用lent-x293t细胞系作为包装系统，为复合car结构产生高病毒滴度。lenti-x293t包装细胞系明显优于其他细胞系，产生的病毒数量是293ft细胞的2-6倍。
ccars的转导效率(cart细胞百分比)通常低于单个单位car。在转染和转导过程中，有几种方法可以提高效率。为了提高制备ccars的病毒滴度，最好使用lentixtm293t(clontech/takara)包装细胞系，用于制备高滴度慢病毒，而不是常用的hek-293ft，转染包装细胞时，最好将质粒dna(含ccar结构)增加1.5-2.0倍，以提高转染效率。在复合物形成过程中，病毒包装质粒和转染试剂的量保持不变。通过在转导过程中降低t细胞与病毒载体的比率，使之达到每毫升0.3x106个细胞，并增加慢病毒上清液或慢病毒的体积，可以进一步提高转导效率。
3.检测不同抗bcma慢病毒载体转导的t细胞中car的表达。
在上述研究的基础上，cd269-a7d(又称a7d)和cs1-hu63(又称hu63)被选为增强型car或复合car(ccar)的良好候选car。我们还生成了一个ccar(cd269-a7d-c11d-2g)，靶向同一抗原bcma上的两个表位。在该ccar中，每单位cars携带不同的单链抗体，针对bcma的不同表位。增强型cars是以bcma抗原为靶点的cd269-a7d-il15/il15sushi和cd269-a7d-41bbl-2g。复合cars是靶向bcma和cd19抗原的cd269-a7d-cd19b-2g，靶向bcma和cs1抗原的cd269-a7d-cs1-hu63或cd269-c11d-cs1-hu63-bb。
激活外周血单核白细胞细胞3天，并用抗bcma慢病毒载体(cd269-a7d-2g、cd269-a7d-il15/il15sushi、cd269-a7d-41bbl-2g)和ccars(cd269-a7d-c11d-2g、cd269-a7d-cd19b-2g、cd269-a7d-cs1-hu63、cd269-c11d-cs1-hu63-bb)或对照载体(图30b)进行转导。用山羊抗鼠fab抗体和小鼠抗人cd3染色转染的t细胞，观察转染后3d，car在t细胞表面的表达。图30b显示了每个慢病毒载体的表面表达：对于cd269-a7d-2g，48.4％；cd269-a7d-il15/il15sushi，32.2％；cd269-a7d-41bbl-2g，36％；cd269-a7d-c11d-2g，27.4％；cd269-a7d-cd19b-2g，30.6％；cd269-a7d-cs1-hu63，28.5％；和cd269-c11d-cs1-hu63-bb，42.0％。
4.cd269-a7d-cd19bccart细胞能有效地裂解表达bcma和/或cd19的肿瘤细胞系
在体外共培养试验中，对cd269-a7d-cd19bccart细胞裂解单个靶细胞系的能力进行了测试(图30c和30d)。对k562细胞进行修饰，使其在细胞表面合成表达bcma(cd269)(称为k-bcma)或cd19(称为k-19)。共孵育18小时后，用抗人cd3和抗人cd269或cd19标记细胞，并用流式细胞术分析(图30c和cd30e)。cd269-a7d-cd19b-ccar细胞在2:1e:t比下能裂解31％的靶细胞，在5:1比下能裂解65％。cd269-a7d-cd19bccart细胞在2:1e:t比下也能裂解60％的靶k-cd19细胞，在5:1比下，几乎裂解所有细胞(图30d和cd30e)。这些结果证实了每一个car单元cd269和cd19b-car都能有效地裂解其特定的靶细胞。
5.cd269-a7d-41bbl、cd269-a7d-cs1-hu63和cd269-a7d-c11dccart细胞有效地裂解mm1s肿瘤细胞株
在体外共培养试验中，对上述产生的不同版本的bcma-cs1ccart细胞裂解特定靶细胞系的能力进行了测试。人多发性骨髓瘤细胞系mm1s与cd269-a7d-41bblcar、cd269-a7d-cs1-hu63ccar、cd269-a7d-c11dccart细胞或对照t细胞以2:1和5:1的e:t比率共同培养(图30f)。共孵育18h后，用cmtmr和抗人cd269标记细胞，流式细胞仪分析。cd269-a7d-41bblcart细胞在2:1e:t比下能裂解74％的靶mm1s细胞，在5:1比下能裂解90％，而cd269-a7d-cs1-hu63ccart细胞在2:1和5:1比下分别裂解59％和90％，cd269-a7d-c11dcart细胞在2:1和5:1比下分别裂解62％和86％(图30f)。这些复合car似乎没有显示任何car与car之间相互作用的证据。体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，表达bcma或cs1或两者的靶细胞被ccart或nk细胞清除或抑制，使用pct/us2016/019953和pct/us2016/039306中描述的方法
6.cd269-a7d-41bbl、cd269-a7d-cs1-hu63和cd269-a7d-c11dcart细胞能有效地裂解合成表达bcma或cs1的k562细胞
在体外共培养试验中，对上述产生的不同版本的bcma-cs1ccart细胞裂解特定靶细胞系的能力进行了测试。将k562细胞修饰为在细胞表面合成表达bcma(cd269)或cs1，然后与cd269-a7d-41bbl、cd269-a7d-cs1-hu63、cd269-a7d-c11dccart细胞或对照t细胞以2:1和5:1e:t的比例共同培养。共孵育18h后，用抗人cd3和抗人cd269(或cs1)标记细胞，流式细胞仪分析。cd269-a7d-41bblcart细胞能以2:1的e:t比率裂解56％的靶细胞，并以5:1的比率完全消除所有靶细胞，而cd269-a7d-cs1-hu63ccart细胞裂解38％和79％，cd269-a7d-c11dcart细胞分别以2:1和5:1的比率裂解16％和74％的k-bcma细胞(图30g)。只有cd269-a7d-cs1-hu63、cd269-a7d-c11dccart细胞在共培养中与k-cs1细胞进行了对比试验(图30h。cd269-a7d-cs1-hu63ccart细胞分别以2:1和5:1的比例溶解了k-562细胞的18％和54％，而cd269-a7d-c11dccart细胞，一种针对bcma抗原上两个不同表位的复合型car，显示以两种比例都没有能力溶解k-cs1细胞，这是预期的，因为没有cs1车单元。(图30h)。这些结果证明了每一个car单元特异性地裂解其目标群体的能力。
通过cll1-cd33bccar(cll1-cd33的一个版本)靶向cll1 和/或cd33 白血病细胞的示例
转导t细胞高效表达cll1-cd33b-ccar(cll1-cd33b-car)
外周血单个核白细胞被活化2-3天，用cll1-cd33b-ccar或对照载体进行转导。用山羊抗鼠fab抗体和小鼠抗人cd3染色转染的t细胞，观察转染后3天t细胞表面cll1-cd33b-ccar的表达。图31显示，用cll1-cd33bccar病毒转染的细胞中，29.7％的f(ab’)2和cd3均呈阳性，这是通过流式细胞术测定的。
cll1-cd33b-ccart细胞特异性靶向表达cll1(cll-1)和cd33的肿瘤细胞系
进行t细胞共培养杀伤测定法来确定cll1-cd33bccart细胞有效且特异性地裂解表达cll1(cll-1)和cd33的细胞系的能力：急性髓细胞白血病细胞系hl60，在细胞表面上表达两种抗原；经修饰以合成表达cll1(称为jurkat-cll-1xp)或cd33(称为jurkate-cd33xp)的jurkat细胞。另外，将cll1-cd33bccart细胞与对cll1和cd33呈阴性的reh和ccrf-cem细胞系共培养(图32a和32b)。所有靶细胞均预先用cfse膜染料标记，以区别于t细胞。共孵育18小时后，将细胞用抗人cd3标记并通过流式细胞仪进行分析。在低的2：1效应子/靶标比率下，cll1-cd33bccart细胞能够有效裂解hl60细胞(89％)，jurkat-cll-1xp细胞(84％)和jurkat–cd33xp细胞(96％)(图32c，32d和32e)；在e：t比为5：1时，几乎所有靶细胞都被耗尽(图2a-d)。但是，reh(8％)和ccrf-cem细胞(14％)均脱靶，显示出极少的细胞裂解(图32a和32b)。这证明了cll1-cd33bccart裂解的显着效力和特异性。条形图总结了结果(图32f)。
cll1-cd33b复合cart细胞能够在体外证明有效和定向的细胞毒性。
我们使用表达大量靶向cll-1和cd33的aml细胞系hl60和u937进行了共培养测定。我们发现cll-1cart细胞能够以大于90％的高效率有效消融这两种细胞(图32g和32h)。此外，复合car对阴性对照细胞系ccrf-cem的靶向作用基本达到最低水平(图32i)。
此外，cll1-cd33bccar在逐步增加的剂量方案中显示出强效的剂量依赖性细胞毒性，即使在最低剂量阈值0.25：1(效应子：靶标)细胞比时，其活性也约为50％(图32j)。
与单一cart选项相比，cll1-cd33bccart细胞显示出优异的抗肿瘤活性
将表达cll-1或cd33的jurkat细胞以1：1的比例合并，并与100,000个效应细胞孵育，以使最终的有效e：t比例为1：2。结果表明，复合car对表达cll-1或cd33的jurkat细胞组(>85％)表现出高度特异性和强力的细胞毒性，同时证明了其单个抗原相对于单个car选项而言具有更高的细胞毒性(图32k和32l)。
cd19b-il-21car(cd19-il-21car的版本)
实例
根据本发明制备了工程化的cd19b-il-21(cd19b-il21)car细胞(图33a)。配备有分泌il-2的cd19bcar裂解表达cd19抗原的白血病/淋巴瘤。
活化外周血单核白细胞两三天，并用cd19b-il-21或对照载体转导。转导后三天，通过用山羊抗小鼠fab抗体和小鼠抗人cd3对转导的t细胞染色，证明了cd19b-il-21在t细胞表面上的表达。图33b显示，通过流式细胞术测定，用cd19b-il-21car病毒转导的细胞中有63.9％的f(ab')2和cd3均为阳性。
进行细胞杀伤测定，并通过il-19-il-21car裂解表达cd19的靶向细胞。
体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，并使用pct/us2016/019953和pct/us2016/039306中所述的方法，通过cd19b-il-21cart或nk细胞消除或抑制表达cd19的靶向细胞。
bcma-il-18car可以使用类似的检测方法(图35)
在一个实施方案中，工程细胞包括cd19嵌合抗原受体多肽和il-21(seqidno.16)，以及相应的核苷酸(seqidno.17)。
在一个实施方案中，工程细胞包括cd19嵌合抗原受体多肽和il-21锚(seqidno.1)，以及相应的核苷酸(seqidno.2)。
在一个实施方案中，工程细胞包括bcma嵌合抗原受体多肽和il-18(seqidno.11)，以及相应的核苷酸(seqidno.12)。
在一个实施方案中，工程细胞包括bcma嵌合抗原受体多肽和il-18锚(seqidno.13)，以及相应的核苷酸(seqidno.14)。
cd19b-il-21锚car(cd19-il-21锚点版本)
实例
根据本发明制备了工程改造的cd19b-il-21锚(cd19b-il21)car细胞(图34)。cd19b-il-21锚car用于溶解表达cd19抗原的白血病/淋巴瘤。
进行细胞杀伤测定，并通过il-19-il-21锚car裂解表达cd19的靶向细胞。
体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，并使用pct/us2016/019953和pct/us2016/039306中所述的方法，通过cd19b-il-21锚cart或nk细胞消除或抑制表达cd19的靶向细胞
bcma-il-18锚car可以使用类似的检测方法(图36)
bcma-cd38ccar靶向多发性骨髓瘤的实例
实例
根据本发明制备了工程改造的bcma-cd38ccar细胞(图37)。慢病毒转染的细胞毒性效应t细胞或nk细胞经过工程改造，可以表达两个完整的car单元，这些car单元通过自切割p2a肽连接。所得复合car能够靶向bcma 和/或cd38 多发性骨髓瘤细胞或异常浆细胞(图37)。每个car单元包括一个先导、一个单链抗体、一个铰链结构域(h)、一个跨膜结构域(tm)、一个共刺激结构域(cd28或4-1bb)和细胞内信号结构域cd3zeta(cd3)。用强脾灶形成病毒启动子(sffv)和cd8引导序列在t细胞或nk细胞表面高效表达bcma-cd38ccar分子。
bcma-cd38ccar裂解表达bcma和/或cd38抗原的多发性骨髓瘤细胞或异常浆细胞。
进行细胞杀伤测定，并且通过bcma-cd38ccar裂解表达bcma和/或cd38抗原的靶向细胞。
体内抗肿瘤活性，在异种小鼠模型中进行细胞杀伤，使用pct/us2016/019953和pct/us2016/039306中所述的方法，表达bcma和/或cd38抗原的靶向细胞被bcma-cd38ccart或nk细胞消除或抑制。
在一个实施例中，cd38抗原识别结构域包括seqidno.15。
在一个实施方案中，工程细胞包括具有bcma抗原识别结构域的第一嵌合抗原受体多肽和具有cd38识别结构域的第二嵌合抗原受体多肽。在一个实施方案中，该工程细胞包括seqidno.5、7、9的多肽和相应多核苷酸seqidno.6、8、10.
cll1-cd33b-il-15/il-15sushi(cll1-cd33-il-15/il-15sushi)的结构组织
cll1-cd33b-il-15/il-15sushi(图39a)包含两个独立的car单元：cll-1car(也称为反cd371car或反cll1car)和cd33bcar(也称为反cd33car)。cll1-cd33b-il-15/il-15sushi可以分泌il-15/il-15sushi。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk或nk-t细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。可溶性il-15/il-15sushi融合可增强car-t/nk或nk-t细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，提供抗肿瘤疫苗样效应。
car表达
用cll1-cd33b-il15/il15sushi慢病毒载体转转导活化的人外周血t细胞。car。图39b显示用对照载体或cll1-cd33b-il15/il-15sushi载体转导的活化t细胞之间的转导效率，通过山羊抗鼠f(ab’)2抗体标记确定。用car载体转导的活化t细胞,cll1-cd33b-il15/il15sushif(ab’)2阳性细胞22％(图39b)。这些cart细胞用于以下体外杀伤试验。
在体外实验中，cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞能够裂解表达cll-1或cd33抗原的肿瘤细胞系
对图39b中的cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞进行分析，以确定它们对合成表达cll-1抗原或cd33抗原的reh细胞的特异性裂解能力。用慢病毒载体转导野生型reh细胞,使其表达cll-1或cd33抗原，经facs(facsaria，bd)阳性选择，建立reh-cll1xp和reh-cd33xp细胞株。与对照t细胞或cll1-cd33b-il15/il-15sushicart细胞共培养24小时，以2:1和5:1的效应细胞与靶细胞比率建立reh-cll1xp(reh细胞表达cll-1抗原)或reh-cd33xp(reh细胞表达cd33抗原)细胞。孵育后，用小鼠抗人cd3抗体(在所有情况下)和小鼠抗人cll1或cd33对细胞进行染色，并用流式细胞术进行分析。在2:1e:t比率下，76％的reh-cll1xp肿瘤细胞溶解，而在5:1比率下，94％的肿瘤细胞溶解(图39c)。与reh-cd33xp细胞共培养时，裂解率也很高，2:1为66.7％，5:1为96％(图39c)。这些结果表明，cll1-cd33b-il15/il15sushi-cart细胞的每个car成分都能裂解其预定的靶细胞。
cll1-cd33b-il15/il15sushi-car-t细胞在异种小鼠模型中具有显著的抗肿瘤活性
为了评估cll1-cd33b-il15/il-15sushicart细胞对人肿瘤细胞系的特异性体内抗肿瘤活性，我们使用经亚致死量照射并静脉注射1x106表达萤光素酶的molm13野生型急性髓性白血病肿瘤细胞的nsg小鼠建立了异种小鼠模型。表达萤光素酶的molm13野生型急性髓性白血病肿瘤细胞在细胞表面表达cd33，以诱导可测量的肿瘤形成。肿瘤细胞注射后四天，向所有小鼠静脉内注射15×106疗程的对照t细胞或cll1-cd33b-il15/il-15sushicart细胞。在第4天(t细胞治疗前一天)，第8天(治疗后72小时)和第12天，对小鼠进行ivis成像以测量肿瘤负荷。将注射cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞的molm13小鼠的平均光强度与注射对照t细胞的小鼠的平均光强度进行比较，以确定靶细胞的裂解百分比。结果显示，用t细胞治疗后仅第3天(第8天)，用cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞治疗的小鼠的肿瘤负担(背侧视图)降低了63％，而腹侧视图降低了59％(腹侧视图)对照t细胞(图40a，40b)。到第12天，裂解率分别提高到77％和86％。这些结果显示了cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞在体内对aml细胞系的功效。
il-15/il15sushi分泌导致小鼠外周血中cll1-cd33b-il15/il15sushicart细胞持续存在
处死时从四只小鼠的每只中抽血；一旦动物由于molm13肿瘤细胞扩散到各个器官而表现出麻痹迹象，就在第18天对每只对照小鼠实施安乐死。在第21和23天对两只接受cart细胞治疗的小鼠实施安乐死。收集外周血并用小鼠抗人cd45，cd3和cd33进行标记，然后进行流式细胞术。移植的人类细胞通过cd45门控，并分析t细胞和molm13细胞群体。如图40c所示，对照小鼠具有大量肿瘤细胞(蓝点)，而经cart处理的小鼠的血液似乎几乎没有肿瘤。尽管血液中缺少肿瘤细胞，但这些小鼠仍保持大量的cart细胞(绿点)，这表明cart细胞具有持久性，并保护了小鼠免受隔离在其他器官中的molm13肿瘤细胞的植入。为了确定这种持久性是否可能是由于il15/il-15sushi的分泌引起的，对每只小鼠的血浆进行elisa定量，以测定分泌的人il-15融合的量。如图40c所示，在两只对照小鼠中未检测到il-15，但是在经cart细胞治疗的小鼠中检测到低水平浓度的30和40pg/ml。
il15在cll1-cd33b-il15/il15sushicarnk细胞中的功能。
为了确定是否分泌il-15，用含有cll1-cd33b-il15/il-15sushicar的慢病毒载体转导了nk-92细胞系。在bdfacsaria上对细胞进行分类，以选择对f(ab')2表型呈阳性的nk细胞(图40d)。扩增分选的细胞，并在72小时后收集上清液，并在预先涂有il-15抗体的96孔板上进行elisa。按照制造商(boster)的指示，将在读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(图40e)。确定在上清液中以488pg/ml检测到il-15。相比之下，含有大约相同数量的野生型对照nk-92细胞的上清液的背景浓度仅为0.33pg/ml。
从cll1-cd33b-il15/il15sushicarnk细胞分泌的il15/il-15sushi可以替代il-2的体外功能
将分选的cll1-cd33b-il15/il15sushicarnk细胞和野生型nk-92细胞在0.5×10e6细胞/ml的24孔板中以1ml的总体积进行培养。将细胞添加到重复的孔中；每对中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一孔则没有。48小时(第2天)后，对细胞进行计数，体积增加，产生大约0.5x10e6细胞/ml的浓度。在第4、6和8天重复此过程。如图40d中的图所示，在无il-2的情况下培养8天的cll1-cd33b-il15/il15sushinkcar细胞的增殖速率接近于加入il-2的野生型nk-92细胞，而没有il-2的野生型nk-92到第6天全部死亡。这表明nkcar细胞分泌的il-15可以代替il-2的扩增活性。
cd20ccd19b和cd20hcd19bcar的产生和表征
该构建体包含sffv启动子，其驱动由p2a肽连接的car的多个模块单元的表达。切割接头后，ccar，cd20h-cd19bccar或cd20h-cd19bccar分裂并与表达cd20和/或cd19的靶标接合。作为新颖的ccar构建体，该构建体的激活结构域可包括但不限于cd20hcar或cd20ccar区段上的4-1bb，以及cd19bcar区段上的cd28区域。ccar中的cd20hcar部分包含靶向cd20表达细胞的人源化抗cd20单链抗体。
靶向表达cd20和/或cd19的细胞的cd20-cd19复合car的两种形式是cd20c-cd19b(cd20ccd19b)和cd20h-cd19bcar(cd20hcd19b)，使用上述类似方法。发现两种复合car，cd20ccd19b和cd20hcd19bcar在转导的t细胞上的表达百分比分别为22％和28％(图41a)。3天后，用抗cd3抗体激活白细胞。用对照载体(左)，cd20ccd19b或cd20hcd19bcar(右)慢病毒上清液转导细胞。孵育3天后，收获细胞并标记以进行流式细胞术。
为了评估cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞对非靶标野生型k562细胞的特异性，以效应物与靶标之比为2：1或5：1进行共培养实验6小时，并通过流动直接分析。cd3和cd45的细胞计数(图41b)。每种测定法仅由k652靶细胞(右)，对照t细胞(左)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中图)组成。目标细胞表示为蓝点(n＝2)。在共培养测定中，cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞未裂解不表达cd20或cd19的k562肿瘤细胞系。
为了评估cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞溶解表达cd19的靶细胞的能力，然后对以效应子与靶标之比为2：1，和合成表达cd19抗原(k-19)的k562细胞株进行共培养实验。或5：1混合24小时，然后通过流式细胞仪直接分析cd19和cd3(图41c)。每种测定法仅由k562-cd19xp目标细胞(右侧)，对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中央面板)组成。目标细胞表示为绿点。两种类型的化合物cart细胞在共培养测定中均裂解了表达cd19的合成的k562肿瘤细胞系。
为了评估cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞裂解表达cd20的靶细胞的能力，采用以效应子与靶标比率为2：1，和表达cd20抗原(k-20xp)的合成的靶k562细胞系进行共培养实验。或5：1混合24小时，然后通过流式细胞仪直接分析cd20和cd3(图41d)。每种测定法仅由k562-cd20xp目标细胞(k-20xp)(右侧)，对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中央面板)组成。靶细胞表示为紫色点。两种类型的复合cart细胞在共培养测定中均裂解了合成的表达cd19或cd20的k562肿瘤细胞系(图41c和41d)
为了评估cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞对表达cd19的靶reh细胞的特异性，用表达cd19的reh细胞系以效应比与靶比为2：1或5：1进行了共培养24小时，通过流式细胞术直接分析cd19和cd3(图41e)。每种测定法仅由reh靶细胞(右侧)，对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中央面板)组成。目标细胞表示为橙色点。在共培养测定中，发现两种类型的复合cart细胞都完全裂解了表达cd19的reh肿瘤细胞系(图41e)。
为了评估cd20ccd19b和cd20hcd19bcart细胞裂解表达cd19和cd20抗原的靶细胞的能力，以效应：靶比例为2：1或5：1，对表达cd19和cd20的sp53b细胞淋巴瘤细胞系进行了共培养实验，持续24小时，并通过流式细胞仪直接分析cd19和cd3(图41f)。每种测定法仅由sp53靶细胞(右侧)，对照t细胞(左侧面板)和cd20ccd19b或cd20hcd19bcart细胞(中央面板)组成。目标细胞表示为绿松石点(n＝2)。在共培养试验中，两种类型的复合cart细胞都完全裂解了同时表达cd19和cd20抗原的sp53肿瘤细胞系。
共培养结果的总结显示在图41g中，其中k562wt(野生型)在6小时共培养中进行，其他在24小时(n＝2)进行。相对于对照t细胞，两种复合car类型均表现出优异的靶标裂解，与cd20ccd19b-2gcart细胞相比，cd20hcd19b-2gcart细胞显示出对合成的表达cd20抗原的靶k562细胞的更强烈的杀死作用。
为了表征体内cd20h-cd19cart细胞的抗肿瘤活性，对nsg小鼠进行了亚致命性照射，并对其静脉内注射了1.0x106个表达荧光素酶的reh细胞(第0天)以诱导可测量的肿瘤形成(图42a，b)。注射肿瘤细胞后6天开始，向小鼠静脉内注射10×106个cd20hcd19bcart细胞或载体对照t细胞。在第5、9和12天，给小鼠皮下注射redijectd-萤光素并进行ivis成像。到第12天，cd20h-cd19cart细胞在背侧和腹侧均实现了98％的肿瘤细胞裂解。这些结果表明，cd20h-cd19cart细胞表现出表达cd19抗原的reh细胞的强大裂解。
cd20h-cd19b-il-15/il-15sushi(cd20hcd19b-il-15/il-15sushi)的组织结构
复合car(ccar)，cd20h-cd19b-il-15/il-15sushi(图43a)包含两个独立的car单元，即cd20hcar(也称为抗cd20car)和cd19bcar(也称为抗cd19car)。cd20h-cd19b-il-15/il-15sushi能够分泌il-15/il-15sushi。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合物，可作为cart/nk细胞及其邻近肿瘤免疫反应细胞的出乎意料且功能强大的免疫调节剂。可溶性il-15/il-15sushi融合物可以增强cart/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和抗肿瘤活性。可溶的il-15/il-15sushi融合物可通过重新编程人体的免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的作用。
car表达
用来自cd20h-cd19b-il15/il15sushi的慢病毒载体转导活化的人外周血t细胞。图43b显示了用对照载体或cd20h-cd19b-il15/il15sushicar载体转导的活化t细胞之间的转导效率，通过用山羊抗小鼠f(ab')2抗体标记来确定。用car载体转导的活化t细胞，cd20h-cd19b-il15/il15sushif(ab')2阳性细胞为25％(图43b)。这些cart细胞用于以下体外杀死试验。
cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞能够在体外测定中裂解表达cd20或cd19抗原或两者的肿瘤细胞系
分析了来自图43b的cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞特异性溶解合成的表达cd20的u937细胞(也称为u937-cd20xp或u-cd20xp)和天然表达cd19抗原的reh细胞的能力。用慢病毒载体转导野生型u937细胞以表达cd20抗原，并通过facs(u-cd20xp；facs-aria，bd)进行阳性选择。将对照t细胞或cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞与u-cd20xp细胞或reh野生型细胞共培养，效应细胞与靶细胞比例设置为2：1和5：1，持续24小时。孵育后，使用小鼠抗人cd3抗体(在所有情况下)以及小鼠抗人cd20或cd19对细胞染色，并通过流式细胞仪进行分析。在2：1e：t比率下，77％的u-cd20xp肿瘤细胞被裂解，而在5：1比率下，74％的肿瘤细胞被裂解(图43c)。对于与reh肿瘤细胞的共培养，裂解接近全部，2：1为96％，5：1为99％(图43c)。这些结果表明，cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞的每个car成分都能裂解其预期的靶细胞。
cd20h-cd19b-il15/il-15sushicart细胞在异种小鼠模型中表现出显着的抗肿瘤活性
为了评估cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞对人类肿瘤细胞系的特异性体内抗肿瘤活性，我们使用经皮下照射并静脉注射1x106荧光素酶的表达reh野生型b-all肿瘤细胞的nsg小鼠建立了异种小鼠模型，以诱导可测量的肿瘤形成。肿瘤细胞注射后四天，向所有小鼠静脉内注射15×106疗程的对照t细胞或cd20h-cd19b-il15/il-15sushicart细胞。在第4天(t细胞治疗前一天)和第8天(治疗后72小时)的第12和16天，对小鼠进行ivis成像以测量肿瘤负荷。将注射cd20h-cd19b-il15/il-15sushicart细胞的reh小鼠的平均光强度与注射对照t细胞的小鼠的平均光强度进行比较，以确定靶细胞的裂解百分比。结果显示，仅在用t细胞治疗后第3天(第8天)，用cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞治疗的小鼠的肿瘤负担比正常情况下少90％(背侧视图)和>86％(腹侧视图)给予对照t细胞的小鼠(图44a，b)。到第16天，无法检测到肿瘤。这些结果显示了cd20h-cd19b-il15/il15sushicart细胞在体内对抗急性淋巴细胞性淋巴瘤细胞系的功效。
il15/il-15sushi分泌导致小鼠外周血中cd20h-cd19b-il15/il-15sushicart细胞持续存在
处死时从四只小鼠的每只中抽血；一旦动物由于reh肿瘤细胞扩散到各个器官而表现出瘫痪迹象，就实施安乐死，在第28天和第30天对一只对照小鼠处死。在第33和36天对两只接受cart细胞治疗的小鼠实施安乐死；但是，在第36天安乐死的鼠标仍然可以活动。收集外周血并用小鼠抗人cd45，cd3和cd19标记，并进行流式细胞术。植入的人类细胞被cd45门控，并分析t细胞和reh细胞群体。如图44c所示，对照小鼠具有大量肿瘤细胞(蓝点)，而经cart处理的小鼠的血液似乎不含肿瘤。尽管血液中没有肿瘤细胞，但这些小鼠仍保持大量的cart细胞(绿点)，这表明cart细胞具有持久性，并保护了小鼠免于植入隔离在其他器官中的reh肿瘤细胞。为了确定这种持久性是否可能是由于il15/il-15sushi的分泌引起的，对每只小鼠的血浆进行elisa以定量分泌的il15的量。如图44c所示，在两只对照小鼠中未检测到人il-15，但在经cart细胞处理的小鼠中检测到159pg/ml的浓度，该小鼠在第36天被安乐死仍相对健康。
il15在cd20h-cd19b-il15/il-15sushicarnk细胞中的功能。
为了进一步确定是否分泌il-15，用含有cd20h-cd19b-il15/il-15sushicar的慢病毒载体转导了nk-92细胞系。在bdfacsaria上对细胞进行分类，以选择对f(ab')2表型呈阳性的nk细胞(图44d)。扩增分选的细胞，并在72小时后收集上清液，并在预先涂有il-15抗体的96孔板上进行elisa。按照制造商(boster)的指示，将在读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(图44e)。确定在上清液中以328pg/ml检测到il-15。相比之下，含有大约相同数量的野生型对照nk-92细胞的上清液的背景浓度仅为0.33pg/ml。
cd20h-cd19b-il15/il15sushicarnk细胞分泌的il15/il15sushi可以替代体外与扩张和生长相关的il-2功能。
分选的cd20h-cd19b-il15/il15sushicarnk细胞和野生型nk-92细胞在0.5×10e6细胞/ml的24孔板中培养，总体积为1ml。将细胞添加到重复的孔中；每对中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一孔则没有。48小时(第2天)后，对细胞进行计数，并增加体积，产生大约0.5x10e6细胞/ml的浓度。在第4、6和8天重复此过程。如图44d所示，在无il-2的条件下培养8天的cd20h-cd19b-il15/il-15sushinkcar细胞以与加入il-2的野生型nk-92细胞，而没有il-2的野生型nk-92到第6天全部死亡。这表明nkcar细胞分泌的il-15可以代替il-2的扩增活性。
在一个实施方案中，工程细胞包括cd20-cd19ccar多肽和il-15/il-15sushi(seqidno.28)，以及相应的核苷酸(seqidno.29)。
在一个实施方案中，工程细胞包括cd20-cd19ccar多肽(seqidno.52)和相应的核苷酸(seqidno.53)。
cd19b-il-15/il-15sushicar的产生
cd19b-il-15/il-15sushicart细胞是通过慢病毒构建转导原代外周血t细胞而产生的(pinz，2015)。cd19b-il-15/il-15sushicar构建体包含一个单位的car，即抗cd19car(也称为cd19bcar)。cd19b-il-15/il-15sushicar能够分泌il-15/il-15sushi(图45a)。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，可作为cart/nk细胞及其邻近肿瘤免疫反应细胞的出乎意料且功能强大的免疫调节剂。可溶性il-15/il-15sushi融合可以增强cart/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和抗肿瘤活性。可溶的il-15/il-15sushi融合物可通过重新编程人体的免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的作用。
流式细胞仪分析显示，转导后约有35％的t细胞表达cd19b-il-15/il-15sushicarf(ab')2片段(图45a)。此cd19b-il-15/il15suhsicar旨在：1)消除靶向的肿瘤细胞，2)增强抗肿瘤细胞毒性，3)通过分泌il-15/il15-sushi融合，牢固地提高car效力和持久性。
共培养实验以效应物与靶标(e：t)的比例从1：1到5：1进行24小时，并通过流式细胞术直接用小鼠抗人cd3ppercp和小鼠抗人cd19-pe进行分析。每种测定均由与p2a对照或cart细胞孵育的靶细胞(sp53，所有cd19 )组成。该实验揭示了cd19b-il-15/il-15sushicart细胞的剂量依赖性，即使在低e：t比(例如1：1)下，肿瘤细胞的有效裂解率也超过60％。在2：1，所有肿瘤细胞都被裂解后，杀伤能力达到饱和(图45b)。
cd19b-il-15/il-15sushicart细胞有效裂解cd19 sp53细胞(与cd19b单cart细胞相比)
使用与上述类似的共培养条件(图45b)，在该实验方案中，共表达抗cd19car和il-15/il-15sushi(cd19b-il-15/il-15sushi)cart细胞和cd19阳性的reh细胞共培养，与对照p2a和单个抗cd19bcart细胞相比。用相同的方法产生抗cd19bcart细胞，并证实在t细胞表面上的表达为～50％(在所有t细胞中，数据未显示)。此处的结果表明，即使在低的e：t比(例如1：1)下，两种cart治疗也同样有效，所有抗原阳性reh细胞均会有效和接近全部缺失。分泌的“il-15/il-15sushi融合”对cart细胞的细胞毒性没有有害作用。
与标准cd19car相比，cd19b-il-15/il-15sushicart构建体提供了增强的持久性和生物学活性
为了表征将car分泌il-15/il-15sushi为当前cart/nk细胞范例的可行选择，我们分析了3个主要因素：1)杀死靶细胞的能力(功效)，2)持久性增强，以提高生物利用度和监测，以及3)更有效的cart表型的增殖。我们发现，与标准cart-19(cd19bcar)相比，cd19b-il-15/il-15sushicar构建体能够在体内控制reh模型肿瘤的生长，且效果具有可比，并且效果略好(图46a)。在第二个reh模型中，我们证明了随着时间的推移，reh肿瘤在标准cart(cd19bcar)治疗中复发，但是，分泌il-15/il-15sushi的car持续存在并消除了复发的肿瘤，并保持了小鼠无病状态(图46b和46c)。此外，从存活终点来看，与未分泌il-15/il-15sushi的cd19bcar相比，给予cd19b-il-15/il-15sushicart细胞的小鼠显示出循环中的细胞毒性t细胞种群数量更高，水平更高。46d)。此外，两个治疗组中剩余的t细胞群体均表明，分泌il-15/il-15sushi的cart细胞(cd19b-il-15/il-15sushi)导致了更具细胞毒性的t细胞群体，其中包括cd8 细胞数量增加(图46d和e)。
bcma-cd38复合car的产生
如前所述，创建了三种版本的复合carscd269-a7d-cd38b，cd269-a7d-cd38a和cd269-a7d-cd38c，并通过用慢病毒构建体转导原始外周血t细胞来产生其cart细胞(pinz，2015年)。流式细胞仪分析显示，转导后具有f(ab′)2片段的cart细胞表达水平各异(图45a)。
测定了来自图45a的cd269-a7d-cd38a或cd269-a7d-cd38bcart细胞特异性溶解天然表达cd38的reh的能力。将具有对照t细胞或cd269-a7d-cd38a或cd269-a7d-cd38bcart细胞与reh野生型细胞的共培养，设置2：1和5：1效应细胞：靶细胞比例，持续24小时。两种cart细胞均显示出强力裂解的靶向细胞(图47b)。
还测试了cd269-a7d-cd38a或cd269-a7d-cd38bcart细胞靶向合成表达bcma的k562细胞的能力。将对照t细胞或cd269-a7d-cd38a或cd269-a7d-cd38b与野生型或k562表达bcma(k-bcma)细胞共培养，效应细胞与靶细胞的比例设置为2：1和5：1，持续24小时。孵育后，使用小鼠抗人cd3抗体(在所有情况下)和任一小鼠抗人bcma(cd269)对细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。两个cart细胞均显示出显着裂解的靶细胞(图47c)。
cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicar的组织结构(也称为bcma-cd38-il-15/il-15sushicar)
cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi(图48a)包含两个car的两个独立单元，即cd269-a7d(也称为抗bcmacar或抗cd269car)和cd38acar(也称为抗cd38)。cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi能够分泌il-15/il-15sushi。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，可作为cart/nk细胞及其邻近肿瘤免疫反应细胞的出乎意料且功能强大的免疫调节剂。可溶性il-15/il-15sushi融合可以增强cart/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和抗肿瘤活性。可溶的il-15/il-15sushi融合可通过重新编程人体的免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的作用
car表达
用来自cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushi的慢病毒载体转导的活化的人外周血t细胞。car。图1显示了用对照载体或cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicar载体转导的活化t细胞之间的转导效率，通过用山羊抗小鼠f(ab')2抗体标记而确定。用car载体转导的活化t细胞,cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushif(ab')2阳性细胞为33％(图48b)。这些cart细胞用于以下体外杀死试验。
用cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicar转导的t细胞表现出cd38 t细胞的自杀作用
为了确定用cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicar转导的t细胞是否会被cd38acar结构域溶解，在第6天(与抗f(ab')2标记的同一天)收获细胞，并第12天。用小鼠抗人cd3和cd38标记细胞，并通过流式细胞术分析。如图2所示，与对照t细胞相比，在第6天表达cd38的cart细胞数量几乎减少了一半(97％至51％)，而在第12天几乎所有的car细胞都是cd38-。这证实了cd38acar对cd38 t细胞的杀灭或自我杀灭。
cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞能够在体外测定中裂解表达bcma(cd269)或cd38抗原的肿瘤细胞系
测定了来自图48b的cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞的特异性裂解合成的表达bcma(cd269)抗原的k562细胞或天然表达cd38抗原的野生型reh细胞的能力。用慢病毒载体转导野生型k562细胞以表达bcma抗原，并通过facs(facs-aria，bd)阳性选择以创建k-bcmaxp细胞系。与对照t细胞或cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞以及k-bcmaxp或reh细胞的共培养，效应细胞：目标细胞比例为2：1和5：1，分别孵育24或48小时后，使用小鼠抗人cd3抗体(在所有情况下)以及小鼠抗人cd269或cd38对细胞染色，并通过流式细胞仪进行分析。结果表明，cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicart细胞的每个car组分都能裂解其预期的靶细胞(图48d)。
il-15在cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicarnk细胞中的功能。
为了确定是否分泌il-15，用含有cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicar的慢病毒载体转导nk-92细胞系。在bdfacsaria上对细胞进行分类，以选择对f(ab')2表型呈阳性的nk细胞(图48e)。扩增分选的细胞，并在72小时后收集上清液，并在预先涂有il-15抗体的96孔板上进行elisa。按照制造商(boster)的指示，将在读板器上获得的比色结果与人il-15产生的标准曲线进行比较，以确定上清液中il-15的浓度(图48f)。确定在上清液中以512pg/ml检测到il-15。相比之下，含有大约相同数量的野生型对照nk-92细胞的上清液的背景浓度仅为0。
cd269-a7d-cd38a分泌的il15/il15sushi-il15/il15sushicarnk细胞可替代体外与扩张和生长相关的il-2功能
将分选出的cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushicarnk细胞和野生型nk-92细胞以0.5ml10e6细胞/ml的总体积1ml培养在24孔板中。将细胞添加到重复的孔中；每对中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一孔则没有。48小时(第2天)后，对细胞进行计数，并增加体积，产生大约0.5x10e6细胞/ml的浓度。在第4、6和8天重复此过程。如图48e中的图所示，在无il-2的情况下cd269-a7d-cd38a-il15/il15sushinkcar细胞培养8天，与添加了il-2的野生型nk-92细胞扩增速度一致，而没有il-2的野生型nk-92已在第6天全部死亡。这表明nkcar细胞分泌的il-15可以替代il-2的扩增活性。
cd123b-cd33b-il15/il15sushiccar
cd123b-cd33b-il15/il15sushi(也称为cd123-cd33-il-15/il-15sushi)和cd123b-cll1-il15/il15sushi(也称为cd123-cll1-il15/il-15sushi)ccar的组织结构
cd123b-cd33b-il15/il15sushi包含两个car的两个独立单元，cd123bcar(也称为抗cd123car)和cd33bcar(也称为抗cd33car)。
cd123b-cll1-il15/il15sushi还包含两个car的两个独立单元，cd123bcar(也称为抗cd123car)和cll-1car(也称为抗cll1car)。使用描述的相似方法产生两种car构建体。
两个car都能够分泌il-15/il-15sushi。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，可作为cart/nk细胞或nkt细胞及其邻近肿瘤免疫反应细胞的出乎意料且功能强大的免疫调节剂。可溶性il-15/il-15sushi融合可增强cart/nk或nkt细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，并具有抗肿瘤活性。可溶的il-15/il-15sushi融合可通过重新编程人体的免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的作用。
il-15在cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sushicar中的功能
为了确定il-15是否被分泌，用包含cd123b-cd33b-il15/il15sushi或cd123b-cll1-il15/il15sush的慢病毒载体转导nk-92细胞系。在bdfacsaria上对细胞进行分类，以选择对f(ab')2表型呈阳性的nk细胞(图49b)。扩增分选的细胞，并在72小时后收集上清液，并在预先涂有il-15抗体的96孔板上进行elisa。按照制造商(boster)的指示，将在读板器上获得的比色结果与人il-15/il-15sushi产生的标准曲线进行比较，以确定上清液中il-15sushi的浓度(图49c)。确定从cd123b-cd33b-il-15/il-15sushi和cd123b-cll1-il-15/il-15sushink细胞的上清液中分别以>1500pg/ml和>1000pg/ml检测到il-15sushi。相比之下，含有大约相同数量的野生型对照nk-92细胞的上清液的背景浓度接近0。
cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sushicarnk细胞分泌的il15/il15sushi可以代替il-2的体外与扩张和生长有关功能
cd123b-cd33b-il15/il15sushi和cd123b-cll1-il15/il15sush
将分选的cd123b-cd33b-il15/il15sushi或cd123b-cll1-il15/il15sushicarnk细胞和野生型nk-92细胞以0.5x10e6细胞/ml的浓度在24孔板中培养，总体积为1ml。将细胞添加到重复的孔中；每对中的一个孔含有300iu/ml的il-2，另一孔则没有。48小时(第2天)后，对细胞进行计数，并增加体积，产生大约0.5x10e6细胞/ml的浓度。在第4、6和8天重复此过程。如图49b中的图所示，将cd123b-cd33b-il15/il15sushi或cd123b-cll1-il15/il15sushinkcar细胞在无il-2的情况下培养8天，扩增的速率与添加il-2的野生型nk-92细胞相同，而没有il-2的野生型nk-92到第8天全部死亡。这表明nkcar分泌的il-15细胞可以替代il-2的扩增活性。
生成ucar(通用car)的示例
从人脐带血制备的表达bcma15/il-15sushi-car的人nk细胞的生成
bcma15/il-15sushi-car构建体(也称为cd269-a7d-il-15/il-15sushi或bcmacarvac)包含一个car单元cd269-a7d(也称为抗bcmacar或抗cd269car)(图50a)。bcma15/il-15sushi-car可以分泌il-15/il-15sushi。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，可作为cart/nk细胞及其邻近肿瘤免疫反应细胞的出乎意料且功能强大的免疫调节剂。可溶性il-15/il-15sushi融合物可以增强cart/nk细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和抗肿瘤活性。可溶的il-15/il-15sushi融合物可通过重新编程人体的免疫系统来对抗癌症，从而提供类似抗肿瘤疫苗的作用。
饲养细胞的生成，用于扩增脐血nk细胞：
产生饲养细胞的步骤在流程图50b中示出。用表达表面锚蛋白或单链抗体标签的il-21(il-21锚)(见图55)或单链抗体标签4-1bbl和il-15/il-15sushi锚(也称为super2)的慢病毒转导k562细胞。(图54和图55)。
在一个实施方案中，工程化的k562细胞包括il-21锚定多肽(seqidno.1)和相应的核苷酸(seqidno.2)。
在一个实施方案中，工程化的k562细胞包括super2多肽(seqidno.50)和相应的核苷酸(seqidno.51)。
用il-21锚定或超2慢病毒将k562转导48小时。转导后，将细胞扩增并用抗体标记，以通过facs分选基因修饰的k562细胞。分选出的经过基因修饰的k562细胞被扩增，照射(10-100gy)并冷冻直至使用。将经辐照的基因修饰的k562细胞添加到脐带血细胞中，以刺激和扩展nk细胞作为饲养细胞。
从人脐带血扩增人nk细胞(图50c)。
流程图(图50c)显示了通过与经辐照的基因修饰的k562细胞共培养,从脐带血生成和扩增car转导的自然杀伤(nk)细胞的步骤。将脐带血细胞悬浮于含有300u/mlil-2的t细胞培养基中48小时。将经辐照的转基因k562细胞添加到脐血细胞中以刺激和扩增nk细胞48小时。
用car慢病毒转导激活的脐血细胞并培养48h，再与受照射的转基因k562饲养细胞共培养。
每隔2-3天，对car转导的脐血细胞进行计数，并用新鲜的培养基培养，以维持细胞状态。所有细胞培养基中均加入外源性il-2。
2周后，nk细胞增殖倍数较第1天增加220-680倍。3周后，nk细胞增殖倍数较第1天增加450～1500倍。
用小鼠fab抗体再次流式细胞仪检测nk细胞和t细胞的百分率以及nk细胞上car的表达。
流式细胞术检测bcma-il15/il15sushi-car病毒转导脐血细胞后，脐血cd56阳性细胞(蓝点呈粉红色)上bcma-il15/il15sushi-car的表达水平。
这些数据表明，将bcma-il15/il15sushicar病毒转导脐血nk细胞成功地产生了bcma-il15/il15sushicar表达的nk细胞。
bcma-il-15/il15sushi-car-nk细胞在小鼠体内具有显著的、意想不到的抗白血病作用。
为了评价bcma-il-15/il-15sushi-car表达的人脐血nk细胞的体内抗肿瘤活性，我们用nsg小鼠亚致死剂量照射并静脉注射表达荧光素酶的mm1s多发性骨髓瘤细胞建立了异种小鼠模型，以诱导可测量的肿瘤形成。第4天，小鼠静脉注射10x106对照nk细胞或bcma-il15/il15sushicar表达的nk细胞。第3、6、8、10天，小鼠皮下注射d-荧光素，进行ivis显像。通过ivis显像观察到，肿瘤负荷生长的对照组小鼠的总流量水平持续增加。相比之下，注射bcma-il15/il15sushi-car-nk细胞的小鼠早在第6天就显著肿瘤负担抑制，肿瘤负担降低了59.5％。结果表明，仅在用car-nk细胞治疗后10天(第6天)，用bcma-il-15/il-15sushi-car-nk细胞治疗的小鼠的肿瘤负担比用对照nk细胞治疗的小鼠低84％(图51a和51b)。此外，car-nk细胞治疗小鼠也有非常显著的更有利的生存结果。生成生存曲线以显示经car-nk细胞处理的小鼠在超过80天的时间内的生存率，与仅存活45天的对照组相比，对数秩检测(log-rank(mantel-cox))试验p＝0.0069(图51c)。
bcma-a7d-il15/il15sushi-car转染nk细胞在体内的持久性评价。
为了评估bcma-a-7d-il-15/il-15sushi(又称cd269-il-15/il-15sushi)nk细胞的持久性，我们将nsg小鼠亚致死性照射，并静脉注射1×106表达荧光素酶的mm1s多发性骨髓瘤细胞，建立了异种小鼠模型，以诱导可测量的肿瘤形成。第4天，白血病小鼠静脉注射10×106bcma-a-7d-il-15/il-15sushink细胞来源的人脐血。在第25天(图52a)和第60天(图52b)对异种移植小鼠模型中注射bcma-a7d-il15/il15sushicar转基因nk细胞的持续性进行评估。在第25天(对照nk或carnk细胞注入小鼠后21天)和第60天(对照nk或carnk细胞注入小鼠后58天)，从单个小鼠采集外周血，用人cd56和人cd45抗体标记细胞，以检测注入的对照和/或carnk细胞的存在。mm1s骨髓瘤细胞系cd56和cd45呈阴性(图52a左面板)，可用于监测小鼠体内的人类nk细胞。采用流式细胞术检测外周血中nk细胞的存活率。左面板显示mm1s对cd56和cd45呈阴性。bcma-il15/il15sushicar转导的nk细胞在输注后持续超过25天(图52a)和60天(图52b)，而在小鼠中未检测到非转导的nk细胞(对照)。此外，进一步的评估表明，bcma-il15/il15sushicar转导的nk细胞能持续3个月以上。一般来说，人类非转导的nk细胞在小鼠体内的存活时间通常不到一到两周。
自然杀伤细胞是一个理想的平台，创造一个通用car，避免与基因组编辑相关的风险。然而，nk-car细胞在体内的预期寿命很短，只有一两周。理想情况下，nk细胞的持续性应该是一个月或两个月，才能被认为是足够的治疗。我们开发了一个nk细胞平台，用于使用il-15/il-15sushi融合提高持久性和杀伤性的通用car治疗。本发明的研究表明，car-nk细胞共表达il-15/il-15sushi可作为非基因编辑通用的car平台，用于多种疾病的治疗。
cd123carsuper1
cd123carsuper1的组织结构
cd123carsuper1(图57)包含一个car，cd123car(也称为反cd123car或cd123bcar)。cd123b-car-super-1还共同表达4-1bbl配体，增强car功能，并与分泌il-15/il-15sushi融合。稳定的可溶性il-15/il-15sushi融合，对car-t/nk或nk-t细胞及其邻近的肿瘤免疫应答细胞具有意想不到的、强大的免疫调节作用。可溶性il-15/il-15sushi融合可增强car-t/nk或nk-t细胞的持久性，刺激肿瘤浸润淋巴细胞增殖，增强抗肿瘤活性。可溶性il-15/il-15sushi融合物通过重新编程人体免疫系统来对抗癌症，提供抗肿瘤疫苗样效应。
car表达
用表达cd123b-car-super-1的慢病毒载体转导脐血nk细胞。图58显示了通过山羊抗鼠f(ab’)2抗体标记确定的用对照载体或cd123bsuper1转导的nk细胞之间的转导效率。用car载体转导的活化t细胞，cd123bsuper1f(ab’)2阳性细胞为8％(图58)。这些cart细胞用于以下体外杀伤试验。将在体外和体内进行上述功能测试。
在一个实施例中，工程细胞包括cd123b嵌合抗原受体多肽和4-1bbl配体、il-15/il-15sushi(seqidno.32)和相应核苷酸(seqidno.33)。
人脐血nk细胞bcma-cd38a-il15/il15sushi-ccar
用表达bcma-cd38a-il15/il15sushi-ccar的慢病毒载体转导脐血nk细胞。图59显示了通过山羊抗鼠f(ab’)2抗体标记确定的用对照载体或bcma-cd38a-il15/il15sushiccar转导的nk细胞之间的转导效率。用car载体转导的活化t细胞，bcma-cd38a-il15/il15sushiccar的f(ab’)2阳性细胞为40％(图59)。这些cart细胞用于以下体外杀伤试验。将在体外和体内进行上述功能测试。
在一个实施例中，所述工程细胞包括bcma-cd38a嵌合抗原受体多肽和4-1bbl配体，il-15/il-15sushi(seqidno.40)，以及相应的核苷酸(seqidno.41)。
gd2-super1-car
实例
图60a所示的gd2super1car的组织结构。通过p2a和t2a原理图链接，生成一个显示car的super1car、一个结构中装有4-1bbl和il-15/il-15sushi的gd2car。该结构由一个sffv启动子驱动car、4-1bbl和il-15/il-15sushi三个片段的表达。连接器(p2a和t2a)断裂后，car，4-1bbl和il-15/il-15sushi分裂并与靶点结合。car具有单链抗体、铰链区、跨膜区、共刺激区(包括但不限于cd28或4-1bb)和细胞内信号转导、cd3-zeta链，4-1bbl或il-15/il-sushi或两者，能与cd28或4-1bb协同发挥t或nk细胞活化和持续或抗肿瘤作用。
为了评价不同靶向gd2的car结构的体内抗肿瘤活性，我们用nsg小鼠亚致死剂量照射并静脉注射表达荧光素酶的y79视网膜母细胞瘤细胞建立了异种小鼠模型，以诱导可测量的肿瘤形成。肿瘤细胞注射后3天，小鼠静脉注射10×10e6的gd2-car、gd2-4-1bbl-car、gd2-super1car或载体对照t细胞。为了确定cart细胞的持久性，在第30天对小鼠实施了安乐死。取小鼠肝脏、脾脏和全血。
流式细胞术分析显示y79肿瘤(蓝点)在用不同形式的抗gd2-cart细胞治疗的小鼠肝脏中持续存在(图60b)。用小鼠抗人cd3和cd56抗体标记匀浆肝细胞，分别检测人t细胞和y79肿瘤细胞。左侧显示了一个代表性的给对照t细胞的小鼠；使用gd2car(左中)、gd2-4-1bblcar(右中)和gd2-super1car(右)t细胞治疗的小鼠。图60b显示，相对于给予对照t细胞的小鼠，gd2cart细胞无法从肝脏清除y79细胞，而用gd2-4-1-bblcart细胞治疗的小鼠肿瘤细胞减少32％。相比之下，gd2-super1car治疗的小鼠肝脏肿瘤细胞减少了85％。构建一个图表，表明与对照小鼠(n＝2)相比，每只car处理的小鼠对y79细胞的杀伤活性百分比(图60b)。从这些数据来看，尤其是gd2超级car清除了肝脏中的y79细胞。对小鼠脾脏的分析显示，与对照组相比，gd2-super1处理的小鼠的人类t细胞增加了1.87倍(图60c)，并且高于gd2car(1.15x)和gd2-4-1bbl(1.35)。在小鼠全血分析中，gd2-super1t细胞的这种增加更为明显，比对照组小鼠增加了近3倍，gd2car的百分比增加了一倍多(图60d)。然后创建一个图表，显示全血样本中人类t细胞的持续性，和流式细胞术分析的总细胞数(n＝2个)相关(图60e)。这些数据有力地表明，gd2-super1car具有分泌il-15/il-15sushi和4-1bbl结构域，能裂解表达gd2的肿瘤细胞，并且比gd2car或gd2-41bblcart细胞具有更大的持久性。
在一个实施例中，工程细胞包括gd2嵌合抗原受体多肽和4-1bbl配体(seqidno.58)以及相应的核苷酸(seqidno.59)。
在一个实施例中，工程细胞包括gd2嵌合抗原受体多肽seqidno.56)和相应的核苷酸(seqidno.57)。
在一个实施例中，工程细胞包括gd2嵌合抗原受体多肽、4-1bbl配体和il-15/il-15sushi(seqidno.58)和相应的核苷酸(seqidno.59)。
序列列表描述
序列表
<110>美商生物细胞基因治疗有限公司
<120>靶向多种抗原的复合嵌合抗原受体（ccar）及其组成和使用方法
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<400>20
aspargthrmetalaleuprovalthralaleuleuleuproleuala
151015
leuleuleuhisalaalaargproaspilevalmetthrglnserpro
202530
aspserleualavalserleuglygluargvalthrmetasncyslys
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serserglnserleuleutyrserthrasnglnlysasntyrleuala
505560
trptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuiletyrtrp
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alaserproglyseralaalaserproargleuarggluglyproglu
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sertrptyrseraspproglyleualaglyvalserleuthrglygly
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asnleuileileleualaasnasnserleuserserasnglyasnval
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thrserserglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglygly
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tgggcggcaagccccagaggaggaagaacccccaggagggcctgtacaacgagctgcaga2880
aggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagaggaggaggggca2940
agggccacgacggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccc3000
tgcacatgcaggccctgccccccaggggcagcggcgaaggccgcggcagcctgctgacct3060
gcggcgatgtggaagaaaacccgggccccatgtacagaatgcagctgctgagctgcatcg3120
ccctgagcctggccctggtgaccaacagcggcatccacgtgttcatcctgggctgcttca3180
gcgccggcctgcccaagaccgaggccaactgggtgaacgtgatcagcgacctgaagaaga3240
tcgaggacctgatccagagcatgcacatcgacgccaccctgtacaccgagagcgacgtgc3300
accccagctgcaaggtgaccgccatgaagtgcttcctgctggagctgcaggtgatcagcc3360
tggagagcggcgacgccagcatccacgacaccgtggagaacctgatcatcctggccaaca3420
acagcctgagcagcaacggcaacgtgaccgagagcggctgcaaggagtgcgaggagctgg3480
aggagaagaacatcaaggagttcctgcagagcttcgtgcacatcgtgcagatgttcatca3540
acaccagctccggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcg3600
gcggctccggcggcggctccctgcaggcccccagaagagccagaggctgcagaaccctgg3660
gcctgcccgccctgctgctgctgctgctgctgagaccccccgccaccagaggcatcacct3720
gccccccccccatgagcgtggagcacgccgacatctgggtgaagagctacagcctgtaca3780
gcagagagagatacatctgcaacagcggcttcaagagaaaggccggcaccagcagcctga3840
ccgagtgcgtgctgaacaaggccaccaacgtggcccactggaccacccccagcctgaagt3900
gcatcagataagtttaaac3919
1.一种工程细胞，包括：
(i.)第一嵌合抗原受体多肽，其包含选自cs-1，cd5，cd19，cd20，cd123，bcma，cd38，cll-1和cd33的第一抗原识别域；第一信号肽；第一铰链区；第一跨膜结构域；第一共刺激域；第一信令域；和
(ii.)第二嵌合抗原受体多肽，其包含选自cs-1，cd5，cd19，cd20，cd123，bcma，cd38，cll-1和cd33的第二抗原识别结构域；第二信号肽；第二铰链区；第二跨膜结构域；第二共刺激域；第二信令域；
其中第一抗原识别结构域和第二抗原识别结构域不同；
其中第一抗原识别域和第二抗原识别域均具有单个抗原识别域。和其中所述工程细胞包含选自il-15/il-15sushi，il-15/il-15sushi锚，4-1bbl和il-15的增强子。
2.根据权利要求1所述的工程细胞，其中所述工程细胞包括seqidno.42(bcma-cs1ccar多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.34(cd123-cd33ccar多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.60(cll1-cd33ccar多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.40(bcma-cd38ccar多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi；seqidno.18(cd5-cd38嵌合抗原受体多肽)；seqidno.42(bcma-cs1ccar多肽和il-15/il-15sushi；seqidno.34(cd123-cd33ccar多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.36(cd123-cll1ccar多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.28(cd20-cd19ccar多肽和il-15/il-15sushi；seqidno.52(cd20-cd19ccar多肽)；seqidno.1(il-21锚多肽)或seqidno.50(super2多肽)。
3.根据权利要求1至2中任一项的工程细胞，其中所述增强子由所述工程细胞分泌。
4.根据权利要求1至3中任一项的工程细胞，其中所述工程细胞是nkt细胞，t细胞或nk细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项的工程细胞，其中所述工程细胞包含至少两种增强子。
6.一种工程细胞，其包含：
(i.)嵌合抗原受体多肽，其包含选自cd3，cd4，cd5，cd19，cd20，cd33，cd123，bcma，gd2和gd3的抗原识别结构域；信号肽铰链区；跨膜结构域；共刺激域；和信令域；和
其中所述工程细胞包含选自il-15/il-15sushi，il-15/il-15sushi锚，4-1bbl和il-15的增强子。
7.根据权利要求6所述的工程细胞，其中所述工程细胞包括seqidno.56(gd2嵌合抗原受体多肽)；seqidno.58(gd2嵌合抗原受体多肽，4-1bbl配体和il-15/il-15sushi)；seqidno.49(cd5嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi；seqidno.22(cd4嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.20(cd4嵌合抗原受体多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi)；seqidno.18(cd3嵌合抗原受体多肽,4-1bbl和il-15/il-15sushi；seqidno.24(cd19嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi)；seqidno.26(cd19嵌合抗原受体多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi)；seqidno.30(cd33嵌合抗原受体多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi)；seqidno.32(cd123嵌合抗原受体多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi)；seqidno.38(bcma嵌合抗原受体多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi)；seqidno.46(gd2嵌合抗原受体多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi)；seqidno.56(gd2嵌合抗原受体多肽；seqidno.32(cd123b嵌合抗原受体多肽和4-1bbl配体和il-15/il-15sushi)；seqidno.54(cd45嵌合抗原受体多肽和il-15/il-15sushi；seqidno.44(cll-1car多肽，4-1bbl和il-15/il-15sishi)；seqidno.40(abcma-cd38a嵌合抗原受体多肽和4-1bbl配体以及il-15/il-15sushi)；seqidno.21(cd33car多肽，4-1bbl和il-15/il-15sushi；或seqidno.50(super2多肽)
8.根据权利要求6至7中任一项的工程细胞，其中所述增强子由所述工程细胞分泌。
9.根据权利要求6至8中任一项的工程细胞，其中所述工程细胞是nkt细胞，t细胞或nk细胞。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的工程细胞，其中所述工程细胞包含至少两种增强子。
11.一种治疗细胞增生性疾病的方法，所述方法包括对有此需要的患者施用权利要求1至5中任一项的工程细胞。
12.根据权利要求11的方法，其中所述细胞增生性疾病包括t细胞恶性肿瘤，白血病或淋巴瘤。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中，所述工程细胞包括nkt细胞，t细胞或nk细胞。
14.一种治疗细胞增生性疾病的方法，包括对有需要的患者施用权利要求6至10中任一项的工程细胞。
15.根据权利要求14的方法，其中所述细胞增生性疾病包括t细胞恶性肿瘤，白血病或淋巴瘤。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的方法，其中所述工程细胞包括nkt细胞，t细胞或nk细胞。
17.根据权利要求14至16中任一项的方法，其中所述工程细胞包含seqidno.56(gd2嵌合抗原受体多肽)；seqidno.58(gd2嵌合抗原受体多肽，4-1bbl配体和il-15/il-15sushi)；或seqidno.46(gd2嵌合抗原受体多肽4-1bbl和il-15/il-15sushi)。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述细胞增生性疾病包括软组织肿瘤。
19.根据权利要求14至18中任一项的方法，其中所述软组织肿瘤选自脑肿瘤，肺癌或骨肉瘤。
20.根据权利要求14至19中任一项的方法，其中所述工程细胞包括nkt细胞，t细胞或nk细胞。
技术总结